CN108411014A - 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物和探针以及检测方法。属于生物检测技术领域，该引物和探针是依据A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD‑hyaC区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的序列作为检测序列设计得到。利用本发明检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，能够在A型和B型牛多杀性巴氏杆菌疫苗菌种的鉴定、筛选及生产质控中发挥作用。

Description

鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的 引物和探针以及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地涉及一种鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物和探针、包含该引物和探针的检测试剂盒、以及使用该引物和探针或检测试剂盒对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行非疾病诊断目的检测的方法。
背景技术
巴氏杆菌病
巴氏杆菌病(Pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM) 引起的一类传染病，可见于各种畜禽和人类。主要引起动物发生出血性败血病或传染性肺炎。动物之间互相传染，人被动物咬伤可感染。牛巴氏杆菌病潜伏期短，传播速度快，死亡率高，常对畜牧业造成重大的经济损失。
多杀性巴氏杆菌最早发现于1881年，多杀性巴氏杆菌根据荚膜型分为A、B、 D、E和F型。近年来，综合国内外报道发现引起牛多杀性巴氏杆菌病的主要血清型是A型和B型。
牛多杀性巴氏杆菌的诊断
多杀性巴氏杆菌的常规检测方法包括细菌分离培养以及分子生物学检测。细菌分离培养的方法不仅耗时，而且仅凭镜检存在较大的误差。目前广泛使用的普通PCR荚膜分型检测法可作为实验室诊断的常规方法，准确且耗时少。但普通PCR检测方法的敏感度有限，细菌数较少的情况下很难检出。
实时荧光定量PCR技术(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一种对基因组进行检测的相对定量技术，与普通PCR技术相比，增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析(Heid CA,Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.GenomeRes.1996Oct；6(10):986-94.)。实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用寡核苷酸探针实现相似性较高基因的鉴别。目前，该方法已广泛用于人类传染病的诊断和病原定量、以及动物病原体的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定等领域。中国专利公开第CN107164557A号公开了一种同时检测多杀性巴氏杆菌及其荚膜A型双重实时荧光定量PCR方法的引物及应用，但其并没有进行A型和B型多杀性巴氏杆菌的鉴别。
牛多杀性巴氏杆菌的预防
畜禽多杀性巴氏杆菌病的防治主要使用多杀性巴氏杆菌疫苗。目前，临床上使用的牛多杀性巴氏杆菌疫苗，多用于预防牛出血性败血症，疫苗株多为B 型多杀性巴氏杆菌。虽然该类疫苗在控制牛源巴氏杆菌病中起到了重要的作用，但是对不同血清型的交叉保护性弱。因此，越来越多的研究人员将目光投向了A 型、B型牛多杀性巴氏杆菌二联苗的开发。因此，准确、特异、快速地检测A型和B型牛多杀性巴氏杆菌抗原的水平在疫苗生产监控等方面具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物和TaqMan探针。
该引物和TaqMan探针依据A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的序列作为检测序列设计得到。
优选地，用于检测A型牛多杀性巴氏杆菌的上游引物的核苷酸序列如SED ID NO：1所示或其衍生序列，用于检测A型牛多杀性巴氏杆菌的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示或其衍生序列，用于检测B型牛多杀性巴氏杆菌的上游引物的核苷酸序列SED IDNO：3所示或其衍生序列，用于检测B型牛多杀性巴氏杆菌的下游引物的核苷酸序列SEQ IDNO：4所示或其衍生序列。
优选地，用于检测A型牛多杀性巴氏杆菌的TaqMan探针的核苷酸序列如 SED IDNO：5所示或其衍生序列，用于检测B型牛多杀性巴氏杆菌的TaqMan 探针的核苷酸序列SEDID NO：6所示或其衍生序列；探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
更优选地，用于检测A型牛多杀性巴氏杆菌的TaqMan探针的荧光基团为 ROX，荧光淬灭基团为BHQ2；用于检测B型牛多杀性巴氏杆菌的TaqMan探针的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为Tamra。
本发明的第二个目的是提供一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包含上述本发明的引物和TaqMan探针。
优选地，该检测试剂盒包含以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，A 型上游引物(20μM)0.5μL，A型下游引物(20μM)0.5μL，A型TaqMan探针(10μM)1μL，B型上游引物(10μM)0.5μL，B型下游引物(10μM)0.5 μL，B型TaqMan探针(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
更优选地，该检测试剂盒中还可包括标准品、阳性对照和阴性对照。标准品为含A型牛多杀性巴氏杆菌PCR扩增产物片段的质粒和B型牛多杀性巴氏杆菌PCR扩增产物片段的质粒；阳性对照为A型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA 和B型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA；阴性对照为不含A型或B型牛多杀性巴氏杆菌的反应体系。
本发明的第三个目的是提供一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法使用上述引物和探针或检测试剂盒，对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行非疾病诊断目的的定性、定量检测。
该方法包括以下步骤：
1)建立标准曲线：构建携带A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC基因的重组质粒pCR TOPO-PM-A标准质粒和/或携带B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD 基因的重组质粒pCRTOPO-PM-B标准质粒，用鉴定正确的重组质粒转录扩增，制备得到DNA标准品，将标准品稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、 1×103、1×102、1×101拷贝/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在上述本发明的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Cq值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在上述本发明的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR；
3)用得到的CQ值或荧光信号的变化对A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌进行定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌；再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌的拷贝数，实现定量检测；
该方法步骤1)和步骤2)中使用25μL双重实时荧光定量PCR反应体系，其包含：模板2μL，实时荧光定量2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，A型上游引物(20μM)0.5μL，A型下游引物(20μM)0.5μL，A型TaqMan 探针(10μM)1μL，B型上游引物(10μM)0.5μL，B型下游引物(10μM) 0.5μL，B型TaqMan探针(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL；双重实时荧光定量PCR反应条件为：95℃5min；然后94℃45s、56℃30s，45个循环。
优选地，该方法步骤3)中的定性检测使用以下方法进行判定：
35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为PM阳性，样品中含有A 型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌；37个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为PM阴性，样品中不含有A型或B型牛多杀性巴氏杆菌；35-37个循环之间判定为可疑，需重检。
优选地，该方法步骤2)中的待测样品包括作为疫苗生产原料的菌种、疫苗中间品或疫苗成品。
本发明提供了一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物和探针、包含该引物和探针的检测试剂盒。本发明能对A型和B 型牛多杀性巴氏杆菌实施快速的鉴别检测，可为疫苗生产过程中的菌种筛选提供有力依据，确保疫苗的安全性和合理性，对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌疫苗的生产具有指导作用。
本发明的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，还可以为后续灭活疫苗的效力检验提供前期技术基础，应用前景广阔。鉴于A 型和B型多杀性巴氏杆菌都是牛巴氏杆菌病的主要病原，本发明方法也用于对多杀性巴氏杆菌进行调查监控，并为后续防治处置提供客观数据。
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1示出本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的技术路线图；
图2示出使用本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测A型牛多杀性巴氏杆菌标准品的扩增曲线(图2中A图)和标准曲线(图2中B图)；
图3示出使用本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测B型牛多杀性巴氏杆菌标准品的扩增曲线(图3中A图)和标准曲线(图3中B图)；
图4示出本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的特异性检测结果的图；
图5示出本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的实时荧光定量 PCR检测方法的灵敏度检测结果的图；
图6示出本发明用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的实时荧光定量 PCR检测方法的重复性检测结果的图。
具体实施方式
生物基因组是直接反应生物基本信息的一个最客观的指标，不同的细菌所含有的基因组信息不同，通过基因组信息可将不同的细菌分类至不同的族群，利用基因组碱基互补配对的原则，可实现特异位点基因序列的大量扩增，从而通过一定的方法使得肉眼可见。
如图1所示，本发明基于以上基本原理设计了两对特异性引物和两条寡核苷酸探针，利用碱基互补配对的原理，建立了一种特异性检测A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法。
本发明所提供的用于对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行双重实时荧光定量PCR检测的引物为：A型上游引物(PM-A-F)的核苷酸序列如SED ID NO： 1所示，A型下游引物(PM-A-R)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，B型上游引物(PM-B-F)的核苷酸序列如SED ID NO：3所示，B型下游引物(PM-B-R) 的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
由上述引物衍生的引物序列也属于本发明。该衍生序列是指在SEQ ID NO： 1和/或SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4的基础上经过一至十个、优选一至五个、更优选一至二个、最优选一个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
本发明所提供的用于对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行双重实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针为：TaqMan A型探针(PM-A-P)的核苷酸序列如 SED ID NO：5所示；该探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团；TaqManB型探针(PM-B-P)的核苷酸序列如SED ID NO：6所示；该探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
由上述TaqMan探针衍生的序列也属于本发明。该衍生序列是指在SEQ ID NO：5和/或SED ID NO：6的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。
用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的A型 TaqMan探针(PM-A-P)的5’端报告荧光基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为 BHQ2；B型TaqMan探针(PM-B-P)的5’端报告荧光基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为Tamra。
为防止PCR扩增时TaqMan探针被延伸，该TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理。
本发明还提供一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其包含上述本发明的引物和探针。
具体来讲，该试剂盒包括以下用于25μL实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量Premix PCR反应液2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(购于TakaRa公司)12.5μL，PM-A-F(20μM)0.5μL，PM-A-R(20μM)0.5μL， PM-A-P(10μM)1μL，PM-B-F(10μM)0.5μL，PM-B-R(10μM)0.5μL， PM-B-P(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
为方便检测，试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为A型和B 型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA，阴性对照为不含A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
本发明进一步提供一种使用上述本发明的引物和探针或检测试剂盒对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行非疾病诊断目的的定性、定量检测的方法。
该方法包括以下步骤：
1)建立标准曲线：选取A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC基因的特异性保守序列作为标准品构建序列，设计对A型牛多杀性巴氏杆菌进行实时荧光定量PCR检测的标准品引物，构建携带A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC特异性保守区域检测基因的重组质粒pCRTOPO-PM-A标准质粒，对鉴定正确的重组质粒进行转录，制备DNA标准品。将DNA标准品分别以10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在上述本发明的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测。检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴) 对其相应Cq值(Y轴)作图，绘制A型牛多杀性巴氏杆菌的标准曲线。选取B 型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD基因的特异性保守序列作为标准品构建序列，设计对B型牛多杀性巴氏杆菌进行实时荧光定量PCR检测的标准品引物，构建携带 B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域检测基因的重组质粒pCR TOPO-PM-B标准质粒，对鉴定正确的重组质粒进行转录，制备DNA标准品。将DNA标准品分别以10倍梯度稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在上述本发明的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log 值(X轴)对其相应Cq值(Y轴)作图，绘制B型牛多杀性巴氏杆菌的标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在上述本发明的引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测；
3)用得到的CQ值或荧光信号的变化实现对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌，再根据荧光信号的强度和步骤1)中的两条标准曲线，得出待测样品中所含A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的拷贝数，实现定量检测。
该方法步骤3)中的定性检测使用以下方法进行判定：35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌阳性(样品中含有A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌)，37个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为A型和B型牛多杀性巴氏杆菌阴性(样品中不含有A型或B 型牛多杀性巴氏杆菌)，35-37个循环之间判定为可疑，需重检。
本发明的双重实时荧光定量PCR检测方法只对PM样品有扩增曲线而对其它同属种细菌样品无扩增曲线，且本发明充分利用A型和B型牛多杀性巴氏杆菌两者基因序列的差异，并利用探针序列差异2个碱基之上无法扩增的原理，从A型牛多杀性巴氏杆菌保守基因hyaD-hyaC中筛选出三处较好的位点(自5’端2648-2667、2676-2704、2808-2827位点)，用PM-A-F、PM-A-P和PM-A-R 可扩增A型牛多杀性巴氏杆菌，PCR扩增若出现标准的“S”型曲线可以确认其为A型牛多杀性巴氏杆菌，因与B型牛多杀性巴氏杆菌以及其它荚膜型巴氏杆菌序列的差异，无法扩增B型牛多杀性巴氏杆菌和其它荚膜型巴氏杆菌序列 (未出现“S”型曲线)；同时，从B型牛多杀性巴氏杆菌保守基因bcbD中筛选出三处较好的位点(自5’端226-246、307-326、271-295位点)，用PM-B-F、 PM-B-P和PM-B-R可扩增B型牛多杀性巴氏杆菌，PCR扩增若出现标准的“S”型曲线可以确认其为B型牛多杀性巴氏杆菌，因与A型牛多杀性巴氏杆菌以及其它荚膜型巴氏杆菌序列的差异，无法扩增A型牛多杀性巴氏杆菌和其它荚膜型巴氏杆菌序列(未出现“S”型曲线)，综合以上内容，可以实现鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的目的。
在上述方法中，步骤2)中的待测样品可以为细菌培养物以及用于疫苗生产的菌种，对其检测用于非诊断目的。通过对此类待测样品中A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌的定量检测以实现对临床病料(病牛肺组织、鼻拭子等)非诊断目的检测及监控，并为后续研究提供客观数据。
在上述方法中，步骤1)和步骤2)中使用25μL双重实时荧光定量PCR 反应体系，其可包括：模板2μL，实时荧光定量Premix PCR反应液2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(购于TakaRa公司)12.5μL，PM-A-F(20μM)0.5μL， PM-A-R(20μM)0.5μL，PM-A-P(10μM)1μL，PM-B-F(10μM)0.5μL， PM-B-R(10μM)0.5μL，PM-B-P(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。A型牛多杀性巴氏杆菌引物稀释为20ng/μL，反应体系中最终加量为10ng，B型牛多杀性巴氏杆菌引物稀释为10ng/μL,反应体系中最终加量为5ng。A型牛多杀性巴氏杆菌TaqMan探针稀释为10ng/μL，反应体系中最终加量为10ng，B型牛多杀性巴氏杆菌TaqMan探针稀释为10ng/μL，反应体系中最终加量为10ng。
在上述方法中，步骤1)和步骤2)中的双重实时荧光定量PCR反应条件可为：先95℃5min；然后95℃45s，56℃30s，45个循环。在每个循环的退火结束时进行荧光信号检测。
实施例
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位 mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的公开内容不限于下述的实施例。
实施例1.设计用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引 物和TaqMan探针
由于A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的核苷酸序列比较大，寻找较好的不同位点特异性的进行A型和B型牛多杀性巴氏杆菌检测是关键。从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索分别获得A型牛多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC的区域基因(Pasteurella multocida capsule biosynthesis gene cluster，GenBank号：AF067175.2)和B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD的区域基因 (Pasteurella multocida capsulebiosynthesis gene cluster,complete sequence GenBank号：AF169324)的序列，用DNAMan软件进行比对后，根据引物、 TaqMan探针设计原则，分别选取A型牛多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC的区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域基因，用Primer 3.0网页(http://primer3.ut.ee)设计对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行双重实时荧光定量PCR检测的引物及TaqMan探针。通过大量分析，本发明确定出hyaD-hyaC 片段为荚膜A型牛多杀性巴氏杆菌的相对保守区域，bcbD基因为荚膜B型牛多杀性巴氏杆菌的相对保守区域，分别在A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的保守区设计引物，经过比较筛选，选择二聚体少且条带单一的引物，最终确定的引物和探针序列如下：
PM-A-F(上游引物)：5’-TAGCGCATGAGCTTCTGACG-3’(SED ID NO： 1)，
PM-A-R(下游引物)：5’-TTATATGCCTTGGGACGAA-3’(SED ID NO： 2)；
PM-B-F(上游引物)：5’-CGGCTCAGACATACCAATCCA-3’(SED ID NO： 3)，
PM-B-R(下游引物)：5’-TACGGAGGTGCTGCTCAAAG-3’(SED ID NO： 4)；
PM-A-P(TaqMan荧光探针)：
5’-ROX-AGAAGTCATCACATCCTGCCAGTCAATTG-BHQ2-3’(SED ID NO： 5)。
PM-A-P的报告荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。
为防止PCR扩增时探针被延伸，探针的3’端已经磷酸化处理。
PM-B-P(TaqMan荧光探针)：
5’-FAM-CCACTCTTGAAATAGGTAGTCTGGA-Tamra-3’(SED ID NO：6)。
PM-B-P的报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ2。
为防止PCR扩增时探针被延伸，探针的3’端已经磷酸化处理。
所用引物由北京华大基因有限公司合成；所用探针由TAKARA基因公司合成。
实施例2.使用本发明的引物及TaqMan探针对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行双 重实时荧光定量PCR鉴别检测
步骤一.提取样品的基因组DNA
分别对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的细菌培养物(用于获得标准品和获得阳性对照)以及待测样品提取基因组DNA，具体方法包括以下步骤( Blood&Tissue Kit，QUAIGEN公司)：
(1)QUAIGEN试剂盒准备：按试剂盒说明书，预先准备(96％-100％) 乙醇并在试剂Buffer AW1和Buffer AW2中添加指定浓度的无水乙醇。
(2)在1.5mL离心管中加入100μL的样品，并加入20μL蛋白酶K和180 μl BufferATL，漩涡震荡混匀。
(3)在步骤(2)的1.5mL离心管中，向样品及试剂的混合液中加200μL Buffer AL，漩涡震荡混匀。
(4)在步骤(3)的1.5mL离心管中，向样品及试剂的混合液中加200μL (96％-100％)乙醇，漩涡震荡混匀。
(5)将制备管置于2mL离心管中(试剂盒内提供)，取步骤(4)的混合液移入制备管中，以6000g离心1min。
(6)弃离心液，将制备管置回至2mL离心管中，加500μL Buffer AW1，以6000g离心1min。
(7)弃离心液，将制备管置回至2mL离心管中，加500μL Buffer AW2，以12000g离心3min。
(8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管的膜中央加100μL无酶水，室温静置1min。以6000g离心1min洗脱DNA，得到DNA溶液。
将从待测样品中提取的DNA作为检测样；A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的细菌培养物中提取的DNA作为阳性对照样；按照下述步骤二的方法将从A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的细菌培养物中提取的DNA制备得到标准品。
步骤二.鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
1.为了制备DNA标准品，首先使用PCR分别扩增A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因，根据引物设计原则，分别设计用于扩增上述基因以制备DNA标准品的引物，序列如下：
用于扩增A型牛多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC区域基因以制备DNA标准品的引物：
PM-A-S-F(上游引物)：5’-GGATCGAGAAAATCAATGCGC-3’(SED ID NO：7)，
PM-A-S-R(下游引物)：5’-ATGAAGAAAATTACAATTGCTGG-3’(SED ID NO：8)；
用于扩增B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域基因以制备DNA标准品的引物：
PM-B-S-F(上游引物)：5’-GCCCACAATTCAAATGCCCT-3’(SED ID NO： 9)，
PM-B-S-R(下游引物)：5’-TAATTTGTGGCCAGCTACGG-3’(SED ID NO： 10)；
所用引物由北京华大基因有限公司合成。
对步骤一提取的来自A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的基因组DNA分别进行PCR扩增，得到A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的目的片段，25μL反应体系如下：
表1 A型牛多杀性巴氏杆菌hyaD-hyaC区域基因的PCR扩增体系
试剂名称 体积(μL)
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12.5
PM-A-S-F(20μM) 0.5
PM-A-S-R(20μM) 0.5
DNA模板 2.0
RNA-free H2O 9.5
表2 B型牛多杀性巴氏杆菌bcbD区域基因的PCR扩增体系
试剂名称 体积(μL)
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12.5
PM-B-S-F(20μM) 0.5
PM-B-S-R(20μM) 0.5
DNA模板 2.0
RNA-free H2O 9.5
2.标准品制备
将纯化回收的A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因(含检测基因的目的片段)和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因(含检测基因的目的片段)克隆至pCR TOPO载体(购自Invitrogen公司)中，构建成重组质粒，并筛选阳性重组质粒，由华大基因公司测序，验证质粒构建是否成功。测序结果表明获得了序列正确的携带A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域或B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的重组质粒，分别命名为pCRTOPO-PM-A 标准质粒和pCR TOPO-PM-B标准质粒，将鉴定正确的重组质粒转录后扩增，制备得到DNA标准品。
3.双重实时荧光定量PCR标准曲线的建立
分别对测序正确的携带A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因的重组质粒pCR TOPO-PM-A标准质粒和携带B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的重组质粒pCRTOPO-PM-B标准质粒提取出的DNA，用Nanodrop测定浓度，并计算各标准品的拷贝数，按照10倍梯度将标准品稀释至1×108、1×107、 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，每个样品做3个重复，以不同浓度的标准品作为模板，在引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测。
双重实时荧光定量PCR的反应体系(25μL)如下：
表3 A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR反应体系
试剂名称 体积(μL)
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12.5
PM-A-F(20μM) 0.5
PM-A-R(20μM) 0.5
PM-B-F(10μM) 0.5
PM-B-R(10μM) 0.5
PM-A-P(10μM) 1.0
PM-B-P(10μM) 1.0
DNA模板 2.0
RNA-free H2O 6.5
双重实时荧光定量PCR的反应条件为(定量PCR仪，型号CFX96，购自美国伯乐)：PCR扩增条件：95℃5min；94℃45s、56℃30s，45个循环。
标准品的双重实时荧光定量PCR扩增曲线如图2中A图和图3中A图所示，标准品扩增曲线为平滑的“S”形曲线(阳性)，图2中A图和图3中A 图中八组线条从左向右对应的标准品浓度分别为1×108、1×107、1×106、1×105、 1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL。检测结束后，以各标准品的浓度Log值 (X轴)对其相应Cq值(Y轴)作图，绘制标准曲线。A型多杀性巴氏杆菌标准曲线如图2中B图所示，B型多杀性巴氏杆菌标准曲线如图3中B图所示，相关系数分别为R2＝0.999和R2＝0.998，误差较小，标准曲线可用。
实施例3.特异性实验
按照实施例2的方法利用QUAIGEN试剂盒对A型、B型、D型、E型和F 型牛多杀性巴氏杆菌、布鲁氏菌、牛A型梭菌、牛B型梭菌、牛C型梭菌、牛 D型梭菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、鼻气管炎病毒(IBRV)提取DNA，对口蹄疫A型、口蹄疫O型、口蹄疫Asia型、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛流行热病毒提取RNA，同时以A型和B型牛多杀性巴氏杆菌细菌培养物提取的 DNA为阳性对照，以无酶水为阴性对照，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的特异性。
检测结果如图4所示，仅有A型和B型牛多杀性巴氏杆菌出现特定的“S”型扩增曲线，结果阳性，其它样品未出现特定的“S”型扩增曲线，结果阴性。检测结果表明用本发明的方法可特异性地检测A型和B型牛多杀性巴氏杆菌。
实施例4.灵敏度实验
按照实施例2所述，将携带A型牛多杀性巴氏杆菌的pCR TOPO-PM-A标准质粒和B型牛多杀性巴氏杆菌的pCR TOPO-PM-B标准质粒标准品按照10倍梯度分别稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝 /μL，以不同浓度的标准品作为模板，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的灵敏度。
检测结果如图5所示，显示本发明A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法可以检测至1×102拷贝/μL，约为1×10-12g/μL。
实施例5.重复性实验
按照实施例2所述，将稀释好的用于定量方法的标准品的8个梯度作为模板，每个梯度进行3个重复，在本发明引物和TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系及反应条件参照实施例2，以验证该方法的重复性。
检测结果如图6和表4所示，从图6中可见每一个浓度梯度的扩增曲线较聚拢，循环数无明显差距，表明本发明的鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好，循环数标准偏差相差最高仅为 0.45。
表4 A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量重复性验证试验结果
实施例6.鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒
基于实施例1和2，本发明所提供的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物 (PM-A-F、PM-A-R、PM-B-F和PM-B-F)和TaqMan探针(PM-A-P和PM-B-P)。
具体来讲，该试剂盒包括以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：Premix PCR反应液2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)(购于TakaRa 公司)12.5μL，PM-A-F(20μM)0.5μL，PM-A-R(20μM)0.5μL，PM-A-P (10μM)1μL，PM-B-F(10μM)0.5μL，PM-B-R(10μM)0.5μL，PM-B-P (10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL。
为方便检测，试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，阳性对照为A型和 B型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA，阴性对照为不含A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)。
试剂盒中各试剂的使用可参考实施例2的内容。
实施例7.双重实时荧光定量PCR检测方法对样品的检测
用建立的用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR 检测方法对35份牛多杀性巴氏杆菌临床分离菌落、菌液培养物等样品进行了检测，均可检测到A型或B型牛多杀性巴氏杆菌特异性的荧光信号。检测结果如表5所示，双重实时荧光定量PCR方法对A型牛多杀性巴氏杆菌的检出率为17/35，普通PCR方法检出率为14/35，双重实时荧光定量PCR方法对B型牛多杀性巴氏杆菌的检出率为16/35，普通PCR方法检出率为12/35。
表5双重实时荧光定量PCR对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的临床样品检测结果
序列表
<110> 金宇保灵生物药品有限公司
<120> 鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物和探针以及检测方法
<141> 2018-04-28
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> PM-A上游引物（PM-A-F）(人工序列)
<400> 1
tagcgcatga gcttctgacg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> PM-A下游引物（PM-A-R）(人工序列)
<400> 2
ttatatgcct tgggacgaa 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> PM-B上游引物（PM-B-F）(人工序列)
<400> 3
cggctcagac ataccaatcc a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> PM-B下游引物（PM-B-R）(人工序列)
<400> 4
tacggaggtg ctgctcaaag 20
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> PM-A TaqMan荧光探针（PM-A-P）(人工序列)
<400> 5
agaagtcatc acatcctgcc agtcaattg 29
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> PM-B TaqMan荧光探针（PM-B-P）(人工序列)
<400> 6
ccactcttga aataggtagt ctgga 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> PM-A标准品上游引物（PM-A-S-F）(人工序列)
<400> 7
ggatcgagaa aatcaatgcg c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> PM-A标准品下游引物（PM-A-S-R）(人工序列)
<400> 8
atgaagaaaa ttacaattgc tgg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> PM-B标准品上游引物（PM-B-S-F）(人工序列)
<400> 9
gcccacaatt caaatgccct 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> PM-B下游引物（PM-B-S-F）(人工序列)
<400> 10
taatttgtgg ccagctacgg 20

Claims (10)

1.一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物或TaqMan探针，依据A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC区域基因和B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD区域基因的序列作为检测序列设计得到。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的引物，其特征在于，A型上游引物的核苷酸序列如SED ID NO：1所示或其衍生序列，A型下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示或其衍生序列，B型上游引物的核苷酸序列SEDID NO：3所示或其衍生序列，B型下游引物的核苷酸序列SEQ ID NO：4所示或其衍生序列。
3.根据权利要求1所述的用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的TaqMan探针，其特征在于，A型TaqMan探针的核苷酸序列如SED ID NO：5所示或其衍生序列，B型TaqMan探针的核苷酸序列SED ID NO：6所示或其衍生序列；所述探针经过荧光标记，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。
4.根据权利要求3所述的用于鉴别牛A型和牛B型牛多杀性巴氏杆菌的双重进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针，其特征在于，A型TaqMan探针的荧光基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2；B型TaqMan探针的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为Tamra。
5.一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的引物和权利要求1、3或4所述的TaqMan探针。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含以下用于25μL双重实时荧光定量PCR反应体系的试剂：实时荧光定量一步法2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，A型上游引物(20μM)0.5μL，A型下游引物(20μM)0.5μL，A型TaqMan探针(10μM)1μL，B型上游引物(10μM)0.5μL，B型下游引物(10μM)0.5μL，B型TaqMan探针(10μM)1μL，RNA-freeH2O 6.5μL。
7.根据权利要求4或5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还可包括标准品、阳性对照和阴性对照，所述标准品为含A型牛多杀性巴氏杆菌PCR扩增产物片段的质粒和B型牛多杀性巴氏杆菌PCR扩增产物片段的质粒，所述阳性对照为A型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA和B型牛多杀性巴氏杆菌基因组DNA，所述阴性对照为不含A型或B型牛多杀性巴氏杆菌的反应体系。
8.一种用于鉴别A型和B型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量PCR的检测方法，其包括使用权利要求5-7中任一项所述的检测试剂盒对A型和B型牛多杀性巴氏杆菌进行非疾病诊断目的定性、定量检测，其特征在于，包括以下步骤：
1)建立标准曲线：构建携带A型牛多杀性巴氏杆菌的hyaD-hyaC基因的重组质粒pCRTOPO-PM-A标准质粒和/或携带B型牛多杀性巴氏杆菌的bcbD基因的重组质粒pCR TOPO-PM-B标准质粒，用鉴定正确的重组质粒转录扩增，制备得到DNA标准品，将标准品稀释成1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101拷贝/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在权利要求1或2所述的引物和权利要求1、3或4所述的TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Cq值(Y轴)作图，绘制标准曲线；
2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述的引物和权利要求1、3或4所述的TaqMan探针的引导下进行双重实时荧光定量PCR；
3)用得到的CQ值或荧光信号的变化对A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌进行定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌；再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌的拷贝数，实现定量检测；
所述步骤1)和步骤2)中使用25μL双重实时荧光定量PCR反应体系，其包含：模板2μL，实时荧光定量2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，A型上游引物(20μM)0.5μL，A型下游引物(20μM)0.5μL，A型TaqMan探针(10μM)1μL，B型上游引物(10μM)0.5μL，B型下游引物(10μM)0.5μL，B型TaqMan探针(10μM)1μL，RNA-free H2O 6.5μL；所述双重实时荧光定量PCR反应条件为：95℃5min；然后94℃45s、56℃30s，45个循环。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的所述定性检测使用以下方法进行判定：
35个循环内若出现“S”型扩增曲线，则确认为PM阳性，样品中含有A型和/或B型牛多杀性巴氏杆菌；37个循环以上未出现“S”型扩增曲线，则确认为PM阴性，样品中不含有A型或B型牛多杀性巴氏杆菌；35-37个循环之间判定为可疑。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的待测样品包括作为疫苗生产原料的菌种、疫苗中间品或疫苗成品。
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