CN111471781A - 淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用 - Google Patents

淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用，涉及分子生物技术领域，本发明提供的引物组包括用于检测淋球菌的引物对、用于检测沙眼衣原体的引物对和用于检测解脲支原体的引物对，实现了一个检测体系能够同时检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)三种病原体，并且本发明提供的引物组还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强，检测结果快速直观等优点。

Description

淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及 应用
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用。
背景技术
淋球菌是一种革兰阴性的专性需氧双球菌，是引起淋病的主要病原体，特点为潜伏期短、传染性强，如不及时治愈可出现严重的并发症和后遗症。根据临床表现分为有症状的泌尿生殖系统感染(常见表现为化脓性炎症)，无症状的泌尿生殖系统感染，眼、咽、皮肤、直肠、盆腔等部位的感染，以及血行播散式感染。男性常见的表现是尿道炎，并发症有附睾炎、前列腺炎、精囊炎等，女性常见的表现是宫颈炎、尿道炎、前庭大腺炎、肛周炎，并发症有盆腔炎；可诱发生育能力下降，新生儿结膜炎等。淋病的早期诊断对于其及时治疗、防止慢性感染有重要价值。
生殖道衣原体是常见的性传播疾病，是革兰阴性病原体，没有合成高能化合物ATP的能力，必须由宿主细胞提供，因而是能量寄生物。衣原体是一类能通过细胞滤器，有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，比病毒大，比细菌小，呈球形。沙眼衣原体引起的疾病范围非常广泛，可累及眼、生殖道、直肠等多个脏器，也可发生母婴传播。根据临床表现分为具有泌尿生殖道症状体征的患者，无症状感染者和新生儿感染。男性常见的临床表现是尿道炎、附睾炎，女性则为宫颈炎、尿道炎、盆腔炎，可诱发生育能力下降，新生儿结膜炎等。
解脲支原体为脲原体属中的一种，目前可分为14个血清型，是人类泌尿生殖道常见的共生微生物，为致病性较弱的条件致病病原体。成人主要通过性接触传播，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染。成人男性的感染部位在尿道粘膜，女性的感染部位在宫颈。妇女妊娠后，由于孕激素的增加，抑制了细胞免疫，机体抵抗力下降，更易受到解脲支原体感染。主要引起非淋菌性尿道炎(子宫炎)、子宫内膜炎、绒毛膜羊膜炎、自然流产、早产、前列腺炎、不育症以及败血症等。解脲支原体感染造成的女性生殖器官病理性改变，是不孕不育的重要原因。解脲支原体感染孕妇容易造成其流产，因此对于不明原因的流产，尤其是多次流产者，应考虑是否有解脲支原体感染的可能。解脲支原体可经过胎盘垂直传播或由孕妇下生殖道感染上行扩散，引起宫内感染，两者均可导致流产、早产、胎儿宫内发育迟缓、胎膜早破，甚至造成胎死宫内等一系列不良后果。
目前，淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)的检测方法主要有细菌的分离培养方法，免疫学诊断和分子生物学诊断。病原体的分离培养是淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)检测的金标准，但是分离培养法对技术要求较高，费用昂贵且耗时长，目前多用于实验研究。免疫学方法简便快捷，但特异性差、灵敏度不高。近年来，实时定量PCR检测平台已渐渐显示了其在检测上的优势，可直接从临床样本(如尿道拭子、宫颈拭子或尿液)中提取病原体的核酸进行检测，该方法具有快速、准确和灵敏度高等优点。
目前国内的核酸诊断中应用最为广泛的是以荧光标记探针为基础的实时荧光PCR技术。检测探针5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，当探针完整时，由于淬灭基团靠近荧光报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光集团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭集团的屏蔽，从而发出可供仪器检测的荧光。国内临床上检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)DNA的方法主要基于实时荧光定量PCR技术及其改进。大部分产品采取针对淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)或解脲支原体(UU)单一检测方法，这样增加了检测成本及其操作的繁琐度。
因此，开发简单、方便、快捷且成本较低的淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)三联检试剂盒及检测方法尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述的引物组在制备检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的产品中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检产品。
本发明提供了一种引物组，包括用于检测淋球菌的引物对、用于检测沙眼衣原体的引物对和用于检测解脲支原体的引物对；
所述用于检测淋球菌的引物对包括淋球菌-F和淋球菌-R；
所述淋球菌-F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述淋球菌-R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测沙眼衣原体的引物对包括沙眼衣原体-F和沙眼衣原体 -R；
所述沙眼衣原体-F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述沙眼衣原体-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测解脲支原体的引物对包括解脲支原体-F和解脲支原体 -R；
所述解脲支原体-F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述解脲支原体-R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测淋球菌的探针、用于检测沙眼衣原体的探针和用于检测解脲支原体的探针；
所述用于检测淋球菌的探针淋球菌-P具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测沙眼衣原体的探针沙眼衣原体-P具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测解脲支原体的探针解脲支原体-P具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述探针组中的探针均独立地含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团；
优选地，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX或CY5；
优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
进一步地，所述引物组还包括用于检测内参基因的引物对；
优选地，所述用于检测内参基因的引物对包括内参基因-F和内参基因 -R；
所述内参基因-F具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述内参基因-R具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
优选地，所述引物对还包括内参探针-P，所述内参探针-P具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有至少 85％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述引物组包括用于检测淋球菌的引物对和探针、用于检测沙眼衣原体的引物对和探针、用于检测解脲支原体的引物对和探针以及用于检测内参基因的引物对和探针；
优选地，所述淋球菌-F、淋球菌-R和淋球菌-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述沙眼衣原体-F、沙眼衣原体-R和沙眼衣原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述解脲支原体-F、解脲支原体-R和解脲支原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述内参基因-F、内参基因-R和内参基因-P的用量比为 2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3。
本发明还提供了上述的引物组在制备检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的产品中的应用。
另外，本发明还提供了一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检产品，所述产品包括上述的引物组。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
进一步地，所述PCR反应液包括10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、dUTP、聚合酶和UDG酶；
优选地，所述聚合酶包括热启动Taq酶；
优选地，所述UDG酶包括尿嘧啶-DNA-糖基酶；
优选地，所述Mg2+包括MgCl2溶液，优选浓度为20-30mM的MgCl2溶液，更优选浓度为25mM的MgCl2溶液；
优选地，所述dNTPs的浓度为20-30mM，更优选浓度为25mM；
优选地，所述dUTP的浓度为90-110mM，更优选浓度为100mM。
进一步地，所述阴性对照品为人基因组DNA，优选浓度为1-3ng/μL的人基因组DNA，更优选浓度为2ng/μL的人基因组DNA；
优选地，所述阳性对照品包括具有如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的淋球菌阳性对照、具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的沙眼衣原体阳性对照和具有如SEQ IDNO.15所示的核苷酸序列的解脲支原体阳性对照。
本发明提供的引物组包括用于检测淋球菌的引物对、用于检测沙眼衣原体的引物对和用于检测解脲支原体的引物对，实现了一个检测体系能够同时检测淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)三种病原体，并且本发明提供的引物组还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强，检测结果快速直观等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的试剂盒检测阳性对照品的检测结果图；
图2为本发明实施例提供的试剂盒检测淋球菌的灵敏度试验结果图；
图3为本发明实施例提供的试剂盒检测沙眼衣原体灵敏度结果图；
图4为本发明实施例提供的试剂盒检测解脲支原体的灵敏度结果图；
图5为本发明实施例提供的内参基因测试结果图；
图6为本发明实施例提供的试剂盒检测淋球菌的特异性试验结果图；
图7为本发明实施例提供的试剂盒检测沙眼衣原体的特异性试验结果图；
图8为本发明实施例提供的试剂盒检测解脲支原体的特异性试验结果图；
图9为本发明实施例提供的淋球菌引物和探针组对比结果图；
图10为本发明实施例提供的沙眼衣原体引物和探针组对比结果图；
图11本发明实施例提供的解脲支原体引物和探针组对比结果图。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
本发明人通过广泛而深入的研究，人工设计多对引物和探针，对其进行筛选验证，从而获得具有最佳特异性和灵敏度多重检测体系，在此基础上完成了本发明。
根据本发明的一个方面，提供了一种引物组，包括用于检测淋球菌的引物对、用于检测沙眼衣原体的引物对和用于检测解脲支原体的引物对；
所述用于检测淋球菌的引物对包括淋球菌-F和淋球菌-R；
所述淋球菌-F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述淋球菌-R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测沙眼衣原体的引物对包括沙眼衣原体-F和沙眼衣原体 -R；
所述沙眼衣原体-F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述沙眼衣原体-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测解脲支原体的引物对包括解脲支原体-F和解脲支原体 -R；
所述解脲支原体-F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述解脲支原体-R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
本发明提供的引物组，实现了一个检测体系能够同时检测淋球菌 (NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)三种病原体，并且本发明提供的引物组还具有灵敏度高、特异性好、可重复性强，检测结果快速直观等优点。
在本发明中，“同一性”指的是核苷酸序列之间的相似性，包括与本发明所述的SEQID NO.1-SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％(例如可以为，但不限于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高)同一性的核苷酸序列。当选择SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列作为本发明提供的引物组中的引物对时，用以检测具有更强的特异性和更高的灵敏度。
需要说明的是，本发明提供的引物组可适于不同种类的PCR反应。例如当选择常规PCR时，可根据扩增产物的有无及扩增产物的片段大小来判定待测样本中是否含有淋球菌、沙眼衣原体或解脲支原体。当选择荧光定量PCR时，可以根据扩增产物中的荧光信号，来判断待测样本中是否含有淋球菌、沙眼衣原体或解脲支原体。对荧光定量PCR的具体表征方法不做限定，例如可以使用染料法进行表征，也可以使用探针法进行表征。当使用探针法进行表征时，能够进一步提高荧光定量PCR反应的特异性。基于此，在一些优选的实施方式中，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测淋球菌的探针、用于检测沙眼衣原体的探针和用于检测解脲支原体的探针；
所述用于检测淋球菌的探针淋球菌-P具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；所述用于检测沙眼衣原体的探针沙眼衣原体-P具有如SEQ ID NO.8 所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；所述用于检测解脲支原体的探针解脲支原体-P具有如 SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
本实施方式提供的探针特异性强、灵敏度高，与本发明提供的引物组配合使用，能够极大地提高检测结果的准确性。
在一些优选的实施方式中，所述探针组中的探针均独立地含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团。对其中的荧光报告基团和荧光淬灭基团的种类不做具体限定，本领域常规使用的荧光报告基团和荧光淬灭基团均可作为本发明探针组中所使用的荧光报告基团和荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX或CY5，优选分别对应的检测病原体为沙眼衣原体、淋球菌、解脲支原体及内参基因；
优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
对荧光报告基团和荧光淬灭基团的对应关系不做具体的限定，只要满足各探针所连接的荧光报告基团互不相同即可。
在一些优选的实施方式中，所述引物组还包括用于检测内参基因的引物对。通过内参基因的加入，使检测过程处于可监控状态，避免了假阴性结果的出现。
优选地，所述用于检测内参基因的引物对包括内参基因-F和内参基因 -R；所述内参基因-F具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；所述内参基因-R具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
优选地，所述引物对还包括内参探针-P，所述内参探针-P具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有至少 85％同一性的核苷酸序列。
在一些优选的实施方式中，所述引物组包括用于检测淋球菌的引物对和探针、用于检测沙眼衣原体的引物对和探针、用于检测解脲支原体的引物对和探针以及用于检测内参基因的引物对和探针，采用特异性的引物和探同时针扩增淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体核酸目的片段，能够保证检测结果更加准确。
对本发明中引物和探针的存在形式不做限定，例如可以为不同引物混合作为引物单独包装，不同探针之间混合作为探针单独包装，使用时混合；也可以将检测同一病原菌的引物和探针混合包装，使用时混合；还可以将各引物和各探针一并混合包装。
本发明对上述引物和探针的配比比例进行了摸索和优化，试验结果发现，不同的配比比例对于检测结果的灵敏性具有显著差异，经过大量筛选试验发现，上述引物和探针在下述用量比下，具有最优的检测效果：
所述淋球菌-F、淋球菌-R和淋球菌-P的用量比为2-5:2-5:1-4，例如可以为，但不限于2:5:1、5:2:4、2:2:4或5:5:1，优选为4:4:3；所述沙眼衣原体-F、沙眼衣原体-R和沙眼衣原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，例如可以为，但不限于2:5:1、5:2:4、2:2:4或5:5:1，优选为4:4:3；所述解脲支原体-F、解脲支原体-R和解脲支原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，例如可以为，但不限于2:5:1、5:2:4、2:2:4或5:5:1，优选为4:4:3；所述内参基因-F、内参基因-R和内参基因-P的用量比为2-5:2-5:1-4，例如可以为，但不限于2:5:1、 5:2:4、2:2:4或5:5:1，优选为4:4:3。
根据本发明的第二个方面，本发明还提供了上述的引物组在制备检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的产品中的应用。应用本发明提供的引物组对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体进行检测，具有灵敏度高、特异性好、可重复性强，检测结果快速直观等优点。
基于本发明提供的引物组相同的发明构思，本发明还提供了用于检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的产品，因此，本发明提供的产品具有与本发明提供的引物组全部的有益效果，在此不再赘述。
在一些优选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒，所述试剂盒优选还包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
其中，PCR反应液可以包括10×PCR Buffer、Mg2+、dNTPs、dUTP、聚合酶和UDG酶。
优选地，所述聚合酶包括热启动Taq酶，使用Taq酶作为聚合酶能有效避免一些非特异扩增和引物二聚体的形成，提高目标基因的扩增成功率。
优选地，所述UDG酶包括尿嘧啶-DNA-糖基酶，采用UDG酶，有效防止了扩增产物的污染。
优选地，所述Mg2+包括MgCl2溶液，优选浓度为20-30mM的MgCl2溶液，例如可以为，但不限于浓度为20mM、22mM、25mM、28mM或 30mM的MgCl2溶液，更优选浓度为25mM的MgCl2溶液；
优选地，所述dNTPs的浓度为20-30mM，例如可以为，但不限于20mM、 22mM、25mM、28mM或30mM，更优选浓度为25mM；
优选地，所述dUTP的浓度为90-110mM，例如可以为，但不限于90mM、 92mM、95mM、98mM、100mM、102mM、105mM、108mM或110mM，更优选浓度为100mM。
在一些优选的实施方式中，所述阴性对照品为人基因组DNA，优选浓度为1-3ng/μL的人基因组DNA，例如可以为，但不限于浓度为1ng/μL、1.5 ng/μL、2ng/μL、2.5ng/μL或3ng/μL的人基因组DNA，更优选浓度为2ng/μL 的人基因组DNA。
优选地，所述阳性对照品包括以下组分：
组分(a)：为含有沙眼衣原体16S核糖体RNA基因上大小为389bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.14；
组分(b)：为含有淋球菌opa基因上大小为374bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.13；
组分(c)：为含有解脲支原体16S核糖体RNA基因大小为345bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.15。
通过阴性对照品和阳性对照品的设置，能够进一步保障检测结果的准确性和有效性。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检试剂盒，包括：PCR反应液、引物组混合液、阳性对照品和阴性对照品。
其中，PCR反应液包括10×PCR Buffer、25mM MgCl2、25mM dNTPs、 100mM dUTP、Taq酶和UDG酶。
引物组混合液包括：
组分(i)：由一对检测沙眼衣原体的引物和一条检测沙眼衣原体的探针组成，其中两条引物的碱基序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针的碱基序列为SEQ IDNo.8所示，该探针的5’端标记有荧光报告基团 (FAM)，3’端标记有荧光淬灭基团(BHQ-1)；其中，沙眼衣原体引物和探针配比为：沙眼衣原体-F：沙眼衣原体-R：沙眼衣原体-P为4:4:3；
组分(ii)由一对检测淋球菌的引物和一条检测淋球菌的探针组成，其中两条引物的碱基序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针的碱基序列为SEQ ID NO.7所示，该探针的5’端标记有荧光报告基团(HEX)， 3’端标记有荧光淬灭基团(BHQ-1)；其中，淋球菌引物和探针配比为：淋球菌-F：淋球菌-R：淋球菌-P为4:4:3；
组分(iii)由一对检测解脲支原体的引物和一条检测解脲支原体的探针组成，其中两条引物的碱基序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，探针的碱基序列为SEQ IDNO.9所示，该探针的5’端标记有荧光报告基团(ROX)，3’端标记有荧光淬灭基团(BHQ-2)；其中，解脲支原体引物和探针配比为：解脲支原体-F：解脲支原体-R：解脲支原体-P为4:4:3；
组分(iv)由一对检测内参基因的引物和一条检测内参基因的探针组成，其中两条引物的碱基序列分别为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针的碱基序列为SEQ IDNO.12所示，该探针的5’端标记有荧光报告基团 (CY5)，3’端标记有荧光淬灭基团(BHQ-2)；其中，内参基因引物和探针配比为：内参基因-F：内参基因-R：内参基因-P为4:4:3。
具体如下表1所示：
表1
名称 序列 序号
淋球菌-F CCTTCTCTTCTCTTCTCTTCTC SEQ ID NO.1
淋球菌-R GGATGTTTCTGAAATAATCGCTTA SEQ ID NO.2
淋球菌-P TCTCTTCTCTTCTCTTCCGCAGC SEQ ID NO.7
沙眼衣原体-F CGCTTTTCTAATTTATACCTGAC SEQ ID NO.3
沙眼衣原体-R CGTCAATTCTTTTGAGTTTCAC SEQ ID NO.4
沙眼衣原体-P TACTCCTCAGGCGGCATACTTAAC SEQ ID NO.8
解脲支原体-F ATGCGTAGATATATGGAAGAAC SEQ ID NO.5
解脲支原体-R CGACATTTAATGATGATCGTTTA SEQ ID NO.6
解脲支原体-P ACTTGGACTATCACTGACGCTTAGG SEQ ID NO.9
内参基因-F CCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTC SEQ ID NO.10
内参基因-R ACAGCAAATAAAAGAAACTAAAAC SEQ ID NO.11
内参基因-P TCCTGAGACTTCCACACTGATGC SEQ ID NO.12
所述阴性对照品为2ng/μL人基因组DNA。
所述阳性对照品包括以下组分：
组分(a)：为含有沙眼衣原体16S核糖体RNA基因上大小为389bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.14；
组分(b)：为含有淋球菌opa基因上大小为374bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.13；
组分(c)：为含有解脲支原体16S核糖体RNA基因大小为345bp的基因片段的质粒，此基因片段核酸序列为SEQ ID NO.15。
1、样本要求
1.1样本采集：采集方法参照《临床标本采集指南》。男性尿道拭子样本：采集样本前2小时禁止小便，用细小棉拭子深入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物(应略带粘膜)。将棉拭子置入无菌收集管内，用无菌棉球将收集管塞紧后密闭送检。女性宫颈拭子样本：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动棉拭子采取宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌收集管中，用无菌棉球将收集管塞紧密闭送检。
1.2样本保存：样本采集后可立即用于检测，也可2℃～8℃保存3天， -20℃保存不超过3个月，但应避免反复冻融。
1.3标本运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
2、样本提取
2.1样本处理：在提取之前需往样本收集管中加入1mL生理盐水，充分震荡好洗涤棉拭子，然后将棉拭子靠管壁挤干并丢弃。
2.2使用博日MagaBio plus病毒DNA/RNA纯化试剂盒进行样本提取，具体步骤详见提取试剂盒说明书。
3、试剂准备
将PCR反应液及引物组混合液室温解冻，充分融化后震荡混匀、瞬时离心数秒后，计算需要准备样本数n份[n＝样本数+2(阴、阳性对照)]，每人份反应体系配置按表2配置：
表2
反应液组分 用量(μL)/每人份
PCR反应液 20μL
荧光探针混合液 10μL
样本 10μL
总体积 40μL
4、PCR扩增及荧光检测
将PCR反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增。
Figure BDA0002463333260000161
检测荧光选择：FAM、HEX、ROX、CY5荧光，荧光收集在60℃，30sec*。
结果判定：
FAM通道荧光曲线呈“S”型曲线且Ct≤36.85，则为沙眼衣原体(CT) 阳性，如无典型“S”型曲线或Ct>36.85，则为沙眼衣原体(CT)阴性。
HEX通道荧光曲线呈“S”型曲线且Ct≤35.21，则为淋球菌(NG)阳性，如无典型“S”型曲线或Ct>35.21，则为淋球菌(NG)阴性。
ROX通道荧光曲线呈“S”型曲线且Ct≤35.53，则为解脲支原体(UU) 阳性，如无典型“S”型曲线或Ct>35.53，则为解脲支原体(UU)阴性。
实施例2阳性对照品检测结果
使用本发明实施例1提供的试剂盒及检测方法对阳性对照品进行检测。阳性对照品为含淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)扩增的靶基因目标片段的混合质粒，结果见图1。
实施例3灵敏性试验
采用本发明实施例1提供的试剂盒及检测方法进行检测：
将已定值的沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲支原体(UU)临床样本作为初始样本分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍，检测结果表明：试剂盒具有良好的灵敏性，并且呈现梯度变化，结果见图2、图3、图4。
实施例4内参测试试验
为检测内参引物探针检测的灵敏性，将2ng/μL人基因组DNA稀释10 倍、102倍、103倍、104倍进行试验，试验结果表明：本试剂盒内参引物探针具有良好的灵敏性，结果见图5。
实施例5特异性试验
为了检测本发明试剂盒的特异性，用本发明的试剂盒检测人乳头瘤病毒(16型、18型、45型、31型)、单纯疱疹毒Ⅱ型、人型支原体、大肠杆菌、人巨细胞病毒和B族链球菌。
检测结果表明：HEX通道仅对淋球菌(NG)进行扩增，见图6，FAM 通道仅对沙眼衣原体(CT)进行扩增，见图7，ROX通道仅对解脲支原体 (UU)进行扩增，见图8。表明本发明试剂盒仅对淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)扩增，而不与其他病原体发生交叉反应。
实施例6对比实验
本试剂盒对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的基因序列进行深入比对分析后，设计了两对引物和探针，并对设计的引物和探针进行筛选和验证，最终确定了可以用于多重PCR扩增的引物和探针序列及其组合。
淋球菌对照引物和探针组：
NG-F1:TCAGACATCAGGTTCGTTCGGT(SEQ ID NO.16)；
NG-R1:TGGGCGTGATGTCGAAACCGA(SEQ ID NO.17)；
NG-P1:ACCACTTACCCAAGCAACGGT(SEQ ID NO.18)。
沙眼衣原体对照引物和探针组:
CT-F1:TGCGGGGTTATCTTAAAAGGGA(SEQ ID NO.19)；
CT-R1:ACCGTCAGACAGAAAAGAGGA(SEQ ID NO.20)；
CT-P1:TCCTGCTTGAGAGAACGTGC(SEQ ID NO.21)。
解脲支原体对照引物和探针组:
UU-F1:GCTAAAGGTCAAGGTATGGAAGA(SEQ ID NO.22)；
UU-R1:TTGCCCCTCAGTCTTCGTG(SEQ ID NO.23)；
UU-P1:TTAAGACCACAAGCACCTGCTACGATT(SEQ ID NO.24)。
将已定值的沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、解脲支原体(UU)临床样本作为初始样本分别稀释10倍、102倍、103倍、104倍，对比实验结果显示：淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体对照引物和探针扩增效率和荧光值均较低，结果见图9、10、11。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州博日科技有限公司
<120> 淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用
<130> 2020
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccttctcttc tcttctcttc tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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cgcttttcta atttatacct gac 23
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<212> DNA
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cgtcaattct tttgagtttc ac 22
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<212> DNA
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atgcgtagat atatggaaga ac 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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acagcaaata aaagaaacta aaac 24
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<212> DNA
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tcctgagact tccacactga tgc 23
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gggtagatgg agaaaaggga atttcacgtg tagcggtgaa atgcgtagat atgtggaaga 120
acaccagtgg cgaaggcgct tttctaattt atacctgacg ctaaggcgcg aaagcaaggg 180
gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cttgccgtaa acgatgcata cttgatgtgg 240
atggtctcaa ccccatccgt gtcggagcta acgcgttaag tatgccgcct gaggagtaca 300
ctcgcaaggg tgaaactcaa aagaattgac gggggcccgc acaagcagtg gagcatgtgg 360
tttaattcga tgcaacgcga aggacctta 389
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaacccgata taatccgccc ttcaacatca gtgaaaatct ttttttaacc ggtcaaaccg 60
atataaggag ccgaaaatga atccagcccg caaaaaacct tctcttctct tctcttctct 120
tctcttctct tctcttctct tccgcagcgc aggcggcaag tgaagacggc ggccgcggcc 180
cgtatgtgca ggcggattta gcctacgcct acgaacacat tacccacgat tatccggaac 240
caaccgctcc aaacaaaaac aaaataagca cggtaagcga ttatttcaga aacatccgta 300
cgcattccgt ccacccccgg gtgtcggtcg gctacgactt cggcggctgg aggatagcgg 360
cagattatgc ccgt 374
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tctagctgta tcaaaaactg taaacctaga gtgtagtagg gagttgggga actccatgtg 120
gagcggtaaa atgcgtagat atatggaaga acaccggtgg cgaaggcgcc aacttggact 180
atcactgacg cttaggctcg aaagtgtggg gagcaaatag gattagatac cctagtagtc 240
cacaccgtaa acgatcatca ttaaatgtcg gcctgaatgg gtcggtgttg tagctaacgc 300
attaaatgat gtgcctgggt agtacattcg caagaatgaa actca 345
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<212> DNA
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<212> DNA
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accgtcagac agaaaagagg a 21
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<400> 21
tcctgcttga gagaacgtgc 20
<210> 22
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<212> DNA
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ttgcccctca gtcttcgtg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttaagaccac aagcacctgc tacgatt 27

Claims (10)

1.引物组，其特征在于，包括用于检测淋球菌的引物对、用于检测沙眼衣原体的引物对和用于检测解脲支原体的引物对；
所述用于检测淋球菌的引物对包括淋球菌-F和淋球菌-R；
所述淋球菌-F具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述淋球菌-R具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测沙眼衣原体的引物对包括沙眼衣原体-F和沙眼衣原体-R；
所述沙眼衣原体-F具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述沙眼衣原体-R具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测解脲支原体的引物对包括解脲支原体-F和解脲支原体-R；
所述解脲支原体-F具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述解脲支原体-R具有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括探针组，所述探针组包括用于检测淋球菌的探针、用于检测沙眼衣原体的探针和用于检测解脲支原体的探针；
所述用于检测淋球菌的探针淋球菌-P具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或与SEQID NO.7所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测沙眼衣原体的探针沙眼衣原体-P具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测解脲支原体的探针解脲支原体-P具有如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述探针组中的探针均独立地含有荧光淬灭基团和互不相同的荧光报告基团；
优选地，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、ROX或CY5；
优选地，所述荧光淬灭基团包括BHQ1或BHQ2。
4.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组还包括用于检测内参基因的引物对；
优选地，所述用于检测内参基因的引物对包括内参基因-F和内参基因-R；
所述内参基因-F具有如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
所述内参基因-R具有如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列；
优选地，所述引物对还包括内参探针-P，所述内参探针-P具有如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测淋球菌的引物对和探针、用于检测沙眼衣原体的引物对和探针、用于检测解脲支原体的引物对和探针以及用于检测内参基因的引物对和探针；
优选地，所述淋球菌-F、淋球菌-R和淋球菌-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述沙眼衣原体-F、沙眼衣原体-R和沙眼衣原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述解脲支原体-F、解脲支原体-R和解脲支原体-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3；
优选地，所述内参基因-F、内参基因-R和内参基因-P的用量比为2-5:2-5:1-4，优选为4:4:3。
6.权利要求1-5任一项所述的引物组在制备检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的产品中的应用。
7.一种淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-5任一项所述的引物组。
8.根据权利要求7所述的三联检产品，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒；
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。
9.根据权利要求8所述的三联检产品，其特征在于，所述PCR反应液包括10×PCRBuffer、Mg2+、dNTPs、dUTP、聚合酶和UDG酶；
优选地，所述聚合酶包括热启动Taq酶；
优选地，所述UDG酶包括尿嘧啶-DNA-糖基酶；
优选地，所述Mg2+包括MgCl2溶液，优选浓度为20-30mM的MgCl2溶液，更优选浓度为25mM的MgCl2溶液；
优选地，所述dNTPs的浓度为20-30mM，更优选浓度为25mM；
优选地，所述dUTP的浓度为90-110mM，更优选浓度为100mM。
10.根据权利要求8或9所述的产品，其特征在于，所述阴性对照品为人基因组DNA，优选浓度为1-3ng/μL的人基因组DNA，更优选浓度为2ng/μL的人基因组DNA；
优选地，所述阳性对照品包括具有如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的淋球菌阳性对照、具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的沙眼衣原体阳性对照和具有如SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的解脲支原体阳性对照。
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