CN103184272A - 沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测方法和试剂盒，其特征在于：使用了MAP方法设计引物，每条引物由3段构成，此设计能使引物的退火温度变得宽泛；对于每个病原体设计了4个引物，扩增反应包括富集阶段和扩增阶段，扩增时仅有内引物标记生物素并且过量；提供了固体形式存在的PCR反应物，预制的生物素标记探针的尼龙膜和阳性对照品。

Description

沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及分子领域，具体是一种淋球菌、沙眼衣原体及解脲脲原体和细小脲原体检测试剂盒。

技术背景：

淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体是一类由性接触为主要传播途径的病原体，它们可分别引发淋病和非淋球菌性尿道炎。

淋病是目前世界上发病较多的性病之一，每年以20％～30％速度递增，由于滥用抗生素及反复感染，导致淋病的临床表现缺乏特异性，尤其女性，感染初期的60％～70％呈现无症状过程，如不及时诊断治疗，既可成为潜在传染源，也有学者认为盆腔炎也是由此菌引物，从而损伤输卵管及卵巢，引起宫外孕和不育症等，故实验室检查对临床确诊及治疗有重大意义

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)感染为美国最常见的性传播疾病(STD)，每年有4～5百万病例发生，每年花费可达40亿美元。据世界卫生组织(WHO)估计，每年有9，200万新的CT感染病例发生。在发展中国家其发生率也呈逐年上升趋势。CT可引起沙眼、泌尿生殖道感染、尿道炎、附睾炎及不孕不育等。

支原体感染男女泌尿生殖道的发病率成逐年上升趋势，女性下生殖道是支原体感染好发的部位，上行还可以子宫腔和输卵管腔从而引起炎症和并发症。吴志芬等对无锡市1600例男女生殖道感染者进行支原体检测，其中解脲脲原体的感染率为42.3％，表明支原体的感染率高，已构成流行。近年来解脲支原体的致病机理和流行病学研究得到了充分的重视。最近的研究表明，解脲支原体应该分为两个独立的种，即细小脲原体(Ureaplasma parvum.原解脲支原体生物一群)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)，生殖道分离到的解脲支原体以细小脲原体为主。

解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，简称UU)和沙眼衣原体是常见的性传播疾病病原体，在临床非淋菌性尿道炎(简称NGU)病人中，二者常常呈共同感染状态；在性传播疾病中解脲脲原体与非淋菌性尿道炎、附睾炎有关；与前列腺炎、女性尿道症状、肾盂肾炎、盆腔炎有明显相关性或提示有病原学作用。

淋病奈瑟菌的实验室诊断主要依靠细菌培养，该法准确可靠，但往往需要2～3天才能得到结果，且常因标本采集方法和运送方式不正确，而使淋病奈瑟菌死亡造成培养失败，使培养阳性率偏低。涂片法操作简单，但缺乏特异性，而且受采集、涂片、染色、镜检等操作过程中的主观因素影响造成漏检。核酸检测法快速、灵敏度和特异度高，是近年来发展的有效方法，但成本较高。

衣原体的实验室诊断主要有细胞培养技术、直接涂片镜检技术、抗原抗体免疫技术、聚合酶链反应、连接酶链反应和糖元试验。直接涂片镜检、免疫胶体金法为临床常用的方法；自动酶联免疫法(VIDAS)，仪器昂贵，检测成本较高；PCR通过方法学及试剂的改进，有望成为临床首选使用方法；LCR为目前已知较理想的方法，但其仅器昂贵，难以在基层推广；细胞培养技术为衣原体实验室诊断的黄金标准，但在医院由于费时等原因难以推广。

支原体的实验室诊断包括分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。在标本中分离培养出支原体对支原体感染的诊断有决定性的意义。但该法灵敏度低，时间长，不利于早期快速诊断。ELISA法敏感性和特异性高，重复性好，简便、快速，可以测定抗体或抗原，有广阔的应用前景。PCR法存在假阳性和假阴性，但此法快速、简便、特异且敏感，众多的优点使其在临床上可能得到广泛应用。

采用多重不对称PCR方法结合反向线点杂交技术可以大大提高杂交的效率，而且操作方便。因此，研制和开发一种可利用导流杂交技术快速、简便、特异、敏感检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体的产品具有重要的意义。

发明内容：

本发明提供一种淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体的检测方法和试剂盒，包括：

(1)一种特殊设计的引物，该引物使用MAP方法(正在申请中)设计，每条引物有P1、P2和P3这样3个功能区构成，这种设计方法保证了引物有较宽泛的退火温度范围，使多重PCR扩增条件不兼容的情况大幅改善，提高了成功率，本引物在试剂盒内以10x混合物形式存在。

(2)本试剂盒提供了可以特异的鉴别4个病原体的引物序列和探针。

(3)一种特殊的扩增策略，称为多重不对称PCR(MAP)，该扩增方法可以产生大量单链核酸序列。

(4)一个预制的低密度尼龙膜基因芯片，其上带有氨基酸臂修饰的特异性探针序列，每种探针可以检测特异的病原体。

(5)固体形式存在的PCR反应物，其配方为：UNG酶、热启动聚合酶、Tris-Hcl、KCl、dNTPs(AGCU)、MgCl2、甘油、DMSO、海藻糖、粘合剂。

(6)阳性模板参考品和阴性参考品。

(7)本发明使用反向线点杂交(RLB)方法进行核酸检测，优化了反向线点杂交的程序，节约了部分时间。

试剂盒方法：

1)引物设计：引物设计使用发表在NCBI上不同病原体核酸序列的保守区域设计P3段引物，然后设计P2段和P1段引物，其中用字母n代替hypoxanthine碱基，hypoxanthine碱基可以和四种碱基配对；对于每种病原体的引物序列群，其内引物5’端标记有生物素。

引物序列表：

可检测病原体	引物名	引物序列号	引物序列
				沙眼衣原体	MOF1	SEQ ID NO.1	GtcaannnnGgattcctgtaacaacaagtcagg
	MiF1	SEQ ID NO 2	GtcaannnnCtcttccccagaacaataagaacac
					MiR1	SEQ ID NO.3	aattGcnnngttgttaacaggatagcacgctcg
	MOR1	SEQ ID NO.4	aattGcnnngccttccctttatacgctcaagc
				解脲脲原体	MOF2	SEQ ID NO.5	GtcaannnnCTAGAATCTGTTAAATATGCACA
	MiF2	SEQ ID NO 6	GtcaannnnCTTCACCAATACGTCCCAT
					MiR2	SEQ ID NO 7	aattGcnnnTACCAGCTTCTACAAACCCAA
	MOR2	SEQ ID NO 8	aattGcnnnGACATAATTGAGATTGCACCC
				细小脲原体	MOF3	SEQ ID NO.9	GtcaannnnTTTTCACGTTCTGTATTTGT
	MiF3	SEQ ID NO 10	GtcaannnnAAAATTCATGCCTATAAGTCA
					MiR3	SEQ ID NO.11	aattGcnnnTTTGAACTTGGAAAACGAC
	MOR3	SEQ ID NO.12	aattGcnnnCTTTAAATTTAGCATATGTCCC
				淋球菌	MOF4	SEQ ID NO 13	GtcaannnnCCAGCAGCCGCGGTAATACGT
	MiF4	SEQ ID NO.14	GtcaannnnGTGCGAGCGTTAATCGGAATT
					MiR4	SEQ ID NO 15	aattGcnnnCGTGGACTACCAGGGTATCTA
	MOR4	SEQ ID NO 16	aattGcnnnCTTTCGTGCATGAGCGTCAGT

2)探针设计：根据NCBI上已知序列的保守区域设计核酸探针，探针5’端经过氨基臂修饰，探针如下表：

沙眼衣原体	P1	SEQ ID NO 17	Gttgttaacaggatagcacgctcg
				解脲脲原体	P2	SEQ ID NO.18	TACCAGCTTCTACAAACCCAA
细小脲原体	P3	SEQ ID NO.19	TTTGAACTTGGAAAACGAC
				淋球菌	P4	SEQ ID NO 20	CGTGGACTACCAGGGTATCTA

3)探针膜的制备：Biodyne C尼龙膜首先在16％的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(EDAC)中孵育15min以激活膜，随后用水漂洗，将膜放置入利用迷你转渍槽中。探针缓冲液使用500mM的NaHCo3配置(PH8.4)，探针浓度为12.5pm～100pm，每个线槽放入150ml含探针的缓冲液。孵育1分钟之后，吸除剩余的缓冲液和探针，然后取出膜，放入100mM的NaOH溶液中孵育10分钟，用水漂洗3～5次，将膜置于55～60℃的2X SSPE(360mM NaCl，20mM NaH2PO4，2mMEDTA[pH 7.2])-0.1％ sodium dodecyl sulfate(SDS)中孵育10分钟，之后使用2XSSPE漂洗一次，加入标记探针的尼龙膜可以置于4℃保存或直接使用。为了优化本探针浓度，本实验室做过优化实验，探针浓度在0.2PM-0.3pM之间比较好。探针的排列见图1。

4)10XPCR引物制备，将各种病原体引物混合，其10x引物浓度为：MOF，MiR，MOR每种为0.4μM，MiF浓度为10μM，溶液为10mM的TE(PH8.4)。

5)反应体系和固体反应物的制备：每人份反应物包括每种引物0.125ul(50uM)，2ul dNTPs(2.5mM of each dNTP)，2ul 10x PCR buffer，3ul 25mMMgCl2，0.2ul Qiagen热启动聚合酶，10％的海藻糖，1％的甘油，以上混合液低温冻干。

6)阳性参考品和阴性参考品的制备：用引物对插入到pMD-T vector中的NG/CT/UU/UP片段进行扩增。PCR反应体系为50ul，包含10x buffer，5.0ul；25mM MgCl2，6.0ul；10mM dNTP，0.5ul；100uM生物素标记的引物混合物，0.5ul；ddH2O，35.4ul；UNGase(IU/ul)，0.2ul；TaqDNA聚合酶，0.4ul；模板DNA，2.0ul；共50ul。PCR反应程序为：首先37℃，5分钟，95℃变性15分钟，然后95℃，30秒；58℃，30秒；72℃，50秒；进行40个循环，最后72℃延伸5分钟。上述PCR产物经过割胶纯化。

7)PCR反应体系和反应程序：95℃ 15min

95℃ 30s，53℃ 90s 68℃ 1min 5次循环

95℃ 30s，58℃ 90s 68℃ 1min 30次循环

68℃ 10min

4℃保存

7)RLB检测：取PCR反应物5ul进行RLB杂交分析。RLB方法是RDB方法的改良，其探针在尼龙膜上排列为线性，普通的RLB实验先要对PCR产物进行双链变性为单链的步骤，由于MAP方法产生的为单链核苷酸片段，因此PCR产物不需要经过变性阶段，可直接用来杂交分析。

8)ECL电化学发光法显色：发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下，鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体，当后者由激发态返回至基态，就会产生荧光。根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。ECL发光液可以自配或者购买自商家。

附图说明：

图1为四种病原体探针膜的设计模式；

图2为MAP技术扩增的示意图；

图3为12个临床样本的检测结果图。

具体实施方案：临床棉签拭子样本检测

第一步：样本DNA的提取，本提取方法来自天根生化有限公司DP322中的方法

1.处理材料：

将擦拭过的样本棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400μl缓冲液GA。振荡15秒，室温放置5分钟。

2.加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋10秒混匀，56℃放置60分钟，其间每15分钟涡旋混匀数次。

3.加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟。

4.加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

6.向吸附柱CR中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。

7.向吸附柱CR中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。

8.向吸附柱CR中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。

9.将吸附柱CR放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。

11.制备的样本DNA待用。

第二步：PCR扩增，将试剂盒中冻干的PCR固体反应物加超纯水10μl，在其中加入引物混合物2.5μl，加水补足至25ul。反应体系终浓度为：Tris-Hcl50mM，KCl12mM，Mg2+离子2.5mM，热启动聚合酶酶1U，UNG酶0.1U，AGCU每种为2mM。反应程序为：

95℃ 15min

95℃ 30s，53℃ 90s 68℃ 1min 5次循环

95℃ 30s，58℃ 90s 68℃ 1min 30次循环

68℃ 10min

4℃保存

第三步：RLB分析，取PCR反应产物8ul进行RLB分析，将PCR产物10ul直接加入140ul 2XSSPE-0.1SDS缓冲液中，45℃孵育60min，40℃2xSSPE-0.5％SDS缓冲液中洗涤2次，链亲和素酶连接体稀释4000倍至2xSSPE-0.5％SDS中，45℃孵育30min，随后用2xSSPE-0.5％SDS缓冲液40℃漂洗10min，结束后用2xSSPE冲洗2～3次，使用ELC电化学发光方法进行分析。

第四步：ECL电化学发光方法显色，本显色试剂盒购买自普利莱基因技术有限公司的SuperECL Plus超敏发光液：

A.首先配制发光工作液：分别取等体积的溶液A和B混合，放置使之升到室温。

B.接着用镊子取出膜，搭在滤纸上沥干洗液但勿使膜完全干燥。将膜完全浸入并与发光工作液(0.125ml发光工作液/cm²膜)充分接触。室温孵育3分钟，准备立即压片曝光。

C.用镊子夹起膜，搭在滤纸上沥干发光工作液。

D.在X光胶片暗盒内面铺一张面积大于膜的保鲜膜。将杂交膜贴在保鲜膜上，将保鲜膜折起来完全包裹杂交膜，去除气泡和皱褶，可剪去边缘部多余的保鲜膜。用滤纸吸去多余的发光工作液。用胶带将覆盖杂交膜的保鲜膜固定在暗盒内，核酸面向上。

F.在黑暗中放入X光胶片，分别曝光3分钟，显影冲洗。

结果：12例临床样本都检测出特异性病原体的存在，大多数为混合感染型，展示了该试剂盒的灵敏性和特异性，探针之间无交叉反应，本实验结果与使用单重PCR荧光定量方法相符。

结论：本发明所述试剂盒能够快速、准确检测出淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体的感染，对于常规性传播疾病检测具有重大的意义。

Claims (6)

1.一种沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测方法和试剂盒，其特征在于包括固体形式存在的10x PCR反应物(由引物混合物、tris-cl、Kcl、MgCl₂、热启动聚合酶、UNG酶和冻干保护剂组成)、阳性对照品和含有生物素标记探针的尼龙膜；其特殊之处在于：

a：特殊的三段式引物，其三段式引物设计及后继的扩增为独创的MAP(多重单链PCR扩增)技术，其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16；

b：特殊的探针，所选取的4个探针具有良好的特异性和保守性，即可以区分不同的病原体，又可以检出特定的病原体，分别为SEQ ID NO.17，SEQ IDNO.18，SEQ ID NO.19，SEQ ID NO.20；

c：特殊的存储条件：本试剂盒为PCR反应物提供了固体形式的存储方式；

d：反应条件通过优化，大致分为两个阶段，其中第一阶段为富集阶段，本阶段使用浓度极低的3个引物和一个过量的正向引物，反应温度一般为50℃左右，扩增阶段低浓度引物将被消耗完，随后第二阶段仅有正向引物工作，随着扩增的进行，将产生大量的单链目的核苷酸序列；

e：对于每个位点，本试剂盒提供了2对引物或2对以上引物进行靶序列富集，这样使其特异性和敏感性大大增强；

f：本试剂盒包括了预处理的标记探针的尼龙膜。

2.权利要求1所述试剂盒，其引物设计为三段式，由P1，P2和P3构成，其中P1为模板特异性的或者人工合成非模板特异性寡聚核苷酸，P2为一段特殊碱基，P3为模板特异性序列。

3.权利要求2所述引物，其P1，P2，P3组合方式是可变的，一般为p1，p2，p3顺序组合，也可以是p2，p1，p3组合，p2也可以镶嵌于p1序列中。

4.权利要求1中的试剂盒，其冻干保护剂成分由海藻糖，甘油和粘合剂组成。

5.权利要求1中的试剂盒，标记生物素的探针预先固定在尼龙膜上。

6.权利要求1中的试剂盒，其PCR产物的检测方法为反向线点杂交、page胶电泳、荧光pcr检测、斑点杂交，反向斑点杂交、液相杂交平台、毛细管电泳。

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