CN109055381B - 用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用 - Google Patents

用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用 Download PDF

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Abstract

本发明是一种用于鳗弧菌（Vibrio anguillarum）特异性识别的ssDNA核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为Apt‑Va01和Apt‑Va02中所示的DNA片段的核苷酸序列。本发明还详细阐述了对该核酸适配体的筛选方法。本发明提供了一条特异性强，亲和力高，检测限低的鳗弧菌核酸适配体，能够快速的对鳗弧菌菌体细胞进行检测，可被应用于食品加工、水产养殖、医学诊断、环境检测等过程中鳗弧菌的快速检测。

Description

用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用
技术领域
本发明属水产病害微生物检测技术领域，具体涉及一种可用于特异性检测鳗弧菌（V. anguillarum）的ssDNA核酸适配体，本发明还涉及该ssDNA核酸适配体的筛选与应用。
背景技术
鳗弧菌（V. anguillarum）是水产养殖中危害最为严重的致病菌株之一。当水产养殖动物受到环境改变、应激反应或受伤等条件下，鳗弧菌可引发疾病的产生。该菌可感染鲑鱼、虹鳟、鳗鲡、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、大菱鲆、牙鲆、黄鱼等鱼类。研究报道，部分感染鳗弧菌的水产动物体表最初出现局部褪色，鳍条、鳍基部及鳃骨下部充血发红，肛门红肿，继而肌肉组织有弥撒性或点状出血，体表发黑，鳍部出现溃烂，解剖检验时有明显的黄色粘稠腹水，肠粘膜组织腐烂脱落，部分鱼肝脏坏死。感染鳗弧菌后的水产动物表现出病情逐步加重的症状，并最终引起死亡。早期、快速诊断对疾病控制与治疗很重要。
上世纪九十年代出现的系统进化配体指数富集技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment, SLEXE)使核酸适配体的筛选研究工作得到了进一步发展。采用SELEX技术可从一个随机寡核苷酸文库（1013~1015）中筛选到的精准识别特定靶标的高特异性和亲和性的适配体（aptamers），这些适配体可被广泛应用于生物制药、分子生物学、微生物学、医学诊断治疗、环境检测等研究领域。适配体与其他生物分子相比拥有很多优良特性：易合成、易修饰、稳定性好、灵敏度高、靶标范围广、特异性强、pH范围广、免疫原性低等。
以鳗弧菌作为靶标的核酸适配体的筛选并进行快速检测具有重要意义。利用SELEX技术筛选得到针对于鳗弧菌菌体细胞的高特异性和亲和力的核酸适配体，可以用于环境检测和鳗弧菌所引发的疾病病原的快速诊断。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的用于鳗弧菌快速检测的ssDNA核酸适配体。
本发明的另一个目的是提供了前述ssDNA核酸适配体的筛选方法。
本发明的另一个目的是提供了前述ssDNA核酸适配体检测鳗弧菌的用途。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种用于鳗弧菌（Vibrio anguillarum）特异性识别的ssDNA核酸适配体，其特点是：所述核酸适配体的核苷酸序列为Apt-Va01和Apt-Va02中所示的DNA片段的核苷酸序列：
Apt-Va01：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACATCTTATCGAATTGTAGACGACGCTTTAGGTCCCTCTTGACGCGCAGTATGATACCTGTATTACCGTGGCGTGCATGTCTGCTGTTAGTGACGGTAAGCTTGGCAC -3’；
Apt-Va02：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACATCTTAGTAAGTCTTCTCTTCGGAACATTATCCAAAAATTGGATATCCTACTCTTATGGGTGATAGATGTGTATGTACGTCTAGATAGTGACGGTAAGCTTGGCAC -3’。
本发明还公开了如上述技术方案所述的用于鳗弧菌（Vibrio anguillarum）特异性识别的ssDNA核酸适配体的筛选方法，其特点是，其步骤如下：
(1)合成含有80个随机碱基的寡核苷酸文库；
(2)将要检测的鳗弧菌在2216E培养基中进行培养。
(3)将上述菌悬液进行浓度梯度稀释并涂琼脂板以检测菌体数；
(4)将步骤（2）所得菌体离心，保留沉淀；
(5)将（4）所得沉淀用结合缓冲液进行洗涤并保留沉淀；
(6)将结合缓冲液稀释的600pM（1）文库进行变性；
(7)将（5）所得沉淀和（6）所得变性文库混匀，结合1小时；
(8)结合完毕后离心并弃去上清，沉淀用洗涤缓冲液清洗；
(9)去离子水重悬沉淀，加热变性获取上清并检测浓度；
(10)不对称PCR扩增，产物用于下一轮筛选；
(11)测序分析，合成FAM荧光素标记的适配体；
(12)适配体结合率、特异性和检测线测定。
本发明所述的筛选方法，其进一步优选的技术方案具体步骤如下：
(1) 合成含有80个随机碱基的初始DNA筛选文库及前后向引物：
初始文库：5’- GGCGAAACATCTT- N80-TAGTGACGGTAAGCTTGGCAC-3’
引物1：5’-GTGCCAAGCTTACCG-3’
引物2：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACA-3’
(2) 采用2216E培养基对鳗弧菌进行培养，待其OD接近于1时停止培养，检测每毫升中菌体数并分装在1.5mL离心管中；
(3) 将100μL由结合缓冲液稀释的600pM初始文库95℃加热5分钟再冰浴10分钟；结合缓冲液：100 mM NaCl, 5 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, pH7.5；
(4) 离心获取鳗弧菌菌体并用洗涤缓冲液洗涤3次，100μL 的结合缓冲液重悬菌体；洗涤缓冲液：50 mM NaCl， 2.5 mM KCl， 25 mM Tris-HCl， 0.5 mM MgCl2, pH7.5；
(5) 将变性后的初始文库与鳗弧菌菌悬液混匀，30℃、100rpm孵育结合1小时；
(6) 混合液在5000g离心5分钟，丢弃上清液，沉淀用200μL洗涤缓冲液洗涤三次，100μL去离子水重悬菌体；
(7) 重悬液在90℃加热10分钟后冰浴10分钟，12000g离心5分钟后收集上清液，醇沉法回收DNA；
(8) 20μL去离子水溶解(7)所得DNA并检测浓度；
(9) 以(8)所得DNA为模板进行不对称PCR扩增，PCR产物纯化回收试剂盒回收扩增产物并稀释至100μL用于下一轮筛选文库；
(10) 以创伤弧菌（vibro vulnificus）为反筛菌，分别在第3、6、8轮中进行反筛，总共进行10轮正筛，选择第10轮PCR产物进行测序；
（11）核酸适配体性质鉴定：
分析测序结果并合成带有FAM荧光标签的核酸适配体；检测核酸适配体结合率，淘汰结合率低的ssDNA，得到两条核酸适配体Apt-Va01 和Apt-Va02。
本发明所述的ssDNA核酸适配体具备在非诊断目的鳗弧菌检测中的用途。所述的检测包括食品加工、水产养殖监控和环境检测。
本发明筛选方法技术方案中，进一步优选的技术方案是：FAM荧光素标签均标记在核酸适配体的5’端；所使用的初始鳗弧菌菌体浓度为4×108 CFU/mL；所有结合反应均在无菌容器中进行；核酸适配体结合荧光强度检测实验的仪器为多功能微孔板检测仪；适配体结合荧光成像实验的仪器为倒置显微镜。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了一条特异性强，亲和力高，检测限低的鳗弧菌核酸适配体，能够快速的对鳗弧菌菌体细胞进行检测，可广泛的应用于鳗弧菌的快速检测。
附图说明
图1为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体具有高特异性、高亲和力的核酸适配体Apt-Va01的二级结构预测图；
图2为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体能特异性、高亲和性结合的核酸适配体Apt-Va02的二级结构预测图；
图3 为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体具有高特异性、高亲和力的核酸适配体Apt-Va01的亲和力检测图；
图4为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体能特异性、高亲和性结合的核酸适配体Apt-Va02的亲和力检测图；
图5为本发明中筛选的两条与鳗弧菌菌体能特异性、高亲和性结合的核酸适配体Apt-Va01，Apt-Va02在不同孵育内时间内的荧光结合对比图；
图6 为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体具有高特异性、高亲和力的核酸适配体Apt-Va01在5种对照菌中的特异性检测对比图；
图7为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体具有高特异性、高亲和力的核酸适配体Apt-Va01在5种对照菌中荧光结合对比图；
图8为本发明中筛选的与鳗弧菌菌体具有高特异性、高亲和力的核酸适配体Apt-Va01的检测线柱形图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述。
实施例1，一种用于鳗弧菌（Vibrio anguillarum）特异性识别的ssDNA核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列为Apt-Va01和Apt-Va02中所示的DNA片段的核苷酸序列：
Apt-Va01：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACATCTTATCGAATTGTAGACGACGCTTTAGGTCCCTCTTGACGCGCAGTATGATACCTGTATTACCGTGGCGTGCATGTCTGCTGTTAGTGACGGTAAGCTTGGCAC -3’；
Apt-Va02：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACATCTTAGTAAGTCTTCTCTTCGGAACATTATCCAAAAATTGGATATCCTACTCTTATGGGTGATAGATGTGTATGTACGTCTAGATAGTGACGGTAAGCTTGGCAC -3’。
其筛选方法如下：
(1) 合成含有80个随机碱基的初始DNA筛选文库及前后向引物。
初始文库：5’- GGCGAAACATCTT- N80-TAGTGACGGTAAGCTTGGCAC-3’
引物1：5’-GTGCCAAGCTTACCG-3’
引物2：5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAGATGGCGAAACA-3’
(2) 采用2216E培养基对鳗弧菌进行培养，待其OD接近于1时停止培养，检测每毫升中菌体数并分装在1.5mL离心管中(1mL量)。
(3) 将100μL由结合缓冲液稀释的600pM初始文库95℃加热5分钟再冰浴10分钟。结合缓冲液：100 mM NaCl, 5 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, pH7.5。
(4) 离心获取鳗弧菌菌体并用洗涤缓冲液洗涤3次，100μL 的结合缓冲液重悬菌体。洗涤缓冲液：50 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 25 mM Tris-HCl, 0.5 mM MgCl2, pH7.5。
(5) 将变性后的初始文库与鳗弧菌菌悬液混匀，30℃、100rpm孵育结合1小时。
(6) 混合液在5000g离心5分钟，丢弃上清液，沉淀用200μL洗涤缓冲液洗涤三次，100μL去离子水重悬菌体。
(7) 重悬液在90℃加热10分钟后冰浴10分钟，12000g离心5分钟后收集上清液，醇沉法回收DNA。
(8) 20μL去离子水溶解(7)所得DNA并检测浓度。
(9) 以(8)所得DNA为模板进行不对称PCR扩增，PCR产物纯化回收试剂盒回收扩增产物并稀释至100μL用于下一轮筛选文库。
(10) 以创伤弧菌（vibro vulnificus）为反筛菌，分别在第3、6、8轮中进行反筛，总共进行10轮正筛，选择第10轮PCR产物进行测序。
核酸适配体性质鉴定如下：
分析测序结果并合成带有FAM荧光标签的核酸适配体。检测核酸适配体结合率，淘汰结合率低的ssDNA，得到两条核酸适配体Apt-Va01 和Apt-Va02。利用DNA二级结构分析软件分析核酸适配体的二级结构，Apt-Va01 和Apt-Va02在第40、100、120碱基位附近形成茎环结构，不同之处是Apt-Va01在第70个碱基位附近形成茎环，Apt-Va02则在形成在第80个碱基附近（见图1，图2）。
亲和力检测如下：
1)亲和力（Kd值）测定。在相同的菌体浓度下各自以100μL不同浓度(终浓度为0，0.5，1，2，5，10，20，30，40，50nM)的适配体为横坐标，结合后上清荧光强度（F代表经去离子水重悬后所得上清荧光值，F0代表适配体浓度为0时的荧光值）为纵坐标，利用SigmaPlot软件和Y=Bmax·(Kd+X)公式进行线性拟合并得出Kd值。结果证明适配体Apt-Va01 亲和力高于Apt-Va02（见图3，图4）。
2)荧光显微成像。将100μL相同浓度的单链适配体Apt-Va01 和Apt-Va02分别与鳗弧菌体孵育5分钟、15分钟、45分钟、60分钟和90分钟，去离子水重悬后取微量涂布于载玻片上进行荧光显微成像。结果显示核酸适配体Apt-Va01 在同等条件下结合率高于Apt-Va02，核酸适配体Apt-Va01对鳗弧菌的亲和性更好（见图5）。
特异性检测如下：
选用创伤弧菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌，海洋氧化节杆菌KQ11对核酸适配体Apt-Va01的特异性进行检测。
1)5种对照菌株分别在各自的最适培养条件下进行培养，根据OD值和活菌计数法稀释至每毫升中所含菌体数目相同。
2)5000g离心5分钟获取菌体细胞，清洗后与相同体积和浓度的核酸适配体Apt-Va01混合，30℃孵育结合1小时（结合前分别测定各适配体的浓度和荧光值）。
3)结合完成后5000g离心5分钟后收集上清，检测荧光值，沉淀洗涤后用去离子水重悬，吸取50μL菌悬液稀释后涂布于载玻片上，自然晾干，观察。
4)余下的菌悬液经加热、冷却、离心后收集上清液并检测DNA浓度和荧光强度。
5)结合前后核酸适配体浓度比值和荧光强度比值（结合后上清荧光值为F，结合前荧光值为F0，与菌体结合的荧光值为△F，其中△F=F0-F）为纵坐标绘制柱状图。结果显示核酸适配体Apt-Va01对鳗弧菌具有较高的特异性（见图6）。
6)荧光显微成像。分别在明场和荧光视场下对6种菌与核酸适配体结合效果进行观察，结果证明核酸适配体Apt-Va01与鳗弧菌菌体具有特异性结合（见图7）。
检测限测定方法如下：
1)将4×108 CFU/mL的鳗弧菌菌悬液按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7进行梯度稀释。对10-7菌液再按2n倍进行稀释。图8中小图的1、2、3、4、5、6、7、8分别代表：40、20、10、5、2、1、0、0 CFU/mL。
2)制备100μL终浓度为20nM的核酸适配体Apt-Va01，测定其荧光强度，将其与上述稀释的鳗弧菌菌体进行30℃混合孵育1小时。
3)结合完成后5000g离心5分钟、清洗、去离子水重悬，加热、冷却后检测上清液荧光强度。
4)以不同的稀释倍数为横坐标，结合前后荧光比值（结合前为F0，去离子水重悬后为F）为纵坐标做柱状比对图。结果显示核酸适配体Apt-Va01对鳗弧菌的检测限可低至10CFU/mL。检测范围为10CFU至4×108 CFU/mL。（见图8）
以上是对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明并不局限于上述实施方式，在本领域相关技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出相应的变化。
序列表
<110> 淮海工学院
江苏省海洋资源开发研究院（连云港）
<120> 用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 3
<211> 149
<212> DNA
<213> Apt-Va01
<400> 3
ctgcagaatt ctaatacgag tcactatagg aagatggcga aacatcttag taagtcttct 60
cttcggaaca ttatccaaaa attggatatc ctactcttat gggtgataga tgtgtatgta 120
cgtctagata gtgacggtaa gcttggcac 149
<210> 4
<211> 149
<212> DNA
<213> Apt-Va02
<400> 4
ctgcagaatt ctaatacgag tcactatagg aagatggcga aacatcttag taagtcttct 60
cttcggaaca ttatccaaaa attggatatc ctactcttat gggtgataga tgtgtatgta 120
cgtctagata gtgacggtaa gcttggcac 149

Claims (3)

1.一种用于鳗弧菌（vibrio anguillarum）特异性识别的ssDNA核酸适配体Apt-Va01，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体Apt-Va01的核苷酸序列为：
5’-CTGCAGAATTCTAATACGAGTCACTATAGGAAG
ATGGCGAAACATCTTATCGAATTGTAGACGACGCTTTAGGTCCCTCTTGACGCGCAGTATGATACCTGTATTACCGTGGCGTGCATGTCTGCTGTTAGTGACGGTAAGCTTGGCAC -3’ 。
2.一种如权利要求1所述的ssDNA核酸适配体Apt-Va01在鳗弧菌（vibrio anguillarum）检测中的用途，其特征在于，所述的用途为非疾病诊断目的。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的检测包括食品加工、水产养殖监控和环境检测中的检测。
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