CN101591707A

CN101591707A - 一种利用rna恒温扩增的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN101591707A
Application number: CNA2009100488298A
Authority: CN
Inventors: 方亮; 张常娥; 于明辉; 王敏; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2009-04-03
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2009-12-02

Abstract

本发明涉及一种利用磁珠－RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对淋病奈瑟菌(NG)进行检测的试剂盒，包含尿样保存液、核酸提取液、洗涤液、NG反应液、NG检测液、SAT酶液、NG阳性对照、NG阴性对照。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。

Description

一种利用RNA恒温扩增的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对淋病奈瑟菌(NG)进行检测的试剂盒。

背景技术

淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoea，NG)是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，呈圆形、卵圆形或肾形，大小一致，无鞭毛、无荚膜、不存在芽孢，在脓液中成对排列于脓细胞(多核白细胞)的胞浆内或其外围(少数分布在细胞外)，故名淋病双球菌，邻近面扁平或略凹陷，大小为0.6μm×0.8μm(0.5μm×0.7μm)。淋球菌感染引起的临床表现取决于感染的程度，机体的敏感性，细菌的毒力，感染部位及感染时间的长短。同时和身体的健康状况。淋球菌感染其潜伏期短、传染性强，最常见的是有症状的泌尿生殖系统的感染，如尿道炎、宫颈炎、附睾炎、前列腺炎、输卵管炎等，如不及时治疗，淋球菌可侵犯眼睛、咽部、皮肤、直肠、盆腔等部位，甚至可经血液传播到全身其他部位，形成淋菌性关节炎、腱鞘炎、脑膜炎、败血症等。另一方面，有5％～20％的男性和60％的女性病人呈现出无症状感染。因而，淋球菌的实验室检测对淋病的临床辅助诊断具有重要作用。目前淋病的实验室诊断方法有细胞生物学检测方法(如培养法，涂片检查)；免疫学检测方法(如直接免疫荧光、固相酶免测定)和分子生物学方法(如PCR、TMA)。

细胞生物学检测方法包括涂片检查和培养法。双球菌涂片对有大量脓性分泌物的单纯淋菌性前尿道炎患者，此法阳性率在90％左右，由于女性宫颈分泌物中杂菌多，敏感性和特异性较差，阳性率仅为50-60％且有假阳性，因此世界卫生组织推荐用培养法检查女病人。淋球菌培养是诊断的重要佐证，培养法对症状很轻或无症状的男性、女性病人都是较敏感的方法，特异性为100％，只要培养阳性就可确诊。在基因诊断问世以前，培养是世界卫生组织推荐的筛选淋病的唯一方法。培养阳性率男性80％～95％，女性80～90％。培养法的阳性率大于涂片法，后者对女性淋病尤其是无症状带菌者检出率较低，容易漏诊。由于约50％的女性淋病患者都没有明显症状，因此女性淋病的实验室检查主要依靠培养法。与男性淋病患者有过性接触的女性，应每周做1次宫颈分泌物涂片和培养，连续3次，都是阴性者才能排除。

免疫学方法包括固相酶免疫试验(EIA)和直接免疫荧光试验。固相酶免疫试验(EIA)可用来检测临床标本中的淋球菌抗原，在流行率很高的地区而又不能作培养或标本需长时间远送时使用，可以在妇女人群中用来诊断淋球菌感染。直接免疫荧光试验通过检测淋球菌外膜蛋白I的单克隆抗体作直接免疫荧光试验。但目前在男女二性标本的敏感不高，特异性差，加之实验人员的判断水平，故该实验尚不能推荐用来诊断淋球菌感染。

分子生物学方法主要包括PCR法、转录介导的扩增(TMA法)，此类方法对于诊断泌尿生殖道淋病奈瑟菌感染敏感性和特异性均达90％～100％。PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是容易造成假阳性污染，并且对用药后康复的病人检测结果仍出现阳性结果。目前国内市场上的核酸检测试剂盒主要是PCR-荧光检测试剂盒。TMA法(Transcription-mediated Amplification，转录介导的扩增)：最新发展的扩增试验是Gen-Probe公司的扩增NG的转录介导扩增试验(TMA)，扩增并检测NG的rRNA。TMA的一个优点是每个感染细胞中有大量的rRNA，而且操作步骤简便，只是一个恒温过程，不需要变换温度的扩增仪。检测方法是终点荧光检测，容易导致环境污染，在污染控制上稍显不足。国内尚无采用该法进行检测的报道。

本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification andTesting，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)；在此两项技术的基础上，本发明淋病奈瑟菌(NG)核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。该试剂盒能够检测拭子和尿样中的NGrRNA，具有特异性高、灵敏度高和污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)的特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术特异性、灵敏性不高，实验污染不易控制的缺点，提供一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对淋病奈瑟菌(NG)进行检测的试剂盒。

本发明所提供的淋病奈瑟菌检测的试剂盒，包括下列组成：

(1)尿样保存液：为裂解和保存尿液或生殖道拭子洗涤液标本中淋病奈瑟菌(NG)RNA的表面活性剂和HEPES缓冲液；

(2)核酸提取液：为oligodT包被的磁珠和特异性结合靶标核酸(NG RNA)的一段RNA序列；

(3)洗涤液：为含SDS、NaCl和乙醇的溶液；

(4)NG反应液：为dNTPs和NTPs等扩增所需组份；

(5)NG检测液：为恒温扩增时必需的引物和荧光探针，序列选自NG 16s rRNA基因的保守区；

(6)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶及稳定剂；

(7)NG阳性对照；为含NG 16s rRNA基因的体外转录RNA稀释物；

(8)NG阴性对照：为不含任何核酸的尿样保存液及生理盐水。

尿样保存液主要有效成分是硫酸铵和去垢剂，高浓度去垢剂的存在能够使RNase迅速失活，有效保存RNA。另外，尿样保存液中高浓度盐离子及去垢剂的存在，通过蛋白质变性使菌体细胞破裂，靶标RNA得到了释放，样本放在该保存液中，延长了样本的保存时间，RNA从细胞中释放出来。

核酸提取液是利用了磁珠分离法进行核酸提取，其主要成分为磁性颗粒和捕获探针。在核酸提取过程中，细菌裂解释放出的核酸与核酸提取液中的磁性颗粒特异结合，在不需要传统的离心操作的情况下，通过清洗磁性颗粒而获得纯净的细菌靶标核酸(RNA)。病原体rRNA的提取通过特异性吸附原理来实现。

核酸提取液中含有的标本提取捕获探针，包含有以下一种或几种序列：序列见序列表SEQ.ID.NO1-5。

SAT酶液中所含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶，其稳定性直接决定了扩增反应的扩增效率和试剂盒的使用有效期。该SAT酶液中加有稳定剂，经长期稳定性试验，稳定性可达10个月，保证了试剂盒有效期达6个月。

NG检测液中NG荧光探针为分子信标，是一类高特异性、高敏感性的分子探针，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎，分子信标探针与线性的TaqMan探针相比，因其发夹结构的打开需要一定的力，因而特异性要好于线性探针。NG检测液中NG引物，依照SAT扩增的原理设计了5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物与靶标完全一致，保证了本试剂盒可准确进行NG检测的SAT反应。

NG检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：

NG T7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10；

NG nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO11-15。

NG检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：

NG probe：序列见序列表SEQ.ID.NO16-20。

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，本发明的试剂盒中的NG阳性对照和NG阴性对照，均含有本试剂盒已述及的尿样保存液及生理盐水，其中NG阳性对照还含有NG RNA，是淋病奈瑟菌16srRNA体外转录产物的稀释物，定值约为10⁷copies/ml。使用本试剂盒时，每次应同时做平行对照的质量控制，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。(dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数，与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似。)

NG阳性对照中的体外转录的NG RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成NG 16s rRNA基因的靶标片段，长度约900bp；

(2)将片段克隆到pGEM^b-T载体中，构建NG阳性对照质粒；

(3)NG阳性对照质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM^b-T-NG菌株，贮存于-70℃；

(4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

NG阳性对照含有长约900bp的NG 16s rRNA基因序列，序列见序列表SEQ.ID.NO21。

本发明的检测试剂盒检测NG RNA的分析灵敏度为10³copies/反应(淋病奈瑟菌1个菌内约含2.0×10³个rRNA)，该灵敏度远远高于目前国内上市的同类产品，故本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。本发明试剂盒可用于尿液标本的检测，这种非侵入性采样方式受到病人的欢迎。

附图说明

图1.实施例4本发明试剂盒检测病人拭子标本的扩增图；

图2.实施例5本发明试剂盒检测病人尿液标本的扩增图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 NG核酸RNA的提取

核酸提取具体步骤为：

在样品处理管(1.5ml离心管)中加入100μl核酸提取液，加入400μl尿样或者拭子洗液，每加一个样本换一个吸头，涡旋混匀；60℃保温5分钟；室温放置10分钟；

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟(如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间)；

待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

用洗涤液(洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清)洗涤两次，每次加入1ml洗涤液后取下样品处理管震荡30秒后置磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠；

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用(此步应清晰可见磁珠)；

向每个样品处理管中加入40μl扩增检测液(40μl NG反应液+2.5μl NG检测液)洗涤磁珠。

实施例2 SAT核酸扩增检测

从震荡混匀后的上述扩增检测液中取30μl扩增检测液(包含磁珠)至洁净微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃；

向微量反应管中加入10μl已预热的酶液(加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀；

将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次；

反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10％84消毒液中，取微量反应管应小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10％84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

参考值：

1.阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。

2.dt≤35的样本为阳性；

3.35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；

4.dt无数值或为40的样本为阴性。

注：dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

质量控制：每次检测均设置阳性对照和阴性对照，且结果应同时满足阳性对照dt≤35，阴性对照dt无数值或为40，否则此次实验视为无效。

实施例3 NG试剂盒各组份的配制和组装

试剂盒分为2～30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15～-35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)。

A盒(标本处理单元)组成为：

尿样保存液：0.1M硫酸铵；0.15M HEPES；

核酸提取液：0.15uM捕获探针和磁性颗粒250mg/L；

洗涤液： 0.1％SDS。

B盒(核酸扩增检测单元)组成为：

NG反应液：4mM dNTPs和16mM NTPs；

SAT酶液：M-MLV 2000U；T7 RNA聚合酶500U；

NG检测液：主要含3.5uM NG特异引物、2.7uM特异荧光探针；

NG阳性对照：主要含10⁷copies/ml NG RNA；

NG阴性对照：不含任何核酸，用于检验操作过程及试剂的有效性。

实施例4 应用模式之临床样本尿液的检测

本检测模式为本发明的最佳体现：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，淋病奈瑟菌尿液临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为NG尿液标本1～8，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为Bio-Rad iQ5。结果见附图1，与金标准培养法检测结果完全相同。

实施例5 应用模式之临床样本拭子的检测

本检测模式为本发明的另一个应用：试剂的制备同实施例3，试剂的生产在GMP车间进行，淋病奈瑟菌拭子临床样本为上海皮肤病性病医院提供的临床实验样品，编号为NG拭子标本1～8(与尿液标本编号为一一对应)，另设阴性对照、阳性对照各一个。标本的核酸提取同实施例1，SAT扩增检测及判定同实施例2，所使用的荧光PCR仪为Bio-RadiQ5。结果见附图2，与金标准培养法检测结果完全相同，与实施例4结果也完全一致。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的淋病奈瑟菌(NG)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不是构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110>上海仁度生物科技有限公司

<120>一种利用RNA恒温扩增的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒

<130>

<160>21

<170>Patentln version 3.5

<210>1

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>标本提取捕获探针

<400>1

cgatatgtta ctcacccgtt cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52

<210>2

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>标本提取捕获探针

<400>2

tgcggtatta gctgatcttt cgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 52

<210>3

<211>55

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>标本提取捕获探针

<400>3

aatccacatc atccaccgct tgtgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 55

<210>4

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>标本提取捕获探针

<400>4

ggtaaggttc ttcgcgttgc atcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 53

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>标本提取捕获探针

<400>5

gcggtcaatt tcacgcgtta gctacgctac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

<210>6

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG T7引物序列

<400>6

aatttaatac gactcactat agggagacac atcctgctta agtaaccgtc tg 52

<210>7

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG T7引物序列

<400>7

aatttaatac gactcactat agggagaatc ctgcttaagt aaccgtctgc gcc 53

<210>8

<211>48

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG T7引物序列

<400>8

aatttaatac gactcactat agggagactc gcaccctacg tattaccg 48

<210>9

<211>52

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG T7引物序列

<400>9

aatttaatac gactcactat agggagaatt accgcggctg ctggcacgta gt 52

<210>10

<211>53

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG T7引物序列

<400>10

aatttaatac gactcactat agggagagcc cagtaattcc gattaacgct cgc 53

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG nT7引物序列

<400>11

gactcctacg ggaggcagc

19

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG nT7引物序列

<400>12

ctgatccagc catgccgcgt gtc 23

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG nT7引物序列

<400>13

ggacaatggg cgcaagcctg atccagc 27

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG nT7引物序列

<400>14

gcgtgtctga agaaggcctt cg 22

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG nT7引物序列

<400>15

cgccacactg ggactgagac

20

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG检测探针

<400>16

cgagcaggct gttgccaata tcgggctcg 29

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG检测探针

<400>17

cgagcgttgt aaaggacttt tgtgctcg 28

<210>18

<211>26

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG检测探针

<400>18

cgagcctgtt gccaatatcg ggctcg 26

<210>19

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG检测探针

<400>19

cgagcgcacc ggctaactac gtggctcg 28

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>NG检测探针

<400>20

cgagcgatga cggtacctga agagctcg 28

<210>21

<211>908

<212>DNA

<213>淋病奈瑟菌16s rRNA基因序列(Neisseria Gonorrhoea)

<400>21

tggcgagtgg cgaacgggtg agtaacatat cggaacgtac cgggtagcgg gggataactg 60

atcgaaagat cagctaatac cgcatacgtc ttgagaggga aagcagggga ccttcgggcc 120

ttgcgctatc cgagcggccg atatctgatt agctggttgg cggggtaaag gcccaccaag 180

gcgacgatca gtagcgggtc tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc 240

agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggcgcaagc ctgatccagc 300

catgccgcgt gtctgaagaa ggccttcggg ttgtaaagga cttttgtcag ggaagaaaag 360

gctgttgcca atatcggcgg ccgatgacgg tacctgaaga ataagcaccg gctaactacg 420

tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat cggaattact gggcgtaaag 480

cgggcgcaga cggttactta agcaggatgt gaaatccccg ggctcaaccc gggaactgcg 540

ttctgaactg ggtgactcga gtgtgtcaga gggaggtgga attccacgtg tagcagtgaa 600

atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc ctcctgggat aacactgacg 660

ttcatgtccg aaagcgtggg tagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa 720

acgatgtcaa ttagctgttg ggcaacttga ttgcttggta gcgtagctaa cgcgtgaaat 780

tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca 840

caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tggttttgac 900

atgtgcgg

908

Claims

1.一种利用RNA恒温扩增的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于包括下列组成：

(2)核酸提取液：为oligodT包被的磁珠和特异性结合靶标核酸的一段RNA序列；

(3)洗涤液：为含SDS、NaCl和乙醇的溶液；

(4)NG反应液：为dNTPs和NTPs等扩增所需组份；

(6)SAT酶液：为恒温扩增时必需的多酶组分体系，含T7 RNA聚合酶、M-MLV反转录酶及稳定剂；

(7)NG阳性对照；为含NG16s rRNA基因的体外转录RNA稀释物；

(8)NG阴性对照：为不含任何核酸的尿样保存液及生理盐水。

2.根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的尿样保存液含有硫酸铵和去垢剂。

3.根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸提取液是利用磁珠分离法进行核酸提取，含有磁性颗粒和捕获探针。

4.根据权利要求3所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的捕获探针包含有以下一种或几种序列：序列见序列表SEQ.ID.NO1-5。

5.根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG检测液中NG荧光探针为分子信标，由两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸分子组成，呈发夹型或茎环结构，分子信标的环部分和靶标互补，两头由于互补而成为茎。

6.根据权利要求5所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG检测液中的探针包含有以下一种或几种序列：NG probe：序列见序列表SEQ.ID.NO16-20。

7.根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG检测液中NG引物为5’端带有T7启动子序列尾巴的下游引物和特异的上游引物，下游引物特异序列与靶标完全互补，上游引物序列与靶标完全一致。

8.根据权利要求7所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG检测液中的引物包含有以下一对或几对序列：

NG T7：序列见序列表SEQ.ID.NO6-10；

NG nT7：序列见序列表SEQ.ID.NO11-15。

9.根据权利要求1所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG阳性对照中体外转录的NG RNA，制备方法包括下列步骤：

(1)用基因合成法获得NG 16s rRNA基因的靶标片段，长度约900bp；

(2)将片段克隆到pGEM^b-T载体中，构建NG阳性对照质粒；

(4)纯化去除DNA，并定量、鉴定RNA。

10.根据权利要求1或9所述的淋病奈瑟菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的NG阳性对照含有长900bp的NG 16s rRNA基因序列，序列见序列表SEQ.ID.NO21。