CN111088249A - 一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法 - Google Patents

一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法 Download PDF

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CN111088249A CN202010059725.3A CN202010059725A CN111088249A CN 111088249 A CN111088249 A CN 111088249A CN 202010059725 A CN202010059725 A CN 202010059725A CN 111088249 A CN111088249 A CN 111088249A
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Abstract

本发明提供一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，涉及生物检测领域，包括以下步骤：病原体富集：在1.5mL第一离心管中加入样本，于室温条件下离心5‑10min，除去上清液；宿主细胞裂解：在第一离心管中加入200‑1000μL裂解缓冲液Buffer G1，20‑40℃孵育10‑30min；宿主DNA去除：第一离心管于室温条件下离心2‑5min，除去上清液，向第一离心管中再次加入200‑500μL裂解缓冲液Buffer G1和1‑3μL全能核酸酶，30‑40℃孵育10‑30min，离心除去上清液，加入500‑1000μL Buffer G1清洗沉淀两次；微生物菌体破壁：加入100‑300μL溶菌酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于30‑40℃孵育10‑30min，涡旋混匀处理5‑10min；微生物裂解和核酸提取。本发明应用范围广，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低。

Description

一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。
背景技术
宏基因组测序鉴定相较于传统的培养鉴定方法，具有鉴定周期短、对操作及鉴定人员的技术水平要求低等优势，被越来越多地应用于微生物鉴定中，特别是不明原因病原微生物的鉴定。目前主流的宏基因组测序方法主要是高通量测序方法，包括二代测序和三代测序。但在大多数的临床样本中，往往存在大量宿主DNA背景，病原体DNA只占很少的一部分。在人类微生物组计划针对不同样品类型进行的全宏基因组鸟枪法测序研究中发现，测序数据中多达99％的测序读段对应于人类基因组，因此至多只有1％的测序数据能够用于微生物物种和耐药基因鉴定。如何解决去宿主化提取是临床病原微生物宏基因组测序的关键之一。在核酸提取环节，怎样做到有效去除宿主核酸，有效富集细菌、真菌等所有病原体核酸，最大限度控制混合样品中病原微生物群落的组分检测偏差，进而提高病原体宏基因组学高通量测序技术的准确度和灵敏度，是临床宏基因组测序难点之一。
现有的去除宿主核酸的方法包括(1)基于宿主细胞与微生物大小差异或其他物理差异(如沉降速度)对宿主细胞进行清除，通常去除效率很低，无法去除游离的宿主DNA，且也会损失真菌、寄生虫和一些胞内微生物的核酸；(2)通过破坏宿主细胞膜游离宿主DNA，再通过盐依赖的HL-SAN酶降解宿主DNA，离心收集细菌为主的微生物菌体，再针对细菌DNA进行提取，通常在盐离子浓度比较高的条件下很多菌体也可能会受到损失，经过这个过程后得到的微生物核酸量往往很低；(3)基于人源细胞比微生物外壳更脆弱，使用低渗溶液、或温和的去污剂处理，仅破坏宿主细胞，使宿主DNA游离释放到溶液中，再通过离心去除上清的方法去除宿主DNA，例如一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法(CN108048450 A，广州赛哲生物科技有限公司)。由于宿主DNA是大分子高分子聚合物，具有很高的粘度，部分游离的宿主DNA可能会粘附于菌体表面，因此采用单纯的缓冲液清洗加离心去除的物理方法，并不能使游离出来的宿主DNA去除干净，导致宿主DNA残留。
此外，在微生物核酸提取环节，由于微生物种类繁多，形态各异，不同微生物细胞壁的结构和成份都不尽相同，导致其对不同破壁裂解方法存在易感性差异，因此任何一种细胞壁裂解方法制备的样品都很可能缺乏代表性，可能带来样品代表性及微生物组相对成分检测的偏差。而采用瞬时高温破壁法对菌体DNA会产生比较大的损伤，造成微生物核酸损失严重，提取量大大降低。
因此急需提供一种应用范围广，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法。
本发明提供了如下的技术方案：
一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1.病原体富集：在1.5mL第一离心管中加入样本，于室温条件下10000-15000rpm离心5-10min，除去上清液，富集样本中所有的细胞，包括宿主细胞，细菌、真菌等菌体细胞；
S2.宿主细胞裂解：在第一离心管中加入200-1000μL裂解缓冲液Buffer G1，在20-40℃条件下孵育10-30min，裂解缓冲液Buffer G1在温和裂解宿主细胞的同时，对菌体细胞破坏很小，能保证宿主细胞被完全裂解，而菌体细胞基本不受影响，其中Tris-HCl可以提供pH6.0-9.0稳定的缓冲环境，SDS是阴离子去垢剂，能使膜蛋白和核蛋白变性，TritonX-100和HEPS-KOH可以溶解脂质，MgCl2能增加金属依赖性核酸酶的活性，促进裂解后游离暴露出来的宿主核酸的降解；
S3.宿主DNA去除：第一离心管于室温条件下离心2-5min，除去上清液，向第一离心管中再次加入200-500μL裂解缓冲液Buffer G1和1-3μL全能核酸酶，于30-40℃孵育10-30min，10000-12000rpm离心2-5min，除去上清液，加入500-1000μL Buffer G1清洗沉淀，10000-12000rpm离心2-5min，除去上清液，重复清洗步骤一次，清洗步骤去除全能核酸酶残留，以免残留的全能核酸酶影响后续微生物核酸提取，造成微生物核酸损失降解；
S4.微生物菌体破壁：加入100-300μL溶菌酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于30-40℃孵育10-30min，涡旋混匀处理5-10min，由于细菌细胞壁主要成分是肽聚糖，溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁中的肽聚糖，革兰氏阳性G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而革兰氏阴性G-细菌只有内壁层为肽聚糖，溶菌酶对于破坏G+细菌的细胞壁较G-细菌强；采用玻璃珠法破碎细胞的物理方法，150-212μm的酸洗小玻璃珠对体积较小的细菌的破碎效果较好，而425-600μm的酸洗大玻璃珠对体积相对较大的真菌细胞的破碎效果较好，在微生物破壁环节，通过溶菌酶破壁结合大、小玻璃珠机械破壁法，有效破除革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌等各种形态结构的菌体细胞壁；
S5.微生物裂解和核酸提取：将样品瞬时离心后加入10-40μL蛋白酶K和200-500μL裂解缓冲液Buffer GL，涡旋混匀后于50-65℃孵育10-30min，12000rpm离心1min，吸取上清至第二离心管中，向第二离心管中加入200μL无水乙醇，涡旋混匀后将溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW1，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW2，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，12000rpm离心2min后，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入第三离心管中，向吸附柱中加入50μL Buffer GE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。蛋白酶K是切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K可以降解蛋白质，灭活DNase和RNase等核酸酶，蛋白酶K在pH 4-12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37-60℃，在盐浓度3M盐酸胍或4M尿素中均有活性，在Tween20(5％)和SDS(1％)去污剂存在的条件下也有活性。
优选的，步骤S2中裂解缓冲液Buffer G1包括5mM Tris-HCl、3mM MgCl2，1％Triton X-100，1％(w/v)SDS，10mM DTT和10mM HEPS-KOH，裂解缓冲液Buffer G1的pH值为8.0。
优选的，步骤S3中的全能核酸酶的浓度为200-250U/μL。
优选的，步骤S4中裂解管置于30-40℃孵育10-30min后，可于恒温混匀仪上2500-2900rpm处理5-10min。
优选的，步骤S5中裂解缓冲液Buffer GL包含Tris-HCl、氯化钠、异硫氰酸胍、SDS和TritonX-100，在高盐条件下，能保证核酸与核酸结合蛋白迅速彻底分离，释放大量核酸，并且在裂解后能使变性蛋白质仍然具有较高的溶解度。
优选的，步骤S5中样品与蛋白酶K的体积比为5：1-20：1，蛋白酶K的酶活浓度范围为10mg/mL-30mg/mL。
本发明的有益效果是：在宿主DNA去除环节，宿主细胞被温和地裂解，而微生物细胞则不会受到影响，这一步骤所释放出的宿主DNA随后被全能核酸酶促降解成3-8个碱基长度的5'-单磷酸寡核苷酸；在微生物核酸提取环节，通过一种优化的物理(玻璃珠机械破壁法)和化学(溶菌酶破壁法)联合破壁法，实施细菌、真菌等细胞壁破壁；随后，在蛋白酶K和裂解缓冲液的作用下，破壁后的菌体细胞被裂解并释放菌体DNA，我们精心设计的缓冲液化学成分可提升所释放菌体DNA与硅胶膜的结合能力；最后，在洗去不需要的成分之后，从柱体上洗脱下微生物组DNA，有效提取富集，最大限度控制样品制备过程中引入的偏差，提取的DNA总量足够建库上机，满足测序需要；在有效去除绝大部分宿主DNA的同时，最大程度全面覆盖细菌、真菌等病原微生物DNA位点，获得具有更高覆盖度的微生物组DNA富集产物，提高微生物有效测序数据。本发明所提供的提取方法兼容性好，适用于从拭子、血液、痰液、肺泡灌洗液等不同类型的临床混合样本中纯化和富集病原微生物基因组DNA，使整个宏基因组样本提取流程时间短，宿主背景低，测序成本低，具有很好的临床应用前景。
具体实施方式
实施例
样品的处理：
(1)模拟混合样本：分别取新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL，加入500μL新鲜血液样本中(EDTA保存管中保存)，作为模拟样本。
(2)临床血液样本：分别取5个临床感染病患者的血液样本500μL于1.5mL离心管中。
(3)胰酶消化液的制备：4g/L胰蛋白酶(1:2500)、30mM CaCl2、100mM NaCl、2mMKCl、8mM Na2HPO4、4mM KH2PO4，用NaOH溶液调pH值至pH 8.0，用0.45μM过滤器过滤除菌及不溶物，2-8℃储存备用。
临床痰液样本：分别取5个临床感染病患者的痰液样本500μL于1.5mL离心管中，加入750μL胰酶消化液，37℃孵育15-30min，使样本完全液化。
一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1.病原体富集：在1.5mL对应样品数量的第一离心管中加入样本，于室温条件下10000rpm离心10min除去上清液，富集样本中所有的细胞，包括宿主细胞，细菌、真菌等菌体细胞；
S2.宿主细胞裂解：在第一离心管中加入500μL裂解缓冲液Buffer G1，涡旋混匀后在30℃条件下孵育10min，裂解缓冲液Buffer G1在温和裂解宿主细胞的同时，对菌体细胞破坏很小，能保证宿主细胞被完全裂解，而菌体细胞基本不受影响，其中Tris-HCl可以提供pH6.0-9.0稳定的缓冲环境，SDS是阴离子去垢剂，能使膜蛋白和核蛋白变性，TritonX-100和HEPS-KOH可以溶解脂质，MgCl2能增加金属依赖性核酸酶的活性，促进裂解后游离暴露出来的宿主核酸的降解；
S3.宿主DNA去除：第一离心管于室温条件下离心2min，除去上清液，向第一离心管中再次加入200μL裂解缓冲液Buffer G1和1μL全能核酸酶(250U/μL)，于37℃孵育20min，12000rpm离心2min，除去上清液，加入500μL Buffer G1清洗沉淀，重复清洗步骤一次，12000rpm离心2min，除去上清液，全能核酸酶促消化反应后，通过离心去上清，去除消化后的宿主DNA碎片，再通过两次清洗步骤，以免残留的全能核酸影响后续微生物核酸提取，造成微生物核酸损失降解；
S4.微生物菌体破壁：加入180μL溶菌酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于37℃孵育30min，涡旋混匀处理5min，由于细菌细胞壁主要成分是肽聚糖，溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁中的肽聚糖，革兰氏阳性G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而革兰氏阴性G-细菌只有内壁层为肽聚糖，溶菌酶对于破坏G+细菌的细胞壁较G-细菌强，采用玻璃珠法破碎细胞的物理方法，150-212μm的酸洗小玻璃珠对体积较小的细菌的破碎效果较好，而425-600μm的酸洗大玻璃珠对体积相对较大的真菌细胞的破碎效果较好；
S5.微生物裂解和核酸提取：将样品瞬时离心后加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)和200μL裂解缓冲液Buffer GL，涡旋混匀后于56℃孵育30min，12000rpm离心1min，吸取上清至第二离心管中，向第二离心管中加入200μL无水乙醇，涡旋混匀后将溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW1，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW2，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，12000rpm离心2min后，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入第三离心管中，向吸附柱中加入50μL Buffer GE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。蛋白酶K是切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽键，将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。蛋白酶K可以降解蛋白质，灭活DNase和RNase等核酸酶，蛋白酶K在pH 4-12.5较广的pH范围内均有活性，作用温度范围为37-60℃，在盐浓度3M盐酸胍或4M尿素中均有活性，在Tween20(5％)和SDS(1％)去污剂存在的条件下也有活性。
核酸质量检测及宿主DNA残留检测
(1)核酸浓度测定：提取后的DNA使用Qubit定量，使用Nanodrop检测纯度。
(2)qPCR检测宿主基因组残留情况：在200μL PCR管中配制如表1的PCR检测体系。
表1
Figure BDA0002374049790000081
PCR的反应条件如表2：
表2
Figure BDA0002374049790000082
Figure BDA0002374049790000091
其中内参引物内参引物-F序列：5’-CCATCCTGCGTCTGGACCT-3’；内参引物-R序列：5’-CCGTGGTGGTGAAGCTGTAG-3’；内参探针序列：VIC-ACTACCTCATGAAGATCCT-MGB。
(3)NGS检测宿主DNA残留情况：采用康为世纪NGS文库构建试剂盒(货号CW3025)对提取的DNA进行NGS文库构建，并上机测序，统计宿主DNA reads占比。
对比例1
采用“一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法”(CN 108048450 A，广州赛哲生物科技有限公司)中去宿主化提取试剂和方法提取实施例1中同样的样本，作为对照，具体步骤如下：
A.样品的处理：
(1)模拟混合样本：分别取新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL，加入500μL新鲜血液样本中(EDTA保存管中保存)，作为模拟样本。
(2)临床血液样本：分别取5个临床感染病患者的血液样本500μL于1.5mL离心管中。
(3)临床痰液样本：分别取5个临床感染病患者的痰液样本500μL于1.5mL离心管中，加入750μL TB1 buffer，37℃孵育15-30min，使样本完全液化。
TB1 buffer包括50mM CaCl2，137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，用NaOH溶液调节至pH为8.0，用0.45μM过滤器过滤，2-8℃储存备用。
B.宿主细胞裂解：
在(1)、(2)样本中加入1.5倍体积的TB1 buffer和1.5倍体积的TB2 buffer，(3)样本中直接加入1.5倍体积的TB2 buffer，涡旋混匀，室温下孵育10min。
TB2 buffer包括10mM Tris-HCl、15mM EDTA、1％Triton X-100、0.25％(w/v)SDS、50mM DTT和20mM HEPS-KOH，pH值为8.0。
C.去除宿主细胞：
将样品于5000xg条件下离心10min，向沉淀中加入4mL TB2 buffer，涡旋混匀，5000xg离心10min，小心去除上清，并用10μL枪头彻底吸弃所有上清，保留微生物沉淀。
D.微生物菌体破壁：
加入200μL溶菌酶(50mg/mL),重悬菌体沉淀，并将菌体重悬液转移1.5mL离心管中，37℃孵育30min后将样本转移到95℃水浴锅中，孵育5min后立即取出。
E.微生物裂解和核酸提取：
瞬时离心后加入20μL蛋白酶K，涡旋混匀，加入200μL Buffer GL，涡旋混匀后于56℃，600rpm条件下孵育30min，12000rpm离心1min，小心吸取上清至新的离心管中；加入200μL无水乙醇，涡旋混匀后加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColμMns DM)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL BufferGW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱置于室温至彻底晾干，将吸附柱置于一个新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50μL Buffer GE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
按照实施例中核酸质量检测及宿主DNA残留检测方法对提取的微生物DNA进行检测。
对比例2
采用康为细菌基因组DNA提取试剂盒(CW0552)对实施例中的相同样本进行提取，并提取菌体混合样本作为对照，具体操作步骤如下：
A.样本准备
(1)模拟混合样本：分别取新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL，加入500μL新鲜血液样本中(EDTA保存管中保存)，作为模拟样本。
(2)临床血液样本：分别取5个临床感染病患者的血液样本500μL于1.5mL离心管中。
(3)临床痰液样本：取5个临床感染病人痰液样本，每个样本取500μL加入1.5mL离心管中，加入750μL胰酶消化液，37℃孵育15-30min，使样本完全液化。
(4)菌体混合样本：分别取实施例中新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL进行混合，作为菌体混合样本。
上述样本于12000rpm离心5min，弃上清，保留沉淀。
B.微生物菌体破壁：
加入180μL溶菌酶(20mg/mL),重悬沉淀后转移到装有酸洗玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于37℃,600rpm孵育20min，涡旋混匀10min。
C.微生物裂解和核酸提取：
采用康为细菌基因组DNA提取试剂盒(CW0552)进行后续菌体裂解和核酸提取步骤，瞬时离心，加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)，涡旋混匀后加入200μL Buffer GL，涡旋混匀，56℃，600rpm孵育30min，12000rpm离心1min，小心吸取上清至新的离心管中，加入200μL无水乙醇，涡旋混匀后全部加入到已装入收集管的吸附柱(Spin ColμMns DM)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL BufferGW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱置于室温至彻底晾干，将吸附柱置于一个新离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入50μL Buffer GE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
按照实施例1中核酸质量检测及宿主DNA残留检测方法对提取的微生物DNA进行检测。
宿主化性能比较：结果如表3所示，按照本发明方法实施例提取的模拟菌血样本(样本编号4-6)DNA浓度显著低于对照组1去宿主化提取方法提取的DNA浓度，也显著低于对照组2不含去宿主化步骤提取DNA浓度，说明本发明提供的去宿主化试剂和方法效果好，相比于对照组来说，本发明提供的方法和试剂能有效去除大部分宿主DNA，qPCR方法和NGS方法检测宿主DNA残留的数据结果进一步证实这一结论。用提取核酸为模版，检测宿主DNA残留情况，实施例宿主内参基因扩增平均Ct值为35.443，NGS检测宿主DNA reads数占比4.65％；对照组1宿主内参基因扩增平均Ct值为20.514，NGS检测宿主DNA reads数占比81.36％；对比例2宿主内参基因扩增平均Ct值为19.650，NGS检测宿主DNA reads数占比93.06％。
菌体损失检测：如表3所示，实施例中去宿主化提取的模拟菌血样本(新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL，加入500μL新鲜血液样本)平均DNA浓度为2.01ng/μL，对照组2中不含去宿主化步骤提取的菌体混合样本(样本编号1-3，为实施例中同批新鲜过夜培养的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、酵母菌菌液各5μL混合)DNA浓度2.37ng/μL，二者浓度接近，说明实施例中去宿主处理步骤并没有对菌体DNA造成太大损失。
表3
Figure BDA0002374049790000131
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.病原体富集：在1.5mL第一离心管中加入样本，于室温条件下离心5-10min，除去上清液；
S2.宿主细胞裂解：在第一离心管中加入200-1000μL裂解缓冲液Buffer G1，在20-40℃条件下孵育10-30min；
S3.宿主DNA去除：第一离心管于室温条件下离心2-5min，除去上清液，向第一离心管中再次加入200-500μL裂解缓冲液Buffer G1和1-3μL全能核酸酶，30-40℃孵育10-30min，10000-12000rpm离心2-5min，除去上清液，加入500-1000μL Buffer G1清洗沉淀，10000-12000rpm离心2-5min，除去上清液，重复清洗步骤一次；
S4.微生物菌体破壁：加入100-300μL溶菌酶重悬沉淀后将重悬液转移到装有玻璃珠的裂解管中，将裂解管置于30-40℃孵育10-30min，涡旋混匀处理5-10min；
S5.微生物裂解和核酸提取：将样品瞬时离心后加入10-40μL蛋白酶K和200-500μL裂解缓冲液Buffer GL，涡旋混匀后于50-65℃孵育10-30min，12000rpm离心1min，吸取上清至第二离心管中，向第二离心管中加入200μL无水乙醇，涡旋混匀后将溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW1，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，向吸附柱中加入500μL清洗液Buffer GW2，12000rpm离心1min，除去收集管中的液体，将吸附柱重新放回至该收集管中，12000rpm离心2min后，除去收集管中的液体，将吸附柱置于室温条件下彻底晾干后放入第三离心管中，向吸附柱中加入50μL Buffer GE，室温放置5min，12000rpm离心1min，收集DNA溶液于-20℃条件下保存。
2.根据权利要求1所述的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S2中裂解缓冲液Buffer G1包括5mM Tris-HCl、3mM MgCl2，1％Triton X-100，1％(w/v)SDS，10mM DTT和10mM HEPS-KOH，裂解缓冲液Buffer G1的pH值为8.0。
3.根据权利要求2所述的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S3中的全能核酸酶的浓度为200-250U/μL。
4.根据权利要求3所述的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S4中裂解管置于30-40℃孵育10-30min后，可于恒温混匀仪上2500-2900rpm处理5-10min。
5.根据权利要求4所述的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S5中裂解缓冲液Buffer GL包含Tris-HCl、氯化钠、异硫氰酸胍、SDS和TritonX-100。
6.根据权利要求5所述的宏基因组样本去宿主化提取试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤S5中样品与蛋白酶K的体积比为5：1-20：1，蛋白酶K的酶活浓度范围为10mg/mL-30mg/mL。
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