CN111534570B

CN111534570B - 一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法

Info

Publication number: CN111534570B
Application number: CN202010643066.8A
Authority: CN
Inventors: 冯二环; 盛滔; 周升; 谢正华
Original assignee: Shanghai Siludi Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111534570A

Abstract

本发明涉及一种高通量混样筛查的病毒核酸提取方法，通过采用多孔混样裂解的方法，在保证混合样本中任一单个样本的提取效果不低于国家药监局批准的病毒核酸提取试剂对于单一样本的提取效果前提下，支持多达20个样本的混合提取，一块试剂板一次可进行320个样本的混合提取，能够大幅提高单次所能提取的混合样本数量，相较现有技术将样本单次提取速度提升20倍，特别适用于大规模病毒核酸筛查使用，检测效率高、安全性好。

Description

一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法

技术领域

本发明涉及病毒核酸检测技术领域，尤其涉及一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法。

背景技术

截至2020年6月8日，新型冠状病毒在全球范围内已经确诊超过700万人，因感染新型冠状病毒造成的死亡人数已经超过了40万人，其中，美国、巴西、印度、俄罗斯等国家的日新增病例都已经超过了5000例/天，然而与之对应的现状却是新冠相关的提取检测试剂、仪器、检测人员以及检测场地的严重缺乏；另一方面，虽然新冠疫情目前在国内基本控制住了，但在全球新冠疫情越来越严峻的情况下，我们仍不能放松警惕，我们有必要对新冠进行“普筛”。为了“保障复工复产疫情防控需要”，国家发展改革委、国家发展改革委在《发展改革委、卫生健康委联合推动地方提高新型冠状病毒感染肺炎诊断效率》、《关于加快推进新冠病毒核酸检测的实施意见》等文件中先后提出“混合样本”进行送样提取、检测的建议。由于目前国内新冠患者比较少，但人口基数又很大，通过混检的方式可以极大的节约检测的时间与成本，同时能有效地排除新冠的无症状感染者，避免新冠疫情的再次复发。但是目前关于“混合样本”的提取、检测方法还不成熟，亟待找到一种有效，可靠而又高效的方法从“混合样本”中高效、高通量地提取出病毒的核酸。在这种情况下，对采集的样本进行“混检”是上述问题的有效解决之道。

目前，核酸提取的主要方法包括苯酚氯仿抽提法、离心柱法以及磁珠法。苯酚氯仿提取核酸是利用酚使蛋白质变性，并在SDS(十二烷基磺酸钠)的作用下将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA（乙二胺四乙酸）的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使核酸从核蛋白中游离出来。最后利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，在相应的试剂层获得所需核酸的一种方法。这种方法由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，不同实验人员操作重复性差，很难进行高通量自动化的操作。

离心柱法的主要原理是将对核酸有吸附作用的官能基团修饰在离心柱模上，通过加入不同的裂解试剂、洗涤试剂反复离心，以达到核酸与杂质分离的目的，以此来获得纯化的核酸。但是这种方法需要较多的样本且对于珍稀样本无法进行有效提取。同时用离心柱法提取核酸需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，不适用于当前形势下对高通量核酸提取设备与方法的需求。

磁珠法的原理是在磁珠表面修饰对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液、结合液、洗涤液在特定的条件下能够与核酸进行结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对核酸的分离纯化，获得纯化的核酸。由于磁珠具有在磁场的作用下可以操控的特性，因此磁珠法对核酸的提取操作可以实现自动化操作，可以满足当前形势下对高通量核酸提取设备与方法的需求。

磁珠法核酸提取技术，虽然能自动化地提取样本的核酸，但是现有技术并未涵盖混合样本的测试，也没有涉及混合样本提取。此外，在现有的磁珠法核酸提取自动化试剂盒的实际应用中，都只应用了单孔裂解提取，且在本领域通用的磁珠法核酸提取试剂以及核酸提取仪器中所用的96孔板单孔容积不超过2.2 mL，考虑到混匀期间磁棒套所占用的体积，实际单孔液体总体积不能超过1 mL，这1 mL体积还需要包括裂解液，蛋白酶K，样本等组分，且裂解液必须达到一定的浓度才能实现样本的充分裂解以及核酸的有效提取，因此样本的上样量一般不超过300 uL。较少的上样量不利于混合样本提取的进行，因为总上样量一定的话，随着混合样本的增加，单个样本的上样量就会减少，在这种情况下，提取的混合样本的数目的增加是以牺牲提取到的单个样本的核酸量为代价的，这样会因为输入的单个样本的核酸量太少而导致很多新冠患者，比如无症状感染者或新冠新感染者的漏检现象，从而造成极大的安全隐患。

目前学术界也提出了一些关于混合样本核酸提取的相关研究：Assessment ofSpecimen Pooling to Conserve SARS CoV-2 Testing Resources中使用50 µL的SARS-CoV-2阳性鼻咽标本与4例阴性患者标本（各50 µL）混合创建了25个混合样本，总体积为250µL，随后从混合样本中提取病毒RNA，并使用SARS-CoV-2 RT-PCR测定法进行测试，检测结果显示，所有25个混合样本均为阳性，循环阈值（Ct）值比原始单个样本的高0~5.03个Ct；Sample Pooling as a Strategy to Detect Community Transmission of SARS-CoV-2中将2740个鼻咽样本和148个支气管肺泡灌洗样本混合成了292个混合样本，进行检测。检测结果发现SARS-CoV-2的确证阳性率为0.07％（2/2888），2份阳性样品显示E基因和RdRp基因的检出，并通过Sanger测序验证了这两个样本的确为阳性样本，有一个混合样本Sanger测序结果显示为阳性样本，但在混合样本的实际操作过程中未检出阳性信号，产生了一个漏检现象；Pooling of samples for testing for SARS-CoV-2 in asymptomatic people将提取好的核酸样本进行4~30个的混合检测，结果显示在用qPCR进行至多30个混合检测时，混合样本与单个阳性样本的Ct值之差小于5。

上述研究中涉及的混合样本提取检测技术方案主要基于两种方法实现：1. 将样本混合起来进行提取，然后进行检测；2.提取单样本，再将提取的样本核酸混合起来进行检测。文章中提及的方法对于多样本的混合检测有一定的借鉴意义，但是有几个关键性的问题没有解决。首先对于样本混合起来进行提取的方法，涉及将5个咽拭子，共计250 uL样本进行混合抽提并进行检测，检测结果为混合样本的Ct值比原始单个样本的高0~5.03个Ct，换算成理论效率（按照2^ΔCt进行计算），也就是混合样本的中提取的新冠病毒的量为单个样本的3%~100%，也就是说这种混合样本的提取方法对病毒核酸的提取量非常不稳定，且提取效果较差；而对于第二种提取单样本，再将提取的样本核酸混合起来进行检测的方法，涉及的将提取的样本核酸混合起来进行检测的方法与单个阳性样本的Ct值之差小于5，换算成理论效率（按照2^ΔCt进行计算），按照上述方法提取混合样本中的核酸的提取效果大约为单个阳性样本提取效果的3.1%，这种提取效果可能会漏掉一大批病毒含量较少的无症状感染者或新感染者，从而造成极大的安全隐患。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法，通过采用多孔混样裂解的方法，在保证混合样本中任一单个样本的提取效果不低于国家药监局批准的病毒核酸提取试剂对于单一样本的提取效果前提下，单个核酸提取操作单元一次支持20个或更多样本的混合提取，一块试剂板一次可进行320个或更多样本的混合提取，特别适用于大规模病毒核酸筛查使用，检测效率高、安全性好。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案包括：

一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、在96孔板中分别加入裂解液、洗涤液和洗脱液，且所述裂解液加入96孔板中的至少两列；

S2、在含有裂解液的孔中加入1个或多个样本，并加入蛋白酶K；

S3、使用磁珠对含有裂解液、样本以及蛋白酶K的混合液进行核酸提取操作得到检测用核酸。

进一步地，所述96孔板依照列分布划分为两个并列同步操作的提取组，所述步骤S1中裂解液加入96孔板时，可任选的加入单个提取组的二列、三列或四列，或在96孔板的两个提取组均加入二列、三列或四列裂解液。

进一步地，所述步骤S2中每个含有裂解液的孔中样本总量与裂解液的加入量体积之比为2:7至5:4。

进一步地，洗涤液的加入量为每孔200至1000 uL，洗脱液的每孔加入量与含裂解液的孔中样本总量体积之比为1:20至1:1。

进一步地，所述磁珠为羟基磁珠。

进一步地，所述步骤S2包括在含有裂解液的孔中加入最多8个样本；优选的，每个样本加入量为100 uL。

进一步地，所述步骤S2包括在含有裂解液的孔中可任选加入7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个样本；优选的，每个样本加入量为50~200uL；更优选的，每个样本加入量为100uL。

进一步地，所述步骤S2包括在含有裂解液的孔中加入5个样本；优选的，每个样本加入量为50~200uL；更优选的，每个样本加入量为100 uL。

进一步地，所述洗涤液包括体积分数为60~85%的乙醇和终摩尔浓度1~4 mmoL/L的Tris；所述洗脱液包括终摩尔浓度0.5~2 mmol/的Tris-HCl和终摩尔浓度0.01~0.5 mmol/L的EDTA，所述Tris-HCl的pH值为7.5~8.5，EDTA的pH值为7.5~8.5。

进一步地，所述洗涤液包括体积分数为80%的乙醇和终摩尔浓度2 mmoL/L的Tris；所述洗脱液包括终摩尔浓度1 mmol/L的Tris-HCl和终摩尔浓度0.2 mmol/L的EDTA，所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0。

进一步地，所述步骤S3包括以下分步骤：

S31、将96孔板上12列孔分为两个并列同步操作的提取组，每个提取组各包括一列洗涤液、一列洗脱液和四列混有样本的裂解液，即每个提取组均包括有8个具备4个裂解液孔的核酸提取操作单元；

S32、将磁珠依次转移入混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到附着有核酸的磁珠；

S33、将附着有核酸的磁珠重新转移入洗涤液孔中混匀洗涤并晾干得到晾干磁珠；

S34、将晾干磁珠转移至洗脱液孔进行洗脱操作，所得洗脱液即为所需要的检测用核酸。

进一步地，所述分步骤S32包括以下子步骤：

S321、依照每个核酸提取操作单元加入1mg的磁珠量，使用磁珠对第一列混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第一磁珠混合物；

S322、将第一磁珠混合物转移入第二列混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第二磁珠混合物；

S323、将第二磁珠混合物转移入第三列混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第三磁珠混合物；

S324、将第三磁珠混合物转移入第四列混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到附着有核酸的磁珠。

进一步地，所述核酸裂解提取操作所用裂解时间为3至8分钟。

进一步地，分步骤S33中所述混匀洗涤包括在室温条件下洗涤1至5分钟，所述晾干包括室温条件下晾干2分钟；分步骤S34中所述洗脱操作包括在50至80℃条件下洗脱1至5分钟。

进一步地，所述步骤S3包括以下分步骤：

S31、将96孔板上12列孔分为两个并列同步操作的提取组，每个提取组各包括两列洗涤液、一列洗脱液和三列混有样本的裂解液，即每个提取组均包括有8个具备3个裂解液孔的核酸提取操作单元；

进一步地，分步骤S33中所述混匀洗涤包括依次进行两次在室温条件下洗涤1至5分钟的操作。

进一步地，所述步骤S3包括将磁珠预先混入洗涤液所在孔中，或，将磁珠预先混入部分裂解液所在孔中，或，将磁珠预先混入全部裂解液所在孔中，或，将磁珠随样本一并加入裂解液所在孔中。

本发明还涉及一种应用在如上所述的高通量混样裂解病毒核酸提取方法中的优选裂解液，其特征在于，所述优选裂解液包括终摩尔浓度3 mol/L~5 mol/L的胍盐、体积分数为25%~45%的乙醇、体积分数为1%~3%的聚多卡醇、终摩尔浓度为20~80 mmol/L的柠檬酸三钠、终摩尔浓度为0.5~2 mM的二硫苏糖醇、体积分数为0.5%的N-月桂酰肌氨酸以及质量分数为50~300ug/mL的糖原。

进一步地，所述优选裂解液还包括体积分数为0.1%~2%的聚丙烯酸钠。

进一步地，所述优选裂解液包括终摩尔浓度4.1 mol/L的胍盐、体积分数为36%的乙醇、体积分数为1%~3%的聚多卡醇、终摩尔浓度为20~80 mmol/L的柠檬酸三钠、终摩尔浓度为0.5~2 mM的二硫苏糖醇、体积分数为0.5%的N-月桂酰肌氨酸以及质量分数为50~300ug/mL的糖原和体积分数为1%的聚丙烯酸钠。

进一步地，所述胍盐包括异硫氰酸胍、硫氰酸胍或盐酸胍。

本发明的有益效果为：

采用本发明所述多孔裂解病毒核酸提取方法克服了现有混样提取研究中对混合样本的Ct值比原始单个样本的高至多5个Ct值的问题，以及对混合样本的Ct值比原始单个样本的Ct值的差值波动过大的问题，实际应用中对于混合样本中任一单个样本的提取效果不低于对于原始单一样本的提取效果，且对混合样本的Ct值比原始单个样本的Ct值的差值在1以内；本发明还涉及一种优选裂解液，通过针对性的优化配方使裂解液更加适用于混合样本多孔提取、浓缩提取的核酸等方法，相对于现有的病毒核酸提取试剂盒所采用裂解液，能够大幅提高单次所能提取的混合样本数量，且对于混合样本中任一单个样本的提取效果不低于达安病毒核酸提取试剂对于单一样本的提取效果。

附图说明

图1为本发明96孔板核酸提取操作单元组成第一实施例示意图。

图2为本发明96孔板核酸提取操作单元组成第二实施例示意图。

图3为应用本发明进行核酸提取实施例1的N基因测试结果图。

图4为应用本发明进行核酸提取实施例1的ORF-1ab基因测试结果图。

图5为应用本发明进行核酸提取实施例2的N基因测试结果图。

图6为应用本发明进行核酸提取实施例2的ORF-1ab基因测试结果图。

图7为应用本发明进行核酸提取实施例3的N基因测试结果图。

图8为应用本发明进行核酸提取实施例3的ORF-1ab基因测试结果图。

图9为应用本发明进行核酸提取实施例4高通量混样病毒提取检测结果图。

图10为应用本发明进行核酸提取实施例4的内参基因测试结果图。

图11为应用本发明进行核酸提取实施例5的核酸提取对比结果图。

图12为应用本发明进行核酸提取实施例6的N基因测试结果图。

图13为应用本发明进行核酸提取实施例7的磁珠性状对比图。

图14为应用本发明进行核酸提取实施例7的ORF-1ab基因测试结果图。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明的内容，将结合附图和实施例详细说明。

本发明的一方面提供了一种优选裂解液，通过优化的配方使所述优选裂解液不仅适用于常规单样本提取，同时在进行高通量混样提取的操作中能表现出更佳的效果；进一步地，所述优选裂解液中还添加了聚丙烯酸钠作为静电稳定分散剂，可以有效改善高通量混养提取过程中由于磁珠反复磁分离再分散而造成的团聚现象，使多个裂解孔中的样本均可以得到有效裂解。

本发明的另一方面提供了一种基于多孔裂解的高通量混样病毒核酸提取方法，所述的多孔裂解指每个核酸提取操作单元均包括有多个相互独立的裂解孔，且每个裂解孔均可以加入多个样本，使每次提取操作能够处理的样本数量大幅提高。如图1所示为应用本发明所述方法提供多孔裂解的情况下96孔板上核酸提取操作单元的第一实施例示意图；其中96孔板依照列划分为编号1至12共12列，依照行划分为编号A至H共8行，即可以采用行编号+列编号的组合方式确定96孔板上的任意一个指定孔。在图1所示的第一实施例中，列编号1至6的6列孔组成第一提取组，第一提取组又可以依照行编号A至H分为8个核酸提取操作单元，且每个核酸提取操作单元均包括列1至列4共4个裂解液孔、列5的洗涤液孔和列6的洗脱液孔，同理对于列编号7至12的6列孔也组成了类似的第二提取组，操作过程中第一提取组与第二提取组并列同步操作。所示的96孔板可以选择常用的2.2mL容量96孔标准深孔板，当然也可以根据需要选择其他规格的96孔板。在操作中，需要通过磁珠的依次转移对全部4个裂解液孔中的样本进行裂解提取操作，以第一提取组为例，可以优选的依照以下步骤执行：依照每个核酸提取操作单元加入1mg的磁珠量，使用磁珠对第一列（列编号1）混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第一磁珠混合物；将第一磁珠混合物转移入第二列（列编号2）混有样本的优选裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第二磁珠混合物；将第二磁珠混合物转移入第三列（列编号3）混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到第三磁珠混合物；将第三磁珠混合物转移入第四列（列编号4）混有样本的裂解液孔中进行核酸裂解提取操作，得到附着有核酸的磁珠。进一步地将所得附着有核酸的磁珠进行洗涤、洗脱后即可得到所需的检测用核酸。

当96孔板上每个核酸提取操作单元设置为具有4个裂解液孔时，所能采用的组合排布方式不局限于图1所示实施例1，表1给出了在每单元设置有4个裂解液孔时的优选列划分，其中所在列数的数字编号均表示图1所示的列编号：

表1

由表1可知，图1所示实施例1属于其中组合方式编号25的情况。

在需要额外洗涤的情况下，还可以优选的采用如图2所示的第二实施例排布方式，类似于图1所示第一实施例，第二实施例中也包含有两个互相独立并列同步操作的第一提取组与第二提取组，区别在于每个提取组中包含3列裂解液孔和2列洗涤液孔，因此相较第一实施例能够提供更充分的洗涤效果，特别适用于提出杂质较多的样本。当然对于3列裂解液孔和2列洗涤液孔的排布方式也不局限于图2所示一种，在96孔板上的任意符合操作要求的排布方式都是可用的。上述裂解液孔中既可以选择使用任意现有技术中的裂解液进行操作，也可以使用本发明所述的优选裂解液以实现更佳的核酸提取效果。

为了进一步说明本发明，以下用多个具体实施例说明本发明所述高通量混样提取方法的效果和优势。以下所述各实施例中所涉及裂解液、洗涤液以及洗脱液均不限定具体配方，任何符合质量标准、能够满足提取操作需要的裂解液、洗涤液以及洗脱液均可以被应用到以下所述实施例中，但通过采用本发明所述优选裂解液、洗涤液以及洗脱液能够实现更佳的核酸提取效果，因此若无额外说明，在以下实施例的实际测试结果中均为应用了本发明所述优选裂解液、洗涤液以及洗脱液所得到的实际核酸提取效果展示。

实施例1

1. 在96孔深孔板中按照表1中组合方式编号25的排列分别加入本发明中的裂解液、洗涤液以及洗脱液；

2. 为了进行区别对照，裂解液的加样方式采用分区域的不同加样量，其中A1至D4为第一区域加入700uL裂解液，E1至H4为第二区域加入600uL裂解液，A7至D10为第三区域加入500uL裂解液，E7至H10为第四区域加入400uL裂解液；洗涤液的体积为每孔900 uL，洗脱液体积为每孔50 uL；

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 样本的加样体积对应裂解液，第一区域加入200uL样本，第二区域加入300uL样本，第三区域加入400uL样本，第四区域加入500uL样本；因此无论样品的加样体积为多少，一个提取操作单元含有的总的病毒核酸量固定为30 Copies；

5. 在96孔深孔板的第1~4列，第7~10列中的每个孔中加入20 uL蛋白酶K，所用蛋白酶K的浓度为20 mg/mL；

6. 使用常规的自动化核酸提取仪进行核酸的提取，以上海思路迪生物医学科技有限公司的ANDiS 350为例，设置程序如表2所示：

表2

7. 提取完成后，进行PCR检测。检测结果如图3、4以及表3所示，当采用本发明的优选裂解液时，哪怕优选裂解液被更大体积的样本稀释，本发明对病毒核酸的提取效果也不会降低，这就意味着本发明可以将样本的上样量体积提升到原来的2.5倍，而不影响提取效果，也意味着单孔可以加更多样本而不影响提取效果。

表3

实施例2

1. 在96孔深孔板中按照表1中组合25的方式分别加入裂解液、洗涤液以及洗脱液；

2. 裂解液的体积为每孔400 uL，洗涤液的体积为每孔900 uL，洗脱液体积为每孔50 uL；

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 按照表4所示的方法进行加样；

表4

5. 在96孔深孔板的第1~4列，第7~10列中的每个孔中加入20 uL蛋白酶K，蛋白酶K的浓度为20 mg/mL；

6. 使用常规的自动化核酸提取仪进行核酸的提取，以上海思路迪生物医学科技有限公司的ANDiS 350为例，设置程序如表2所示；

7. 提取完成后，进行PCR检测。检测结果如图5，图6以及表5所示，无论样本在哪一个孔的裂解液中，样本均能被有效的提出来，且当一个提取操作单元中存在多个阳性样本时，混合样本的Ct值明显降低，这表明混合样本中存在多个阳性样本时，这些阳性样本都能被提取出来。这个实验证明了多孔提取可以显著增加样本加入体积（增加4倍），可以再增加4倍的混合样本数量，且不会降低病毒的提取效果；此外还可以证明样本在不同位置的裂解液中提取效果相差不大，均能实现有效的提取。

表5

备注：L1代表在第1列裂解液孔；L2代表在第2列裂解液孔；L3代表在第3列裂解液孔；L4代表在第4列裂解液孔；L1，2，3，4代表在第1，2，3以及第4列裂解液都加入相同量的样本。

实施例3

2. 裂解液的体积为每孔400 uL，洗涤液的体积为每孔900 uL，洗脱液体积依照区域不同采取不同的添加量，其中A6至D6为第一区域每孔加入50 uL，E6至H6为第二区域每孔加入75 uL，A12至D12为第三区域每孔加入100 uL；

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 在第1列和第7列加入500 uL阳性样本；

7. 提取完成后，进行PCR检测。检测结果如图7，图8以及表6所示，用50 uL洗脱液进行洗脱比用100 uL进行洗脱Ct值提前了1个Ct以上，提高了混合提取检测的灵敏度。

表6

实施例4

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 取320个咽拭子，灭活，已知320个咽拭子中有3个含有阳性样本，其余为阴性样本；

5. 在96孔深孔板的第1~4列，第7~10列中的每个孔中加入5个咽拭子样本，1 uL内参，每个样本的体积为100 uL，总体积为500 uL，一块96孔板共加入320个样本；

6. 在96孔深孔板的第1~4列，第7~10列中的每个孔中加入20 uL蛋白酶K，蛋白酶K的浓度为20 mg/mL；

7. 使用常规的自动化核酸提取仪进行核酸的提取，以上海思路迪生物医学科技有限公司的ANDiS 350为例，设置程序如表2所示；

8. 提取完成后，取洗脱液（共16个洗脱液，每个洗脱液含有20个混合样本）进行PCR检测。

9. 检测结果如图9所示，通过本发明的一次提取，3个阳性样本的核酸均成功地从320个样本（16个混合样本，每个混合样本为20个样本的混合）中提取出来，且未发现交叉污染；本发明一个提取反应可以同时对20个样本混合成的混合样本进行有效的提取操作。从图10以及表7可知，本发明对于混合样本的提取效果很稳定，样本中内参的CV<1%。

表7

实施例5

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 取60个阴性咽拭子，灭活；

5. 在96孔深孔板的A1~A3，B1~B3，C1~C3孔中各加入5个咽拭子样本，每个样本的体积为100 uL，总体积为500 uL；在A4，B4，C4孔中各加入4个咽拭子样本，每个样本的体积为100 uL；在A4，B4，C4孔中各加入1个已知浓度的相同的阳性样本，每个样本的体积为100uL。

8. 取相同的阳性样本，按照达安的提取程序加入单个200 uL的阳性样本，进行病毒核酸的提取。

9. 提取完成后，进行PCR检测。

10. 检测结果如图11以及表8所示，本发明从20个混合样本中对1个阳性样本的提取成功，且提取效果好于达安的提取试剂对该单一阳性样本的提取效果。

表8

实施例6

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 在96孔板的A1，B2，C3，D4孔中的裂解液中分别加入500uL阳性样本；其他裂解液孔加入阴性样本；

7. 取相同的阳性样本，以现有技术单样本提取方案（例如申请号201810867325.8，名称为“一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法”的专利申请所公开的提取方法）进行病毒核酸的提取，其中加入的样本为相同的阳性样本，加入量同样为500uL，进行4个重复。

8. 提取完成后，进行PCR检测。

9.检测结果如图12以及表9所示，结合实施例1，本发明将上样量提升到500uL后仍然具有很好的提取效果，与对比专利进行对比，N基因的Ct值提前了2.5，也就是说在500uL上样量的情况下，本发明的提取效果可以达到对比发明的5.7倍左右。本发明对大体积样本的提取效果有显著的优势。结合实施例1，本发明可以对增加样本的加入量而不影响提取效果，对于混合样本的提取检测具有重大意义。

表9

实施例7

3. 在洗涤液中加入1 mg羟基磁珠；

4. 在96孔板上的A1，B1，C1，D1；E2，F2，G2，H2；A9，B8，C9，D9；E10，F10，G10，H10孔中的裂解液中分别加入500uL阳性样本；其他裂解液孔加入阴性样本；

7.按照现有技术所提供的方案配置裂解液，漂洗液以及洗脱夜（例如申请号201810867325.8，名称为“一种病毒核酸提取试剂盒及提取方法”的专利申请所公开的方法），在96孔板的第1，2，3，7，8，9列加入裂解液，在96孔板的第4，10列加入漂洗液1；在96孔板的第5，11列加入漂洗液2；在96孔板的第6，12列加入洗脱液。

8. 在对比发明的A1，B1，C1，D1；E2，F2，G2，H2；A9，B8，C9，D9孔中的裂解液中分别加入500uL相同的阳性样本、蛋白酶K和磁珠进行病毒核酸的提取操作。

9. 提取完成后，进行PCR检测。

10.如图13所示，经过多孔提取后本发明的磁珠没有发生明显的团聚现象，但是对比专利的磁珠发生了明显的团聚；检测结果如图14以及表10所示，本发明多孔提取的效率会比对比专利的配方好很多，Ct值大概减小了6，也就是说相对与对比专利的配方，本专利多孔裂解的提取效果提高较大（提取效果可提升高达64倍），且对于不同孔中的样本提取效果波动不大，确保了任一裂解孔中的样本均能进行有效地提取。

表10

以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换等都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims

1.一种高通量混样裂解病毒核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S3、使用磁珠对含有裂解液、样本以及蛋白酶K的混合液进行核酸提取操作得到检测用核酸；所述步骤S3包括以下分步骤：

S31、将96孔板上12列孔分为两个并列同步操作的提取组，每个提取组各包括一列洗涤液、一列洗脱液和四列混有样本的裂解液，即每个提取组均包括有8个具备4个裂解液孔的核酸提取操作单元；或，将96孔板上12列孔分为两个并列同步操作的提取组，每个提取组各包括两列洗涤液、一列洗脱液和三列混有样本的裂解液，即每个提取组均包括有8个具备3个裂解液孔的核酸提取操作单元；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中每个含有裂解液的孔中样本总量与裂解液的加入量体积之比为2:7至5:4。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液的加入量为每孔200至1000uL，洗脱液的每孔加入量与含裂解液的孔中样本总量体积之比为1:20至1:1。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠为羟基磁珠。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2包括在每个含有裂解液的孔中加入1~5个样本。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述5个样本中每个样本加入量为50~200uL。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述洗涤液包括体积分数为60~85%的乙醇和终摩尔浓度1~4 mmoL/L的Tris；所述洗脱液包括终摩尔浓度0.5~2 mmol/的Tris-HCl和终摩尔浓度0.01~0.5 mmol/L的EDTA，所述Tris-HCl的pH值为7.5~8.5，EDTA的pH值为7.5~8.5。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗涤液包括体积分数为80%的乙醇和终摩尔浓度2 mmoL/L的Tris；所述洗脱液包括终摩尔浓度1 mmol/L的Tris-HCl和终摩尔浓度0.2 mmol/L的EDTA，所述Tris-HCl的pH值为8.0，EDTA的pH值为8.0。

9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，当每个提取组均包括有8个具备4个裂解液孔的核酸提取操作单元时，所述分步骤S32包括以下子步骤：

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸裂解提取操作所用裂解时间为3至8分钟。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，当每个提取组均包括有8个具备4个裂解液孔的核酸提取操作单元时，分步骤S33中所述混匀洗涤包括在室温条件下洗涤1至5分钟，所述晾干包括室温条件下晾干2分钟；分步骤S34中所述洗脱操作包括在50至80℃条件下洗脱1至5分钟。

12.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，当每个提取组均包括有8个具备3个裂解液孔的核酸提取操作单元时，分步骤S33中所述混匀洗涤包括依次进行两次在室温条件下洗涤1至5分钟的操作。

13.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤S3包括将磁珠预先混入洗涤液所在孔中，或，将磁珠预先混入部分裂解液所在孔中，或，将磁珠预先混入全部裂解液所在孔中，或，将磁珠随样本一并加入裂解液所在孔中。

14.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述裂解液为优选裂解液，所述优选裂解液包括终摩尔浓度3 mol/L~5 mol/L的胍盐、体积分数为25%~45%的乙醇、体积分数为1%~3%的聚多卡醇、终摩尔浓度为20~80 mmol/L的柠檬酸三钠、终摩尔浓度为0.5~2 mM的二硫苏糖醇、体积分数为0.5%的N-月桂酰肌氨酸以及质量分数为50~300ug/mL的糖原。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述优选裂解液还包括体积分数为0.1%~2%的聚丙烯酸钠。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述优选裂解液包括终摩尔浓度4.1 mol/L的胍盐、体积分数为36%的乙醇、体积分数为1%~3%的聚多卡醇、终摩尔浓度为20~80 mmol/L的柠檬酸三钠、终摩尔浓度为0.5~2 mM的二硫苏糖醇、体积分数为0.5%的N-月桂酰肌氨酸以及质量体积分数为50~300ug/mL的糖原和体积分数为1%的聚丙烯酸钠。

17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述胍盐包括异硫氰酸胍、硫氰酸胍或盐酸胍。