CN105734176B - 一种联合检测多种性病病原体dna的方法 - Google Patents

一种联合检测多种性病病原体dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，GP和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针、IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。本发明的检测方法可以同时定性检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、人型支原体共9种常见性病病原体DNA，检测性病病原体多，方法简单。

Description

一种联合检测多种性病病原体DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种联合检测多种性病病原体DNA的方法。
背景技术
性传播感染是引起全球急性疾病、不孕、长期残疾和死亡的一个主要因素，给成千上万的成人和婴儿造成严重的医疗与心理后果。至今已经有超过30种细菌、病毒和寄生虫等病原体被证实可以通过性接触途径传播。
世界卫生组织(WHO)统计2008年全球和区域15-49岁成年人中4种可治愈性病(沙眼衣原体感染、淋病、梅毒和阴道毛滴虫病)发病与患病估计数。2008年全球15-49岁成年人的4种性病新发病例总数约为4.989亿，其中沙眼衣原体感染1.057亿，淋病1.061亿，阴道毛滴虫病2.764亿。此外，在2008年的任一时点上估计有1.004亿成年人患沙眼衣原体感染，3640万患淋病，1.87亿患阴道毛滴虫病。中国疾病预防控制中心性病控制中19家哨点门诊2012年10至2013年2月共报告5种性病2580例，为生殖道沙眼衣原体感染418例，占16.23％；淋病407例，占15.81％；生殖器疱疹140例，占5.44％。
因此，开发对多种性病病原体的联合检测方法对性病的诊断非常重要。
发明内容
有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种联合检测多种性病病原体DNA的方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，包括以下步骤：
(1)、使用商品化的细菌DNA提取试剂盒(如天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒)提取生殖泌尿道分泌物棉拭子样本的基因组DNA，取1.0mL或以上体积无菌生理盐水漂洗棉拭子样本，转移至1.5mL离心管中，12000rpm/min离心10min，小心去除干净上清液避免扰动或触动到沉淀，可多次收集沉淀；沉淀按天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒提取，提取方法按说明书第二步开始操作，最后用50μL洗脱液洗脱；
(2)、以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，通用引物GP1、GP2和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针，IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；
所述待测性病病原体为沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、和人型支原体；
所述通用引物GP1具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，所述通用引物GP2具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述GPSP引物为针对IAC的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、以及针对沙眼衣原体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、针对淋球菌的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、针对阴道毛滴虫的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、针对HSVII的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、针对生殖支原体的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、针对HSVI的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、针对人型支原体的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、针对解脲脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、和针对微小脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21中的一对以上；
所述特异性探针为针对IAC的SEQ ID NO:30、以及针对沙眼衣原体的SEQ ID NO:26、针对淋球菌的SEQ ID NO:27、针对阴道毛滴虫的SEQ ID NO:28、针对HSVII的SEQ IDNO:29、针对生殖支原体的SEQ ID NO:22、针对HSVI的SEQ ID NO:23、针对人型支原体的SEQID NO:25、针对解脲脲原体的SEQ ID NO:24、和针对微小脲原体的SEQ ID NO:24中的一条以上；
(3)、实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与步骤(1)的PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。
在其中一些实施例中，所述多重PCR反应的反应体系为25.0μL，具体成分如下：
Figure BDA0000982480260000031
在其中一些实施例中，所述多重PCR反应的反应程序为：95℃，预变性10min；95℃，15sec，50-60℃，30sec，72℃，30sec，10个循环；95℃，20sec，61-72℃，2min，20个循环；95℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，30个循环。
在其中一个实施例中，所述多重PCR反应的反应程序为：95℃，预变性10min；95℃，15sec，55℃，30sec，72℃，30sec，10个循环；95℃，20sec，72℃，2min，20个循环；95℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，30个循环。
在其中一些实施例中，所述特异性探针的两端分别标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团。
在其中一些实施例中，上述步骤(3)所述熔解曲线的分析程序为：95℃，2min，45℃，2min，50℃-85℃阶段每0.5-1.0℃采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。
在其中一些实施例中，所述样本为生殖泌尿道分泌物棉拭子(男性生殖泌尿道分泌物棉拭子、女性生殖道分泌物棉拭子、女性尿道分泌物棉拭子)、尿道口或患病部位刮片。
本发明的性病病原体的DNA的多重检测方法采用了荧光PCR熔解曲线法，其基本原理是：本发明设计了分别与沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、生殖支原体(MG)、阴道毛滴虫(TV)、HSVI、HSVII、解脲脲原体(UU)、微小脲原体(UP)、人型支原体(MH)共9种常见性病病原体靶点互补的不同荧光标记探针，其两端分别标记有荧光基团与淬灭基团，在PCR体系中加入探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列；在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)；从而检测出感染相应的病原体DNA。本发明所采用的荧光PCR熔解曲线法具有通量大、敏感性高、特异性强、重复性好、操作简单、灵活性强、应用范围广的优点，是临床上准确、高效而实用的常见性病病原体的DNA的检测方法。
与现行临床使用的检测试剂相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的检测方法可以同时定性检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、人型支原体共9种常见性病病原体DNA，检测性病病原体多，方法简单。
附图说明
图1本发明的联合检测多种性病病原体DNA的方法的流程图；
图2为实施例1中内控对照及各性病病原体的Tm值及对应荧光通道；其中2.1为FAM(GREEN)通道熔解曲线，2.2为Cy5(RED)通道熔解曲线，2.3ROX(ORANGE)通道熔解曲线，2.4为HEX(YELLOW)通道熔解曲线；
图3为实施例2中内控对照及各性病病原体的Tm值及对应荧光通道，其中3.1为PCR反应体系A中ROX(ORANGE)通道熔解曲线，3.2为PCR反应体系A中HEX(YELLOW)通道熔解曲线，3.3为PCR反应体系A中FAM(GREEN)通道熔解曲线，3.4为PCR反应体系A中Cy5(RED)通道熔解曲线，3.5为PCR反应体系B中FAM(GREEN)通道熔解曲线，3.6为PCR反应体系B中Cy5(RED)通道熔解曲线，3.7为PCR反应体系B中HEX(YELLOW)通道熔解曲线，3.8为PCR反应体系A中ROX(ORANGE)通道熔解曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中所使用的方法如无特殊说明，均采取本领域常规技术方法，所使用的原料如无特殊说明，均为市售原料。
如图1所示，为本发明所述的联合检测多种性病病原体DNA的方法的流程图，本发明的联合检测多种性病病原体DNA的方法包括以下步骤：
(1)、提取待测性病病原体样本的基因组DNA；
(2)、以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，通用引物GP和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针、IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；所述待测性病病原体为沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、和人型支原体；
(3)、实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与步骤(1)的PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。
所述GPSP引物包含GPSP正向引物和反向引物，所述GPSP正向引物5’端带有通用引物GP1序列，3’端分别带有内控对照及九种不同性病原体特异性靶标序列的正向引物序列，所述GPSP反向引物5’端带有通用引物GP2序列，3’端分别带有内控对照及九种不同性病原体特异性靶标序列的反向引物序列；
所述GPSP引物中UU和UP的正向引物序列是一样，所述特异性探针中UU和UP的特异性探针序列完全一样，探针跟UU靶标结合时有三个碱基错配，而UP靶标是完全匹配的，因此UU的Tm值比UP的低；
所述多重PCR扩增，包括以下几个程序：程序(1)预变性，为使PCR反应体系的热启动Taq酶激活，模板DNA充分打开双链进行预变性；程序(2)GPSP引物低温预扩增，GPSP引物的特异性序列部位以较低退火温度结合相应病原体或内控对照并延伸，预扩增形成两端带有GP序列的PCR产物片段；程序(3)GPSP引物高温预扩增，为避免较低退火温度下非特异性扩增，主要利用程序(2)中的预扩增形成的两端带有GP序列的PCR产物片段产物为模板，以GPSP引物在较高退火温度继续预扩增，形成更多两端带有GP序列的PCR产物片段；程序(4)通用引物(GP引物)不对称PCR扩增，以程序(2)和程序(3)中GPSP引物预扩增形成的两端带有GP序列的PCR产物片段为模板，以不同浓度的通用引物GP1、GP2进行不对称PCR扩增，形成更多的有利于和特异性探针结合的单链PCR产物片段。
所述内控对照IAC质粒是人工合成的质粒，其序列与各种性病病原体序列没有高度同源性或者同源性差，因此不会干扰上述九种性病病原体的检测，其目的是质控试剂运输、保存不当或试剂配制不准确的引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果；
所述内控对照IAC质粒是质粒中插入了一段150bp的碱基序列，插入的这段碱基序列与九种性病病原体沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、生殖支原体(MG)、阴道毛滴虫(TV)、HSVI、HSVII、解脲脲原体(UU)、微小脲原体(UP)、和人型支原体(MH)的同源很差或者没有相似序列，插入的碱基序列如下，为SEQ ID NO:31：
5’-GGTACCACATGTAACCGCCCCCATTGATTTTGTCTACCCCACTGGGGTGAAGCACCCAGACTTGCCTCCTTGTGAGAGGCCGCACCTTGGTAGTAAATAGACACATGGCCGAGTCTGACTGGACTTCCATAGTAGTGCGTGCGTGGATCC-3’
上述步骤(2)所述多重PCR反应，可以把所有GP引物、GPSP引物和特异性探针在一管里面进行多重PCR反应，也可以分成两管、三管、四管、五管、六管、七管、八管甚至九管同时进行多重PCR反应；上述各种多重PCR反应分管方法中，各管必须有内控对照；上述各种多重PCR反应分管方法中，各管必须有九种病原体特异性探针和GPSP引物中的至少有一种，甚至是九种。
以下通过一管法和二管法来详细说明本发明的几种性病病原体DNA的联合检测方法。
实施例1一管法检测生殖泌尿道分泌物棉拭子样本中的九种性病病原体DNA
本实施例是在一管PCR反应体系中，包含通用引物GP1(SEQ ID NO:1)及GP2(SEQID NO:2)，内控对照IAC(SEQ ID NO:31)，内控对照IAC及九种性病病原体相应的GPSP引物(SEQ ID NO:3～21)和内控对照IAC及九种性病病原体相应的特异性探针(SEQ ID NO:22～30)，进行多重PCR反应。生殖泌尿道分泌物棉拭子样本(A、B、C、D、E)中只要包含九种性病病原体中的任意一种或者一种以上病原体，其都可以在一管PCR反应体系中检测出相应的病原体。
包括以下具体步骤：
1、提取待测生殖泌尿道分泌物棉拭子样本基因组DNA
取五个生殖泌尿道分泌物棉拭子样本，编号A、B、C、D和E。使用商品化的细菌DNA提取试剂盒(如天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒)提取上述五个生殖泌尿道分泌物棉拭子样本的基因组DNA，取1.0mL或以上体积无菌生理盐水漂洗棉拭子样本，转移至1.5mL离心管中，12000rpm/min离心10min，小心去除干净上清液避免扰动或触动到沉淀，可多次收集沉淀；沉淀按天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒提取，提取方法按说明书第二步开始操作，最后用50μL洗脱液洗脱。
2、多重PCR扩增
此步骤包括以下几个程序：
(1)预变性：为使PCR反应体系的酶达到最优活性，模板DNA充分打开双链进行预变性；
(2)GPSP引物低温预扩增：所用GPSP引物具有以下特征，正向引物5’端带有通用引物GP1引物序列且3’端带有九种不同性病原体和内控对照IAC的特异性靶标序列，反向引物5’端带有通用引物GP2引物序列且3’端带有九种不同性病原体和内控对照IAC的特异性靶标序列；以步骤1提取的生殖泌尿道分泌物棉拭子样本的基因组DNA作为模板，使用GPSP引物(选自表1中内控对照IAC的GPSP正反向引物(SEQ ID NO:11～12)和性病病原体CT、NG、MG、TV、HSVI、HSVII、UU、UP和MH的GPSP正反向引物(SEQ ID NO:3～10和SEQ ID NO:13～21)，其中UU和UP的正向引物序列是一样)对提取的生殖泌尿道分泌物样本的基因组DNA进行预扩增，GPSP引物的特异性序列部位以较低退火温度结合相应病原体或内控对照IAC并延伸，预扩增形成两端带有通用引物GP序列的PCR产物片段；
(3)GPSP引物高温预扩增：为避免较低退火温度下非特异性扩增，主要利用程序(2)中的预扩增形成的两端带有GP序列的PCR产物片段产物为模板，以GPSP引物在较高退火温度继续预扩增，形成更多两端带有GP序列的PCR产物片段；
(4)通用引物(GP引物)不对称PCR扩增：以程序(2)和程序(3)中GPSP引物预扩增形成的两端带有GP序列的PCR产物片段为模板，以较低浓度的通用引物GP1和较高浓度的通用引物GP2进行不对称PCR扩增，形成更多的与性病病原体特异性探针结合的单链PCR产物片段；
表1引物和特异性探针序列
Figure BDA0000982480260000101
该步骤的多重PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0000982480260000112
该步骤的多重PCR扩增的反应程序为：
Figure BDA0000982480260000113
Figure BDA0000982480260000121
3、多色荧光溶解曲线分析PCR产物
设置检测荧光通道为FAM，HEX，ROX，Cy5
反应条件为：95℃2min；45℃2min；50℃-85℃熔解曲线分析，速度1.0℃/s。每1.0℃采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。
判读阈值：根据阴性对照，确定合理的阈值。
熔解曲线分析过程——由于性病病原体特异性探针是两端标记有荧光报告基团与淬灭基团的探针，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)。通过探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。熔解曲线分析程序的内控对照和性病病原体靶点的Tm值及荧光通道见表2及图2。
表2内控对照及各性病病原体的Tm值及对应荧光通道
Figure BDA0000982480260000122
Figure BDA0000982480260000131
结果见图2.1-2.4：图2.1可见在FAM(Green)通道上样本A有一个54℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本A的54℃熔解峰代表NG阳性，其余样本及NTC为NG和MG阴性；图2.2可见在Cy5(Red)通道上样本B有一个57.5℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本B的57.5℃熔解峰代表CT阳性，其余样本及NTC为CT和HSVI阴性；图2.3可见在ROX(Orange)通道上样本C和样本D分别有一个55.7℃熔解峰和另一个66.5℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本C的55.7℃熔解峰代表UU阳性，样本D的66.5℃熔解峰代表UP阳性，其余样本及NTC为HSVII、UU和UP阴性；图2.4可见在HEX(Yellow)通道上样本E有一个62.5℃熔解峰和一个76℃熔解峰，其他样本及NTC各有一个76℃熔解峰，所有样本及NTC的76℃熔解峰都代表IAC内控对照阳性，都有扩增，试剂无问题，样本E的62.5℃熔解峰代表MH阳性，样本A、样本B、样本C、样本D及NTC中除有76℃熔解峰熔解峰外没有其他熔解峰，因此样本A、样本B、样本C、样本D及NTC为TV和MH阴性。
因此，本实施例的五个生殖泌尿道分泌物棉拭子样本A、样本B、样本C、样本D和样本E中分别含有NG、CT、UU、UP、MH性病病原体基因组DNA。
实施例2两管法检测生殖泌尿道分泌物棉拭子样本中的九种性病病原体DNA
本实施例是在两管PCR反应体系中进行多重PCR反应，其中一管PCR反应体系A包含通用引物GP1(SEQ ID NO:1)及GP2(SEQ ID NO:2)、内控对照IAC质粒(SEQ ID NO:31)、CT、NG、TV、HSVII四种性病病原体及内控对照IAC相应的GPSP引物(SEQ ID NO:3～12)、CT、NG、TV、HSVII四种性病病原体相应及内控对照IAC的特异性探针(SEQ ID NO:26～30)；另一管PCR反应体系B包含通用引物GP1(SEQ ID NO:1)及GP2(SEQ ID NO:2)、内控对照IAC质粒(SEQ ID NO:31)、MG、HSVI、UU、UP、MH五种性病病原体及内控对照IAC相应的GPSP引物(SEQID NO:11～21)、MG、HSVI、UU、UP、MH五种性病病原体及内控对照IAC相应的特异性探针(SEQID NO:22～25及SEQ ID NO:30)。将提取的生殖泌尿道分泌物棉拭子样本DNA分别加入PCR反应体系A和PCR反应体系B中，进行多重PCR反应。生殖泌尿道分泌物样本中只要包含上述CT、NG、TV、HSVII四种性病病原体中的任意一种或者一种以上病原体，其都可以在PCR反应体系A中检测出相应的病原体；生殖泌尿道分泌物样本中只要包含上述MG、HSVI、UU、UP、MH五种性病病原体中的任意一种或者一种以上病原体，其都可以在PCR反应体系B中检测出相应的病原体。
包括以下具体步骤：
1、提取待测生殖泌尿道分泌物棉拭子样本基因组DNA
取四个生殖泌尿道分泌物棉拭子样本，编号F、G、H和I，使用实施例1相同的方法提取生殖泌尿道分泌物样本的基因组DNA。
2、多重PCR扩增
此步骤的多重PCR扩增的反应体系为：
PCR反应体系A为：
Figure BDA0000982480260000151
PCR反应体系B为：
Figure BDA0000982480260000152
该步骤的多重PCR扩增的反应程序与实施例1相同。
3、多色荧光溶解曲线分析PCR产物的步骤同实施例1。
熔解曲线分析程序的内控对照和性病病原体靶点的Tm值及荧光通道见表2及图3.1-3.8，图3.1可见PCR反应体系A中，在ROX(ORANGE)通道上样本F有一个74℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本F在PCR反应体系A的74℃熔解峰代表HSVII阳性，其他样本及NTC为HSVII阴性；图3.2可见PCR反应体系A中，在HEX(YELLOW)通道上样本G有一个66.5℃熔解峰及一个76℃熔解峰，其他样本及NTC各有一个76℃熔解峰，所有样本及NTC的76℃熔解峰代表IAC内控对照阳性，都有扩增，试剂无问题，样本G的66.5℃熔解峰代表TV阳性，样本F、样本H、样本I和NTC除76℃熔解峰外无66.5℃熔解峰代表其都为TV阴性；图3.3可见PCR反应体系A中，在FAM(GREEN)通道无熔解峰，代表各样本和NTC在PCR反应体系A中为NG阴性；图3.4可见PCR反应体系A中，在Cy5(RED)通道无熔解峰，代表各样本和NTC在PCR反应体系A中为CT阴性；图3.5可见PCR反应体系B中，在FAM(GREEN)通道上样本H有一个66.3℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本H的66.3℃熔解峰代表MG阳性，其他样本及NTC为MG阴性；图3.6可见PCR反应体系B中，在Cy5(RED)通道上样本I有一个68.8℃熔解峰，其他样本及NTC无熔解峰，样本I的68.8℃熔解峰代表HSVI阳性，其他样本及NTC为HSVI阴性；图3.7可见PCR反应体系B中，在HEX(YELLOW)通道上各个样本及NTC各有一个76℃熔解峰，所有样本及NTC的76℃熔解峰代表IAC内控对照阳性，都有扩增，试剂无问题，所有样本及NTC除76℃熔解峰无其他熔解峰代表其都为MH阴性；图3.8可见PCR反应体系B中，在ROX(ORANGE)通道上所有样本及NTC都无熔解峰，代表所有样本及NTC为UU和UP阴性。
因此，本实施例的四个生殖泌尿道分泌物棉拭子样本F、样本G、样本H和样本I中分别含有HSVII、TV、MG和HSVI性病病原体基因组DNA。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure IDA0000982480330000011
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Figure IDA0000982480330000051
Figure IDA0000982480330000061
Figure IDA0000982480330000071

Claims (2)

1.一种联合检测多种性病病原体DNA的检测试剂，其特征在于，包括：GP1引物、GP2引物、GPSP引物、特异性探针和IAC质粒；
所述的GP1引物如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，所述GP2引物如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；
所述GPSP引物为针对IAC的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、针对沙眼衣原体的SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4、针对淋球菌的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、针对阴道毛滴虫的SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、针对HSVII的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、针对生殖支原体的SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、针对HSVI的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、针对人型支原体的SEQID NO:17和SEQ ID NO:18、针对解脲脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、和针对微小脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21；
所述特异性探针为针对IAC的SEQ ID NO:30、针对沙眼衣原体的SEQ ID NO:26、针对淋球菌的SEQ ID NO:27、针对阴道毛滴虫的SEQ ID NO:28、针对HSVII的SEQ ID NO:29、针对生殖支原体的SEQ ID NO:22、针对HSVI的SEQ ID NO:23、针对人型支原体的SEQ ID NO:25和针对微小脲原体的SEQ ID NO:24；
所述IAC质粒如SEQ ID NO：31的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的联合检测多种性病病原体DNA的检测试剂，其特征在于，所述特异性探针的两端分别标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团。
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