CN107619850A - 一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，具体步骤如下：合成核酸适配体并标记荧光素；将要检测的溶藻弧菌、已知浓度的溶藻弧菌分别与核酸适配体混合；混合均匀后，将溶藻弧菌和检测试剂结合；结合完毕后，离心并弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤菌沉淀；重复上述步骤；用洗涤缓冲液重悬菌沉淀，将缓冲液转移至新管中；荧光法测定新管中溶液的荧光值；根据荧光值进行线性拟合，得出相应的标准曲线及拟合方程，再根据标准曲线计算出要检测的溶藻弧菌浓度。本发明提供一种具有简便快速、识别性强、重复性好和准确度高等优点的对溶藻弧菌及其灭活菌的定量检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量检测方法，具体是一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法。
背景技术
随着水产养殖规模的不断扩大，水产养殖动物受到各种病原微生物的感染而造成疾病也越来越多，这其中一种重要的致病菌便是溶藻弧菌。虽然针对溶藻弧菌已研发了一系列的检测手段并取得了不错的效果，但是大部分检测方法由于操作繁琐、检测周期长、成本较高和需要一些大型精密仪器的支持而无法进行大规模的推广和野外现场检测，错过了病害预防的最佳时期，因此，有必要开展对水环境中溶藻弧菌定量检测的研究，以有效监测水环境中溶藻弧菌的数量，预防可能爆发的病害。
目前，针对溶藻弧菌的定量检测可大致分为三类，即细菌培养法、基于抗原抗体的定量检测技术和分子水平定量检测。细菌培养法工作量大，步骤繁琐、耗时，而且结果误差较大，无法区分具有相同或相似的生理生化特性的病原菌，特别是属于同一种间的病原菌，不利于病原菌的快速定量检测。基于抗原抗体的定量检测技术，需要将病原菌作为抗原免疫动物获得相应的抗体或血清，整个免疫的过程不但费时，操作繁琐，还存在以下不足：①制备要求严格，成本较高；②可作为抗原和用于免疫的动物范围有限，抗原性弱的物质或亲缘关系太近的抗原和免疫动物不易产生抗体；③无法很好地区分亲缘关系很近的两种病原菌，易产生交叉反应，特异性不够强；④抗体蛋白是由活体细胞产生，受免疫动物的影响较大，制备过程较难控制，免疫动物时易产生大量的非特异性抗体；⑤抗体蛋白的稳定性不够理想，易受外界因素的影响发生变性而失去活性，保存和运输条件较为苛刻。另外，由于弧菌的种类较多，亲缘关系近，种间的生化效果也并不理想。Kita等(Kita-Tsukamoto,K.,etal.,Phylogenetic relationships of marine bacteria,mainly members of thefamily Vibrionaceae,determined on the basis of 16S rRNA sequences.Int J SystBacteriol,1993.43(1):p.8-19.)、Kim等(Kim,Y.B.,et al.,Identification ofVibrioparahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxRgene.J Clin Microbiol,1999.37(4):p.1173-7.)、孙颖等(孙颖等,弧菌16S rRNA基因特异引物设计及海洋弧菌菌群结构分析.中国海洋大学学报(自然科学版),2010(S1):第122-130页.)研究证明，16S rRNA序列在弧菌种间相似性非常高，作为区分弧菌种的依据并不恰当，而且也离不开专业仪器的操作。此外，由于致病微生物具有种类多、遗传变异快和易受外界环境因素影响以及引发的早期症状非常相似等特点，现有的诊断方法远远不能满足弧菌检测的需要。
核酸适配体是利用指数富集配体的系统进化技术，即SELEX筛选技术，从人工构建的寡核苷酸文库中筛选得到的一类对靶目标有高度亲和特异性的寡核苷酸分子。核酸适配体易于筛选、合成和修饰，在体外合成的同时可以定点、精确地修饰或连上一些功能基团或分子，如荧光素(Ai,J.,et al.,In situ labeling and imaging of cellular proteinvia a bi-functional anticancer aptamer and its fluorescent ligand.Anal ChimActa,2012.741:p.93-9.)、氨基(Zhao,N.,et al.,Oligonucleotide aptamer-drugconjugates for targeted therapy of acute myeloid leukemia.Biomaterials,2015.67:p.42-51.)、纳米颗粒(Taghdisi,S.M.,et al.,Double targeting,controlledrelease and reversible delivery of daunorubicin to cancer cells by polyvalentaptamers-modified gold nanoparticles.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl,2016.61:p.753-61.)和药物(Han,S.R.,J.Yu and S.W.Lee,In vitro selection of RNA aptamersthat selectively bind danofloxacin.Biochem Biophys Res Commun,2014.448(4):p.397-402.)等，而适配体被修饰后的功能和化学特性还能维持不发生大的变化；核酸适配体的特异性和亲和力比抗体蛋白更强更高，靶标物质的范围更广，而且无免疫原性，可以进入到细胞或肿瘤的内部，实现对病变部位进行定位；另外，核酸适配体还能作为靶向运输载体定向运输药物，而不会被当做外来抗原引起机体的免疫反应。
以上研究报道均表明核酸适配体在溶藻弧菌定量检测方面具有较好的应用前景，但有关以核酸适配体作为识别分子应用于溶藻弧菌的定量检测研究，国内外报道很少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有简便快速、识别性强、重复性好和准确度高的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，具体步骤如下：
(1)合成核酸适配体并标记荧光素；
(2)将要检测的溶藻弧菌以及已知浓度的至少5个浓度梯度的溶藻弧菌分别与核酸适配体混合；
(3)混合均匀后，将溶藻弧菌和检测试剂结合；
(4)结合完毕后，离心并弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤菌沉淀；
(5)重复步骤(4)一次；用洗涤缓冲液重悬菌沉淀，将缓冲液转移至新管中；
(6)荧光法测定新管中溶液的荧光值；
(7)利用已知浓度的溶藻弧菌的荧光值进行线性拟合，得到相应的标准曲线及其拟合方程；
(8)根据获得的标准曲线和拟合方程，将待测溶藻弧菌的荧光值代入标准曲线或拟合方程，算出待测溶藻弧菌的浓度。
作为本发明进一步的方案：所述的核酸适配体为溶藻弧菌核酸适配体，包括如下几个序列：
序列#4为：
5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA-GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’；
序列#9为：5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC--TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA–GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中标记荧光素是在核酸适配体序列的5’端标记荧光素HEX、FITC。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(6)中测定溶液中与溶藻弧菌结合的核酸适配体的荧光值所用的仪器为超微量荧光计。
作为本发明进一步的方案：述步骤(5)和步骤(6)中新管为用于超微量荧光计检测的无色透明的薄壁管。
作为本发明进一步的方案：待测溶藻弧菌的浓度和用于制作标准曲线所选用的溶藻弧菌的已知浓度均小于106个/mL。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中检测出的荧光值通常都小于2000。
作为本发明再进一步的方案：所述的核酸适配体在定量检测溶藻弧菌方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种具有简便快速、识别性强、重复性好和准确度高等优点的对溶藻弧菌及其灭活菌的定量检测方法。该方法在准确、快速定量检出水体、血清、水产品等样品的中溶藻弧菌以及监测水环境中溶藻弧菌数量变化方面具有广泛应用价值。
附图说明
图1为本发明中#4适配体对的溶藻弧菌的特异性分析柱形示意图。
图2为本发明中#9适配体对的溶藻弧菌的特异性分析柱形示意图。
图3为本发明中#4适配体对应细菌培养液中灭活溶藻弧菌定量检线测性拟合示意图。
图4为本发明中#9适配体对应细菌培养液中溶藻弧菌定量检测线性拟合示意图。
图5为本发明中#4适配体对应血清中灭活溶藻弧菌定量检测线性拟合示意图。
图6为本发明中#9适配体对应血清中溶藻弧菌定量检测线性拟合示意图。
图7为本发明中#4适配体对应溶藻弧菌病爆发的水产养殖水体中灭活溶藻弧菌定量检测线性拟合示意图。
图8为为本发明中#9适配体对应溶藻弧菌病爆发的水产养殖水体中溶藻弧菌定量检测线性拟合示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-8，下面是基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌方法及其在水产养殖环境、海洋环境、淡水环境、血清以及细菌培养液等中快速检出溶藻弧菌方面的应用。
(1)合成核酸适配体并标记荧光素(上海生工合成并标记):
核酸适配体序列：
序列1为序列#4：
5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC--AGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA-GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’；
序列2为序列#9：
序列#9为：5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC--TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA–GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’，在5’端标记荧光素；将两种核酸适配体均用TE缓冲液配制成10umol/L溶液-20℃保存备用；
(2)溶藻弧菌的培养与处理：
将溶藻弧菌接种到事先制备好的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，放入摇床30℃，100RPM培养8个小时后，取溶藻弧菌菌液于离心管中，6000RPM离心5min，弃去上清液，用0.9％无菌生理盐水清洗菌沉淀3次，洗去多余的培养基成分；然后以无菌生理盐水为空白对照，用可见光分光光度计在550nm处测定溶藻弧菌的OD值并计算相应的菌浓度，冰箱4℃保存备用；
(3)相应浓度溶藻弧菌的稀释及其灭活菌的制备：
1)灭活菌的制备：
将溶藻弧菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，摇床30℃、100RPM培养8小时，测定其OD值；然后取菌液于离心管中，6000RPM离心5min，弃上清，再加入含6％甲醛的生理盐水于62.5℃水浴1小时，6000RPM离心5min后用生理盐水洗涤3次，再用2×结合缓冲液(TAE)重新悬浮菌沉淀，冰箱4℃保存备用；
2)溶藻弧菌的稀释：
将已测定OD值的溶藻弧菌及其灭活菌进行一系列的浓度梯度稀释，用于后续测定。获得灭活的浓度为1×105个/mL的溶藻弧菌。
同时，选择哈维氏弧菌、迟钝爱德华菌、嗜水气单细胞菌等水产常见菌作为对照菌，按前面同样方法制备出相应浓度的灭活菌备用。
3)适配体的处理：取化学合成的10μM适配体与2×结合缓冲液按1:2999进行稀释，然后每100μl分装到200μl的PCR管中，95℃变性5min，冰浴10min。
(4)适配体对溶藻弧菌亲和特异性分析：
将上述两条核酸适配体在5’端标记荧光素HEX，由上海生工合成并标，适配体处理同上，与1×105个/mL的溶藻弧菌、对照菌和空白(适配体+2×结合缓冲液)在摇床中30℃，100RPM结合30min，然后6000RPM离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀2次，加入1×结合缓冲液200ul重新悬浮菌沉淀，混匀，用超微量荧光计(型号：Qubit3.0Fluorometer，生产商：Life technologies，USA)测定荧光值(每个样本设置三个平行)，利用EXCEL2013统计分析数据，并绘制相应的柱状图(如图1、图2)，结果显示两种适配体对溶藻弧菌的亲和力显著高于对照菌和空白(p＜0.05)。
(5)基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法：
1)细菌培养液中溶藻弧菌及其灭活菌定量检测：
将溶藻弧菌接种到事先制备好的胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，放入摇床30℃，100RPM培养8个小时后，取溶藻弧菌菌液于离心管中，6000RPM离心5min，弃去上清液，用0.9％无菌生理盐水清洗菌沉淀3次，洗去多余的培养基成分，灭活菌的制备参照3.1。然后以无菌生理盐水为空白对照，用可见光分光光度计在550nm处测定溶藻弧菌的OD值并计算相应的菌浓度，将已测定OD值的溶藻弧菌及其灭活菌进行一系列的浓度梯度稀释并依次稀释到106、105、104、103、102、10个/ml。
将上述两条核酸适配体在5’端标记荧光素HEX，由上海生工合成并标记，用于亲和力测定。取化学合成的10uM适配体和2×结合缓冲液按1:2999进行稀释，然后每100ul分装到200ul的PCR管中，95℃变性5min，冰浴10min，与106、105、104、103、102、10个溶藻弧菌和空白(适配体+2×结合缓冲液)在摇床中30℃，100RPM结合30min，然后6000RPM离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀2次，加入1×结合缓冲液200ul重新悬浮菌沉淀，混匀，用超微量荧光计测定荧光值(每个样本设置三个平行)，利用EXCEL2013统计分析数据，以细菌个数的指数为横坐标，以亲和力为纵坐标，并进行线性拟合(如图3、图4)；
2)血清中溶藻弧菌及其灭活菌定量检测：
采用两种方法对血清中的溶藻弧菌进行定量检测：一是直接检测法，即将血清与适配体直接结合；二是培养后检测，即将血清涂平板，挑取平板中的单菌落，经TSB培养基培养，对其进行灭活处理后与适配体结合进行溶藻弧菌及其灭活菌的定量检测。本检测方法主要针对直接检测法，定量检测方法和数据处理参照细菌培养液中溶藻弧菌及其灭活菌定量检测，结果如图5、图6。
3)溶藻弧菌病爆发的水产养殖水体中溶藻弧菌及其灭活菌定量检测：
将水样涂平板，挑取平板中的单菌落，经TSB培养基培养，对其进行灭火处理后与适配体结合进行溶藻弧菌及其灭活菌的定量检测。定量检测方法和数据处理参照细菌培养液中溶藻弧菌及其灭活菌定量检测，结果如图7、图8。
本发明提供一种具有简便快速、识别性强、重复性好和准确度高等优点的对溶藻弧菌及其灭活菌的定量检测方法。该方法在准确、快速定量检出水体、血清、水产品等样品的中溶藻弧菌以及监测水环境中溶藻弧菌数量变化方面具有广泛应用价值。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (8)
1.一种基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)合成核酸适配体并标记荧光素；
(2)将要检测的溶藻弧菌以及已知浓度的至少5个浓度梯度的溶藻弧菌分别与核酸适配体混合；
(3)混合均匀后，将溶藻弧菌和检测试剂结合；
(4)结合完毕后，离心并弃去上清液，用洗涤缓冲液洗涤菌沉淀；
(5)重复步骤(4)一次；用洗涤缓冲液重悬菌沉淀，将缓冲液转移至新管中；
(6)荧光法测定新管中溶液的荧光值；
(7)利用已知浓度的溶藻弧菌的荧光值进行线性拟合，得到相应的标准曲线及其拟合方程；
(8)根据获得的标准曲线和拟合方程，将待测溶藻弧菌的荧光值代入标准曲线或拟合方程，算出待测溶藻弧菌的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，所述的核酸适配体为溶藻弧菌核酸适配体，包括如下几个序列：
序列#4为：
5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCA-GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’；
序列#9为：5’-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC--TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGA–GCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3’。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，所述步骤(1)中标记荧光素是在核酸适配体序列的5’端标记荧光素HEX、FITC。
4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，所述步骤(6)中测定溶液中与溶藻弧菌结合的核酸适配体的荧光值所用的仪器为超微量荧光计。
5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，述步骤(5)和步骤(6)中新管为用于超微量荧光计检测的无色透明的薄壁管。
6.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，待测溶藻弧菌的浓度和用于制作标准曲线所选用的溶藻弧菌的已知浓度均小于106个/mL。
7.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，步骤(6)中检测出的荧光值通常都小于2000。
8.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的定量检测溶藻弧菌的方法，其特征在于，所述的核酸适配体在定量检测溶藻弧菌方面的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180123 |