CN110373485A - 一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒 - Google Patents

一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒，具体的本发明将筛选出的针对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的不同引物、探针进行组合测试，获得了具有较佳特异性和灵敏度的针对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的多重检测体系，可实现单管检测3种病原体，一次试验完成3种病原体的测试，极大降低了检测的工作量。

Description

一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒。
背景技术
解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)是一类介于细菌和病毒之间，没有细胞壁的原核微生物。目前已知与人类疾病有关的有14种血清型，分为两个生物群，即微小脲原体(U.parvum，UPA)包括血清型1，3，6，14；解脲脲原体(U.urealyticum，UUR)包括其余10种血清型。Uu广泛存在于健康人群泌尿生殖道中，但同时也与很多疾病有关，如非淋球菌性尿道炎、绒毛膜羊膜炎等，一定条件下能引起泌尿系统感染和不孕症。解脲脲原体多寄生在男性尿道、阴茎包皮和女性阴道。可引起男性前列腺炎或附睾炎、女性阴道炎、宫颈炎，并可感染胎儿导致流产、早产及低体重胎儿，也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系的感染。目前Uu的致病机制还不清楚。实验室诊断方法有分离培养、检测解脲脲原体抗原或核酸成分。
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体，除能引起化脓性宫颈炎、阴道炎、尿道炎外，还能经生殖道上行感染，有可能引起急、慢性输卵管炎，子宫内膜炎等盆腔炎症，患病人群以青壮年为主。感染后，潜伏期为数天到数月，一般是1～3周。感染沙眼衣原体后妇女最常见的是引起化脓性宫颈炎，出现脓性白带增多，可伴有外阴瘙痒。如果引起尿道炎时，约一半病人出现尿急、尿频和排尿困难。
淋球菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)为引发淋病的病原体，存在于急性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，形态染色类似于脑膜炎球菌。这种病菌拥有自我调节能力，能够通过变异获得抗药性，或者使药物的疗效下降，并且它正在对越来越多种类的抗生素发展出免疫力。人类是淋球菌唯一的自然宿主，淋病主要由性接触而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫颈炎。如治疗不彻底，可扩散至生殖系统。胎儿可经产道感染造成新生儿淋病性急性结膜炎。人类对淋球菌无自然免疫力，均易感，病后免疫力不强，不能防止再感染。
因此，本领域技术人员致力于开发简单、方便、快捷且成本较低的上述致病菌检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的三联检试剂盒及检测方法。
本发明的第一方面，提供了一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的PCR引物对组，所述引物对组包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物；
第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物；以及
第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:8所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对组还包括：
第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:10所示的正向引物；和，如SEQID NO.:11所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的探针组，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:6所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:9所示的第三探针。
在另一优选例中，所述探针组还包括：如SEQ ID NO.:12所示的第四探针。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
所述第一引物对、和所述第一探针；所述第二引物对、和所述第二探针；所述第三引物对、和所述第三探针。
在另一优选例中，所述PCR反应液还包括所述第四引物对、和所述第四探针。
在另一优选例中，所述PCR反应液还包括dNTPs、和/或PCR缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括PCR酶系，所述PCR酶系包括选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、和UNG酶。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
本发明的第四方面，提供了一种检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的基因；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组。
在另一优选例中，所述步骤(2)中在实时荧光PCR仪中进行扩增反应。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对组、和本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体，和/或淋球菌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1.解脲脲原体检测限PCR测试结果；
图2.沙眼衣原体检测限PCR测试结果；
图3.淋球菌检测限PCR测试结果；
图4.内标PCR测试结果；
图5.解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌特异性PCR测试结果；
图6.解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌特异性检测内标PCR测试结果；
图7.解脲脲原体精密度PCR测试结果；
图8.沙眼衣原体精密度PCR测试结果；
图9.淋球菌精密度PCR测试结果；
图10.解脲脲原体准确性PCR测试结果；
图11.沙眼衣原体准确度PCR测试结果；
图12.淋球菌准确度PCR测试结果；
图13.解脲脲原体干扰性PCR测试结果；
图14.沙眼衣原体干扰性PCR测试结果；
图15.淋球菌干扰性PCR测试结果。
图16.多重检测UU对照引物对1-UU。
图17.多重检测UU对照引物对1-CT。
图18.CT引物对2检测结果。
图19.多重检测CT通道(CT引物对3)。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，人工设计多对引物和探针，再对其进行优化选择并验证，最后将筛选出的针对各病原体的不同引物、探针进行组合测试，获得了具有较佳特异性和灵敏度的针对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的多重检测体系。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
实时荧光定量PCR
目前解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的实验室检测方法主要有分离培养法、免疫学方法、涂片镜检、基于核酸PCR法等。培养法具有较高的特异性和敏感性，但临床检测时间过长，过程繁琐，不适用于大范围检测。免疫学方法简便快捷，但灵敏度低、特异性差。而聚核酶链式反应(PCR)法经过逐步的发展，显现了其在检测上的优势。
实时荧光PCR技术是在核酸反应管中加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时,探针结合在DNA任意一条单链上；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR技术是一种灵敏度、特异性和精密度更高的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能反应病原体变化，同时避免了传统PCR需后处理的问题，降低了污染的可能性。
目前依据实时荧光定量PCR技术开发的解脲脲原体、沙眼衣原体或淋球菌DNA的试剂盒产品，大都是针对解脲脲原体、沙眼衣原体或淋球菌的单重检测试剂盒，对于多种病原体微生物混合的检测的产品很少，且多重检测的产品性能普遍较差，存在灵敏度低，特异性差等问题。基于此，开发一套灵敏度高、特异性强、重复性好的产品用于泌尿生殖道微生物的检测显得非常必要。
多重实时荧光PCR法，在同一个反应体系内使用多种荧光标记就可以实现对多重病原体的同时检测，而且特异性强，灵敏度高，操作简便快捷，所用仪器容易普及，易于推广使用。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本发明人在研究过程中，对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的PCR扩增引物进行了设计及实验验证。结果表明，使用多重荧光PCR扩增体系，由于检测方法的限制性，很难在同一检测体系中有效检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌。经过深入研究和反复实验，人工设计多对引物和探针，再对其进行优化选择并验证，最后将筛选出的针对各病原体的不同引物、探针进行组合测试，最终很好地解决多重荧光PCR体系引物间互相干扰抑制的难题，获得了具有较佳特异性和灵敏度的针对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的多重检测体系，体系中各引物探针序列信息见表1，其中，F为正向引物，R为反向引物，P为探针。
表1多重体系中引物和探针序列
在此基础上，本发明提供了一种特异性检测样品中解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的寡核苷酸序列组合。
试剂盒
在上述多重检测体系基础上，本发明提供一种特异性检测样品中解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的试剂盒，其中用于解脲脲原体扩增的引物序列为：SEQ NO:1：CAGAAGCTGTYGCTTTAATTACTGA和SEQ ID NO.:2:ACGTARTACTTCACGAGC AGATTG，对应的检测探针的序列和标记为SEQ ID NO.:3:5’FAM-AACTARCTTACCATCTC TTGCCCCTTCC BHQ1-3’；用于沙眼衣原体扩增的引物序列为：SEQ NO:4：AAGAAATTGATCCAACACCCTT和SEQ ID NO.:5:CAAGGTCGATGTGATAGGGAAAG，对应的检测探针的序列和标记为SEQ ID NO.:6:5’HEX-TCGCCGATGAGTTCGACATTCCAC BHQ1-3’；用于淋球菌扩增的引物序列和标记为为：SEQ NO:7：GATTTCGGCGGCTGGAG和SEQ ID NO.:8:TTTATGCTGACGGAATATTTACTGT，对应的检测探针的序列和标记为SEQ ID NO.:9:5’Texas red-TAGCGGCAGATTATGCCCGTTACAG-BHQ2-3’。本发明各病原体的探针标记不限于列出的同一波长的单个标记，包括不同标记的不同组合形式的多重检测试剂。
在一个优选地实施方式中，所述试剂盒还包括内标质控及扩增引物和检测探针；内标质控含有序列如SEQ ID NO.:13:TTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGACCCCTGGACCA所示的GAPDH目的基因片段；内标质控扩增引物序列分别SEQ ID NO.:10:TTTGGCTACAGCAACAGGGT和SEQ ID NO.:11:TGGTCCAGGGGTCTTACTCC所示，对应的检测探针的序列和标记为SEQ NO:12：5’Cy5-ACCTCATGGCCCACATGGCCTC-BHQ2-3’。选择GAPDH目的基因片段作为内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。
在一个优选地实施方式中，所述试剂盒包括灭活的沙眼衣原体、解脲脲原体和淋球菌阳性对照和灭菌生理盐水的阴性对照。
在一个优选地实施方式中，所述试剂盒包括含有针对解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌和内标GAPDH的引物、探针，dNTPs(dU)(dATP:dCTP:dGTP:dUTP＝1:1:1:2)及PCR缓冲液的PCR反应液；和，含有热启动Taq酶(来自中山大学达安基因股份有限公司，货号：E0201)和UNG酶(购自菲鹏生物股份有限公司公司，货号MD014)的PCR酶系，其中引物和探针的浓度优选为约0.1-1μM，dNTPs(dU)浓度优选为约0.2-0.4mM，MgCl2浓度优选为约2-5mM,UNG酶浓度优选为约1-3U，热启动Taq浓度优选为约2.5-10U。
在一个优选地实施方式中，所述检测试剂盒使用过程中PCR反应体系中各组分的含量如下：
检测方法
本发明还提供了解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检方法，包括如下步骤：
提取待测样本(提取试剂可以采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20150348号)，得到核酸样本(阳性质控、阴性质控和内标质控同步参与提取)；
取20μL加入到上述PCR反应液(27μL)和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、VIC/HEX、Texas red和Cy5,PCR扩增程序如下；
50℃，2min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec(搜集荧光)；40个循环。
PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体DNA的阴、阳性，检测结果可用于解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为研究提供可靠的依据。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的试剂为多重检测试剂，可实现单管检测3种病原体，一次试验完成3种病原体的测试，极大降低了检测的工作量。
(2)本发明的检测试剂盒体系中含有内源性内标质控体系，可全程监控取样、样本保存、核酸提取以及PCR扩增整个过程，防止假阴性的出现。
(3)本发明的多重检测试剂盒，不仅灵敏度高、特异性好，而且对污染样本的抗干扰能力强，不仅能够用于疾病的诊断，还能够用于非诊断目的，比如在卫生防疫工作中用于环境污染物的监控等。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料与方法
1.样本
以下实施例中的解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌灭活培养物均通过临床分离获得，经由常规微生物学鉴定为解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌。
特异性参考品人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、脑膜炎奈瑟菌、嗜血短杆菌、大肠杆菌、EB病毒、金黄色葡萄球菌均为临床分离并经由常规微生物学鉴定后保存的菌(毒)株。本实施例中涉及的微生物材料可通过中山大学达安基因股份有限公司获得。
2.临床样本
医院临床采集的50例呼吸道病原体阳性样本和20例阴性样本。
3.引物和探针
本发明中所用引物和探针均由上海生工生物股份有限公司合成，具体序列特征和探针标记如上所述。
4.核酸提取
提取采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20150348号)，按试剂盒说明书进行操作。提取后的核酸置于-20℃冰箱中。
5.多重荧光PCR反应
多重荧光PCR采用单管50μl反应体系，多重体系主要包含针对解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌和内标GAPDH的引物、探针，dNTPs(dU)(dATP:dCTP:dGTP:dUTP＝1:1:1:2)及PCR缓冲液的PCR反应液；和，含有热启动Taq酶(来自中山大学达安基因股份有限公司，货号：E0201)和UNG酶(购自菲鹏生物股份有限公司公司，货号MD014)的PCR酶系。
采用ABI 7500 PCR仪进行扩增，扩增条件为：
50℃，2min，95℃，15min；1个循环
94℃，15sec，55℃，45sec(搜集荧光)；40个循环。
体系的优化实验，每对引物和探针用相同用量，以梯度稀释的阳性核酸为模板进行检测，单重条件下初步筛选扩增效率高的引物探针对；将筛选的引物探针对进行组合，测试每种组合中引物探针对之间是否有竞争抑制及非特异扩增情况；选择效果较好的组合，根据荧光值的高低和Ct值情况对引物探针用量进行优化。
实施例1、解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒检测限测试
将以已定值的解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌灭活培养物做为初始样本分别稀释至浓度为105copies/ml，依次稀释至104、103、500、250、100copies/ml，各浓度样本中分别加入终浓度为104copies/ml的含内标扩增片段的质粒菌作为待检样本，测试3重检测试剂的灵敏度。
检测结果如图1、2、3所示，结果表明本发明的多重检测体系针对解脲脲原体的检测灵敏度能够达到250copies/ml，针对沙眼衣原体的检测灵敏度能够达到250copies/ml，针对淋球菌的检测灵敏度能够达到250copies/ml。
实施例2、解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒特异性测试
以生理盐水、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、脑膜炎奈瑟菌、嗜血短杆菌、大肠杆菌、EB病毒、金黄色葡萄球菌作为特异性参考品，测试解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒的特异性。
检测结果如图5和图6所示，检测结果表明，本发明的多重检测体系，特异性良好，针对非靶标病原体和阴性对照(生理盐水)均没有非特异性扩增反应。检测特异性参考品(生理盐水、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型、单纯疱疹病毒Ⅱ型、脑膜炎奈瑟菌、嗜血短杆菌、大肠杆菌、EB病毒、金黄色葡萄球菌)，检测结果均为阴性，内标质控均为阳性。
实施例3、解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒精密度测试
分别将解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌灭活培养物稀释至105和103copies/ml作为精密度参考品，各重复10次，计算各浓度精密度参考品的变异系数。
检测结果分别如图7、图8、和图9所示，检测结果表明，本发明的多重检测体系，具有较佳的精密度，针对不同的浓度的样本，不同检测批次内无显著差异，完全能够满足临床精密度的要求。经测试解脲脲原体高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数分别为1.16％和1.54％；沙眼衣原体高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数分别为0.68％和1.10％；淋球菌高浓度和低浓度精密度参考品的变异系数分别为1.13％和1.45％；三种病原体不同浓度的精密度参考品的变异系数均小于5％。
实施例4、解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒准确性测试
分别制备5份不同浓度(浓度分别为105、105、104、104、103copies/ml)的解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌灭活培养物作为阳性参考品，经提取后以解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒测试验证试剂盒的准确性。
检测结果分别如图10、图11、和图12所示，检测结果表明，本发明的多重检测体系，具有较佳的准确性，针对不同的浓度的样本，各病原体对应阳性参考品结果均为阳性，且与其它病原体无交叉反应，检测准确度均能够达到100％，完全能够满足临床精密度的要求。
实施例5、解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒干扰物质测试
分别向103copies/ml的解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌灭活培养物中加入5％含量的全血，5％的粘液、大观霉素(100mg/L)、青霉素(0.5mg/ml)、四环素(5mg/L)、氧氟沙星(3.06mg/L)、阿奇霉素(0.45mg/L)作为干扰物质测试样本，以不含干扰物质的样本作为对照，测试干扰物质对引物探针扩增的影响。
检测结果分别如图13、图14、和图15所示，检测结果表明，本发明的多重检测体系，抗干扰能力较强，在待测样本中加入5％全血，5％的粘液、大观霉素(100mg/L)、青霉素(0.5mg/ml)、四环素(5mg/L)、氧氟沙星(3.06mg/L)、阿奇霉素(0.45mg/L)的样本对检测结果无明显干扰，不影响结果判读。特别是在添加全血的样本中，本发明的多重检测体系仍然能够展示出正常的检测效果。
实施例6、临床样本检测
采用本发明所建立的多重荧光PCR检测体系，对30例临床阳性样本以及20例阴性样本进行双盲检测，并采用中山大学达安基因股份有限公司生产的对应型别单重荧光定量PCR检测试剂盒进行对照验证，结果显示30例临床样本中，单重荧光定量PCR和多重荧光PCR法均检出30例阳性，阳性检出率为100％，20例阴性样本检测均为阴性，两种方法一致性高，结果具有统计学意义。
具体到不同类别，多重荧光PCR法与单重荧光PCR法比较，结果显示解脲脲原体12例，沙眼衣原体11例，淋球菌7例，未出现漏检情况。
对比例1
本试剂盒对解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的基因序列，进行深入比对分析后，针对各目标序列设计了5对以上引物和探针，由于多重反应体系引物之间的竞争抑制、引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，很难获得有效的多重PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物和探针序列及其组合。
研究发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著地差异。
例如，分别制备4份不同浓度(浓度分别为105、106、107、108copies/ml)的解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌灭活培养物作为阳性参考品进行实验，在多重PCR步骤中，将上述多重反应体系中的解脲脲原体(UU)引物探针序列替换为：
对照引物对1：
UU-F1：AACGYAAAGTTGCTTATGGACG(SEQ ID NO.:14)
UU-R1：TTCTTTTTTGTCTCCTGGTTCA(SEQ ID NO.:15)
对照探针1：CGTTTCGATATTCCATCAGGTACTGC(SEQ ID NO.:16)
其他组分不变。
上述对照引物对1和对照探针1在单重PCR检测中能够正常检测出靶核酸序列。
特异性试验结果表明，该对照多重检测体系对解脲脲原体和沙眼衣原体的扩增曲线均受抑制。对照多重检测体系检测结果如图16、图17所示。
对比例2特异性扩增沙眼衣原体(CT)引物和探针优化
本试剂盒针对各目标序列分别设计了5对以上引物和探针序列，本对比例以解脲脲原体为例，展示了部分效果不理想的引物和探针。
沙眼衣原体引物探针筛选，将设计好的沙眼衣原体引物和探针，先用单重荧光PCR扩增筛选扩增效率较高的引物，将筛选出的引物探针加入到多重荧光PCR法进行测试。
沙眼衣原体引物探针序列及筛选：
引物对1：
F-1：AAGAAATTGATCCAACACCCTT(SEQ ID NO.:4)
R-1：CAAGGTCGATGTGATAGGGAAAG(SEQ ID NO.:5)
P-1:FAM-TCGCCGATGAGTTCGACATTCCAC-BHQ1(SEQ ID NO.:6)
引物对2：
F-2：AGAAGATTTTCGTTATAGGAGGAC(SEQ ID NO.:17)
R-2：TCGCCAATTATCTGATTTCTTA(SEQ ID NO.:18)
P-2:FAM-AAACTCCGGAACATATGATGCGAAGT-BHQ1(SEQ ID NO.:19)
引物对3：
F-3：CTTTTATACATTAGCCACCGAT(SEQ ID NO.:20)
R-3：CGAGAGCATGTGAAGACTCC(SEQ ID NO.:21)
P-3:FAM-AAGAGGCGTTACGAGCTTTTTTCCTG-BHQ1(SEQ ID NO.:22)
对各组引物探针组合，先用单重荧光PCR扩增筛选引物扩增效果，单重检测结果发现引物探针对2扩增效率低(如图18所示)，与引物探针对1、3相比Ct值均靠后或荧光值低，引物探针对1、3可以基本满足后续实验要求，需要加入到多重荧光PCR法中做进一步验证。
将引物对1、3分别加入到多重荧光PCR体系中进行扩增，检测结果如下：
引物对3加入到多重荧光PCR体系检测结果：引物对扩增低，可能和其他引物对之间有竞争抑制或者有引物二聚体导致扩增效率变低；
引物对1加入到多重荧光PCR体系检测结果：各型别扩增效率不变，且荧光值和Ct值均满足要求；
从多方面综合考虑，最终选择引物对1做为沙眼衣原体在多重PCR荧光检测体系中的引物，该体系经过反复验证，均能满足要求。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 一种解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌三联检试剂盒
<130> 000033
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
cagaagctgt ygctttaatt actga 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
acgtartact tcacgagcag attg 24
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aactarctta ccatctcttg ccccttcc 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
aagaaattga tccaacaccc tt 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
caaggtcgat gtgataggga aag 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
tcgccgatga gttcgacatt ccac 24
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
gatttcggcg gctggag 17
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
tttatgctga cggaatattt actgt 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
tagcggcaga ttatgcccgt tacag 25
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
tttggctaca gcaacagggt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
tggtccaggg gtcttactcc 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
acctcatggc ccacatggcc tc 22
<210> 13
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
tttggctaca gcaacagggt ggtggacctc atggcccaca tggcctccaa ggagtaagac 60
ccctggacca 70
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
aacgyaaagt tgcttatgga cg 22
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
ttcttttttg tctcctggtt ca 22
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
cgtttcgata ttccatcagg tactgc 26
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
agaagatttt cgttatagga ggac 24
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
tcgccaatta tctgatttct ta 22
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
aaactccgga acatatgatg cgaagt 26
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
cttttataca ttagccaccg at 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
cgagagcatg tgaagactcc 20
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
aagaggcgtt acgagctttt ttcctg 26

Claims (10)

1.一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的PCR引物对组，其特征在于，所述引物对组包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物；
第二引物对，所述第二引物对包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物；以及
第三引物对，所述第三引物对包括如SEQ ID NO.:7所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:8所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对组，其特征在于，所述引物对组还包括：
第四引物对，所述第四引物对包括如SEQ ID NO.:10所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:11所示的反向引物。
3.一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的探针组，其特征在于，所述探针组包括：如SEQ ID NO.:3所示的第一探针；以及选自下组的一种或多种探针：
如SEQ ID NO.:6所示的第二探针；
如SEQ ID NO.:9所示的第三探针；和
如SEQ ID NO.:12所示的第四探针。
4.一种用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的PCR引物对组。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括：
所述第一引物对、和所述第一探针；所述第二引物对、和所述第二探针；所述第三引物对、和所述第三探针。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括所述第四引物对、和所述第四探针；和/或，
所述PCR反应液还包括dNTPs、和/或PCR缓冲液。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR酶系，所述PCR酶系包括选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、和UNG酶。
9.一种检测解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测样本，所述样本中含有解脲脲原体、沙眼衣原体和淋球菌的基因；
(2)制备扩增反应体系，进行扩增反应：
其中，所述扩增反应体系包括步骤(1)提供的待检测样本、如权利要求1所述的引物对组、和如权利要求3所述的探针组。
10.如权利要求1所述的引物对组、和如权利要求3所述的探针组的用途，其特征在于，用于制备检测试剂盒，所述检测试剂盒用于检测解脲脲原体、沙眼衣原体，和/或淋球菌。
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