CN111534624A - 一种基于rpa对解脲脲原体的快速检测方法 - Google Patents

一种基于rpa对解脲脲原体的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的属于解脲脲原体检测技术领域，具体为一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，包括以下步骤：材料准备：S1：菌株，S2：试剂；该种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，将RPA技术利用于解脲脲原体的快速检测，同时具有较高的灵敏度和良好的特异性，建立的RPA扩增方法完成对解脲脲原体的快速检测，与对照病原体相比，仅解脲脲原体呈现经典的扩增曲线；RPA检测解脲脲原体最低检出限为3pg；用临床病例样本评估检测效果证明RPA方法具有可行性，能满足临床检测的需要，建立的解脲脲原体实时荧光RPA方法具有高特异度、高灵敏性、简便快捷等优点，可用于解脲脲原体快速检测，为进一步的研究提供了可行性以及良好的研究基础。

Description

一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法
技术领域
本发明涉及解脲脲原体检测技术领域，具体为一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法。
背景技术
解脲支原体是一类主要寄居于人体的泌尿生殖道的病原微生物，当机体免疫力下降时，常引起非淋菌性尿道炎(NUG)、宫颈炎、盆腔炎、睾丸炎、附睾炎等疾患，并可引起男女不孕不育，孕期感染可导致流产、早产、胎膜早破等不良妊娠结局，加之此类病原体侵袭破坏泌尿生殖道粘膜上皮细胞，因此更易引起其它性病的继发感染，是性传播疾病的重要病原体之一。解脲脲原体属于条件致病病原体，正常人群中的携带者往往不一定出现临床表征，这很大程度上掩盖了患者的病情，极易造成漏检，导致患者错过最佳治疗时间。
目前，临床检测解脲脲原体感染的主要方法有培养法和基于聚合酶链式反应的检测方法(PCR)，培养法培养周期较长且容易因为污染造成假阳性结果；PCR需要经历高温变性、低温退火、中温延伸等热循环过程，需要有专门温控设备，而且对实验条件以及操作人员的要求都较高，比较难以在基层及偏远地区广泛应用。
近年来，恒温扩增技术由于在某一特定的温度条件就可以进行扩增，因此备受青睐，现在常见的恒温扩增技术主要包括主要包括环介导恒温扩增、链置换恒温扩增、滚环恒温扩增、依赖解旋酶恒温扩增和重组酶聚合酶恒温扩增等，恒温扩增技术相对于传统方法和PCR而言能够摆脱精密的温度循环系统，实现了在缺乏完善的高精密设备的情况下也能进行快速和准确检测，RPA是一项基于PCR技术发展而来的等温核酸扩增技术，具有较高灵敏性和特异性；操作便捷；检测耗时短；结果读取多样化以及能够在等温条件下对靶DNA进行扩增的优点。
RPA技术以T4噬菌体核酸复制机制为原理,利用重组酶uvsX以及辅助蛋白uvsY和单链结合蛋白在常温下实现引物和模板的特异结合,从而实现目标序列的扩增，在RPA反应中，重组酶uvsX以及辅助蛋白uvsY(uvsY可以提高与ssDNA的亲和力，提高uvsX-ssDNA相互作用的稳定性)与上下游引物结合形成核酸蛋白复合体，该复合体会寻找同源的双链DNA，接着，复合体侵入5’端位点形成D环状，单链绑定蛋白(SSB)和亲本链结合，阻止其与脱离的另一条模板链发生相互作用，同时，重组酶uvsX离开引物，降解后被DNA聚合酶利用，之后DNA聚合酶结合在上下游引物的3’端启动模板合成，进行链的延伸，形成新的互补链，新合成的互补链和原始模板链形成双链DNA，以上步骤循环进行，即可实现DNA的指数增长，若引入逆转录酶，即可建立RT-RPA。
现有的解脲脲原体检测RPA方法还存在一些缺点，如低特异度、低灵敏性、繁琐复杂等缺点，难以快速检测解脲脲原体，在用于解脲脲原体快速检测的过程中存在提升空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的现有的解脲脲原体检测RPA方法还存在一些缺点，如低特异度、低灵敏性、繁琐复杂等缺点，难以快速检测解脲脲原体，在用于解脲脲原体快速检测的过程中存在提升空间的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，包括以下步骤：
材料准备：
S1：菌株，临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液；临床确认且经培养得到的病原体培养液；30列临床女性阴道拭子；
S2：试剂；
S3：仪器；
引物、探针的设计与合成：
S1：NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列，应用Oligo7设计特异性引物和探针，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，引物交由生物工程公司合成，其中，引物长度：RPA引物比典型的PCR引物更长，为30～35个核苷酸；引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp，理想长度为100～200bp：
S2：引物选择：选择靶区：GC含量在40％～60％之间；重复序列；很少正向/反向重复、回文等；候选引物：利用PCR软件如Primer 3、Primer-BLAST进行设计：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；
S3：探针设计：探针由寡核苷酸骨架组成，骨架中包含：一个脱碱基核苷酸类似物；一个侧翼dT-荧光团，为荧光素，可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团；在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团，通常是合适的淬灭团[BHQ]；一个合适的3’-修饰基团以阻断探针的聚合酶延伸；
骨架组合物的选择：根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团，BHQ1作为猝灭团，C3-间臂作为3’端修饰基团；
S4：探针长度：应为46～52个核苷酸，其中30个位于THF位点的5’端，另外15个位于其的3’端；
S5：条件优化：温度：根据酶的最适温度，分别设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5个温度梯度下扩增20min，扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行，通过凝胶电泳法分析产物，39℃下条带最亮与试剂说明书一致；
S6：探针选择：将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测，通过实时荧光PCR在39℃下进行检测荧光信号；
模板制备：
S1：将收集到的标本10000转离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至沉淀彻底悬浮，向各管加入20μlProteinase K溶液，混匀，各管加入220μl的GB液，振荡15sec出现絮状沉淀，全部EP管在70℃金属浴放置10min，溶液变清亮，瞬离，各管加入220μl无水乙醇，充分振荡15sec需要无沉淀，瞬离，将上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入洁净收集管中，12000转离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl缓冲液GD，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步，将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min，倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入60μl洗脱液TE，室温放置2～5分钟，12000转离心2min，将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用；
S2：筛选RPA最优引物，按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、无引物再水合缓冲液29.5μl、模板和水13.2μl(总体积47.5μl)，振荡并短暂离心，对于每份样本，将47.5μl再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，对于每份样本，加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀，如需同时如此处理多个样本，可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中，小心盖紧管盖，并通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应，短暂振荡并再次快速离心，其中，TwistAmp反应是靠MgOAc来激活，在加入MgOAc后，迅速将样本置于选择的孵育温度下进行孵育，将试管放入合适的恒温仪中孵育20min，温度为39℃；
S3：纯化产物。
优选的，所述病原体培养液为：沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌。
优选的，所述试剂为：TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；
Figure BDA0002543859490000051
exo试剂盒；
Figure BDA0002543859490000052
Basic试剂盒；TIAN GEN 50×TAE Buffer；TIANGEN Agarose LE；BIOTIUM GelRedTM 10000×in water；MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit。
优选的，所述仪器为：JJ523BC电子天平；Synergy UV系统超纯水仪；DRY BATH金属浴；HFsafe～1500TE生物安全柜；XW～80A Vortex振荡器；D1008E离心机；eppendorf 5424R低温离心机；Biospectrum510凝胶成像仪；StepOne Plus实时荧光PCR仪。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，将RPA技术利用于解脲脲原体的快速检测，同时具有较高的灵敏度和良好的特异性，为病原体感染领域的快速检测提供了新的方法，建立的RPA扩增方法在39℃条件下20min内完成对解脲脲原体的快速检测，与对照病原体相比，仅解脲脲原体呈现经典的扩增曲线；RPA检测解脲脲原体最低检出限为3pg；用临床病例样本评估检测效果证明RPA方法具有良好的可行性，能够满足临床检测的需要，建立的解脲脲原体实时荧光RPA方法具有高特异度、高灵敏性、简便快捷等优点，可用于解脲脲原体快速检测，为进一步的研究提供了可行性以及良好的研究基础。
附图说明
图1为本发明初筛引物的扩增效果示意图；
图2为本发明以解脲脲原体DNA为模板的RPA技术检测UU的扩增时长结果示意图；
图3为本发明以解脲脲原体DNA为模板的RPA检测的扩增曲线示意图；
图4为本发明图3相对应的凝胶电泳结果示意图；
图5为本发明以临床培养阳性的解脲脲原体RPA检测的扩增曲线示意图；
图6为本发明图5相对应的凝胶电泳结果示意图；
图7为本发明RPA检测临床样本的扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，包括以下步骤：
材料准备：
S1：菌株，临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液；临床确认且经培养得到的病原体培养液；30列临床女性阴道拭子；
S2：试剂；
S3：仪器；
引物、探针的设计与合成：
S1：NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列，应用Oligo7设计特异性引物和探针，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，引物交由生物工程公司合成，其中，引物长度：RPA引物比典型的PCR引物更长，为30～35个核苷酸；引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp，理想长度为100～200bp：
S2：引物选择：选择靶区：GC含量在40％～60％之间；重复序列；很少正向/反向重复、回文等；候选引物：利用PCR软件如Primer3、Primer-BLAST进行设计：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；
S3：探针设计：探针由寡核苷酸骨架组成，骨架中包含：一个脱碱基核苷酸类似物；一个侧翼dT-荧光团，为荧光素，可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团；在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团，通常是合适的淬灭团[BHQ]；一个合适的3’-修饰基团以阻断探针的聚合酶延伸；
骨架组合物的选择：根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团，BHQ1作为猝灭团，C3-间臂作为3’端修饰基团；
S4：探针长度：应为46～52个核苷酸，其中30个位于THF位点的5’端，另外15个位于其的3’端；
S5：条件优化：温度：根据酶的最适温度，分别设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5个温度梯度下扩增20min，扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行，通过凝胶电泳法分析产物，39℃下条带最亮与试剂说明书一致；
S6：探针选择：将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测，通过实时荧光PCR在39℃下进行检测荧光信号；
模板制备：
S1：将收集到的标本10000转离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至沉淀彻底悬浮，向各管加入20μlProteinaseK溶液，混匀，各管加入220μl的GB液，振荡15sec出现絮状沉淀，全部EP管在70℃金属浴放置10min，溶液变清亮，瞬离，各管加入220μl无水乙醇，充分振荡15sec需要无沉淀，瞬离，将上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入洁净收集管中，12000转离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl缓冲液GD，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步，将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min，倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入60μl洗脱液TE，室温放置2～5分钟，12000转离心2min，将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用；
S2：筛选RPA最优引物，按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、无引物再水合缓冲液29.5μl、模板和水13.2μl(总体积47.5μl)，振荡并短暂离心，对于每份样本，将47.5μl再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，对于每份样本，加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀，如需同时如此处理多个样本，可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中，小心盖紧管盖，并通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应，短暂振荡并再次快速离心，其中，TwistAmp反应是靠MgOAc来激活，在加入MgOAc后，迅速将样本置于选择的孵育温度下进行孵育，将试管放入合适的恒温仪中孵育20min，温度为39℃；
S3：纯化产物；
其中，所述病原体培养液为：沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌，所述试剂为：TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；
Figure BDA0002543859490000081
exo试剂盒；
Figure BDA0002543859490000082
Basic试剂盒；TIAN GEN 50×TAE Buffer；TIANGEN Agarose LE；BIOTIUM GelRedTM 10000×in water；MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit，所述仪器为：JJ523BC电子天平；Synergy UV系统超纯水仪；DRY BATH金属浴；HFsafe～1500TE生物安全柜；XW～80A Vortex振荡器；D1008E离心机；eppendorf 5424R低温离心机；Biospectrum510凝胶成像仪；StepOne Plus实时荧光PCR仪。
实施例1
材料准备：
S1：菌株，临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液；临床确认且经培养得到的病原体培养液；30列临床女性阴道拭子；
S2：试剂；
S3：仪器；
引物、探针的设计与合成：
S1：NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列，应用Oligo7设计特异性引物和探针，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，引物交由生物工程公司合成，其中，引物长度：RPA引物比典型的PCR引物更长，为30个核苷酸；引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp，理想长度为100bp：
S2：引物选择：选择靶区：GC含量在40％之间；重复序列；很少正向/反向重复、回文等；候选引物：利用PCR软件如Primer 3、Primer-BLAST进行设计：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；
S3：探针设计：探针由寡核苷酸骨架组成，骨架中包含：一个脱碱基核苷酸类似物；一个侧翼dT-荧光团，为荧光素，可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团；在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团，通常是合适的淬灭团[BHQ]；一个合适的3’-修饰基团以阻断探针的聚合酶延伸；
骨架组合物的选择：根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团，BHQ1作为猝灭团，C3-间臂作为3’端修饰基团；
S4：探针长度：应为46个核苷酸，其中30个位于THF位点的5’端，另外15个位于其的3’端；
S5：条件优化：温度：根据酶的最适温度，分别设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5个温度梯度下扩增20min，扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行，通过凝胶电泳法分析产物，39℃下条带最亮与试剂说明书一致；
S6：探针选择：将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测，通过实时荧光PCR在39℃下进行检测荧光信号；
模板制备：
S1：将收集到的标本10000转离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至沉淀彻底悬浮，向各管加入20μlProteinase K溶液，混匀，各管加入220μl的GB液，振荡15sec出现絮状沉淀，全部EP管在70℃金属浴放置10min，溶液变清亮，瞬离，各管加入220μl无水乙醇，充分振荡15sec需要无沉淀，瞬离，将上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入洁净收集管中，12000转离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl缓冲液GD，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步，将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min，倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入60μl洗脱液TE，室温放置2分钟，12000转离心2min，将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用；
S2：筛选RPA最优引物，按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、无引物再水合缓冲液29.5μl、模板和水13.2μl(总体积47.5μl)，振荡并短暂离心，对于每份样本，将47.5μl再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，对于每份样本，加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀，如需同时如此处理多个样本，可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中，小心盖紧管盖，并通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应，短暂振荡并再次快速离心，其中，TwistAmp反应是靠MgOAc来激活，在加入MgOAc后，迅速将样本置于选择的孵育温度下进行孵育，将试管放入合适的恒温仪中孵育20min，温度为39℃；
S3：纯化产物；
其中，所述病原体培养液为：沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌，所述试剂为：TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；
Figure BDA0002543859490000111
exo试剂盒；
Figure BDA0002543859490000112
Basic试剂盒；TIAN GEN 50×TAE Buffer；TIANGEN Agarose LE；BIOTIUM GelRedTM 10000×in water；MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit，所述仪器为：JJ523BC电子天平；Synergy UV系统超纯水仪；DRY BATH金属浴；HFsafe～1500TE生物安全柜；XW～80A Vortex振荡器；D1008E离心机；eppendorf 5424R低温离心机；Biospectrum510凝胶成像仪；StepOne Plus实时荧光PCR仪。
实施例2
一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，包括以下步骤：
材料准备：
S1：菌株，临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液；临床确认且经培养得到的病原体培养液；30列临床女性阴道拭子；
S2：试剂；
S3：仪器；
引物、探针的设计与合成：
初步得到的引物序列如表1，最终选取的引物和探针序列如下表2所示：
Figure BDA0002543859490000121
注：FAM-dT表示以FAM修饰碱基T，THF为四氢呋喃残基，BHQ1-dT表示以BHQ1修饰碱基，C3 Spacer为C3-间臂：
S1：NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列，应用Oligo7设计特异性引物和探针，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，引物交由生物工程公司合成，其中，引物长度：RPA引物比典型的PCR引物更长，为35个核苷酸；引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp，理想长度为200bp：
S2：引物选择：选择靶区：GC含量在60％之间；重复序列；很少正向/反向重复、回文等；候选引物：利用PCR软件如Primer 3、Primer-BLAST进行设计：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；
S3：探针设计：探针由寡核苷酸骨架组成，骨架中包含：一个脱碱基核苷酸类似物；一个侧翼dT-荧光团，为荧光素，可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团；在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团，通常是合适的淬灭团[BHQ]；一个合适的3’-修饰基团以阻断探针的聚合酶延伸；
骨架组合物的选择：根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团，BHQ1作为猝灭团，C3-间臂作为3’端修饰基团；
S4：探针长度：应为52个核苷酸，其中30个位于THF位点的5’端，另外15个位于其的3’端；
S5：条件优化：温度：根据酶的最适温度，分别设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5个温度梯度下扩增20min，扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行，通过凝胶电泳法分析产物，39℃下条带最亮与试剂说明书一致；
S6：探针选择：将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测，通过实时荧光PCR在39℃下进行检测荧光信号；
模板制备：
S1：将收集到的标本10000转离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至沉淀彻底悬浮，向各管加入20μlProteinase K溶液，混匀，各管加入220μl的GB液，振荡15sec出现絮状沉淀，全部EP管在70℃金属浴放置10min，溶液变清亮，瞬离，各管加入220μl无水乙醇，充分振荡15sec需要无沉淀，瞬离，将上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入洁净收集管中，12000转离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl缓冲液GD，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步，将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min，倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入60μl洗脱液TE，室温放置5分钟，12000转离心2min，将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用；
RPA实时荧光法检测解脲脲原体方法建立：
DNA为模板，采用筛选的最优引物进行RPA扩增，同时设置超纯水为阴性对照，测试反应39℃反应时长(即扩增循环数)分别为10、15、20、25、30min时的扩增效果，RPA反应体系为50μl，其中，2.1μl正反向引物(10μM)，0.6μl
Figure BDA0002543859490000141
exo探针，29.5μl无引物再水合缓冲液，3μlDNA模板和10.2μlddH2O，充分振荡混匀并且瞬离，最后加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)，将反应管置于实时荧光PCR仪中39℃恒温反应相应时长；
S2：筛选RPA最优引物，按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、无引物再水合缓冲液29.5μl、模板和水13.2μl(总体积47.5μl)，振荡并短暂离心，对于每份样本，将47.5μl再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，对于每份样本，加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀，如需同时如此处理多个样本，可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中，小心盖紧管盖，并通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应，短暂振荡并再次快速离心，其中，TwistAmp反应是靠MgOAc来激活，在加入MgOAc后，迅速将样本置于选择的孵育温度下进行孵育，将试管放入合适的恒温仪中孵育20min，温度为39℃；
S3：纯化产物：
操作如下：
1、向RPA产物中加入2倍体积Buffer PN，充分混匀；
2、柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱中加入200μl Buffer BL，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，将步骤1所得溶液加入到平衡后的吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；
3、向吸附柱中加入450μl Buffer PW静置2-5分钟，13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液；
4、重复步骤3；
5、将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管(自备)中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl Buffer EB，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟，搜集DNA溶液，-20℃保存DNA；
其中，为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新滴加到吸附柱中，室温放置2分钟，13000rpm离心1分钟；洗脱体积不应小于30μl，体积过少会影响回收效率；回收大于10kb的DNA片段时，Buffer EB应在50℃水浴中预热，可增加回收效率。
纯化后产物在琼脂糖凝胶上跑胶，加样(第一孔maker 5μl；扩增产物10μl/每孔)，接通电泳装置电源，设定电压90V，开始电泳，电泳结束后，凝胶放入仪器进行成像观察；
RPA检测解脲脲原体的灵敏度：测定出所提取DNA模板的DNA浓度为3ng/μl，将DNA模板系列稀释，得到浓度为3ng/μl、300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl的模板溶液，进行RPA扩增，确定RPA方法的最低检测限；
RPA检测解脲脲原体的特异性：提取解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌DNA进行特异性验证，按照2.2的方法提取上述试验病原体DNA作为试验模板，首先进行RPA扩增，分析引物的特异性及RPA方法的可行性；
RPA检测实际临床样品：为了验证RPA在临床标本中的应用，检测30列采集的临床患者标本，用阴道拭子从病人身上收集标本，并转移到一个含有1ml生理盐水的无菌试管中，保持湿润，提取DNA模板且-20℃储存，将提取的临床样本DNA模板进行RPA扩增，将检测结果与临床PCR检测结果进行比较；
结果与分析：
S1：最优引物的筛选：以解脲脲原体DNA为模板，并以超纯水为阴性对照，试了5对初筛引物的扩增效果，可见图1中跑道1、2、3、4均分别出现明显的扩增条带，且与表1中预期目的条带大小一致，阴性对照未扩增到可见条带。因此可得所筛选出的5对引物中1、2、3、4号引物为有效引物，能够实现针对UU的靶序列能够实现有效的RPA扩增，且3号引物的条带亮度最高，说明其扩增效率最高，为最优引物；
S2：RPA检测方法的构建：以解脲脲原体DNA为模板，并以超纯水为阴性对照，测试了不同扩增时长的RPA实时荧光法检测效果，结果如图2，在10以及15个循环时，扩增曲线都未达到平台期，20个循环后呈现明显的平台期，一个循环用时为1分钟，说明RPA检测解脲脲原体的最佳扩增时间为20分钟，阴性对照未出现明显的扩增曲线，本实验所创建的RPA检测体系能够准确检测UU16sRNA基因：
S3：RPA检测方法的灵敏度评价：以解脲脲原体不同浓度DNA为模板进行RPA试验，如图所示，当模板浓度为3ng，300pg，30pg，以及3pg时，均出现明显扩增曲线与目的条带，但模板浓度低于3pg时无明显扩增曲线与目的条带，即说明RPA的检测最低限为3pg：
S4：RPA检测方法的特异性分析：选择临床培养阳性的解脲脲原体、沙眼衣原体、淋球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和阴道乳酸杆菌标本提取DNA进行RPA特异性验证；
S5：临床样本的检测，为了验证RPA检测解脲脲原体的实用性，选择30例临床标本，用RPA方法检测与临床PCR检测结果进行比较分析；
其中，所述病原体培养液为：沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌，所述试剂为：TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；
Figure BDA0002543859490000171
exo试剂盒；
Figure BDA0002543859490000172
Basic试剂盒；TIAN GEN 50×TAE Buffer；TIANGEN Agarose LE；BIOTIUMGelRedTM 10000×in water；MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit，所述仪器为：JJ523BC电子天平；Synergy UV系统超纯水仪；DRY BATH金属浴；HFsafe～1500TE生物安全柜；XW～80A Vortex振荡器；D1008E离心机；eppendorf 5424R低温离心机；Biospectrum510凝胶成像仪；StepOne Plus实时荧光PCR仪。
临床标本测试结果：
Figure BDA0002543859490000173
Figure BDA0002543859490000181
虽然在上文中已经参考实施例对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施例中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施例，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。

Claims (4)

1.一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
材料准备：
S1：菌株，临床经培养方法确认UU阳性的病原体培养液；临床确认且经培养得到的病原体培养液；30列临床女性阴道拭子；
S2：试剂；
S3：仪器；
引物、探针的设计与合成：
S1：NCBI数据库中查获解脲脲原体16sRNA以及多带抗原基因特异序列，应用Oligo7设计特异性引物和探针，同时并且在NCBI上对所设计出的引物进行特异性筛选，引物交由生物工程公司合成，其中，引物长度：RPA引物比典型的PCR引物更长，为30～35个核苷酸；引物序列：避免引物中存在不寻常的序列，如一段长序列全由一种特定的核苷酸组成，或存在许多重复的短序列；扩增产物长度：对于超快速的RPA分析，扩增子长度不超过500bp，理想长度为100～200bp：
S2：引物选择：选择靶区：GC含量在40％～60％之间；重复序列；很少正向/反向重复、回文等；候选引物：利用PCR软件如Primer 3、Primer-BLAST进行设计：引物大小最小30，最大36；引物GC％最小20％，最大70％；引物Tm最小50，最大100；最大允许的单核苷酸重复长度设定为5；BLAST验证；
S3：探针设计：探针由寡核苷酸骨架组成，骨架中包含：一个脱碱基核苷酸类似物；一个侧翼dT-荧光团，为荧光素，可使用任何作为dT偶联试剂用于寡核苷酸合成的荧光团；在THF基团另一侧有一个相应的dT-淬灭团，通常是合适的淬灭团[BHQ]；一个合适的3’-修饰基团以阻断探针的聚合酶延伸；
骨架组合物的选择：根据试剂盒设计手册要求选FAM作为荧光团，BHQ1作为猝灭团，C3-间臂作为3’端修饰基团；
S4：探针长度：应为46～52个核苷酸，其中30个位于THF位点的5’端，另外15个位于其的3’端；
S5：条件优化：温度：根据酶的最适温度，分别设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃的5个温度梯度下扩增20min，扩增后的产物立即放在冰上以中止反应的进行，通过凝胶电泳法分析产物，39℃下条带最亮与试剂说明书一致；
S6：探针选择：将设计好的两条探针分别同时对多个阳性样本进行检测，通过实时荧光PCR在39℃下进行检测荧光信号；
模板制备：
S1：将收集到的标本10000转离心1min，吸净上清，保留菌体沉淀，向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至沉淀彻底悬浮，向各管加入20μlProteinase K溶液，混匀，各管加入220μl的GB液，振荡15sec出现絮状沉淀，全部EP管在70℃金属浴放置10min，溶液变清亮，瞬离，各管加入220μl无水乙醇，充分振荡15sec需要无沉淀，瞬离，将上述所得溶液加入吸附柱CB3，吸附柱放入洁净收集管中，12000转离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，向CB3中加入500μl缓冲液GD，GD使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，向CB3中加入600μl漂洗液PW，PW使用前应先按要求加入规定量的无水乙醇，12000转离心30sec，倒掉废液，将CB3放回收集管，重复上一步，将装有CB3的收集管放入离心机，12000转离心2min，倒掉废液，将CB3置室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液，CB3放入干净的EP管中，向吸附膜的中间部分悬空加入60μl洗脱液TE，室温放置2～5分钟，12000转离心2min，将核酸溶液收集到EP管中，-20℃冰冻保存备用；
S2：筛选RPA最优引物，按试剂盒说明书要求制备每份样本的再水合溶液：正向引物(10μM)2.4μl、反向引物(10μM)2.4μl、无引物再水合缓冲液29.5μl、模板和水13.2μl(总体积47.5μl)，振荡并短暂离心，对于每份样本，将47.5μl再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，对于每份样本，加入2.5μl的280mM醋酸镁(MgOAc)并充分混匀，如需同时如此处理多个样本，可将MgOAc加到反应管(8联排管)的盖子中，小心盖紧管盖，并通过离心使MgOAc进入再水合材料中以激活反应，短暂振荡并再次快速离心，其中，TwistAmp反应是靠MgOAc来激活，在加入MgOAc后，迅速将样本置于选择的孵育温度下进行孵育，将试管放入合适的恒温仪中孵育20min，温度为39℃；
S3：纯化产物。
2.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，其特征在于：所述病原体培养液为：沙眼衣原体、淋球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和阴道乳酸杆菌。
3.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，其特征在于：所述试剂为：TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒；
Figure FDA0002543859480000031
exo试剂盒；
Figure FDA0002543859480000032
Basic试剂盒；TIAN GEN 50×TAE Buffer；TIAN GEN Agarose LE；BIOTIUM GelRedTM 10000×in water；MonPureaTM Gel&PCR Clean Kit。
4.根据权利要求1所述的一种基于RPA对解脲脲原体的快速检测方法，其特征在于：所述仪器为：JJ523BC电子天平；Synergy UV系统超纯水仪；DRY BATH金属浴；HFsafe～1500TE生物安全柜；XW～80A Vortex振荡器；D1008E离心机；eppendorf 5424R低温离心机；Biospectrum510凝胶成像仪；StepOne Plus实时荧光PCR仪。
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