CN113278622B - 一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法 - Google Patents

一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法。适配体序列如SEQ.NO.1‑5所示，采用反筛等SELEX技术，筛选能特异性识别抑制变形假单胞菌生长的核酸适配体，通过测定亲和力来表征核酸适配体对变形假单胞菌的影响。本发明可对高频序列进行客观有效的分类，为后续核酸适配体的精准选择和验证提供了一种客观有效的依据，该方法简单，操作方便，大大减少了验证的盲目性，提高了筛选效率。从筛选结果中挑选相对重要指数最高的五个适配体#1、#2、#3、#4、#5，这些适配体对28℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对28℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性。

Description

一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法
技术领域
本发明涉及一种核酸适配体，尤其涉及一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法。
背景技术
假单胞菌(Pseudomonas)广泛分布于森林土壤、河流水体及生物体中，是世界范围内常见的细菌种类之一。目前，按16sRNA序列将假单胞菌属分为两大，第一类由丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)及施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)组成，第二类即穿孔假单胞菌(Pseudomonaspertucinogena)。假单胞菌不仅感染人类，严重影响人类的健康生活，同时它们也是养殖经济鱼类的致病菌，据报道，恶臭假单胞菌所感染的鱼类品种主要集中在香鱼、虹鳟鱼和五条鰤等，铜绿假单胞菌所感染的鱼类品种主要集中在鲤鱼和罗非鱼等。变形假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)所感染的鱼类品种主要集中在香鱼、大黄鱼以及斜带石斑鱼等，给水产养殖产业造成了重大的经济损失。
变形假单胞菌隶属于假单胞菌科，假单胞菌属，恶臭假单胞菌组，杀香鱼假单胞菌种，是一种直或微弯、不呈螺旋状的革兰氏阴性杆菌，以单极毛或数根极毛运动，需氧，不生芽孢，感染的鱼类品种主要集中在香鱼、石斑鱼和大黄鱼，被感染的大黄鱼主要表现为部分病鱼有腹水，肝、脾、肾等内脏组织与器官都表现出不同程度的充血、出血、坏死，其中肝脏严重充血，脾脏和肾脏布满白色小结节。根据病鱼脾、肝脏、肾等内脏长满白色结节而命名该病为大黄鱼内脏白点病，发病温度在特定温度15℃到20℃之间，是近年来在大黄鱼养殖中暴发流行的一种细菌性疾病，给养殖产业造成了重大的经济损失。目前，尽管大黄鱼内脏白点病的研究报道已有多篇，但是主要集中在病理形态学分析等，其致病机制虽然与胞外产物有一定相关性，但是还不能完全解释其致病性，因此迫切需要对变形假单胞菌的致病机理的研究思路和研究方法，识别变形假单胞菌对温度敏感的位点，揭示变形假单胞菌的温度敏感机制。
核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集配体的系统进化技术(SystematicEvolutionofligandsbyExponentialEnrichment，SELEX)筛选出的对靶目标具有较高亲和特异性的寡核苷酸分子。Ellington等人于1990年首次报道，利用体外筛选技术从随机文库中分离出罕见的RNA分子，这些RNA分子可以任意地与所选的靶分子结合，Ellington将这些产生得到的基序命名为“适配体(aptamer)”。由于核酸适配体具有多项优势：(1)核酸适配体的体积小，质量在6-30KDa之间，大小约为5nm；(2)核酸适配体结构简单，易化学修饰；(3)核酸适配体化学稳定性高；(4)核酸适配体免疫原性低；(5)核酸适配体组织渗透率高；(6)核酸适配体的靶目标范围广：可为离子、小分子、多肽、蛋白质、病毒、细菌、寄生虫和整个活细胞等；(7)核酸适配体可识别细胞表面功能分子：需借助配体或翻译后修饰；被广泛应用于生物医学、蛋白质科学、纳米材料及疾病诊断等各研究领域。核酸适配体在水产病害方面也有应用，目前已成功筛选到特异性核酸适配体的水产病原有病毒性出血性败血症病毒(Viralhemorrhagicsepticemiavirus，VHSV)，新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singaporegrouperiridovirus，SGIV)，赤点石斑鱼神经坏死症病毒(Redspottedgroupernervousnecrosisvirus，RGNNV)，牙鲆弹状病毒(Hiramerhabdovirusvirus，HIRRV)，鲤春病毒血症病毒(Springviremiaofcarpvirus，SVCV)，中华鳖虹彩病毒(Soft-shelledturtleiridovirus，STIV)，副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)，溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)，哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种能特异性识别变形假单胞菌的核酸适配体及其筛选方法。
本发明是这样实现的：
本发明首先提供了一种变形假单胞菌适配体，其核苷酸序列按5’-3’的顺序如下：
#1：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGGACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#2：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGTACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#3：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCCGGGGTGGTCAGTAGGAGCAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#4：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTAGACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#5：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGAACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG。
本发明还提供了一种变形假单胞菌适配体的筛选方法，具体包括如下步骤：
(1)菌的处理：取培养好的变形假单胞菌洗涤后加无菌培养液混合均匀，测菌液0D值，然后取含菌量为(1-10)×108个的变形假单菌菌液，离心，弃上清，沉淀洗涤后用2×结合缓冲液重悬，得到菌悬液；
(2)结合：取ssDNA随机文库，用2×结合缓冲液稀释，在95℃恒温金属浴中变性5min后冰浴10min，然后加入到前述的菌悬液中，混匀后在28℃，100r/min的摇床中结合2h；
(3)洗涤：摇床结合完成后，6000r/min下离心5min，弃上清，含有菌及其结合ssDNA的菌沉淀用1×结合缓冲液洗涤；
(4)分离：用1×结合缓冲液溶液重悬菌沉淀，95℃加热5min，使ssDNA变性，从而与菌分离，冷却后在15000r/min离心10min，取上清液，则可分离到与目标菌结合的ssDNA，该ssDNA即为获得的筛选产物，将该筛选产物用PCR管分装，放于-20℃保存备用；
(5)扩增：采用不对称PCR扩增来获取下一级ssDNA文库；
(6)电泳检测：取不对称PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果电泳检测后显示PCR产物中有条带，则将该轮PCR产物用作下一轮SELEX筛选的文库；
(7)重复筛选：重复上述(1)到(6)的筛选过程，在第六、七轮添加嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、哈维氏弧菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌进行反筛，一共进行七轮筛选。
(8)IRI筛选：每轮筛选产物测序后都可获得数万条的序列，这些序列中有的种类出现一次，有的出现数千次，高频序列是指测序结果中出现的频率大于等于2次的序列，对高频序列进行分析；
根据公式：相对重要性指数IRI＝N％×F％，其中N％为所有筛选轮或测序轮中某种序列的出现次数占所有序列总数量的百分比，F％为该种序列出现的测序轮数占总测序轮数的百分比；根据IRI计算结果进行分类，相应的分类依据为：IRI≥1000时，该高频序列为优势高频适配体；10≤IRI＜100时，该高频序列为常见高频适配体；1≤IRI＜10时，该高频序列为一般高频核酸适配体；IRI＜1时，该高频序列为少见高频适配体；从相对重要性指数IRI来看，其中#1属于优势高频适配体，#3、#4、#5属于常见高频适配体，#2属于一般高频适配体，最后对筛选的适配体进行亲和力验证。
本发明具有如下优点：本发明可对高频序列进行客观有效的分类，为后续核酸适配体的精准选择和验证提供了一种客观有效的依据，该方法简单，操作方便，大大减少了验证的盲目性，提高了筛选效率。从筛选结果中挑选相对重要指数最高的五个适配体#1、#2、#3、#4、#5，这些适配体对28℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对28℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性，从而验证了通过相对重要性指数筛选核酸适配体的可行性。
附图说明
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为电泳检测图。
图2为#1核酸适配体的亲和特异性。
图3为#2核酸适配体的亲和特异性。
图4为#3核酸适配体的亲和特异性。
图5为#4核酸适配体的亲和特异性。
图6为#5核酸适配体的亲和特异性。
具体实施方式
本发明以变形假单胞菌为对象，采用反筛等SELEX技术，筛选能特异性识别变形假单胞菌的核酸适配体，之后再验证核酸适配体的亲和力。
1核酸适配体的SELEX筛选
(1)菌的处理：取培养好的变形假单胞菌离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，洗涤菌3次后再加无菌培养液混合均匀，测菌液0D值，然后取含菌量约为4×108个的变形假单菌菌液，6000r/min下离心5min，弃上清，0.9％生理盐水洗涤菌沉淀3次，1×结合缓冲液洗涤菌沉淀1次，最后加入100μL的2×结合缓冲液重悬。
(2)结合：取ssDNA随机文库，用2×结合缓冲液稀释到2μ mol/L100μL，在95℃恒温金属浴中变性5min后冰浴10min，然后加入到前面的菌悬液中，混匀后在28℃，100r/min的摇床中结合2h。
(3)洗涤：摇床结合完成后，6000r/min下离心5min，弃上清，含有菌及其结合ssDNA的菌沉淀，用200μL1×结合缓冲液洗涤1次。
(4)分离：用100μL1×结合缓冲液溶液重悬菌沉淀，95℃加热5min，使ssDNA变性，从而与菌分离，冷却后在15000r/min离心10min，取上清液，则可分离到与目标菌结合的ssDNA，该ssDNA即为获得的筛选产物，将该筛选产物用PCR管分装成每管20μL，放于-20℃保存备用。
(5)扩增：采用不对称PCR扩增来获取下一级ssDNA文库。
对样品进行纯化，以确定PCR反应需要加入的DNA量。
引物如下：
下游引物F：TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC
上游引物R：CCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGC
PCR体系按照如下进行：
热力学循环参数：
(6)电泳检测：将制好的琼脂糖凝胶放置于电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲溶液使琼脂糖凝胶完全被覆盖。取2μL的Marker参考，取5μL的不对称PCR产物与2μL的上样缓冲液混合均匀后加入孔中，在电压为90V、45min的条件下进行电泳。最后进行观察和拍照，如图1所示。
(7)重复筛选：如果电泳检测后显示PCR产物中有条带，表明PCR效果可以，则可将该轮PCR产物用作下一轮SELEX筛选的文库，重复上述(1)到(6)的筛选过程。在第六、七轮添加嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、大肠杆菌、哈维氏弧菌、迟钝爱德华氏菌、铜绿假单胞菌进行反筛。
注：培养方法：取嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌和迟钝爱德华氏菌于适量的TSB液体培养基中，取变形假单胞菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌于适量的LB培养基中，均放置于28℃，100rpm摇床过夜。
2测序序列的筛选
表2适配体相对重要性指数
根据公式：相对重要性指数IRI＝N％×F％，当IRI≥1000时，该高频序列为优势高频适配体；10≤IRI＜100时，该种类为常见高频适配体；1≤IRI＜10时，该高频序列为一般高频适配体；IRI＜1时，该种类为少见高频适配体。如表2所示，从相对重要性指数IRI来看，其中#1属于优势高频适配体，#3、#4、#5属于常见高频适配体，#2属于一般高频适配体。取相对重要性指数IRI前5的核酸适配体进行分析。
3亲和力亲和常数的测定
3.1材料
3.1.1核酸适配体
核酸适配体为本申请人前期经IRI筛选得到的变形假单菌适配体，其序列如表1(两端带下划线的是和引物结合的固定序列)。
上述适配体由生工生物工程股份有限公司合成。合成的冻干粉产物，用1×TE缓冲液配制成浓度为10μmol/L的贮存液，于-20℃冰箱保存备用。
表1变形假单菌适配体的序列
3.1.2实验用菌
变形假单菌(Vibrioanguillarum)由集美大学病害实验室鉴定并提供。
3.1.3培养基和试剂
LB固体培养基：取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，NaC15g，琼脂粉7.5g。加超纯水溶解，用HC1或NaOH调pH至7.0，总体积至500mL，经121℃灭菌45min后备用。
20×结合缓冲液：取NaC15.844g、KC13.725g、Tris-HC1 6.06g、MgC1 2·6H2O2.033g。加超纯水溶解，用HC1或NaOH调pH至7.0定容至100mL。稀释为2×和1×结合缓冲液，经121℃灭菌后备用。
3.2实验方法
(1)变形处理：取培养好的变形假单胞菌于离心管中，6000r/min离心5min，弃上清，用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀1次，再用2×结合缓冲液悬浮菌沉淀。然后测菌液的OD值，并根据其OD值将其配制成5×108个/mL的菌液。
(2)核酸适配体处理：取10μmol/L的核酸适配体，用2×结合缓冲液将其稀释成不同的浓度梯度：为10、20、40、60、80、100、120、140、200、250、300、350nmol/L，然后在恒温金属浴中95℃变性5min，再冰浴10min。
(3)结合和洗涤：取100μL浓度为5×108个/mL变形假单胞菌分别与100μL的上述浓度梯度的核酸适配体混合均匀，在30℃、100r/min的摇床中结合30min后，6000r/min离心5min，弃上清，再用1×结合缓冲液洗涤菌沉淀3次。
(4)亲和力测定：用100μL1×结合缓冲液悬浮菌沉淀，菌悬液在恒温金属浴中95℃加热变性5min，使结合的核酸适配体与菌分开，然后15000r/min离心10min，取上清，并用超微量分光光度计测定上清中的ssDNA浓度，从而得到相应浓度梯度所对应的ssDNA浓度，即亲和力值。
(5)数据拟合：以核酸适配体的浓度为横坐标，亲和力为纵坐标，采用Origin8.0软件，选择反比例函数(Hyperbola函数)进行非线性拟合，从而获得相应核酸适配体的饱和结合曲线及其拟合方程，从拟合方程中可以得到相应适配体的亲和常数Kd值和最大亲和力Am值。
4实验结果
4.1适配体的亲和特异性
本发明采用单链ssDNA浓度法测定#1、#2、#3、#4、#5适配体对28℃下生长的变形假单胞菌(Pp)、以及嗜水气单胞菌(Ah)、溶藻弧菌(Va)、哈维氏弧菌(Vh)、大肠杆菌(Ec)、迟钝爱德华氏菌(Et)、铜绿假单胞菌(Pa)亲和力，各适配体对细菌的亲和力如图2-6所示，由图可以看出，这些适配体对28℃变形假单胞菌的亲和力均高于对其他菌的亲和力，从而得知这些适配体均对28℃变形假单胞菌有较好的亲和特异性。
4.2适配体的亲和常数
核酸适配体亲和常数Kd和饱和亲和常数Am结果如下：适配体#2亲和常数Kd是最低的，#2、#3、#1、#5、#4适配体的亲和常数Kd依次是7.14±1.86nM、19.59±3.01nM、25.77±6.11nM、34.31±8.76nM、83.22±22.45nM。适配体#3的饱和亲和力Am最高，适配体#3、#4、#2、#5、#1的饱和亲和力依次是3012.50±106.19nM、1457.99±171.32nM、1392.27±58.03nM、1070.91±70.16nM、789.23±38.46nM。一般而言Kd值越低，表明结合能力越强。Am越大，菌能结合的适配体量越多。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种变形假单胞菌适配体及其筛选方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
tcagtcgctt cgccgtctcc ttcagcggga tgagggagta ggagggccac agtggactgc 60
acaagaggga gaccccagag gg 82
<210> 2
<211> 82
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
tcagtcgctt cgccgtctcc ttcagcggga tgagggagta ggagggccac agtgtactgc 60
acaagaggga gaccccagag gg 82
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
tcagtcgctt cgccgtctcc ttcagccggg gtggtcagta ggagcagcac aagagggaga 60
ccccagaggg 70
<210> 4
<211> 83
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
tcagtcgctt cgccgtctcc ttccagcggg atgagggagt aggagggcca cagtagactg 60
cacaagaggg agaccccaga ggg 83
<210> 5
<211> 82
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
tcagtcgctt cgccgtctcc ttcagcggga tgagggagta ggagggccac agtgaactgc 60
acaagaggga gaccccagag gg 82

Claims (1)

1.一种变形假单胞菌适配体，其特征在于：为如下任一条核苷酸序列所示的适配体：
#1：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGGACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#2：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGTACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#4：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTAGACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG，
#5：
TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCAGCGGGATGAGGGAGTAGGAGGGCCACAGTGAACTGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG。
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