CN114107289A - 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法，涉及生物技术领域，试剂盒包括：蛋白酶K、初裂解缓冲液和裂解结合缓冲液；蛋白酶K的浓度范围10‑30mg/mL；初裂解缓冲液包含：pH6.0‑8.550‑200mM Tris‑HCl，0.5‑30％(w/v)SDS，1‑10mM EDTA，pH8.0‑9.0；裂解结合缓冲液包含：50‑200mM Tris‑HCl，1‑15M盐酸胍，1‑10mM EDTA，0.1‑5％TritonX‑100，0.1‑5％Tween‑20，pH7.0‑8.0。试剂盒提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，解决粪便样本提取的DNA保存时间短的问题。

Description

粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法。
背景技术
粪便样本或肠道内容物样本是肠道疾病研究和肠道临床检测的重要样本来源。粪便或肠道内容物中含有大量宿主消化道脱落细胞及游离的核酸，这些脱落细胞中常含有癌变信号，粪便或肠道内容物中脱落细胞及游离核酸的检测由于无创、无痛、且检测特异性高等特征，常用于结直肠癌等消化道疾病的初筛普查，能更好地达到″早发现、早诊断、早治疗″的目的，是最有效最节约成本的降低肠癌(结直肠癌)发病率和死亡率的方法。肠道微生物研究的主要样本也是粪便样本或肠道内容物样本，可以反应人体肠道内微生物的共生状态。
但是，粪便样本成分复杂，样本中食物残渣等杂质较多，并且含有大量蛋白酶、核酸酶及胆盐、胆红素、腐殖质和色素等各种PCR抑制剂，大多数常规分离提纯核酸技术并不能有效地去除抑制剂等物质，因此通过常规方法分离提纯的粪便样本核酸浓度和质量低下，易降解，保存时间短，并且检测抑制剂常常随着DNA分离提纯一起被分离和浓缩，对后续核酸检测造成不利影响，往往造成PCR扩增实验的失败。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法，试剂盒操作简便，能配合自动核酸提取设备使用，提取纯化的DNA核酸得率高、纯度好，不含核酸酶及PCR抑制剂，有效解决粪便样本提取的DNA保存时间短的问题，有利于DNA核酸的保存和后续PCR检测。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种粪便样本DNA核酸提取试剂盒，试剂盒主要包括以下组分：蛋白酶K、初裂解缓冲液、裂解结合缓冲液、磁珠悬浮液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱缓冲液。
[蛋白酶K]
蛋白酶K是切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K可以降解蛋白质，灭活DNase和RNase等核酸酶。蛋白酶K在pH 4-12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37-60℃，在盐浓度3M盐酸胍或4M尿素中均有活性，在Tween20(5％)和SDS(1％)去污剂存在的条件下也有活性。
蛋白酶K的浓度范围为10-30mg/mL，例如10、15、20、25、30mg/mL。
在一种优选的实施方式中，蛋白酶K的浓度范围为20mg/mL。
[初裂解缓冲液]
初裂解缓冲液包括：离子缓冲物质50-200mM(例如50、100、150、200mM)Tris-HCl(pH6.0-8.5)，表面活性剂0.5％-30％(例如0.5、1、2、5、10、15、20、25、30％)(w/v)SDS、金属离子螯合剂1-10mM(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM)EDTA，以及余量的水，初裂解缓冲液的pH为8.0-9.0。
在一种优选的实施方式中，初裂解缓冲液中的成分含量为：100mM Tris-HCl，10％(w/v)SDS，8mM EDTA，初裂解缓冲液的pH为8.5。
本发明提供的初裂解缓冲液在裂解粪便样本时，能保证样本中的所有细胞迅速裂解，核酸与核酸结合蛋白分离，释放核酸。
具体原理如下：
Tris-HCl：可以提供pH6.0-9.0稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与磁珠带电状态，利于氢键的保持，对DNA碱基起保护作用，不易破坏其完整性或产生断裂。
十二烷基硫酸钠(SDS)：阴离子去垢剂，高温(55-65℃)条件下能够破坏蛋白质和核酸之间静电引力或配位键，使染色体解析，蛋白变性，形成SDS/蛋白质/多糖复合物，释放核酸，操作简单，温和，可提取到高分子量的DNA。
乙二胺四乙酸(EDTA)：EDTA是一种二价离子螯合剂，能够螯合Mg2+、Ca2+或Mn2+等二价阳离子，抑制金属依赖性的酶如DNase和RNase的活性，能够抑制核酸酶对裂解后游离暴露出来核酸的降解，从而减少提取过程中游离核酸的损失。
[裂解-结合缓冲液]
裂解-结合缓冲液，包括：50-200mM(例如50、100、150、200mM)Tris-HCl，1-15M(例如1、2、5、8、10、12、15M)盐酸胍，1-10mM(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM)EDTA，0.1-5％(例如0.1、1、2、3、4、5％)TritonX-100，0.1-5％(例如0.1、1、2、3、4、5％)Tween-20，其pH为7-8。
在一种优选的实施方式中，裂解-结合缓冲液中的成分含量为：50mM Tris-HCl(pH6.0-8.0)，10M盐酸胍，4mM EDTA，1％TritonX-100，3％Tween-20，其pH为7.5。
具体原理如下：
盐酸胍：作为蛋白变性剂可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，与EDTA协同作用防止提取过程中核酸被核酸酶降解。
TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)是一种比较温和的非离子型去污剂，可以溶解细胞膜上的脂质，用Triton X-100来裂解细胞时，0.1％Triton X-100就足够了，不过，达到0.5％时也没问题。蛋白酶K在含1％Triton X-100的溶液中依然保持活性。
Tween-20(吐温)为非离子型表面活性剂，广泛用作乳化剂和油类物质的增溶剂，在生物学实验中乳化蛋白，和同类型的Triton X-100协同作用，不破坏蛋白的结构，但可减少蛋白质之间原有的相互作用。
在加入磁珠悬浮液进行核酸吸附前，需向样本-吸附结合混合液中添加一定体积的异丙醇，异丙醇的主要作用是沉淀核酸。
[磁珠悬浮液]
磁珠悬浮液：体积分数为70-80％的超顺磁微球，所述超顺磁微球的粒径介于10～50nm，磁珠悬浮液pH5.0-6.0。
在一种优选的实施方式中，磁珠悬浮液的组成成分为：体积分数为70％的磁球(磁珠粒径介于10～50nm)，30％的无核酸酶水，磁珠悬浮液pH5.4。需要注意的是，磁珠悬浮液于4-8℃储存，不能冷冻。
[第一漂洗液]
第一漂洗液，包括：10-100mM(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mM)Tris-HCl(pH6.0-8.0)，10-100mM(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mM)氯化钠，1-10mM(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mM)EDTA缓冲液，50-80％(例如50、55、60、65、70、75、80％)乙醇。
在一种优选的实施方式中，第一漂洗液的组成成分为：50mM Tris-HCl，100mM氯化钠，4mM EDTA，pH8.0，70％乙醇。
[第二漂洗液]
第二漂洗液，包括：10-100mM(例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mM)Tris-HCl，1-5mM(例如1、2、3、4、5mM)EDTA，pH6.0-8.0，50-80％(例如50、55、60、65、70、75、80％)乙醇。
在一种优选的实施方式中，第二漂洗液的组成成分为：50mM Tris-HCl，4mM EDTA，pH8.0，80％乙醇。用于洗去残留的盐离子和胍盐，以免对核酸提取后的后续分子生物学实验产生不利影响。
[洗脱缓冲液]
洗脱缓冲液，包括：5-20mM(例如5、8、10、12、15、18、20mM)Tris-HCl(pH6.0-8.0)，1-5mM(例如1、2、3、4、5mM)EDTA，以及余量的水。
在一种优选的实施方式中，洗脱缓冲液的组成成分为：10mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0。
本发明的粪便样本DNA核酸提取试剂盒通过各个试剂能够快速高效裂解粪便样本中各种细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量，并且提取的核酸不含核酸酶及PCR检测抑制剂，DNA保存时间长，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高，利于粪便样本核酸的保存和检测。操作简便、高效、可运用于自动化提取设备。
第二方面，本发明提供了一种上述核酸提取试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(a)获取蛋白酶K；
(b)初裂解缓冲液制备：在去离子水中加入所述金属离子螯合剂、所述缓冲溶液的缓冲物质和所述表面活性剂，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至8.0-9.0。
(c)裂解-结合缓冲液制备：在去离子水中加入所述盐酸胍、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100和Tween-20，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至7-8。
(d)获取磁珠悬浮液：在无核酸酶水中加入超顺磁微球，形成悬浮液。
(e)第一漂洗液制备：在去离子水中加入所述Tris-HCl、氯化钠、EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至7-8。使用之前加入无水乙醇至乙醇终浓度50-80％。
(f)第二漂洗液制备：在去离子水中加入所述Tris-HCl和EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至6.0-8.0。
(g)洗脱缓冲液制备：在去离子水中加入所述Tris-HCl和EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至8.0。
第三方面，提供了一种粪便样本核酸提取方法。
总的来说，本试剂盒提取方法大致可以分为四个步骤，第一步是利用裂解液裂解细胞，并促使核酸与核蛋白分离释放；第二步是把释放的核酸特异地吸附在磁珠上，并且磁珠只对核酸有较强的亲和力和吸附力，而对其他的生化组分如蛋白质、多糖、脂类不具有亲和力和吸附力；第三步是漂洗，洗去非特异结合的组分；第四步是把吸附在磁珠上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。
优选地，粪便样本或粪便保存液样本与蛋白酶K的质量/体积比为5∶1-20∶1。在一些较为优选的实施方案之中，待处理样本与蛋白酶K的体积比为10∶1。
利用本发明第一方面所述的粪便样本核酸提取试剂盒从0.25-2g粪便样本或200-400μl粪便保存液样本中提取DNA总核酸，具体步骤包括：
1、样本裂解：取0.25-2g新鲜或冻存粪便样本，或200-400μl粪便保存液样本，置于干净的EP管(自备)中，加入200-800μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟或直至粪便样品充分均质化，将样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育3-5分钟，随后80℃，600rpm，孵育5-10分钟，8000-12000rpm离心样品1-5分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清200-500μl至新EP管中，加入10-25μl蛋白酶K，加入200-400μl裂解结合缓冲液，涡旋混匀，置于恒温混匀仪上，80℃，600rpm，孵育20分钟。
2、吸附结合：上述样品中加入200-400μl异丙醇，加入10-25μl磁珠悬浮液，颠倒混匀，置于恒温混匀仪上，室温，600rpm，孵育5-10分钟，将EP管置于磁力架上，静置3-5min至磁珠全部吸附，弃去所有液体。
3、漂洗：在上述EP管中加入500-750μl第一漂洗液，用枪吹打混匀后置于磁力架上，静置3-5min至磁珠全部吸附，弃去所有液体，重复第一漂洗液漂洗步骤一次；再加入500-750μl第二漂洗液，用枪吹打混匀后置于磁力架上，静置3-5min至磁珠全部吸附，弃去所有液体，重复第二漂洗液漂洗步骤一次。
4、洗脱：将上述EP管敞开，室温静置3-5min，晾干磁珠以去除残余的漂洗液，避免对下游实验产生影响，加入70μl洗脱缓冲液，吹打混匀，置于恒温混匀仪上65℃孵育5-10分钟，最后将EP管置于磁力架上，静置3-5min至磁珠全部吸附，吸取所有液体至新EP管中，即为粪便样本DNA核酸，-20℃保存备用。
本发明提供的粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法至少具有如下有益效果：
(1)简便高效，可适用于自动化提取设备：试剂盒可与自动核酸提取仪匹配使用，其操作简便，能够快速高效裂解粪便样本中各种细胞类型，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量。
(2)提取核酸纯度高，不含检测抑制剂：提取的核酸不含核酸酶及检测抑制剂，DNA保存时间长，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高，利于粪便样本核酸的保存和检测。
(3)成本低：试剂盒所有组分均为自主研发，并实现了量产，成本低，可满足分子生物学多领域研究和应用，具有广泛的应用前景和市场推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为qPCR检测提取后的粪便样本DNA核酸的保存效果结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
本实施例提供一种粪便样本DNA核酸提取试剂盒及制备方法。该试剂盒包括蛋白酶K、初裂解缓冲液、裂解-吸附结合缓冲液、磁珠悬浮液、第一漂洗液、第二漂洗液以及洗脱缓冲液。
本实施例中，试剂盒各试剂组分如下：
蛋白酶K为20mg/mL；
初裂解缓冲液含有：100mM Tris-HCl，10％(w/v)SDS，8mM EDTA，裂解液的pH为8.5。
裂解-吸附结合缓冲液含有：50mM Tris-HCl(pH6.0-8.0)，10M盐酸胍，4mM EDTA，1％TritonX-100，3％Tween-20，其pH为7.5；
磁珠悬浮液含有：体积分数为70％的磁球(磁珠粒径介于10～50nm)，30％的无核酸酶水，磁珠悬浮液pH4.5；
第一漂洗液含有：50mM Tris-HCl，100mM氯化钠，4mM EDTA，pH8.0，70％乙醇；
第二漂洗液含有50mM Tris-HCl，4mM EDTA，pH8.0，80％乙醇；
洗脱缓冲液含有10mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0。
实施例2粪便样本DNA提取方法(手动提取)
采用实施例1中制备的粪便提取试剂盒试剂进行粪便样本DNA核酸提取。
手动提取具体步骤如下：
1.样本裂解
新鲜或冻存粪便样本：取0.2-0.3g新鲜或冻存粪便样本至2ml干净离心管中，加入600μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。
粪便保存液保存的样本：取300μl粪便保存液样本，置于2mL干净的离心管中，加入300μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。
将以上充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育5分钟，随后80℃，600rpm，孵育10分钟，12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl至新的离心管中，加入20μl蛋白酶K，加入300μl裂解-结合缓冲液，涡旋混匀，置于恒温混匀仪上，80℃，600rpm，孵育20分钟。
2.吸附结合
上述样品中加入300μl异丙醇，加入20μl磁珠悬浮液，颠倒混匀，置于恒温混匀仪上，室温，600rpm，孵育8分钟，将离心管置于磁力架上，静置5分钟至磁珠全部吸附，弃去所有液体。
3.漂洗
在上述离心管中加入750μl第一漂洗液，用枪吹打混匀后置于磁力架上，静置5分钟至磁珠全部吸附，弃去所有液体，重复第一漂洗液漂洗步骤一次；再加入750μl第二漂洗液，用枪吹打混匀后置于磁力架上，静置5分钟至磁珠全部吸附，弃去所有液体，重复第二漂洗液漂洗步骤一次。
4.洗脱
将上述离心管敞开，室温静置3-5分钟，晾干磁珠以去除残余的漂洗液，避免对下游实验产生影响，加入70μl洗脱缓冲液，吹打混匀，置于恒温混匀仪上65℃孵育10分钟，最后将离心管置于磁力架上，静置3-5分钟至磁珠全部吸附，吸取所有液体至新离心管中，即为粪便样本DNA核酸，-20℃保存备用。
实施例3优化粪便DNA提取试剂盒自动提取程序
样本：新鲜粪便样本
试剂：按照实施例1配制的提取试剂
仪器：CWE2100自动核酸提取仪(康为世纪)
匹配CWE2100仪器具体操作如下：
1.样本前处理
新鲜或冻存粪便样本：取0.2-0.3g新鲜或冻存粪便样本至2ml干净离心管中，加入600μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。
粪便保存液保存的样本：取300μl粪便保存液样本，置于2mL干净的离心管中，加入300μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。
将以上充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育5分钟，随后80℃，600rpm，孵育10分钟，12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl备用。
2.吸附结合、漂洗、洗脱
按下表向96深孔板中加入试剂(切记1&7Colume按表中顺序添加试剂)：
Figure BDA0003425808370000111
将加入试剂的深孔板和磁套放于核酸提取仪的相应位置，按照下表方案1-方案6所示，运行不同的自动化提取程序。
Figure BDA0003425808370000112
Figure BDA0003425808370000121
Figure BDA0003425808370000122
Figure BDA0003425808370000123
Figure BDA0003425808370000124
Figure BDA0003425808370000131
Figure BDA0003425808370000132
其中方案1运行约20分钟左右后，程序暂停，向1&7列各个样本中加入300μl异丙醇和20μl磁珠磁珠悬浮液后继续程序，约35分钟后程序运行结束。程序运行结束后取出96深孔板与磁套，将深孔板6&12列中的洗脱液(提取的核酸)转移至干净的离心管中，低温保存备用。
检测提取DNA核酸的浓度、纯度及荧光定量PCR扩增检测
提取后的DNA使用dsDNA HS Assay Kit for Qubit(康为世纪，货号CW2838)进行浓度定量测定，使用Nanodrop检测核酸样本纯度，每个样本取5μl作为模板进行荧光定量qPCR检测人类内参基因和菌体16S基因检测。
使用康为世纪qPCR检测试剂(货号CW0957)对提取的DNA核酸样本进行荧光定量PCR检测，所用引物分别为人类内参基因β-actin引物(引物序列信息为βactin-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT(SEQ ID NO.1)，βactin-R：CGGCGGATCGGCAAA(SEQ ID NO.2)和菌体16S内参基因引物341F/517R(341F：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’(SEQ ID NO.3)；517R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’(SEQ ID NO.4))。以未添加粪便样本的粪便保存液提取的DNA核酸作为阴性对照，具体操作参考说明书。反应体系采用15μl PCR反应体系(包括：10μlUltraSYBR Mixture、0.4μl βactin-F/341F(10μM)、0.4μl βactin-R/517R(10μM)、4.2μl无核酸酶水)+5μl提取的DNA样本模板。在ABI7500(美国Thermofisher公司)型荧光定量PCR仪上进行人类内参基因actin和菌体16S基因核酸检测，反应条件如下：95℃ 5min→95℃10s，60°C30s(40个循环)，SYBR通道。所有检测均进行3次重复，取平均循环阈值(cyclingthreshold，Ct)进行计算。提取核酸检测结果如表1所示，自动化提取程序方案3，运行时间短，提取核酸的浓度、纯度和后续PCR检测结果相对较好。
表1.比较不同自动化提取程序提取核酸DNA效果
Figure BDA0003425808370000141
实施例4优化粪便DNA提取试剂盒样本前处理条件
样本：粪便保存液样本
试剂：按照实施例1配制的提取试剂
仪器：CWE2100自动核酸提取仪(康为世纪)
匹配CWE2100仪器具体操作如下：
1.样本前处理
取300μl粪便保存液样本，置于2mL干净的离心管中，加入300μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。将充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，600rpm，按照下表方案1-方案5的条件对粪便样本进行初裂解处理：
方案1 70℃ 5min，80℃ 10min
方案2 70℃ 10min
方案3 70℃ 5min
方案4 80℃ 10min
方案5 80℃ 5min
样本处理结束后，12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl备用。
2.裂解、吸附结合、漂洗、洗脱
按实施例3中提取方案3所示，向96深孔板中加入试剂，将加入试剂的深孔板和磁套放于核酸提取仪的相应位置，按照实施例3中提取程序方案3运行仪器，进行自动化提取。
荧光定量PCR扩增检测提取的DNA核酸：
提取后的DNA，每个样本取5μl作为模板进行荧光定量qPCR检测人类内参基因和菌体16S基因检测。使用康为世纪qPCR检测试剂(货号CW0957)对提取的DNA核酸样本进行荧光定量PCR检测，所用引物分别为人类内参基因β-actin引物和菌体16s内参基因引物，具体操作参考说明书。反应体系采用15μl PCR反应体系(包括：10μl UltraSYBR Mixture、0.4μlβactin-F/341F(10μM)、0.4μlβactin-R/517R(10μM)、4.2μl无核酸酶水)+5μl提取的DNA样本模板。在ABI7500(美国Thermofisher公司)型荧光定量PCR仪上进行检测，反应条件如下：95℃ 5min→95℃ 10s，60℃30s(40个循环)，SYBR通道。所有检测均进行3次重复，取平均Ct值进行计算。
提取核酸检测结果如表2所示，样本前处理方案3：70℃处理5min后，进行自动化提取，提取后进行人类基因组和菌体基因组PCR检测，总体效果较好。
表2.荧光定量PCR检测不同前处理方案提取的核酸DNA
Figure BDA0003425808370000161
实施例5测试不同磁珠提取效果
实验材料：新鲜粪便保存液样本；实施例1中制备的粪便样本提取试剂，其中磁珠分别选用国产磁珠1(英芮诚MSi100-DNA-0507)、国产磁珠2(吉恩特GNT-108)和进口磁珠(Promega，MD1441)。
实验方法：取9等份(各300μl)新鲜粪便保存液样本分装于干净的离心管中，分别加入300μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化。将充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育5分钟后，12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl，然后按照实施例3中匹配CWE2100仪器的提取方案3运行仪器，进行自动化提取。
9份样本分为三组，分别进行三种提取处理：其中(国产磁珠组1)3份采用英芮诚生化科技的国产磁珠(货号MSi100-DNA-0507)进行提取；(国产磁珠组2)3份粪便样本采用吉恩特生物的国产磁珠(货号GNT-108)进行提取；(进口磁珠组)3份粪便样本采用Promega的磁珠(货号：MD1441)进行提取。
提取后的DNA使用Nanodrop检测核酸样本浓度和纯度，结果如表3所示，国产磁珠组提取效果基本相当，使用进口磁珠提取组提取的核酸浓度明显更高，纯度好。
表3.不同磁珠提取效果比较
Figure BDA0003425808370000171
实施例6粪便样本提取试剂盒反应体系测试
实验材料：3个志愿者提供的新鲜粪便样本；
实验组试剂：选用实施例1中制备的部分粪便样本提取试剂(采用Promega的磁珠)；
对比组试剂：实施例1中制备的粪便样本提取试剂(采用Promega的磁珠)；
实验方法：将3个志愿者提供的新鲜粪便样本保存于粪便样本DNA保存液中(康为世纪，货号CW2654)，混匀，每个样本分别取3份(每份300μl)分装于干净的离心管中，分别进行3种提取处理：
(A)实验组试剂1：取其中3份样本，按实施例3进行样本初处理，提取所需试剂如表4所述，提取程序按实施例3中方案3进行自动化提取；
表4实验组试剂1
Figure BDA0003425808370000181
(B)实验组试剂2：取其中3份样本，按实施例3进行样本初处理，提取所需试剂如表5所述，提取程序按实施例3中方案3进行自动化提取；
表5实验组试剂2
Figure BDA0003425808370000182
(C)对比组试剂：取其中3份样本，按实施例3进行样本初处理，提取所需试剂如表6所述，提取程序按实施例3中方案3进行自动化提取；
表6对比组试剂
Figure BDA0003425808370000191
提取后的核酸用nanodrop进行DNA浓度和纯度的检测。实验结果如表7所示，实验组试剂1和实验组试剂2在核酸得率与纯度均不如对比组试剂，说明蛋白酶K、结合缓冲液需搭配使用。
表7
Figure BDA0003425808370000192
实施例7粪便样本提取试剂盒提取能力测试
实验材料：5个志愿者提供的新鲜粪便样本，幽门螺杆菌。
实验组试剂：实施例1中制备的粪便样本提取试剂(采用Promega的磁珠)；
对比组试剂：QIAGEN的粪便样本快速提取试剂盒(
Figure BDA0003425808370000201
Fast DNA StoolMini Kit，Cat No./ID：51604)。
实验方法：将5个志愿者提供的新鲜粪便样本保存于粪便样本DNA保存液中(康为世纪，货号CW2654)，分别加入等体积量的幽门螺杆菌菌液，混匀，每个样本分别取9份(每份300μl)分装于干净的离心管中，分别进行3种提取处理：
(A)实验组试剂-CWE2100仪器提取组：取其中3份样本，每份样本加入300μ1初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化，将充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育5分钟，随后12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl，按实施例3中提取程序方案3运行仪器进行自动化提取；
(B)实验组试剂-手动提取组：取其中3份样本，每份样本加入300μl初裂解缓冲液，连续涡旋1分钟直至粪便样品充分均质化，将充分均质化的样品置于恒温混匀仪上，70℃，600rpm，裂解孵育5分钟，随后12000rpm离心样品1分钟以沉淀粪便杂质，吸取上清400μl，按实施例2中处理粪便保存液保存的样本的手动提取方法进行DNA核酸提取；
(C)对比组试剂-手动提取组：取其中3份样本(每份样本300μl)，采用QIAGEN的粪便样本快速提取试剂盒(目录号51604)按照说明书操作提取。
提取后的核酸用nanodrop进行DNA浓度和纯度的检测，每组实验平行处理3个样本，实验数据为三个平行处理的均值。实验结果如表8所示，实验组手动提取组和机器提取组提取浓度和纯度基本相当，均可以有较高的核酸得率，并且后续荧光定量PCR检测人基因组内参基因和菌体基因组内参基因，实验组手动提取组和机器提取组基本无明显差异，检测Ct值相差不大。在提取核酸纯度方面，虽然QIAGEN粪便提取方法使用的是离心柱法提取，但是Abs260/Abs280比值偏低，多在1.5-1.8之间，Abs260/Abs230比值小于1，纯度相对较低，可能存在胍盐或者蛋白污染；而本实施例提供的实验组粪便核酸提取试剂和方法采用的磁珠吸附法，纯度Abs260/Abs280比值多分布在1.8-2.0之间，Abs260/Abs230比值在1.0-1.5之间，纯度相对较高，并且PCR检测Ct值更低，可以更好地满足后续核酸检测实验要求。
表8.粪便提取试剂盒提取性能检测
Figure BDA0003425808370000211
提取的核酸保存时间检测：将上述提取后的核酸样本按不同处理组混合，分别为A、B、C三组核酸，每组等分成2份，分别置于室温保存0天、7天后，每份取5μl作为模板进行荧光定量qPCR检测。使用康为世纪qPCR检测试剂(货号CW0957)对提取的DNA核酸样本进行荧光定量PCR检测，所用引物为人类内参基因β-actin引物，引物序列信息为βactin-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT(SEQ ID NO.1)，βactin-R：CGGCGGATCGGCAAA(SEQ ID NO.2)。反应体系采用15μl PCR反应体系(包括：10μl UltraSYBR Mixture、0.4μlβactin-F(10μM)、0.4μlβactin-R(10μM)、4.2μl无核酸酶水)+5μl提取的DNA样本模板。在CFX96(美国BioRad公司)型荧光定量PCR仪上进行人类内参基因actin核酸检测，反应条件如下：95℃ 5min→95℃10s，60℃30 s(45个循环)，SYBR通道。所有检测均进行3次重复，取平均循环阈值(cyclingthreshold，Ct)进行计算。
实验结果：结果如表9和图1所示，与0天对照组的Ct相比，实验组A、B核酸样本和对照组C核酸样本，在室温保存7天后检测的Ct差值大部分差异不显著，说明采用本发明提供的提取试剂盒，不管是手动提取还是配合自动化提取仪提取的核酸，室温条件下放置也能有效保持DNA核酸稳定，可以在保存7天后也能保证核酸有效检出。
表9.qPCR检测提取后的粪便样本DNA核酸的保存效果
Figure BDA0003425808370000221
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 江苏康为世纪生物科技股份有限公司
泰州健为医学检验实验有限公司
北京健为医学检验实验室有限公司
<120> 粪便样本的核酸提取试剂盒、制备方法及提取方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 1
gcgccgttcc gaaagtt 17
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
cggcggatcg gcaaa 15
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
cctacgggag gcagcag 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 4
attaccgcgg ctgctgg 17

Claims (10)

1.一种粪便样本的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒包括：蛋白酶K、初裂解缓冲液和裂解结合缓冲液；
所述蛋白酶K的浓度范围为10-30mg/mL；
所述初裂解缓冲液包含：pH6.0-8.550-200mM的Tris-HCl，0.5-30％(w/v)的SDS，1-10mM的EDTA，所述初裂解缓冲液的pH为8.0-9.0；
所述裂解结合缓冲液包含：50-200mM的Tris-HCl，1-15M的盐酸胍，1-10mM的EDTA，0.1-5％的TritonX-100，0.1-5％的Tween-20，所述裂解结合缓冲液的pH为7.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂盒还包括：磁珠悬浮液、第一漂洗液、第二漂洗液和洗脱缓冲液；
所述磁珠悬浮液包含：体积分数为70-80％的超顺磁微球，所述超顺磁微球的粒径为10～50nm，所述磁珠悬浮液的pH为5.0-6.0；
所述第一漂洗液包含：pH6.0-8.010-100mM的Tris-HCl，10-100mM的NaCl，1-10mM的EDTA，50-80％的乙醇，所述第一漂洗液pH为7.0-8.0；
所述第二漂洗液包含：10-100mM的Tris-HCl，1-5mM的EDTA，50-80％乙醇，所述第二漂洗液的pH为6.0-8.0；
所述洗脱缓冲液包含：pH6.0-8.05-20mM的Tris-HCl，1-5mM EDTA。
3.根据权利要求1或2所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述初裂解缓冲液包含：100mM Tris-HCl，10％(w/v)SDS，8mM EDTA，pH 8.5；
所述裂解结合缓冲液包含：50mM Tris-HCl，10M盐酸胍，4mM EDTA，1％TritonX-100，3％Tween-20，pH 7.5。
4.根据权利要求3所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液为：体积分数70％的超顺磁微球，体积分数30％的无核酸酶水，pH 5.4；
优选地，所述超顺磁微球为Promega的磁珠；
所述第一漂洗液包含：50mM Tris-HCl，100mM NaCl，4mM EDTA，70％乙醇，pH 8.0；
所述第二漂洗液包含：50mM Tris-HCl，4mM EDTA，80％乙醇，pH 8.0；
所述洗脱缓冲液包含：10mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0。
5.一种权利要求1-4任一项所述的核酸提取试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)获取蛋白酶K；
(b)初裂解缓冲液：在水中加入所述EDTA、所述Tris-HCl和所述SDS，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至8.0-9.0；
(c)裂解结合缓冲液：在水中加入所述盐酸胍、Tris-HCl、EDTA、TritonX-100和Tween-20，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至7.0-8.0；
(d)获取磁珠悬浮液；
(e)获取第一漂洗液：在水中加入所述Tris-HCl、NaCl、EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至7.0-8.0，使用之前加入无水乙醇至乙醇终浓度50-80％；
(f)获取第二漂洗液：在水中加入所述Tris-HCl和EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至6.0-8.0，使用之前加入无水乙醇至乙醇终浓度50-80％；
(g)获取洗脱缓冲液：在水中加入所述Tris-HCl和EDTA，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物，调节所述混合物的pH至8.0；
其中，(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)无先后顺序，(d)、(e)、(f)、(g)是可选的。
6.一种粪便样本的核酸提取方法，其特征在于，使用权利要求1-4任一项所述的核酸提取试剂盒，包括以下步骤：
(1)向粪便样本或粪便保存液样本中加入初裂解缓冲液进行初裂解处理，分离获得上清液，再向上清液中加入蛋白酶K和裂解结合缓冲液，孵育，得到样品A；
(2)样品A中加入异丙醇和磁珠悬浮液，孵育，置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附，弃去所有液体；
(3)用第一漂洗液和第二漂洗液依次进行漂洗；
(4)用洗脱缓冲液洗脱磁珠上结合的DNA，得到纯化的核酸。
7.根据权利要求6所述的核酸提取方法，其特征在于，粪便样本或粪便保存液样本与蛋白酶K的质量体积比为5∶1-20∶1，优选为10∶1。
8.根据权利要求6所述的核酸提取试方法，其特征在于，初裂解缓冲液的加入量为每0.25-2g粪便样本或200-400μl粪便保存液样本加入200-800μl。
9.根据权利要求6-8任一项所述的核酸提取方法，其特征在于，裂解结合缓冲液的加入量为每0.25-2g粪便样本或200-400μl粪便保存液样本加入200-400μl。
10.根据权利要求6-8任一项所述的核酸提取试方法，其特征在于，初裂解处理的温度为70℃，时间为3-5min。
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