CN105524988A

CN105524988A - 一种快速检测痰液中结核分支杆菌的试剂盒

Info

Publication number: CN105524988A
Application number: CN201511026218.5A
Authority: CN
Inventors: 迟大利; 吴大治; 夏懿
Original assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2016-04-27

Abstract

本发明提供了一种快速检测痰液样本中结核分枝杆菌的试剂盒，试剂盒包括液化液、裂解液、探针溶液、终止液和固定液、载玻片、盖玻片。本发明通过对痰液样本进行液化处理后，经过细胞裂解、探针杂交、荧光固定等操作，利用荧光显微镜对结核分枝杆菌进行肉眼可见的观察、计数、分析等。本发明的试剂盒操作方法简单、程序简短、操作简便，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于对痰液样本中的结核分枝杆菌进行直接、简便、有效的检测。

Description

一种快速检测痰液中结核分支杆菌的试剂盒

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，具体涉及一种快速检测痰液样本中结核分枝杆菌的试剂盒。

背景技术

结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis），俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。但应注意，世界上有些地区因艾滋病、吸毒、免疫抑制剂的应用、酗酒和贫困等原因，发病率又有上升趋势。因此，对结核分枝杆菌的及时、高效、特异性的检测成为预防、治疗结核分枝杆菌引起病症的有效手段。

细菌培养和涂片检查是应用最为广泛的病原学诊断技术之一，其中痰液培养约占50%以上。痰液标本检验对于呼吸道疾病的诊断和鉴别具有重要的临床意义。正常人下呼吸道是无菌的，当人体的肺部或支气管发生细菌性感染时，痰液分泌量会明显增加。经痰液细菌培养，分离出病原菌，有助于对下呼吸道感染性疾病的诊断和治疗。经痰液培养发现常见的致病菌：

革兰阳性菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、放线菌、奴卡菌、厌氧球菌、白喉棒状杆菌等；

革兰阴性菌：卡他布兰汉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌、假单胞菌、军团菌等。

传统习惯程序的痰液标本细菌学检验其临床符合率并不高，其原因是多方面的。除了痰标本采集不规范导致的不合格标本带来的培养结果与病人感染不相符外，还因为微生物和人体的相关性本身就具有复杂性：源自细菌的致病与条件致病的辨证性，如致病菌可能为正常携带，而细菌在肺通气功能异常病人的下呼吸道的可以发生单纯定植或感染，要证明培养结果与感染的相关性是医学微生物学所面临的难题，这也使得一直以来在对于痰培养的标准化进展十分缓慢。

痰液细菌培养阳性率普遍较低，临床符合率差的关键因素是痰标本采集不规范，不合格痰标本将直接导致病原菌被分离的机会降低，大量正常菌群也会抑制病原菌的生长或干扰病原菌的检出，降低了临床符合率；再有就是操作程序的不规范，不重视直接涂片，检验过程控制的不严密；且痰液中细菌的种类很多，它们的生理特性和所需要的培养条件不尽相同。如果要采用培养的方法技术食品中所有的细菌种类和数量，必须采用不同的培养基及培养条件，其工作量很大，以上均为导致临床符合率低的重要原因。

国内外对结核分枝杆菌的检测试剂主要基于抗体检测、核酸检测和药敏培养基检测等。目前，核酸检测已成为结核分枝杆菌检测的主要方法；对结核分枝杆菌的核酸检测主要有以下类型：PCR-荧光探针法、环介导恒温扩增法、荧光PCR熔解曲线法、PCR-反向点杂交法、DNA微阵列芯片法等。

由于抗体检测灵敏度较低、假阳性现象较多，核酸检测需要荧光PCR仪等大型仪器，且需事先对病原菌进行核酸提取、后续荧光检测耗时较长等特点，一种仪器应用广泛廉价、操作简便、结果判定直观、灵敏度高的检测方法呼之欲出。

荧光原位杂交（FluorescenceInSituHybridization,FISH）是一种分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期发展起来的一种非放射性原位杂交技术。FISH的基本原理是用荧光标记的单链核酸为探针，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。可用荧光标记的探针直接与染色体进行杂交从而对基因进行染色体定位。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

分子信标（molecularbeacon）是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号，因其检测具有高灵敏性、高特异性，且可用于活体实时检测，因而被广泛应用于生物学等诸多领域。

在病原菌遗传信息中，以16SrRNA基因为代表的核糖体RNA基因是病原菌上编码核糖体RNA（rRNA）相对应的DNA序列，存在于所有病原菌的基因组中。该基因具有高度的保守性和特异性以，对以16SrRNA基因为代表的核糖体RNA检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。

本发明有效拟合了荧光原位杂交技术、分子信标技术、荧光显微镜技术的优点，对痰液样本中的结核分枝杆菌进行直接、简便、有效的检测。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种快速检测痰液样本中结核分枝杆菌的试剂盒。

1.本发明的技术方案为：提供一种快速检测痰液样本中结核分枝杆菌的探针、方法和试剂盒。所述探针呈分子信标结构，即探针序列由茎环结构两部分组成，总长度25~50个碱基，其中中间的环序列部分与细菌中核糖体RNA（16srRNA、23srRNA等）序列相匹配，两端茎部分为5~10个互补的DNA序列，探针的5'-端用荧光基团标记，3'-端用荧光淬灭基团标记，在常温、游离状态下探针可自动退火形成发夹结构，荧光基团与荧光淬灭基团由于距离较近而不发出荧光信号，只有当探针与靶序列成功杂交之后，荧光基团与荧光淬灭基团彼此分离，进而发出荧光信号；所述探针是通过核酸杂交的原理检测痰液中的结核分枝杆菌，结核分枝杆菌分子信标探针序列〈SEQIDNo.1〉为：

5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’

2.本发明提供了一种用于检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括：

（1）权利要求1所述的探针；

（2）液化液；

（3）裂解液；

（4）终止液；

（5）固定液；

所述液化液包括：1%(w/v)PEG，0.6mMDTT，13.4mMNaCl，0.3mMKCl，1mMNaH₂PO₄，0.1mMKH₂PO₄，50mMEDTA，0.1%(v/v)TritonX-100，50mMTrisHClpH8.0；

所述裂解液包括：5M盐酸胍，0.2mMDTT，50mMEDTA，0.5%(w/v)过硫酸铵，0.1%(v/v)TritonX-100，10mMTrisHClpH7.0；

所述终止液包括50mMTrisHClpH10.0，0.5MNaCl，0.1%(v/v)NP-40，0.5%(v/v)TritonX-100；

所述固定液包括：5%(w/v)甘油，0.2MDTmT，25mMNaCl，0.3mMKCl，0.6mMNaH₂PO₄，0.6mMKH₂PO₄，50mMEDTA，10mMTrisHClpH7.0。

本发明提供了一种用于检测痰液样本中结核分枝杆菌的方法，所述方法采用上述试剂盒进行检测，所述方法包括以下步骤：

(a)取待检痰液样本，加入到液化液中，样本与所述液化液的体积比为1:1~1:10，震荡混匀；

(b)取按步骤(a)操作获得的液体5~10ul滴至载玻片上，50~65℃烘干5~10min；

(c)将按步骤(b)操作获得的载玻片浸入乙醇中5~10min，50~65℃烘干5~10min；

(d)在按步骤(c)操作获得的载玻片加样孔中加入探针5~10ul，置于加热板中50~65℃避光烘干5~10min；

(e)将按步骤(d)操作获得的载玻片浸入终止液中1~60sec，置于加热板中50~65℃烘干5~10min；

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液5~20ul，加盖盖玻片，用荧光显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用40×或100×物镜观察细菌形态。

本发明所述试剂盒和检测方法的技术要点或原理：本发明所述液化液对痰液样本进行液化处理，增强其均一性、流动性，易与载玻片加样孔结合。荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）是一种应用分子探针技术，通过荧光原位杂交的方法来检测痰液中细菌基因组特异性DNA或RNA的方法；分子信标是一种基于荧光共振能量转移原理设计的一种新型核酸荧光探针，其与靶序列结合会发生结构的变化从而影响荧光信号，该信号可通过荧光显微镜检测到。

本发明使用增强的多重FISH技术，在既有FISH技术基础上，使用荧光标记的分子信标作为病原体微生物保守核酸序列（核糖体rRNA）检测的探针，是对传统FISH技术的改进，并大幅减少了实验时间：利用核酸高特异性和灵敏性的分子信标技术对病原微生物保守核酸序列（核糖体rRNA）进行快速核酸杂交检测，通过荧光显微镜对分子信标荧光基团发出的荧光信号进行肉眼可见的直观结果判定。该技术检测的样本来源于临床病人呼吸道分泌液——痰液，检测前无需经过任何培养，可检测到临床上常见的微生物病原菌，整个检测过程仅需要荧光显微镜和加热板两款仪器，易于操作；具有不需核酸提取、操作简便、耗时短、无污染、直观有效等优点。

附图说明

图1为通过本发明所述的检测方法检测痰液样本中结核分枝杆菌的一种实施例的荧光显微镜镜检效果图。

具体实施方式

实施例1痰液样本中结核分枝杆菌的检测

检测方法：

(a)取待检痰液样本500ul，加入到1ml液化液中，震荡混匀；

(b)取按步骤(a)操作获得的液体10ul滴至载玻片上，置于加热板中52℃烘干5min；

(c)将按步骤(b)操作获得的载玻片浸入乙醇中5min，置于加热板中52℃烘干5min；

(d)在按步骤(c)操作获得的载玻片加样孔中加人探针10ul，置于加热板中52℃避光烘干5min；

(e)将按步骤(d)操作获得的载玻片浸入终止液中40sec，置于加热板中52℃烘干5min；

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液15ul，加盖盖玻片，用荧光显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用100×物镜观察细菌形态。在暗色背景中，结核分枝杆菌发出红色荧光，如图1所示。

核苷酸序列表

SEQUENCELISTING

<110>上海星耀医学科技发展有限公司

上海复星医药（集团）股份有限公司

迟,大利

吴,大治

夏,懿

<120>一种快速检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒

<130>detectionofMycobacteriumtuberculosisfromsputum

<140>cn

<141>2015-11-11

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>41

<212>DNA

<213>M.tuberculosis

<220>

<221>SEQIDNo.1

<222>(2)..(40)

<223>b=TXR;d=DABCYL

<400>1

bcacgcacgatacgggcagactagagtactgcagtgcgtgd。

Claims

1.一种用于检测痰液中结核分枝杆菌的探针，其特征在于：所述探针为分子信标探针，该分子信标探针由茎环结构两部分组成，总长度25~50个碱基，其中中间的环序列部分与细菌中核糖体RNA（16srRNA、23srRNA等）序列相匹配，两端茎序列部分为5~10个碱基互补的DNA序列，分子信标探针的5'-端用荧光基团标记，3'-端用荧光淬灭基团标记，在常温、游离状态下分子信标探针可自动退火形成发夹结构，荧光基团与荧光淬灭基团由于距离较近而不发出荧光信号，只有当分子信标探针中环序列部分与靶序列特异性结合之后，荧光基团与荧光淬灭基团彼此分离，进而发出荧光信号；所述探针是通过核酸杂交的原理检测痰液中的结核分枝杆菌，

结核分枝杆菌分子信标探针序列〈SEQIDNo.1〉为：

5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’。

2.一种用于检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

（1）权利要求1所述的探针；

（2）液化液；

（3）裂解液；

（4）终止液；

（5）固定液。

3.根据权利要求2所述的用于检测痰液中结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述液化液包括：1%(w/v)PEG，0.6mMDTT，13.4mMNaCl，0.3mMKCl，1mMNaH₂PO₄，0.1mMKH₂PO₄，50mMEDTA，0.1%(v/v)TritonX-100，50mMTrisHClpH8.0；

所述固定液包括：5%(w/v)甘油，0.2mMDTT，25mMNaCl，0.3mMKCl，0.6mMNaH₂PO₄，0.6mMKH₂PO₄，50mMEDTA，10mMTrisHClpH7.0。

4.一种采用如权利要求3所述试剂盒的用于检测痰液样本中结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(f)在按步骤(e)操作获得的载玻片加样孔中加入固定液5~20ul，加盖盖玻片，用荧光显微镜镜检观察，用10×物镜观察计数，用40×或100×物镜观察细菌形态；