CN111944802A - 真菌核酸提取裂解液及提取核酸的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真菌核酸提取裂解液，以达到简单快速提取样品中真菌核酸的目的。具体的，本发明提供一种真菌核酸提取裂解液，包括以下组分和用量：1～5mM的氢氧化钠；40‑70mM的Tris‑HCl；200‑400mM异硫氰酸胍；150～300mM NaCl；30～80mM十二烷基硫酸钠；pH调节剂及溶剂；所述pH调节剂调节所述裂解液的pH为7～8。本发明的细胞裂解液成分极其简单，但是DNA提取效果能达到一般试剂盒的水平，使得DNA提取的成本大幅降低。本发明细胞裂解方法操作快速简便，提取时间短，重复性强。且本发明的裂解液可以简单快速的提取真菌的核酸，减少污染，具有省时、省力的优势，在微生物检验领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种真菌核酸提取裂解液、制备方法及应用。
背景技术
核酸提取方法包括传统的苯酚-氯仿法、盐析法、滤膜离心柱法等。传统的核酸提取法各有其优缺点，但提取效果欠佳。当前主流的核酸提取方法有硅胶膜吸附柱法、抗DNA单克隆抗体的免疫亲和法、自动化平台广泛应用的磁珠法核酸提取方法等等。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸提取是指利用物理、化学等方法将核酸从样品中分离出来的过程。分离得到高质量的核酸是分子生物学研究的关键步骤。目前，主要采用核酸提取试剂盒进行核酸提取。然而，传统的核酸提取试剂盒提取的核酸质量较差，不能满足实际需求。
近几年来，细菌或是真菌的变异快，品种多，用普通的培养以及药敏已经很难完全准确的鉴定出其型别。所以核酸检测成为目前能够精确判断型别的可靠便利手段，核酸检测的前提条件是提取足够且质量可以的DNA或RNA，而对于这个要求的前提条件是细菌和真菌的细胞壁需要充分破裂，使得核酸充分释放出来，从而有利于进一步实验。
苯酚-氯仿方法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配。酚-氯仿方法经典、便宜，用的都是实验室常用试剂，提纯效率和纯度都很高，但缺点是费时费力，苯酚和氯仿还有一定毒性。
另外，目前市场上的DNA提取试剂盒原理是在特定溶液环境下(高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质(一般是硅胶膜)上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中。这些DNA提取试剂盒价格高，成分比较复杂，且步骤多，而且不能在第一步通过煮沸使细菌灭活，增加了感染的危险性。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种真菌核酸提取裂解液，以达到简单快速提取样品中真菌核酸的目的。
具体的，本发明提供一种真菌核酸提取裂解液，包括以下组分和用量：
1～5mM的氢氧化钠；
40-70mM的Tris-HCl；
200-400mM异硫氰酸胍；
150～300mM NaCl；
30～80mM十二烷基硫酸钠；
pH调节剂及溶剂；所述pH调节剂调节所述裂解液的pH为7～8。
进一步的，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液。
一步的，所述溶剂为水。
进一步的，所述NaCl的浓度为200～250mM。
进一步的，所述异硫氰酸胍的浓度为250～350mM。
本发明还提供一种微生物病原体裂解试剂盒，所述试剂盒包括：上述所述的裂解液；以及至少一个容纳所述裂解液的容器。
本发明还提供一种真菌快速裂解提取核酸的方法，所述方法包括步骤：
S1：将真菌菌丝加入上述的裂解液中，在40～70℃下水浴加热5～10min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用70％～75％的乙醇洗涤后干燥。
进一步的，所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1。
进一步的，所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
进一步的，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
本发明的优选裂解液配方为：
3mM的氢氧化钠；
55mM的Tris-HCl；
300mM异硫氰酸胍；
200mM NaCl；
50mM十二烷基硫酸钠；
磷酸盐缓冲液及水；
磷酸盐缓冲液调节所述裂解液的pH为7。
本发明的另一优选裂解液配方为：
2mM的氢氧化钠；
40mM的Tris-HCl；
250mM异硫氰酸胍；
250mM NaCl；
60mM十二烷基硫酸钠；
磷酸盐缓冲液及水；
磷酸盐缓冲液调节所述裂解液的pH为7。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明的细胞裂解液成分极其简单，但是DNA提取效果能达到一般试剂盒的水平，使得DNA提取的成本大幅降低。(2)细胞裂解方法操作快速简便，提取时间短，重复性强。(3)本发明的裂解液可以简单快速的提取真菌的核酸，减少污染，具有省时、省力的优势，在微生物检验领域具有广泛的应用前景。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以人体唾液为生物样本进行真菌核酸提取和检测。
1、裂解液的制备：按原料组分配比配制6份裂解液，如下表所示：
表1裂解液1～6组分表
核酸提取：S1：将唾液样本加入上表配制得到的所述的裂解液中，在60℃下水浴加热10min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用75％的乙醇洗涤后干燥，即得。
所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1；所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
4、核酸检测：分别对6份已提取好的唾液样本进行核酸浓度检测，具体检测方法采用现有技术核酸浓度检测试剂盒；检测结果如下表2所示；根据以上检测发现：本发明的裂解液核酸提取纯度在1.70-1.90之间，蛋白和盐离子的含量最少，所以用这个方法提取核酸，纯度和含量都与成品试剂盒提取到的核酸纯度一样，完全可以进行进一步的实验。
表2唾液样本1～6核酸浓度检测
| 样本序号 | 核酸浓度 | 单位 | OD260/280 |
| 1 | 120.12 | ng/μl | 1.87 |
| 2 | 84.39 | ng/μl | 1.82 |
| 3 | 57.22 | ng/μl | 1.78 |
| 4 | 69.00 | ng/μl | 1.76 |
| 5 | 110.41 | ng/μl | 1.82 |
| 6 | 98.78 | ng/μl | 1.79 |
实施例2
以粪便作为生物样本进行核酸提取及检测。
1、样本处理及核酸提取：取6份粪便样本；S1：将粪便样本加入实施例1中配制得到的6份所述的裂解液中，在70℃下水浴加热5min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用70％的乙醇洗涤后干燥，即得。
所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1；所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
4、核酸检测：分别对6份已提取好的唾液样本进行核酸浓度检测，，具体检测方法采用现有技术核酸浓度检测试剂盒；检测结果如下表3所示；根据以上检测发现：本发明的核酸提取液核酸提取纯度在1.70-1.90之间，蛋白和盐离子的含量最少，所以用这个方法提取核酸，纯度和含量都与成品试剂盒提取到的核酸纯度一样，完全可以进行进一步的实验。
表3粪便样本1～6核酸浓度检测
| 样本序号 | 核酸浓度 | 单位 | OD260/280 |
| 1 | 50.54 | ng/μl | 1.85 |
| 2 | 28.09 | ng/μl | 1.78 |
| 3 | 44.45 | ng/μl | 1.82 |
| 4 | 36.50 | ng/μl | 1.74 |
| 5 | 79.27 | ng/μl | 1.80 |
| 6 | 100.01 | ng/μl | 1.81 |
| 7 | 55.46 | ng/μl | 1.72 |
实施例3
以鼻腔拭子作为生物样本进行核酸提取及检测。
1、样本处理及核酸提取：取6份鼻腔拭子样本，S1：将粪便样本加入实施例1中配制得到的6份所述的裂解液中，在40℃下水浴加热10min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用75％的乙醇洗涤后干燥，即得。
所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1；所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
4、核酸检测：分别对6份已提取好的唾液样本进行核酸浓度检测，，具体检测方法采用现有技术核酸浓度检测试剂盒；检测结果如下表4所示；根据以上检测发现：本发明的核酸提取液核酸提取纯度在1.70-1.90之间，蛋白和盐离子的含量最少，所以用这个方法提取核酸，纯度和含量都与成品试剂盒提取到的核酸纯度一样，完全可以进行进一步的实验。
表4鼻腔拭子样本1～7核酸浓度检测
| 样本序号 | 核酸浓度 | 单位 | OD260/280 |
| 1 | 46.73 | ng/μl | 1.79 |
| 2 | 52.11 | ng/μl | 1.85 |
| 3 | 105.17 | ng/μl | 1.78 |
| 4 | 98.14 | ng/μl | 1.80 |
| 5 | 29.78 | ng/μl | 1.83 |
| 6 | 89.50 | ng/μl | 1.88 |
对比例1
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，未添加氢氧化钠，以等量的溶剂水替代，制得对比例裂解液1。
对比例2
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，未添加Tris-HCl，以等量的溶剂水替代，制得对比例裂解液2。
对比例3
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，未添加异硫氰酸胍，以等量的溶剂水替代，制得对比例裂解液3。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，未添加NaCl，以等量的溶剂水替代，制得对比例裂解液4。
对比例5
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，未添加十二烷基硫酸钠，以等量的溶剂水替代，制得对比例裂解液5。
对比例6
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，添加pH调节剂调节pH为4，制得对比例裂解液6。
对比例7
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例的真菌核酸提取裂解液中，添加pH调节剂调节pH为9，制得对比例裂解液7。
针对以上对比例1～7中得到的裂解液进行核酸提取实验，并测定最终的核酸浓度。
1、核酸提取：S1：将唾液样本加入对比例1～7配制得到的所述的对比例裂解液1～7中，在60℃下水浴加热10min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用75％的乙醇洗涤后干燥，即得。
所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1；所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
3、核酸检测：分别对以上7份已提取好的粪便样本进行核酸浓度检测，检测结果如下表5所示；具体检测结果如下。说明发明人从众多化学成分中筛选出来的各组分对本发明核酸提取率影响较大，各组分相辅相成不可或缺，具有较高的实用价值。
表5对比例1～7中裂解液的核酸提取效率考察
| 对比例 | 样本序号 | 核酸浓度 | 单位 | OD260/280 |
| 对比例1 | 1 | 78.56 | ng/μl | 1.48 |
| 对比例2 | 2 | 46.74 | ng/μl | 1.24 |
| 对比例3 | 3 | 38.35 | ng/μl | 0.59 |
| 对比例4 | 4 | 79.47 | ng/μl | 1.09 |
| 对比例5 | 5 | 60.17 | ng/μl | 0.79 |
| 对比例6 | 6 | 58.60 | ng/μl | 1.62 |
| 对比例7 | 7 | 32.72 | ng/μl | 1.59 |
对比例8
本对比例与实施例1的不同之处在于，本对比例核酸提取：S1：将唾液样本加入实施例1～6配制得到的所述的裂解液1～6中，在60℃下水浴加热10min后离心，得上清液；S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；S4：将DNA沉淀用75％的乙醇洗涤后干燥，即得。
所述的步骤S2中萃取剂为正丁醇；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1；所述的步骤S3中DNA沉淀剂为甲醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
3、核酸检测：分别对以上7份已提取好的粪便样本进行核酸浓度检测，检测结果如下表5所示；具体检测结果如下。
| 样本序号 | 核酸浓度 | 单位 | OD260/280 |
| 1 | 12.11 | ng/μl | 0.22 |
| 2 | 20.05 | ng/μl | 0.45 |
| 3 | 15.08 | ng/μl | 0.53 |
| 4 | 17.54 | ng/μl | 0.41 |
| 5 | 33.32 | ng/μl | 0.40 |
| 6 | 20.08 | ng/μl | 0.43 |
对比实施例1，进一步说明实施例1中的核酸提取方法提取率高，纯度高，稳定性好，适于推广应用。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.真菌核酸提取裂解液，其特征在于，包括以下组分和用量：
1～5mM的氢氧化钠；
40-70mM的Tris-HCl；
200-400mM异硫氰酸胍；
150～300mM NaCl；
30～80mM十二烷基硫酸钠；
pH调节剂及溶剂；
所述pH调节剂调节所述裂解液的pH为7～8。
2.根据权利要求1所述的真菌核酸提取裂解液，其特征在于，所述pH调节剂为磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求1所述的真菌核酸提取裂解液，其特征在于，所述溶剂为水。
4.根据权利要求1所述的真菌核酸提取裂解液，其特征在于，所述NaCl的浓度为200～250mM。
5.根据权利要求1所述的真菌核酸提取裂解液，其特征在于，所述异硫氰酸胍的浓度为250～350mM。
6.一种微生物病原体裂解试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
如权利要求1～5任一项所述的裂解液；
至少一个容纳所述裂解液的容器。
7.一种真菌快速裂解提取核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
S1：将真菌菌丝加入权利要求1～5任一项所述的裂解液中，在40～70℃下水浴加热5～10min后离心，得上清液；
S2：将萃取剂加入所述步骤S1的上清液中抽提DNA，再次离心；
S3：将DNA沉淀剂加入步骤S2离心所得的上清液中混合均匀，静置后离心沉淀DNA；
S4：将DNA沉淀用70％～75％的乙醇洗涤后干燥。
8.根据权利要去7所述的真菌快速裂解提取核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S2中萃取剂为氯仿和异丙醇的混合溶剂；所述步骤S2中所述萃取剂与步骤S1所述上清液体积比为1∶1。
9.根据权利要去7所述的真菌快速裂解提取核酸的方法，其特征在于，所述的步骤S3中DNA沉淀剂为无水乙醇；所述步骤S3中DNA沉淀剂加入步骤S2所述的上清液体积比为1∶1。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样品选自：菌液、全血、血清、血浆、尿液、唾液、咽拭子、粪便，或其组合。
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|---|---|---|---|---|
| CN114180218A (zh) * | 2021-11-14 | 2022-03-15 | 广州源古纪科技有限公司 | 传染病研究用的病理诊断中痰液样本保存设备 |
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- 2020-08-23 CN CN202010853447.9A patent/CN111944802A/zh active Pending
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