CN108048450B - 一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物分子生物学检测技术领域，具体公开了一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，包括第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测等步骤。本发明还公开了一种痰液微生物宏基因组建库方法，包括样品基因组DNA提取、基因组DNA处理、文库扩增、文库初纯化、两步法片段选择和上机检测等步骤。本发明采用胰蛋白酶和SDS联合的温柔型消化法，将宿主基因组释放于溶液中，获得保留完整细胞壁结构的微生物，实现去宿主化微生物核酸提取。本发明所提供的提取方法及建库方法兼容性好，可广泛用于主流测序平台，具有灵活简便、高效快捷、节约成本的优点，具有较好的推广应用前景。

Description

一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法
技术领域
本发明涉及微生物分子生物学检测技术领域，具体地，涉及一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法。
背景技术
近年来微生物宏基因组领域的研究越来越热门，尤其是在人体肠道微生物与人类健康方面取得了重大进展，但呼吸道微生物方面却因为呼吸道样品处理和建库较困难，进展缓慢。呼吸道微生物方面研究的主要是呼吸道疾病，如重症肺炎、肺结核、囊性纤维化病、流感等带有传染性的疾病。这些疾病常见的样品类型为唾液、痰液、气道灌洗液等，常见菌有金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、溶血性链球菌、肠杆菌科细菌、结核分枝杆菌、乙肝病毒、厌氧链球菌、米勒链球菌、拟杆菌属、卡他莫拉菌、铜绿假单胞菌、呼吸道真菌、呼吸道病毒等，这些病原微生物多数为《人间传染的病原微生物名录》危害程度分类为二类、三类高传染、高致病性的微生物，且要求在基础实验室-二级生物安全水平（BSL-2）进行处理，即有配套微生物处理规范的病毒房里进行实验操作。因此，对工作人员及科研单位要求较高，目前常规医院及科研公司尚未具备相应条件，而无法开展实验。
常见样本中的痰液痰核粘稠坚硬，气道灌洗液中也含有痰液或血液，在进行核酸提取前，需要进行液化，才能将痰液里面的细菌DNA释放出来，进而使用过柱法或者磁珠法进行核酸提取。目前，痰液的液化和核酸提取主要有以下四种方法：（1）直接水煮法，煮沸10min后将上清液进行PCR扩增检测反应，该法方便快捷、成本低，但容易造成部分液化不全、基因组断裂；（2）先用4%或1M NaOH溶液液化处理后再提取，该法试剂来源方便、反应时间足够长，能够完全液化痰液，但碱性较强，容易将宿主和细菌的DNA均变性、解链，使DNA降解严重；（3）先用巯基乙醇等变性剂变性和超声波法联合预处理后再提取，该法能在一定程度上液化痰液，但巯基乙醇具有剧烈毒性和挥发性气味，且超声会使宿主和微生物的DNA均被碎片化；（4）加入0.2mg/mL蛋白酶K，于55℃条件下水浴3h或者过夜消化后再提取，只要酶足够多、时间足够长，可以完全实现液化，但该法成本较高、蛋白酶K消耗大、时间较长。以上方法均可有助于痰液液化，完成检测工作，可应用于细菌致病基因靶标扩增、细菌16S rRNA基因测序、细菌涂片等一些可以忽略宿主基因组的检测中，还可用于分枝结核杆菌等具有较厚细胞壁、难裂解的革兰式阳性菌检测。但是，宏基因测序会将提取到的所有核酸均测序出来，如使用上述方法，则这类样本的测序数据中，宿主基因组可能占99.9%，测序数据基本浪费。如何解决去宿主化提取是痰液宏基因测序的关键之一。
就微生物建库策略而言，目前的DNA建库方法主要有三种：（1）超声波和经典DNA建库方法，包括末端修复、接头连接、文库扩增等步骤，该法测序片段随机性、均一性最好，但片段主峰分布范围大，需要较高的DNA起始量；（2）DNA酶切基因组和经典DNA建库方法，该法可快捷完成片段化反应，需要的DNA起始量较超声波少，但片段化随机性效果次之，且需要增加酶成本；（3）转座酶建库法，其特点是转座酶切割DNA的同时，连接上部分测序接头，再进行文库扩增，该法速度最快，在剪切的同时和连接接头一起完成，目前主要应用于人全基因组及外显子测序。而目前现有的转座酶建库试剂盒尚不能同时满足多种文库类型及多种测序平台，达到高效、准确定量的要求。
目前呼吸道宏基因组测序研究中尚未有专门针对痰液微生物去宿主基因组的核酸提取方法和试剂盒，以及完善的低起始量、快速建库方法。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，通过胰蛋白酶和SDS对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁，进而实现去宿主化核酸提取。
本发明的另一目的在于提供一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法。
本发明的另一目的在于提供一种痰液微生物宏基因组建库方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；
所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶和TB1 buffer组成；所述TB1 buffer包含如下终浓度的各组分：45～55mM CaCl2、132～142mM NaCl、2.2～3.2mM KCl、9.5～10.5mMNa2HPO4•12H2O和1.5～2.5mM KH2PO4，pH值为7～9；
所述第二次痰液液化工作液由TB2 buffer组成，包含如下终浓度的各组分：5～15mM Tris-HCl、10～20mM EDTA、0.5～1.5% Triton X-100、0.2～0.3%(w/v) SDS、45～55mM DTT和15～25mM HEPS-KOH，pH值为8.0。
本发明通过胰蛋白酶对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁，进而实现去宿主化核酸提取。同时进行痰液的液化和去宿主化处理，含Ca2+的磷酸盐缓冲液环境对该酶具有增强和稳定效果。
本发明还通过TB2 buffer对残留的成絮痰液进行二次消化，裂解宿主细胞膜，将宿主基因组释放于溶液中，而微生物仍保持完整的细胞壁。其中，Tris-HCl（pH8.0）能提供弱碱性，对DNA的碱基有保护性，不易破坏其完整性或产生开环及断裂；EDTA为金属螯合剂，能抑制核酸酶对裂解后暴露于细胞外的DNA的降解，终止胰蛋白酶反应；Triton X-100和HEPS-KOH具有增加细胞脂质溶解的作用；SDS具有强渗透力，可以切断痰液中蛋白质的二硫键；DTT具有强氧化作用，阻止蛋白质分子内或分子间二硫键的形成。
优选地，所述胰蛋白酶活力为1：2500、1：250或1：300，要求现配现用。
更优选地，所述胰蛋白酶为胰蛋白酶干粉，酶活力为1：2500，反应温度为37℃，pH值为7.5～8.5，此时的酶活力最佳。
优选地，所述TB1 buffer包含如下终浓度的各组分：50mM CaCl2、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4•12H2O和2mM KH2PO4，pH值为7～9。
优选地，所述TB2 buffer包含如下终浓度的各组分：10mM Tris-HCl、15mM EDTA、1% Triton X-100、0.25%(w/v) SDS、50mM DTT和20mM HEPS-KOH，pH值为8.0。
一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，包括以下步骤：第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测；
所述第一次痰液液化为取痰液样品，加入0.5～3倍体积上述第一次痰液液化工作液，混匀后25～40℃孵育15～30min，每5min摇晃一次；当痰液变清亮时，即停止反应；
所述第二次痰液液化为向第一次痰液液化后的反应液中加入0.5～3倍体积上述第二次痰液液化工作液，混匀后室温孵育10min，离心后弃去上清液，向沉淀中再加入3～6mL TB2 buffer，离心后保留微生物沉淀。
本发明通过胰蛋白酶对痰液进行温柔消化，且不破坏微生物细胞壁；要求严格控制痰液液化的时间，当痰液液化呈流动液态、溶液清亮即停止反应，使细胞和细菌从粘稠的絮状痰液中分离出来。若液化时间过长，过度消化，会损伤微生物细胞壁，影响去宿主化核酸提取效果。本发明还通过TB2 buffer对残留的成絮痰液进行二次消化，裂解宿主细胞膜，将其宿主基因组释放于溶液中，而微生物仍保持完整的细胞壁。通过二次离心去上清，将宿主基因组去除，并将微生物收集于底部。
作为一种优选的实施方式，所述第一次痰液液化包括胰蛋白酶消化和终止消化，具体操作步骤为：按样品体积，加入0.5～3倍体积上述第一次痰液液化工作液，摇晃混匀，放在水浴锅的架上，25～40℃恒温孵育15～30min，每隔5min摇晃痰液收集管底部1次；观察当痰液液化变为无痰丝、痰核、底部块状粘稠物，溶液变得清亮时，即停止反应。如液化不完全，可以适当延迟液化时间5min。
作为一种优选的实施方式，所述第二次痰液液化包括SDS消化、去宿主细胞及微生物沉淀清洗，具体操作步骤为：向第一次痰液液化后的反应液中加入0.5～3倍体积上述第二次痰液液化工作液，涡旋混匀，室温孵育10min；于5000×g转速离心10min，彻底吸弃所有上清液（含有宿主基因组），保留沉淀（含有未破壁的微生物）；向沉淀中再次加入3～6mLTB2 buffer，涡旋混匀，于5000×g转速离心10min，彻底吸弃所有上清液，保留微生物沉淀。
优选地，所述微生物破壁为溶菌酶破壁或高温破壁。更优选地，高温破壁适用于提取真菌基因组DNA，具体操作为：将样品放置在95℃高温水浴锅中孵育5min，通过瞬时高温，使真菌有效破壁。此外，精准控制95℃、5min对宏基因组测序不会产生不利影响，同时有助于溶菌酶充分裂解细胞壁较厚的革兰式阳性菌（如结核杆菌），但高温时间过长，则会降解基因组DNA。
一种痰液微生物宏基因组建库方法，包括以下步骤：
S1.按照上述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法提取痰液样品的基因组DNA；
S2.向S1所得样品基因组DNA中加入转座酶混合液，于50～60℃孵育3～7min，将基因组片段化为230bp长度；
S3.将S2所得产物进行PCR扩增，PCR扩增条件为72℃ 3min；95℃ 30s；95℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 30s，10～14个循环；72℃ 5min；
S4.将磁珠与S3所得产物按体积比为0.5～1：1混合，经清洗、洗脱后回收磁珠上的DNA；
S5.将磁珠与S4所得产物按体积比为0.5～1：1混合，留取上清液，去除DNA大片段；将磁珠与上清液按体积比为0.5～1：1混合，回收磁珠上的DNA；
S6.将纯化后的基因组DNA文库上机检测。
本发明使用转座酶类型建库方法，将常规的DNA打断、末端修复、接头连接通过一步反应完成；同时，控制的参数只有酶的反应时间和温度，方便快捷。
优选地，S2中加入转座酶混合液后，于55℃反应6min能更稳定地将基因组片段化为230bp。
优选地，S3中所述PCR扩增为13个循环，能保证扩增后DNA总量在400ng左右，纯化后DNA总量在200ng左右，有利于文库备份。
优选地，S4中所述磁珠与S3所得产物的体积比为0.8：1；S5中所述磁珠与S4所得产物的体积比为0.65：1，所述磁珠与上清液的体积比为0.8：1。
优选地，S4中加入0.8倍体积的纯化磁珠，除了能去除PCR底物（dNTP、Buffer、引物、酶），还起到片段选择的作用，能去除200bp以下分布的文库，如86bp的引物二聚体、120bp的接头二聚体。
在S5的两步磁珠片段选择流程中，首先使用0.65倍体积的磁珠与S4所得产物的大片段结合，在总量一定、连续分布的DNA片段（200～1000bp）和有限的磁珠下，磁珠优先会与大片段先结合，而小片段停留在上清液中。所使用的0.65倍体积的磁珠经多次测试验证，能与本发明基因组中600bp 以上的DNA结合，在转移上清液时，为200～600bp的DNA溶液，并以350bp为主峰。然后加入0.8倍体积的纯化磁珠与上清液结合，较高浓度的磁珠能将200bp以上的片段均高效回收，且彻底去除S4中0.8倍体积磁珠纯化残留的200bp片段。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明采用胰蛋白酶和SDS联合的温柔型消化法，充分考虑了痰液样品的物理特性、微生物与宿主细胞的生物学差异，让细胞、微生物从痰核中释放出来，将宿主基因组释放于溶液中，获得保留完整细胞壁结构的微生物，实现去宿主化微生物核酸提取。
（2）本发明所提供的痰液微生物宏基因组建库方法，通过优化调整转座酶反应时间、扩增循环数，增加文库初纯化、两步法片段选择等步骤，实现了测序分析要求、片段分布特征、磁珠特性的有机统一，使文库片段分布达到测序上机的标准要求，且在大批量文库混合时，统一的文库主峰大小更有利于定量的稳定性。
（3）本发明所提供的提取方法可用于其他分子检测实验中，建库方法兼容性好，可广泛用于主流测序平台，具有灵活简便、高效快捷、节约成本的优点，从去宿主化核酸提取到宏基因组文库构建，可缩短至两天时间内完成，具有较好的推广应用前景。
附图说明
图1为本发明一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法的试验流程图。
图2为实施例1中27例痰液样本经去宿主化核酸提取结果电泳图。
图3为对比例1中17例痰液样本经NaOH痰液液化法提取结果电泳图。
图4为实施例2中微生物宏基因组文库片段分布总览图。
图5为实施例2中微生物宏基因组文库片段分布结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，具体包括以下步骤：
1、样品预处理
（1）样品准备：样品材料为南方医科大学南方医院提供的一组重症肺炎患者痰液、气道灌洗液约60例。取约2mL痰液样品装载在一个5cm高的圆柱形痰液收集管中，且集中在底部，-80℃保存。
（2）样本速溶：将痰液收集管底部置于37℃水浴锅中不断摇晃，使样品在2min内由固态转变为溶解的液态。若样品为冷冻状态则需要速溶，若为4℃或新鲜样品，则可以省略此步。速溶可以使样品在短时间内融化，而不破坏样品本身及其细胞完整性。
2、第一次痰液液化
（1）溶液制备
TB1 buffer组成：50mM CaCl2、137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4•12H2O和2mMKH2PO4，使用5% NaOH溶液调节pH值至7.5～8.5，使用时用0.45μM过滤器过滤除菌及不溶物。
工作液组成：胰蛋白酶干粉（1:2500）与TB1 buffer配置成浓度为5g/L的工作液（即1g胰蛋白酶干粉，加入200mL TB1 buffer），要求现配现用。
所述胰蛋白酶干粉（1:2500）的1:2500指所投酶量与要水解的蛋白质量的质量比，即一个单位质量的胰蛋白酶可以水解2500个单位质量的蛋白质。该胰蛋白酶，相对于常用于细胞培养的1：250或1：300规格，属于高浓度类型。
（2）胰蛋白酶消化
按样品体积，加入1.5倍体积上述工作液，摇晃混匀，放在水浴锅的架上，37℃恒温孵育15～30min，每隔5min摇晃痰液收集管底部1次。
（3）终止消化：观察当痰液液化变为无痰丝、痰核、底部块状粘稠物，溶液变得清亮时，即停止反应。如液化不完全，可以适当延迟液化时间5min。
（4）转移新管：用1mL枪头将液态痰液转移到15mL离心管中，以便后续离心操作。
3、第二次痰液液化
（1）溶液制备
100mL 1M Tris-HCl（pH 8.0）：称取12.11g Tris，加入80mL双蒸水溶解，使用浓HCl调节pH值至8.0，并定容至100mL。
100mL 0.5M EDTA：称取18.612g EDTA-Na2•2H2O，加入80 mL双蒸水溶解，使用1MNaOH溶液调节pH值至8.0，并定容至100mL。
1%(w/v) SDS（十二烷基硫酸钠）：称取10g高纯度的SDS，加入800mL双蒸水，于68℃加热溶解，使用浓HCl调节pH值至8.0，并定容至1000mL。
100mL 1M DTT（二硫苏糖醇）：称取15.425g DTT溶解，双蒸水定容至100mL。
HEPS-KOH溶液：HEPS（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）购于HyClone公司，加入双蒸水制成浓度为100mM的储备液，用KOH溶液调节pH值至7.4，配制成HEPS-KOH（pH 7.4）溶液，4℃保存。
TB2 buffer各成分终浓度：10mM Tris-HCl、15mM EDTA、1% Triton X-100、0.25%(w/v) SDS、50mM DTT和20mM HEPS-KOH，pH值为8.0。
（2）SDS消化：向第一次痰液液化后的反应液中加入1.5倍体积上述TB2 buffer，涡旋混匀，室温孵育10min。
（3）去宿主细胞：于5000×g转速离心10min，彻底吸弃所有上清液（含有宿主基因组），保留沉淀（含有未破壁的微生物）。
（4）微生物沉淀清洗：向沉淀中再次加入3～6mL TB2 buffer，涡旋混匀，于5000×g转速离心10min，并用10μL枪头彻底吸弃所有上清液，保留微生物沉淀。
4、微生物破壁
（1）溶菌酶破壁：加入200μL溶菌酶溶液（20～60mg/mL）到沉淀中，吹打混匀，并转移至1.5mL离心管中，于37℃孵育10～30min。
（2）高温破壁（真菌）：提取真菌基因组DNA时采用瞬时高温破壁法，取1.5 mL经溶菌酶破壁处理后的样品转移到95℃水浴锅中，孵育5min。
本发明优选采用50mg/mL溶菌酶溶液进行微生物破壁，相比于常规试剂盒（20mg/mL溶菌酶，孵育30min），能大大缩短反应时间，对于细胞壁较厚的革兰式阳性菌（如结核杆菌），更容易充分破壁。高温破壁中通过瞬时高温，可以使真菌有效破壁，释放基因组DNA。精准控制95℃、5min对宏基因组测序不会产生不利影响，同时有助于溶菌酶充分裂解细胞壁较厚的革兰式阳性菌（如结核杆菌），但高温时间过长，则会降解基因组DNA，此步骤是保证测序数据能否准确检测到所有细菌物种及比例的关键步骤。
5、DNA提取
选经典的通用性DNA提取试剂盒QIAamp® DNA Mini（QIAGEN，cat.51304）或者其他国产品牌的DNA提取试剂盒，对裂解后的微生物溶液进行基因组提取。具体操作步骤见试剂盒操作说明书，主要操作步骤如下：
（1）向经过微生物破壁处理的样品溶液中加入200μL无水乙醇，混匀，上过滤柱；
（2）加入500μL Buffer AW1，离心清洗；
（3）加入500μL Buffer AW2，离心清洗；
（4）晾干乙醇，加入50μL洗脱液洗脱DNA，即可得到微生物基因组DNA。
6、核酸质量检测
取5μL微生物基因组DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测，于120V恒压电泳30min，观察目的条带是否在约15kb处有单一的基因组条带，满足要求的合格样品进行下一步文库构建。
结果如图2所示，图中泳道数字为27例痰液样品去宿主化核酸提取电泳检测结果。由图2可以看出，在27例样品微生物基因组条带中，有25例均符合预期在15kb左右处有明亮条带，且无连续降解片段，其中2号、11号样品条带较弱，但经Qubit 2.0 HS DNA kit荧光检测测序浓度分别为5ng/μL、3ng/μL，推测这两例样品本身含有的微生物含量较少，导致总量较低。说明通过本发明的痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，合格率达到92.6%以上，浓度总量100%合格，均在1ng/μL以上。
对比例1
采用NaOH痰液液化法提取微生物基因组DNA，作为对照，具体步骤如下：
选取17例痰液样本，经实施例1中样品预处理后，按照常规NaOH痰液液化法，在各样品中加入1倍体积的4% NaOH溶液液化处理，于37℃孵育1h后，按照实施例1中DNA提取以及核酸质量检测步骤，对微生物基因组进行提取和核酸质检。
结果如图3所示，图中泳道数字为17例痰液样品经NaOH痰液液化法提取电泳检测结果。由图3可以看出，17例样品的微生物基因组条带均在15kb左右处有明亮条带，在500bp处有连续降解片段，这说明了两个问题：（1）通过NaOH痰液液化法获得的基因组条带较亮，总量较高，推测是由于NaOH裂解强度过度，且难以控制，在痰液液化时将宿主和微生物均裂解，二者的基因组均被释放出来，得到包含大量宿主基因组污染的DNA；（2）通过NaOH获得的基因组条带出现降解片段，推测是由于NaOH作用强烈，能使基因组变性降解。
综上所述，通过NaOH痰液液化法得到的基因组，无法用于微生物宏基因组建库测序，否则会导致严重的宿主基因组污染，测序质量低下。
对比例2
比较在不同的缓冲液环境中，不同胰蛋白酶含量和消化时间条件下，第一次痰液液化的消化效果，设置6组实验，分别为：
A、生理盐水组：胰蛋白酶干粉（1:2500）与生理盐水（0.9%NaCl溶液）配置成5g/L的工作液，即等体积替代实施例1中第一次痰液液化工作液。
B、磷酸盐缓冲液组1：除不含CaCl2外，其余组分与实施例1中第一次痰液液化工作液相同。
C、磷酸盐缓冲液组2：除CaCl2终浓度为10mM外，其余组分与实施例1中第一次痰液液化工作液相同。
D、磷酸盐缓冲液组3：除CaCl2终浓度为100mM外，其余组分与实施例1中第一次痰液液化工作液相同。
E、含低浓度胰蛋白酶组：胰蛋白酶干粉（1:2500）与TB1 buffer配置成2g/L的工作液。
F、含高浓度胰蛋白酶组：胰蛋白酶干粉（1:2500）与TB1 buffer配置成8g/L的工作液。
每组选择5例痰液样本进行实验，与本发明实施例1中第一次痰液液化的工作液同批进行第一次痰液液化，其余实验方法和反应条件一致与实施例1相同，比较各组的消化结果。结果如表1所示。
表1 不同反应液条件下的消化结果
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以上实验结果表明，本发明实施例1中第一次痰液液化的工作液在消化30min时，液化效果达到最充分的状态，而时间延长或酶量增加，则无明显改善效果。生理盐水组无法进行正常液化，因为该组无法为胰蛋白酶提供合适的反应缓冲液环境，严重影响了胰蛋白酶的反应活性；含50mM CaCl2的磷酸盐缓冲液为胰蛋白酶的最佳工作环境，Ca离子过高或过低都会抑制痰液液化的酶促反应效果。含低浓度胰蛋白酶组若想到达完全液化状态，所需要的液化时间较长，不利于宿主细胞和目标微生物的释放，同时影响宿主细胞和目标微生物的完整性，不利于微生物基因组的去宿主化提取。
实施例2
一种痰液微生物宏基因组建库方法，具体包括以下步骤：
1、样品基因组DNA提取
参照实施例1的方法提取。
2、基因组DNA处理
（1）加入10µL反应缓冲液和5µL gDNA（总量QB准确定量1ng）混合，然后加入5µL转座酶混合液（ATM），混合均匀；
（2）将混合物在PCR仪上进行反应，于55℃反应6min，将基因组片段化为230bp长度，然后加入5µL终止反应缓冲液（NT）以终止酶反应。
3、文库扩增
（1）向经处理过的基因组DNA中各加入一个组合的标签引物；
（2）加入15µL PCR扩增酶主混合液，并混合离心；
（3）将混合物在PCR仪上进行反应，PCR扩增条件为：72℃ 3min；95℃ 30s；95℃10s，55℃ 30s，72℃ 30s，13个循环；72℃ 5min；
所述PCR扩增为13个循环，能保证扩增后DNA总量在400ng左右，纯化后DNA总量在200ng左右，有利于文库备份。通过本方法，所有文库均能稳定达到二代测序多样品混池上机所要求的浓度和体积。
4、文库初纯化
（1）将纯化磁珠与步骤3所得产物按体积比为0.8：1涡旋混匀，室温静置5min，然后在磁力架上放置2min，直到溶液澄清；
（2）去除步骤（1）中的上清液，加入200µL 80%乙醇，清洗两次；
（3）将装有样品和磁珠的低吸附离心管短暂离心5s，用10µL枪头将残留液吸干，晾干乙醇；
（4）加入100µL RSB（再悬缓冲液）洗脱液，得到纯化后的DNA。
5、两步法片段选择
（1）取经文库初纯化后的100µL样品，与0.65倍体积的纯化磁珠混合，涡旋混匀后室温静置5min，然后在磁力架上放置2min，直到溶液澄清；
（2）用1mL枪头将所有上清液转移到新的低吸附管中，弃去磁珠，此步骤可去除大片段；
（3）向步骤（2）得到的上清液中，加入0.8倍的纯化磁珠，混合均匀；
（4）去除步骤（3）中的上清，再加入200µL 80%乙醇，清洗两次；
（5）将装有样品和磁珠的低吸附离心管短暂离心5s，用10µL枪头将残留液吸干，晾干乙醇。
6、上机检测
取1µL经文库初纯化和两步法片段选择后得到的文库，按常规方法对其进行检测，结果如图4和图5所示：
图4为微生物宏基因组文库经Agilent 2100生物分析仪检测后片段分布总览图（部分样品），结果表明各文库间结果均一，且符合微生物宏基因组文库测序要求，主峰大小为350bp，呈正态分布。
图5为微生物宏基因组文库经Agilent 2100生物分析仪检测后片段分布结果图，由图5可以看出文库的主峰在350bp（即插入片段230bp左右），片段长度分布范围在250～600bp之间，呈正态分布，符合要求。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；
所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶干粉和TB1 buffer配制而成，其中胰蛋白酶干粉的浓度为5g/L；所述胰蛋白酶干粉的酶活力为1：2500；所述TB1 buffer包含如下终浓度的各组分：50mM CaCl2、137mM NaCl、2.7mMKCl、10mM Na2HPO4•12H2O和2mM KH2PO4，pH值为7.5～8.5；
所述第二次痰液液化工作液由TB2 buffer组成，其包含如下终浓度的各组分：10mMTris-HCl、15mM EDTA、1% Triton X-100、0.25%（w/v）SDS、50mM DTT和20mM HEPS-KOH，pH值为8.0。
2.一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，包括以下步骤：第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测；
所述第一次痰液液化为取痰液样品，加入1.5倍体积权利要求1中所述的第一次痰液液化工作液，混匀后37℃ 孵育15～30 min，每5min摇晃一次；当痰液变清亮时，即停止反应；
所述第二次痰液液化为向第一次痰液液化后的反应液中加入1.5倍体积权利要求1中所述的第二次痰液液化工作液，混匀后室温孵育10 min，离心后弃去上清液，向沉淀中再加入3～6mL 权利要求1中所述的第二次痰液液化工作液，离心后保留微生物沉淀。
3.根据权利要求2所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，所述微生物破壁为溶菌酶破壁或高温破壁。
4.根据权利要求3所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，所述高温破壁条件为95℃水浴孵育5min。
5.一种痰液微生物宏基因组建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.按照权利要求2～4中任一所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法提取痰液样品的基因组DNA；
S2.向S1所得样品基因组DNA中加入转座酶混合液，于50～60℃孵育3～7min，将基因组片段化为230bp长度；
S3.将S2所得产物进行PCR扩增，PCR扩增条件为72℃ 3min；95℃ 30s；95℃ 10s，55℃30s，72℃ 30s，10～14个循环；72℃ 5min；
S4.将磁珠与S3所得产物按体积比为0.5～1：1混合，经清洗、洗脱后回收磁珠上的DNA；
S5.将磁珠与S4所得产物按体积比为0.5～1：1混合，留取上清液，去除DNA大片段；将磁珠与上清液按体积比为0.5～1：1混合，回收磁珠上的DNA；
S6.将纯化后的基因组DNA文库上机检测。
6.根据权利要求5所述痰液微生物宏基因组建库方法，其特征在于，S4中所述磁珠与S3所得产物的体积比为0.8：1；S5中所述磁珠与S4所得产物的体积比为0.65：1，所述磁珠与上清液的体积比为0.8：1。
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