CN102191321A

CN102191321A - 一种利用rna恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN102191321A
Application number: CN201110071284XA
Authority: CN
Inventors: 于明辉; 方亮; 张常娥; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2011-09-21
Anticipated expiration: 2031-03-23
Also published as: CN102191321B

Abstract

本发明涉及一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：尿样保存液；核酸提取液；UU反应液；UU检测液；SAT酶液；UU阳性对照；UU阴性对照。本发明的检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

Description

一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属体外诊断试剂技术领域，特别是涉及一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒。

背景技术

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)是一类原核细胞微生物，体积介于细菌与病毒之间，是人类泌尿生殖道的常见病原体，与许多泌尿生殖道感染症、围产期感染和不育症都有关系，是性传播疾病的病原体之一。值得注意的是，在孕妇中解脲脲原体感染者较多，国外有报道为80％，而我国有报道为55.12％。在这个时期感染解脲脲原体，不仅危害母体健康，而且危害胎儿生存，很容易发生低体重儿、新生呼吸道感染、中枢神经系统感染、胎儿死亡等严重后果。

解脲脲原体感染后，患者大多无明显症状，很难被患者觉察，也易造成医生漏诊，因此实验室检测是临床诊断的重要辅助手段。目前，解脲脲原体的实验室检测方法主要有细胞生物学检测方法(如培养和镜检)、免疫学检测方法(如抗原检测法)和分子生物学方法(如PCR和实时荧光定量PCR法)。然而细胞生物学法耗时费力，操作技术高；免疫学检测方法(如抗原检测法)特异性差，灵敏度低，都不利于早期的临床快速、特异诊断。分子生物学方法主要为PCR法。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是容易造成假阳性污染，并且对用药后康复的病人检测结果仍出现阳性结果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，该检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

本发明的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：

(1)尿样保存液：含有硫酸铵和去垢剂；

(2)核酸提取液：含有磁性颗粒和捕获探针；

(3)UU反应液：含dNTPs和NTPs扩增所需组份；

(4)UU检测液：为恒温扩增时必需的UU引物和UU荧光探针溶解在TE溶液(10mMTris和1mM EDTA的混合液)中配制而成；其中UU检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：UU T7：序列见序列表SEQ.ID.NO3-6；UU nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO7-10；UU检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：UU probe：序列见序列表SEQ.ID.NO11-12；

(5)SAT酶液：为恒温扩增时的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mMKCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)Triton X-100、10～40％(v/v)glycerol；

(6)UU阳性对照：为失活的UU菌，浓度为2×10⁵CFU/ml；

(7)UU阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO13核酸序列或不含有解脲脲原体的溶液。

所述的试剂盒还包括洗涤液。

所述的洗涤液为含十二烷基磺酸钠(SDS)、NaCl和乙醇的溶液，具体包含SDS 0.1～1％，NaCl 10～150mM，乙醇0.1～1％。

尿样保存液主要有效成分是硫酸铵和去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。另外，尿样保存液中高浓度盐离子及去垢剂的存在，通过蛋白质变性使菌体细胞破裂，靶标RNA得到了释放，样本放在该保存液中，延长了样本的保存时间，RNA从细胞中释放出来。

尿样保存液为裂解和保存尿液或生殖道拭子洗涤液标本中解脲脲原体(UU)RNA的表面活性剂和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液，具体包括0.1～10M硫酸铵；0.15～1MHEPES。

核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的支原体靶标核酸(RNA)。病原体rRNA的提取通过特异性吸附原理来实现。

核酸提取液为捕获核酸时必须的一个组分，具体包含磁珠0.1～10mg/ml，TCO0.1～100μM。

核酸提取液中含有的标本提取捕获探针，包含有以下一种或几种序列：序列见序列表SEQ.ID.NO1-2。

UU反应液具体包含Tris 10～50mM，MgCl₂ 10～40mM，dNTP 0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM。

SAT酶液中所含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。

UU检测液中UU荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。UU检测液中UU引物，依照SAT扩增的原理设计了5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进行UU检测的SAT反应。

所述步骤(4)中的引物探针序列选自长1197bp UU 16S rRNA基因，序列见序列表SEQ.ID.NO13。

由于UU是一个条件致病菌，临床中检测UU需浓度≥10⁴CFU/ml，才认为与炎症关系较大。结合本试剂盒要求的操作方法，本发明中阳性对照为灭活的UU菌，浓度设定为2×10⁵CFU/ml，最终通过换算，相当于临床上10⁴CFU/ml。因此，本发明中阳性对照具有界值参考品的功能，可用于UU检测的相对定量。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中的UU阳性对照和UU阴性对照，均含有本试剂盒已述及的尿样保存液及生理盐水。使用本试剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似。)

在专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)的基础上，本发明解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测拭子和尿样中的UU rRNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。

有益效果

本发明的检测试剂盒检测UU菌的分析灵敏度为50CFU/反应，该灵敏度高于目前国内上市的同类产品，故本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本发明试剂盒可用于尿液标本的检测，这种非侵入性采样方式受到病人的欢迎。

附图说明

图1为实施例4本发明试剂盒检测病人尿液标本的扩增图；1，2，3，4，5，6，7，8表示临床样本的编号。

图2为实施例5本发明试剂盒检测病人拭子标本的扩增图；1，2，3，4，5，6，7，8表示临床样本的编号。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

UU核酸RNA的提取

核酸提取具体步骤为：

阳性对照品制备：取200μl生理盐水，加入10μl阳性对照，混匀备用

阴性对照品制备：取200μl生理盐水，加入10μl阴性对照，混匀备用。

在样品处理管(1.5ml离心管)中加入100μl核酸提取液，200μl尿样保存液，200μl尿样或者拭子洗液或者阳性对照品或者阴性对照品，每加一个样本换一个吸头，涡旋混匀；60℃保温5分钟；室温放置10分钟；

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟(如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间)；

待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

用洗涤液(洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清)洗涤两次，每次加入1ml洗涤液后取下样品处理管震荡30秒后置磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用(此步应清晰可见磁珠)；

向每个样品处理管中加入40μl扩增检测液(40μl UU反应液+2.5μl UU检测液)洗涤磁珠。

实施例2

SAT核酸扩增检测

从震荡混匀后的上述扩增检测液中取30μl扩增检测液(包含磁珠)至洁净微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃；

向微量反应管中加入10μl已预热的酶液(加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀；

将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；

反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10％84消毒液中，取微量反应管应小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10％84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

参考值：

1.阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

2.dt≤35的样本为阳性(UU菌携带者)；

3.dt≤阳性对照(界值参考品)，表明样本中UU菌总数≥10⁴CFU/ml，需要进行临床干预治疗；

4.35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；

5.dt无数值或为40的样本为阴性。

注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。

实施例3

UU试剂盒各组份的配制和组装

试剂盒分为2～30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15～-35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)。

A盒(标本处理单元)组成为：

尿样保存液：含0.1～10M硫酸铵；0.15～1M HEPES；

核酸提取液：含磁珠0.1～10mg/ml，TCO 0.1～100μM；

洗涤液：含SDS 0.1～1％，NaCl 10～150mM，乙醇0.1～1％；

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

UU反应液：含dNTPs和NTPs，主要包含Tris 10～50mM，MgCl2 10～40mM，dNTP0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM；

SAT酶液：含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、1～10mM EDTA、2～20％(v/v)Triton X-100、10～40％(v/v)glycerol；

UU检测液：含UU特异引物、特异荧光探针，引物和探针均溶解于TE溶液(10mM Tris和1mMEDTA的混合液)；

引物序列为SEQ.ID.NO3和SEQ.ID.NO8，探针序列为SEQ.ID.NO12。

引物探针序列选自长1197bp UU 16S rRNA基因，序列见序列表SEQ.ID.NO13；

UU阳性对照：为失活的UU菌，浓度为2×10⁵CFU/ml；

UU阴性对照：为不含有SEQ.ID.NO13核酸序列或不含有UU的溶液，用于检验操作过程及试剂的有效性。

实施例4

应用模式之临床样本尿液的检测

本检测模式为本发明的最佳体现：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，解脲脲原体尿液临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为UU尿液标本1～8，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为ABI7300。结果见附图1，与金标准培养法检测结果完全相同。

实施例5

应用模式之临床样本拭子的检测

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，解脲脲原体拭子临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为UU拭子标本1～8(与尿液标本编号为一一对应)，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为ABI7300。结果见附图2，与金标准培养法检测结果完全相同，与实施例4结果也完全一致。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的解脲脲原体(UU)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，包括：

(1)尿样保存液：含有硫酸铵和去垢剂；

(2)核酸提取液：含有磁性颗粒和捕获探针；

(3)UU反应液：含dNTPs和NTPs扩增所需组份；

(4)UU检测液：为恒温扩增时必需的UU引物和UU荧光探针溶解在TE溶液中配制而成；其中UU检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：

UU T7：aatttaatac gactcactat agggagacta ctacactcta ggtttacagt tt；

aatttaatac gactcactat agggagacct actacactct aggtttacag；

aatttaatac gactcactat agggagaagc gtcgcaatag atgtcaaacc；

aatttaatac gactcactat agggagaagc gtcgcaatag atgtcaaacc tag；

UU nT7：agccgcggta atacatagga tgcaag；

agccgcggta atacatagga tg；

agtagtccac accgtaaacg a；

tagtagtcca caccgtaaac gatcatca；

UU检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：

UU probe：ccgagcggtg ttgtagctaa ctcgg；

ccgagtctag atgcttaacg tctcgg；

(5)SAT酶液：为恒温扩增时的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶200～2000U/反应、M-MLV反转录酶400～4000U/反应、2～10mM HEPES pH7.5、10～100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04～0.4mM zinc acetate、10～100mM trehalose、40～200mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mMKCl、1～10mM EDTA、2～20％v/v Triton X-100、10～40％v/v glycerol；

(6)UU阳性对照：为失活的UU菌，浓度为2×10⁵CFU/ml；

2.根据权利要求1所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括洗涤液，洗涤液具体包含十二烷基磺酸钠0.1～1％，NaCl10～150mM，乙醇0.1～1％。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(1)中的尿样保存液具体包括0.1～10M硫酸铵；0.15～1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸。

4.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(2)中的核酸提取液为捕获核酸时必须的一个组分，具体包含磁珠0.1～10mg/ml，TCO 0.1～100μM。

5.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(2)中的核酸提取液中的捕获探针，包含有以下一种或几种序列：ccatccaaaa gcgtcgcaaa cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa；ccccaccttc ctctaccttg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa。

6.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(3)中的UU反应液具体包含Tris 10～50mM，MgCl₂ 10～40mM，dNTP0.5～5mM，NTP 1～10mM，PVP40 1～10％，KCl 5～40mM。

7.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(4)中的UU检测液中UU引物为5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物序列与靶标完全一致。

8.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(4)中的引物探针序列选自长1197bp UU 16S rRNA基因，序列见序列表SEQ.ID.NO13。

9.根据权利要求1或2所述的一种利用RNA恒温扩增的解脲脲原体核酸检测试剂盒，其特征在于：所述步骤(4)中的UU荧光探针为分子信标，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。