CN102605075A - 一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法，涉及哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。寡核苷酸序列包括SEQ ID No.1～4。合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)；将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸序列，尤其是涉及一种一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。
背景技术
在养殖业中，每年约有10％的水产养殖动物死于感染性病害，其中弧菌感染导致的疾病占了相当大的比重。虽然化学药品和抗生素可控制其感染，但是药物防治常会产生不良后果，如在水产动物体内积累、残留，容易产生耐药菌株和易污染环境等问题，因此建立病原弧菌的快速检测技术，以提早防治病害的发生和流行仍是目前的主要手段。
目前，弧菌的检测方法主要是根据伯杰氏细菌鉴定手册，通过对微生物的生理生化特征检测进行鉴定，由于需要测试的项目较多，因此该方法工作量较大、操作较繁琐。16SrRNA的分子生物学方法虽有较高的准确性，但需要提取病原菌的16SrRNA，专业技术水平要求较高，且对检测设备有一定要求，难以实现现场的快速检测需要；免疫学方法制备的抗血清虽能实现快速检测，但由于制备的抗血清为多克隆抗体，实际应用中可能会出现假阳性或假阴性，即使采用单克隆抗体，由于制备技术要求较高、周期较长，使其应用也受到一定的限制。
指数富集配体进化技术(Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)，简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——适配子，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的适配子，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。
哈维氏弧菌是一种革兰氏阴性、发光的(并非所有菌株)海洋弧菌，菌体呈弧状，极生单鞭毛。它广泛分布于近岸温暖的海水、海洋沉积物、海洋动物的体表，也是许多海洋脊椎动物和无脊椎动物的正常菌群。但是在某些特定条件下，如水质恶化或环境异常等条件下常会引起养殖动物发病，是近些年来才被认识到的水产养殖动物的重要致病菌。溶藻弧菌是一种广泛分布于世界各地海水及河口处的一种病原微生物，其数量居海水类弧菌之首，存在于多种海洋动物中，是鱼、虾、贝等海水养殖动物的条件致病菌，并可引起人食物中毒、耳部发炎等疾病，对公共卫生安全构成十分严重的威胁。因此，运用SELEX技术筛选哈维氏弧菌和溶藻弧菌的共同适配子，将能同时识别检测哈维氏弧菌和溶藻弧菌，从而能大大提高哈维氏弧菌和溶藻弧菌检测的效率。
中国专利CN102199667A公开一类可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其应用，包括SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3和SEQIDNo.4四条寡核苷酸序列，且采用其中一条就能完成溶藻弧菌识别检测。
中国专利CN102329862A公开一种三条可用于溶藻弧菌识别检测的寡核苷酸序列及其制备方法与应用，寡核苷酸序列包括SEQIDNo.1～3。将寡核苷酸文库与溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选；SELEX筛选完成后对适配子富集文库进行克隆测序；对测序结果中出现的高拷贝ssDNA进行不同长度的截取，得到一系列新的序列，再构建这些新序列的互补序列；对获得的新序列及其互补序列进行亲和特异性的验证，获得相应适配子。
发明内容
本发明的目的在于提供不仅具有检测快速、操作简单、稳定性高于抗体等特点，而且制备方法容易、制备周期较短的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列及其制备方法。
所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，包括SEQ ID No.1(该序列又可记为“C7”)、SEQ ID No.2(该序列可记为“C8”)、SEQ ID No.3(该序列可记为“C14”)和SEQ ID No.4(该序列可记为“C22”)4条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；
所述SEQ ID No.1为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.3为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.4为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′。
所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：
1、合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；
2、将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；
3、SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；
4、选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。
在步骤2中，所述SELEX筛选的具体方法为：
2.1 弧菌菌液的制备
用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108～9×108个/ml，于-20℃低温保存备用；
2.2 适配子的SELEX筛选，具体方法如下：
2.2.1 ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离，具体方法如下：
取100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；
所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4。
2.2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离，具体方法如下：
将步骤2.2.1分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100μl自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同步骤2.2.1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库。
2.2.3 不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下：
对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25μl的不对称PCR扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl(可购于Fermentas公司)；
P1(10μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
P2(0.2μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可购于Takara公司)；
MgCl2(25mM)：1.2μl(可购于Fermentas公司)；
ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；
Taq DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可购于Fermentas公司)；
ddH2O：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；
2.2.4 亲和力的测定(操作流程如图2)，具体方法如下：
2.2.4.1 扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.2.4.2 与菌结合：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μL，95℃变性5min，冰浴10min后加入到室温恢复的100μL菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；
2.2.4.3 洗涤：将细菌沉淀用1×结合缓冲液500μL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.2.4.4 与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL 1∶900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5～9g NaCl，再加Tris-HCl(0.5M、pH7.6)溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl(pH7.6，100ml)溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml。
2.2.4.5 洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液500μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.2.4.6 TMB(四甲基联苯胺)显色：加入400μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3，2.2.4.4，2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
所述TMB显色液的配制方法为：1mg/ml TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1(V/V)，现配现用，其中1mg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成1mg/ml；底物缓冲液的配制：称取0.5103g柠檬酸、1.84g Na2HPO4·12H2O与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml。
2.2.4.7 测定PCR产物中DNA的摩尔浓度：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100μL PCR产物中的DNA摩尔数。
2.2.4.8 计算相应文库的亲和力：
2.3 重复筛选，具体方法为：
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.2，直到亲和力不再上升为止，则最后一轮筛选得到的ssDNA次级文库即为筛选获得的适配子富集文库。
在步骤3中，所述克隆测序的具体方法如下：
将步骤2筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2.2.3，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，可以得到一系列具有如下结构的寡核苷酸序列或ssDNA：5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-NNNN......NNN-GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′(其中N为ATCG中四种核苷酸中的任何一种)，选择具有这种结构的ssDNA。
在步骤4中，所述“选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具体方法如下：
4.1 高拷贝的ssDNA的选择：对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，若发现有2或2个以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者说在测序结果中发现有2个以上的拷贝数的ssDNA，则进入下一步骤；若没有发现多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数较多且至少有2个以上拷贝数的ssDNA进行后续操作；
4.2 对步骤4.1获得的多拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，最终获得4条对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)，具体方法如下：
4.2.1 合成需要进行验证的ssDNA序列(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；
4.2.2 微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，将哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和这两种对照菌，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃下100rpm摇床培养8～10h；然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
4.2.3 亲和特异性的验证
4.2.3.1 与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌、溶藻弧菌这4种菌液各100μl混合(菌数量约为3×108个)，在30℃、100rpm摇床结合30min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白(即用2×结合缓冲液代替ssDNA，同样进行步骤4.2.3.1的操作)；
4.2.3.2 洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤，6000rpm离心5min，弃上清，取细菌沉淀；
4.2.3.3 与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000TBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体购于北京博奥森生物技术公司，与TBS的体积比为1∶1000)，充分混合反应10min；
所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5-9g NaCl，再加Tris-HCl(0.5M、pH7.6)溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl(pH7.6，100ml)溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml。
4.2.3.4 洗涤：6000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤，弃上清，取细菌沉淀；
4.2.3.5 显色：加入400μl双蒸水重悬细菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤4.2.3.2、4.2.3.3、4.2.3.4和4.2.3.5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
4.2.3.6 数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异，统计分析后获得ssDNA对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌和溶藻弧菌等4种菌的识别效果。若ssDNA对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力均显著高于对其它两株菌(嗜水气单胞菌、迟缓型爱德华氏菌)的亲和力(p＜0.05)，则这个ssDNA就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；若经过亲和特异性验证和统计分析后，没有发现能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，则重复步骤3和4，进一步进行克隆测序，从中选择新的高拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，直到获得对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著亲和特异性的ssDNA，则这个ssDNA序列就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。
本发明所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，具有识别检测哈维氏弧菌和溶藻弧菌的功能，且采用所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列中的任意一条就能够单独应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的检测。
所述四条寡核苷酸序列的5′端均标记有地高辛。
所述一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列可用于各类样品中哈维氏弧菌及溶藻弧菌的识别检测。具体检测方法如下：
(1)待测菌液制备：取样品，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30℃下100rpm摇床培养8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用。
(2)亲和特异性检测：然后用5′端标记有地高辛的上述四条寡核苷酸序列中的任意一条按说明书制备步骤4.3.2的亲和特异性验证方法对待测菌液进行亲和力的检测；同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，同样按说明书制备步骤4.3.2的亲和特异性验证方法进行亲和力检测，得到阳性对照1、2；用无菌蒸馏水代替待测菌液，同样按说明书制备步骤4.3.2的亲和特异性验证方法进行亲和力检测，得到阴性对照；结果显示阳性对照组颜色为黄色，阴性对照组不显色；若待测样品检测结果呈现黄色，则说明样品中有哈维氏弧菌或溶藻弧菌，或两株菌均有，为阳性；若待测样品检测结果不显色，则说明样品中既没有哈维氏弧菌，也没有溶藻弧菌。
本发明具有检测快速，操作简单，适配子的稳定性高于抗体的特点，而且合成制备容易，制备周期较短。
附图说明
图1为SELEX筛选流程图。
图2为亲和力的测定流程图。
图3为本发明实施例1中SEQ ID No.1适配子对4种菌的识别效果图。在图3中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。
图4为本发明SEQ ID No.2适配子对4种菌的识别效果图。在图4中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。
图5为本发明SEQ ID No.3适配子对4种菌的识别效果图。在图5中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。
图6为本发明SEQ ID No.4适配子对4种菌的识别效果图。在图6中，横坐标为微生物，纵坐标为亲和力。
在图3～6中，柱形上的标记“**”分别代表与嗜水气单胞菌组、迟钝爱德华氏菌组比较达到极显著水平(p＜0.01)。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备步骤主要包括：
1、弧菌菌液的制备
用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108～9×108个/ml，于-20℃低温保存备用；
2、适配子的SELEX筛选
2.1 ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离
取100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；
所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4。
2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离
将步骤2.2.1分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100μl自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同2.1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库。
2.3 不对称PCR扩增ssDNA
对2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增。总体积为25μl的不对称PCR扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl(可购于Fermentas公司)；
P1(10μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
P2(0.2μM)：1μl(可购于上海生物工程公司)；
dNTP(各2.5mM)：0.4μl(可购于Takara公司)；
MgCl2(25mM)：1.2μl(可购于Fermentas公司)；
ssDNA模板(0.2μg/μl)：2μl；
Taq DNA聚合酶(5u/μl)：0.2μl(可购于Fermentas公司)；
双蒸水：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s)，最后72℃延伸7min；
2.4 亲和力的测定(操作流程如图2)
2.4.1 扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.4.2 与菌结合：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μL，95℃变性5min，冰浴10min后加入到室温恢复的100μL菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；
2.4.3 洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.4.4 与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL 1∶900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5-9g NaCl，再加Tris-HCl(0.5M、pH7.6)溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl(pH7.6，100ml)溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml。
2.4.5 洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液500μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.4.6 TMB(四甲基联苯胺)显色：加入400μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3，2.2.4.4，2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
TMB显色液配制方法为：1mg/ml TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1(V/V)，现配现用。其中1mg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成1mg/ml；底物缓冲液的配制：称取0.5103g柠檬酸、1.84g Na2HPO4·12H2O与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml。
2.4.7测定PCR产物中DNA的摩尔浓度：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100μL PCR产物中的DNA摩尔数。
2.4.8 计算相应文库的亲和力：
2.3 重复筛选
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.2，直到亲和力不再上升为止，则最后一轮筛选得到的ssDNA次级文库即为筛选获得的适配子富集文库。
3、克隆测序：筛选得到的适配子富集文库经不对称PCR扩增后(扩增条件同步骤2.3)，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取64个克隆进行测序(由上海美吉生物医院科技有限公司完成克隆和测序工作)，得到49条有效的ssDNA(编号为C1～C49号)，其中拷贝数最多的四个适配子分别为C7、C8、C14和C22，C7拷贝数为3，C8拷贝数为4，C14拷贝数为4，C22拷贝数为6，因此选择这些ssDNA进行后续操作。
4、对步骤3获得的多拷贝序列进行亲和特异性的验证：分别对编号为C7、C8、C14、C22进行亲和特异性的验证试验，最终证明这4条序列(C7、C8、C14、C22)是对哈维氏弧菌和溶藻弧菌有较好亲和特异性的寡核苷酸序列(适配子)；具体过程如下：
4.1 合成需要进行验证的ssDNA序列C7、C8、C14、C22(由上海生工生物工程技术有限公司合成)，并在5’端标记地高辛；
4.2 微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，将哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)以及上述两种对照菌，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，30℃下100rpm摇床培养约8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
4.3 亲和特异性的验证
4.3.1 与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与上述4种菌液各100μl混合(菌数量约为3×108个)，在30℃、100rpm摇床结合40min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白(即用2×结合缓冲液代替ssDNA，同样进行上述操作)；
4.3.2 洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤1次，6000rpm离心5min，弃上清，取细菌沉淀；
4.3.3 与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000TBS稀释的过量的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体(购于北京博奥森生物技术公司)，混合反应10min；
4.3.4 洗涤：60000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤3次，弃上清，取细菌沉淀；
4.3.5 显色：加入400μl双蒸水重悬细菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2M H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤4.3.2～4.3.5，得到空白的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
5.数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异。
通过SELEX筛选和亲和特异性验证，C7、C8、C14、C22等4个寡核苷酸序列对哈维氏弧菌和溶藻弧菌均有极显著的亲和力(p＜0.01)，且这4个序列对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力均极显著高于对其它2株菌(嗜水气单胞菌、迟缓型爱德华氏菌)的亲和力(p＜0.01)，说明这4个适配子对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测(如图3～6)。
实施例2
寡核苷酸序列具有识别检测哈维氏弧菌的用途：具体使用步骤如下：1)取病鱼的伤口组织粘液，蒸馏水溶解后接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)培养基中，30℃下100rpm摇床培养8～10h。然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用。然后用5′端标记有地高辛的适配子C7(SEQ ID No.1)按实施例1中的步骤4.3的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测；同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，按同样的方法进行亲和力检测，得到两个阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，按同样的方法进行亲和力检测，得到阴性对照。结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明样品中有哈维氏弧菌或溶藻弧菌，或者两株菌均有，病鱼感染了哈维氏弧菌或者溶藻弧菌，或者两者均感染。
2)取感染了弧菌病的养殖水体，经过微生物的培养后，按实施例1中样品的制备，然后用5′端标记有地高辛的适配子C8(SEQ ID No.2)按制备步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测；同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到两个阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到阴性对照。结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明染病水样中含有哈维氏弧菌或者溶藻弧菌，或者两者均有。
3)取市售活鱼的血清，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5′端标记有地高辛的适配子C14(SEQ ID No.3)按制备步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测；同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到两个阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到阴性对照。结果显示阳性对照组颜色变黄，而实验组和阴性对照组颜色未变，说明样品中不含有哈维氏弧菌或溶藻弧菌。
4)取病鱼的鳃组织，按上述方法进行微生物的培养和样品的制备，然后用5′端标记有地高辛的适配子C22(SEQ ID No.4)按制备步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测；同时分别用哈维氏弧菌和溶藻弧菌代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到两个阳性对照；用无菌蒸馏水代替待测菌液，按步骤4.3.2的亲和特异性验证的方法进行亲和力检测，得到阴性对照。结果显示阳性对照组和实验组颜色变黄，而阴性对照组颜色未变，说明样品中有哈维氏弧菌或溶藻弧菌，或者两株菌均有，病鱼感染了哈维氏弧菌或者溶藻弧菌，或者两者均感染。
Claims (5)
1.一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，其特征在于包括SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4四条寡核苷酸序列，且采用其中的一条寡核苷酸序列就能完成对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；
所述SEQ ID No.1为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.2为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.3为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCGGGGGCGCGGTGAGGGGCTGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′；
所述SEQ ID No.4为：5′-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTC TGCAGGGCCAGAACAGGGGGAAGGCACAAGAGGGAGCACAAGAGGGAGGCACAAGAGGGAGACCCCAGAGGG-3′。
2.如权利要求1所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成用于筛选的ssDNA寡核苷酸文库(5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC----N35----GCA CAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′)，其中N35为35个随机寡核苷酸；
2)将寡核苷酸文库分别与哈维氏弧菌、溶藻弧菌混合后进行SELEX筛选，获得适配子富集文库；
3)SELEX筛选完成后，对获得的适配子富集文库进行克隆测序；
4)选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述SELEX筛选的具体方法为：
2.1 弧菌菌液的制备
用生理盐水将哈维氏弧菌和溶藻弧菌菌落从斜面上洗涤下来，6000rpm离心，弃上清液，用生理盐水重悬并稀释菌液到下列浓度范围：1×108～9×108个/ml，于-20℃低温保存备用；
2.2 适配子的SELEX筛选，具体方法如下：
2.2.1 ssDNA与哈维氏弧菌的结合、分离，具体方法如下：
取100μM的ssDNA寡核苷酸文库4μL，用2×结合缓冲液稀释至100μl，95℃变性5min，冰浴10min后加入100μl自然室温恢复的哈维氏弧菌菌液，摇床结合30min，再6000rpm离心5min，弃上清，然后用1×结合缓冲液洗沉淀，弃上清；在沉淀中再加入1×结合缓冲液100μL，96℃加热5min，然后15000rpm离心10min，取上清液，对沉淀再次加热并离心，合并上清液，则可分离得到与哈维氏弧菌有亲和力的ssDNA次级文库；
所述2×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释10倍后的溶液，所述1×结合缓冲液为20×结合缓冲液用双蒸水稀释20倍后的溶液；所述20×结合缓冲液配方为1M NaCl、50mM KCl、500mM Tris-HCl、10mM MgCl2、pH 7.4；
2.2.2 ssDNA与溶藻弧菌的结合、分离，具体方法如下：
将步骤2.2.1分离得到的能与哈维氏弧菌结合的ssDNA，再与100μl自然室温恢复的溶藻弧菌菌液，摇床结合30min，后续步骤同步骤2.2.1，则可分离到与溶藻弧菌和哈维氏弧菌都有亲和力的ssDNA次级文库；
2.2.3 不对称PCR扩增ssDNA，具体方法如下：
对步骤2.2.2分离获得的ssDNA次级文库进行不对称PCR扩增，总体积为25μl的不对称PCR扩增体系为：
10×PCR缓冲液：2μl；
P1，10μM：1μl；
P2，0.2μM：1μl；
dNTP，各2.5mM：0.4μl；
MgCl2，25mM：1.2μl；
ssDNA模板，0.2μg/μl：2μl；
Taq DNA聚合酶，5u/μl：0.2μl；
ddH2O：17.2μl；
PCR反应参数：94℃预变性4min，然后进行40个循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20s，最后72℃延伸7min；
2.2.4 亲和力的测定，具体方法如下：
2.2.4.1 扩增：用带有地高辛标记的引物P1不对称PCR扩增筛选出来的ssDNA次级文库，扩增条件和参数与步骤2.2.3的不对称PCR扩增体系和参数相同；
2.2.4.2与菌结合：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物100μL，95℃变性5min，冰浴10min后加入到室温恢复的100μL菌液中，充分混合，在室温下结合30min，然后6000rpm离心，分离细菌沉淀与上清液，细菌沉淀中包含有与菌结合的带地高辛标记的ssDNA，上清液中是未结合的ssDNA，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替PCR产物，同样进行上述操作；
2.2.4.3 洗涤：将细菌沉淀用1×结合缓冲液500μL洗涤1次，6000rpm离心，弃上清，取菌沉淀；
2.2.4.4 与酶标兔抗地高辛抗体结合：在菌沉淀中加入100μL 1∶900TBS稀释的过量的酶标兔抗地高辛抗体，充分混合后，反应10min，使之与菌沉淀中的地高辛标记的ssDNA结合；
所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5～9g NaCl，再加Tris-HCl，0.5M，pH7.6，溶液100ml，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl溶液，pH7.6，100ml，溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml；
2.2.4.5 洗涤：6000rpm离心，去上清，再用1×结合缓冲液500μL洗涤3次，得菌沉淀；
2.2.4.6 TMB(四甲基联苯胺)显色：加入400μL双蒸水重悬菌沉淀，再加入200μL TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μL终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映与菌结合的ssDNA的亲和力，即OD结合，空白同样进行上述步骤2.2.4.3，2.2.4.4，2.2.4.5和2.2.4.6，得到空白相应的吸光度OD空白；
所述TMB显色液的配制方法为：按体积比，1mg/ml TMB∶底物缓冲液∶30％过氧化氢＝100∶900∶1，其中1mg/ml TMB是将TMB用无水乙醇配成1mg/ml；底物缓冲液的配制：称取0.5103g柠檬酸、1.84g Na2HPO4·12H2O与烧杯中，溶解后加入蒸馏水定容至100ml；
2.2.4.7 测定PCR产物中DNA的摩尔浓度：取步骤2.2.4.1扩增所得的PCR产物，以已知浓度梯度的初始ssDNA文库为标准品，用Bandscan软件作为图像分析软件，采用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法定量测定PCR产物中的DNA含量，获得相应DNA的摩尔浓度，进而可以计算出100μL PCR产物中的DNA摩尔数；
2.2.4.8 计算相应文库的亲和力：
2.3 重复筛选，具体方法为：
以每一轮不对称PCR的产物作为下一轮的筛选文库，重复上述SELEX筛选步骤2.2，直到亲和力不再上升为止，则最后一轮筛选得到的ssDNA次级文库即为筛选获得的适配子富集文库。
4.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述克隆测序的具体方法如下：
将步骤2筛选出的适配子富集文库进行不对称PCR扩增，扩增条件同步骤2.2.3，扩增产物送测序公司进行克隆，并随机挑取5个以上克隆进行测序，可以得到一系列具有如下结构的寡核苷酸序列或ssDNA：5′-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-NNNN......NNN-GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3′(其中N为ATCG中四种核苷酸中的任何一种)，选择具有这种结构的ssDNA。
5.如权利要求2所述的一组能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述“选择测序结果中出现的高拷贝ssDNA，进行亲和特异性的验证，筛选获得能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列”的具体方法如下：
4.1高拷贝的ssDNA的选择：对步骤3)获得的一系列ssDNA进行比较分析，若发现有2或2个以上的ssDNA的全部序列是完全相同的，或者说在测序结果中发现有2个以上的拷贝数的ssDNA，则进入下一步骤；若没有发现多拷贝ssDNA，则重复步骤3)，继续克隆测序，直到获得至少一个多拷贝的ssDNA，然后选择拷贝数较多且至少有2个以上拷贝数的ssDNA进行后续操作；
4.2 对步骤4.1获得的多拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，最终获得4条对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有较好亲和特异性的寡核苷酸序列，具体方法如下：
4.2.1 合成需要进行验证的ssDNA序列，并在5’端标记地高辛；
4.2.2 微生物的准备
选取水产养殖环境常见的病原微生物——嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)作为对照菌，将哈维式弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和这两种对照菌，在无菌条件下分别接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，30℃下100rpm摇床培养8～10h；然后取菌液离心，弃上清培养液，再用生理盐水稀释到1×108～9×108个/mL，-20℃低温保存备用；
4.2.3 亲和特异性的验证
4.2.3.1 与菌结合：取合成出的ssDNA序列10pmol用2×结合缓冲液稀释到100μl，95℃变性5min，冰浴10min后，分别与嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌、溶藻弧菌这4种菌液各100μl混合，菌数量为3×108个，在30℃、100rpm摇床结合30min，然后6000rpm离心5min，分离细菌沉淀与上清液，同时做一不加ssDNA的空白，即用2×结合缓冲液代替ssDNA，同样进行步骤4.2.3.1的操作；
4.2.3.2 洗涤：将上述细菌沉淀用1×结合缓冲液500μl洗涤，6000rpm离心5min，弃上清，取细菌沉淀；
4.2.3.3 与辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体结合：在空白及实验组菌沉淀中加入100μl1∶1000 TBS稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗地高辛抗体，充分混合反应10min；
所述TBS为0.5M Tris-NaCl溶液，配制方法为：先水溶8.5～9g NaCl，再加Tris-HCl溶液100ml，0.5M，pH7.6，最后加水定容至1L；0.5M Tris-HCl溶液100ml，pH7.6，溶液配制方法：称取Tris 6.06g，加入双蒸水40ml溶解，滴加浓HCl调pH至7.6，定容至100ml；
4.2.3.4 洗涤：6000rpm离心5min，再用1×结合缓冲液500μl洗涤，弃上清，取细菌沉淀；
4.2.3.5 显色：加入400μl双蒸水重悬细菌沉淀，再加入200μl TMB显色液，避光显色10min后，以2mol/L H2SO4 200μl终止反应，测定450nm处的吸光值OD450，该值即反映结合的酶标抗地高辛的OD值，即为OD结合，空白同样进行上述步骤4.2.3.2、4.2.3.3、4.2.3.4和4.2.3.5，得到空白相应的吸光度OD空白，相应适配子的亲和力＝OD结合-OD空白；
4.2.3.6 数据处理分析
用EXCEL软件中的统计函数进行数据处理，统计指标采用T检验进行统计分析，统计概率p＜0.05为显著差异，p＜0.01为极显著的差异，统计分析后获得ssDNA对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、哈维式弧菌和溶藻弧菌等4种菌的识别效果；若ssDNA对哈维氏弧菌和溶藻弧菌的亲和力均显著高于对嗜水气单胞菌和迟缓型爱德华氏菌的亲和力，p＜0.05，则这个ssDNA就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，它对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著的特异性识别能力，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测；若经过亲和特异性验证和统计分析后，没有发现能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，则重复步骤3和4，进一步进行克隆测序，从中选择新的高拷贝ssDNA进行亲和特异性验证，直到获得对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都有显著亲和特异性的ssDNA，则这个ssDNA序列就是能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌的寡核苷酸序列，可同时应用于哈维氏弧菌和溶藻弧菌的识别检测。
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