CN113308459A - 一种磁珠法全血核酸提取裂解液、试剂盒及提取方法 - Google Patents

一种磁珠法全血核酸提取裂解液、试剂盒及提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磁珠法全血核酸裂解液，包括高浓度无机盐离子和高离序盐；所述裂解液pH为7以下。由高浓度无机盐配合高离序盐使用，在酸性缓冲条件下更好的实现磁珠悬浮在裂解液中，以达到裂解充分、快速的目的。

Description

一种磁珠法全血核酸提取裂解液、试剂盒及提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于磁珠法的全血核酸裂解液、试剂盒及应用，可应用于人全血DNA提取。本发明还涉及应用该试剂盒从全血样本中提取DNA的方法。
背景技术：
随着分子生物学技术的发展，基因组水平上的研究已成为热点。在分子遗传学和分子流行病学中，无论是全基因组关联分析(GWAS)、候选SNP位点基因分型，还是基因组文库的建立，都需要从大批量血液样本中提取基因组DNA。所抽提得到的DNA浓度、纯度和一级结构的完整性都会影响到后续的研究，因此高效、可靠的高通量DNA提取方法是分子遗传学基础研究迫切需要的。
传统的核酸抽提方法包括酚-氯仿法、盐析法、滤膜离心柱法等。这些方法各有优缺点，但都只适合用于人工提取，不适用于自动化操作。与传统的核酸纯化方法相比,以磁性复合微球为载体的核酸提取方法由于其利用磁性硅胶对DNA的特异性吸附，在磁场作用下分离并获取DNA，所以使其具有无需离心，避免交叉污染，结果重复性好、稳定性高、操作简单,适合于自动化操作等优点而成为一种非常有前景的提取方法。
磁珠法能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA，可应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。但因为其提取效率不佳，纯度较低，提取时间长，成本高等问题，磁珠法核酸提取的应用受到一定的限制。因此，为了解决上述问题，本发明提出一种新的核酸提取裂解液。
核酸裂解是核酸提取中最初且最重要的一步，而其效果取决于裂解液的作用，性能优良的裂解液，不仅需要做到快速高效的裂解细胞，还需要使磁珠更好的分散在溶液中，实现更低磁珠用量达到更高核酸提取效率的目的，在降低成本的同时保证所提核酸的数量和质量。
发明内容:
技术问题：本发明的目的是提供一种基于磁珠法的全血核酸裂解液、试剂盒及应用，具体是裂解液提供一种高盐低PH的环境，快速裂解细胞、提高磁珠分散性，利用更少量的磁珠，实现对核酸的高效提取。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下
一种磁珠法全血核酸提取裂解液，其特征在于，所述裂解液包括高浓度无机盐离子和高离序盐，所述裂解液pH为7以下。
可选地，所述无机盐离子的浓度为1～4mol/L优选1.5～4mol/L。
优选地，所述高离序盐的浓度为2～6mol/L。
优选地，所述pH为5-7。
优选地，上述裂解液中的无机盐离子选自氯化钾，醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种；高离序盐选自高离序盐选自盐酸胍、LiCl、硫氰酸胍、硫氰酸钾或NaClO4中的一种或多种。
优选地，所述的裂解液，还包括缓冲液，作为优选，包括但不限于HEPES、Tricine、醋酸钠-醋酸或Tris-HCl的缓冲液。
优选地，所示裂解液还包括表面活性剂，作为优选，包括但不限于TRITON X-100、NP-40、tween 20、tween 80、SDS或月桂醇聚醚(更优选月桂醇聚醚-21)中的一种或多种。
可选地，所述缓冲液浓度为20～180mmol/L，所述表面活性剂浓度为25～150g/L。
本发明的另一个目的还在于提供一种含有所述裂解液的试剂盒。
所述试剂盒还包含洗涤液、洗脱液、磁珠悬液和蛋白酶K。
作为优选，磁珠选用超顺磁性氧化硅纳米微球。
优选地，所述洗脱液，含有5～100mmol/L的缓冲液，1～50mmol/L的无机盐离子。
优选地，所述洗涤液含有20～180mmol/L的缓冲液，20～1000mmol/L的无机盐离子，20％～80％(体积百分数)的沉淀剂；
优选地，所述洗脱液和洗涤液中的缓冲液选自HEPES、Tricine或醋酸钠-醋酸缓冲液；所述沉淀剂选自异丙醇或PEG6000；所述无机盐离子选自氯化钾，醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种。
一种磁珠法全血核酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)混合裂解液、样本、蛋白酶K和磁珠溶液，进行裂解提取；
(2)用洗涤液洗涤，吸磁，去上清液；
(3)加洗脱液进行洗脱。
本发明的有益效果：(1)提取效率高：高离序盐、高浓度无机盐和酸性pH配合进行核酸提取。可以使磁珠均一稳定的分散在裂解液中，达到充分高效裂解细胞的目的。(2)本发明裂解液不使用乙醇，异丙醇，可以避免醇类对盐类物质的稀释作用而导致核酸提取效果下降的问题。(3)产物纯度高、提取过程中使用裂解液对磁珠具有很好的分散性，有利于磁珠快速高效吸附释放出来的核酸。(4)本发明裂解过程实现常温裂解，无需再加热来促进样本的裂解。(5)本发明匹配自动化提取仪器，裂解时间为5-10min,提取32例样本的时间约为20min，极大提高了操作便利性。(6)本发明提取的全血样本中的核酸可应用于下游PCR、测序、杂交等，产物纯度高，对结果无干扰。
具体实施方式
为了使本发明的目的，技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
制备例1-8核酸裂解液的制备
制备例1-8为核酸裂解液的实施方案的筛选，通过不同组分及条件的配合，考察核酸裂解液与磁珠溶液的混合后对磁珠分散性的影响。
制备例1-8通用的制备方法为：1)将一定量的缓冲液(Tris-HCl)，无机盐(醋酸钠)，高离序盐(盐酸胍)，表面活性剂(阴离子表面活性剂月桂醇聚醚-21)混合，调节pH值。2)将裂解液与磁珠溶液按比例混合(磁珠为超顺纳米磁微粒，裂解液与磁珠混合比例优选为作为优选体积比为200～250：1～10，更优选体积比为250:3)。
表1核酸裂解液组分
Figure BDA0002392696280000031
磁珠具有一定的流动性，能够分散在液体中，跟随液相进入实验体系，但分散的均一性和稳定性会受到溶液的影响，合适的溶液可以使磁珠均一的分散其中，不发生沉降，从而保证核酸裂解过程更为彻底。对混合后的裂解液与磁珠溶液进行稳定性测定，效果如表2所示。
表2稳定性分析
制备例 Zeta电位(mV) 半沉降时间(min)
1 -48.73 33
2 -44.63 30
3 -28.52 20
4 5.41 8
5 -34.26 23
6 -30.43 21
7 -19.37 15
8 -21.64 17
通过对混合液的稳定性考察意外制备例1的zeta电位的绝对值最高，且沉降时间最长。推测可能是制备例1特定的高离序盐、高无机盐和低pH的条件使磁珠颗粒之间相互作用，形成相对稳定的悬浮体系。为进一步验证该推测，在保持pH＝6的情况下，对各组分的用量和种类进行进一步考察，结果如表3所示。
表3裂解液稳定性研究
Figure BDA0002392696280000041
通过表3可知，种类可换，更换缓冲液，无机盐离子，高离序盐，对稳定性指标影响不大，更换表面活性剂会有一定影响，不过影响不大，月桂醇聚醚-21效果最好。
在酸性条件下，更改无机盐和高离序盐浓度，对稳定性影响很大，无机盐离子和高离序盐浓度较大，稳定性较好，太低稳定性会受到明显影响，过大并不会使稳定性有明显增加，只会浪费用量，且会导致核酸提取过程中的成分析出，不利于核酸提取。
实施例1-23
一种血液检测试剂盒，包含制备例1-23裂解液，洗涤液I，洗涤液II，洗脱液，蛋白酶K和磁珠悬液,所述洗涤液I，洗涤液II，洗脱液，蛋白酶K和磁珠悬液为常规配方，可以使用市面上在售试剂盒中的组分，优选为以下组分：
洗涤液I组分如下：
TRIS缓冲液50mmol/L
醋酸钠80mmol/L
无水乙醇30％(体积比)
其溶剂为纯化水
洗涤液II组分如下：
TRIS缓冲液50mmol/L
醋酸钠35mmol/L
无水乙醇30％(体积比)
其溶剂为纯化水
洗脱液组分如下：
TRIS缓冲液9mmol/L
乙二胺四乙酸二钠2mmol/L
其溶剂为纯化水
核酸提取步骤如下：
(1)预处理：按裂解液:蛋白酶K：磁珠溶液＝500:20:6(μL)混合溶液，
(2)裂解：将上述溶液与血液样本混合并震荡5min
(3)洗涤：吸磁10s，去除上清液；
(4)加入洗涤液I，吸磁10s，去除上清液；
(5)加入700μL洗涤液II，吸磁10s，去除上清液
(6)洗脱：吸磁10s，去除上清液；
(7)加入洗脱液，震荡混匀5s；
(8)80℃加热洗脱6min，吸磁10s，上清为核酸裂解液，取上清备用。
核酸提取结果如表4所示
表4提取效果
制备例 提取浓度 OD260/280 OD260/230
1 172.05 1.91 1.96
2 166.72 1.91 2.22
3 108.072 1.83 2.06
4 69.832 1.83 2.01
5 131.246 1.82 2.26
6 126.679 1.83 2.29
7 68.104 1.81 1.91
8 70.336 1.81 2.12
9 184.895 1.8 2.14
10 171.569 1.82 1.82
11 149.203 1.84 2.27
12 137.969 1.83 2.2
13 111.406 1.81 2.22
14 209.617 1.84 2.12
15 9.16 1.94 1.29
16 125.679 1.79 2.02
17 16.195 1.61 1.68
18 166.72 1.91 2.22
19 60.235 1.98 1.87
20 45.595 1.55 1.75
21 187.215 1.81 2.02
22 175.715 1.86 2.08
23 138.253 1.84 2.01
上述结果表明，酸性、高无机盐、高离序盐的裂解液，能够让磁珠更好的悬浮分散其中，使裂解更加充分，获得更高的提取浓度和纯度。但盐浓度不能过高，盐浓度过大，会导致样本中的杂质大量析出，不能溶解到裂解液中，这部分杂质会黏附在磁珠上，会导致提取效率降低，也会导致提取产物中，有其他杂质的干扰，产物的纯度不高。
综上，最佳的无机盐浓度取值为1.5～4mol/L，高离序盐取值为2-6mol/L。

Claims (10)

1.一种磁珠法全血核酸提取裂解液，其特征在于，所述裂解液包括高浓度无机盐离子和高离序盐；所述裂解液pH为7以下。
2.根据权利要求1所述的裂解液，其特征在于，所述无机盐离子的浓度为1～4mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的裂解液，其特征在于，所述高离序盐的浓度为2～6mol/L。
4.根据权利要求1-3中任意权利要求所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液pH为5-7。
5.根据权利要求1-4中任意权利要求所述的裂解液，其特征在于，所述无机盐离子选自氯化钾、醋酸钠或柠檬酸钠中的一种或多种。
6.根据权利要求1-5中任意权利要求所述的裂解液，其特征在于，所述高离序盐选自盐酸胍、LiCl、硫氰酸胍、硫氰酸钾或NaClO4中的一种或多种。
7.根据权利要求1-6中任意权利要求所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括缓冲液，所述缓冲液选自HEPES、Tricine、醋酸钠-醋酸或Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求1-7中所述的裂解液，其特征在于，所述裂解液还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自TRITON X-100、NP-40、tween20、tween 80、SDS或月桂醇聚醚的表面活性剂中的一种或多种。
9.一种含有权利要求1-8任意权利要求所述裂解液的试剂盒.。
10.一种磁珠法全血核酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)混合如权利要求1-8任意权利要求所述裂解液、样本、蛋白酶K和磁珠溶液，进行裂解提取；
(2)用洗涤液洗涤，吸磁，去上清液；
(3)加洗脱液进行洗脱。
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