WO2012016375A1

WO2012016375A1 - 检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片及其应用

Info

Publication number: WO2012016375A1
Application number: PCT/CN2010/075677
Authority: WO
Inventors: 黄倢; 李晨; 杨冰; 王秀华; 荆晓艳; 张庆利; 张宝存; 赵培; 谢国驷; 闫丽
Original assignee: 中国水产科学研究院黄海水产研究所
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2010-08-03
Publication date: 2012-02-09
Also published as: CN102869785A; CN102869785B

Description

说明书

检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片及其应用 · 技术领域

本发明涉及海水养殖动物中病原菌的检测技术，具体涉及一种检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片及应用。

背景技术

细菌性疾病对海水养殖动物健康及水产品质量安全造成重要影响，可导致海水养殖动物致病的细菌种类繁多，经常发生多种微生物的同时感染，传统的细菌检测方式多为生理生化鉴定与 16S rR A测序相结合，但是操作繁琐、时间较长，更无法对微生物的致病性进行判断。继而发展的检测方法有间接荧光抗体技术、核酸印迹杂交、 PCR检测方法等，但都不能应对海水养殖动物疾病多种病原高通量检测的需求。 20世纪 90年代迅速发展起来的基因芯片技术，是一种快速、灵敏、简便的、高通量的检测技术，可对大量样品进行同时、平行的检测，弥补.了以上检测方法的不足，此方法己在疾病的基因诊断、基因的表达分析、基因组的研究、药物筛选、微生物检测等领域得到了广泛应用。

目前，已经有检测海水养殖动物部分病原性细菌基因芯片技术的报道，如美国学者 Warsen 根据细菌 16S rDNA设计寡核苷酸探针构建基因芯片，对 18种细菌进行检测，其中包括嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、葡萄球菌、链球菌等】 5种鱼类常见病原菌，结果能 100%特异性地检测出这些病原菌； Georg Mitterer等根据 23S rDNA设计特殊的引物和探针，建立固相 PCR- 芯片检测技术，可以检测出多种葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌等。但己有的芯片主要是利用属间高度保守的核糖体序列或某些特征基因的序列作为探针，致力于病原菌种类的准确鉴定，但在病原菌的毒力分析上缺乏有利的证据和说服力。发明一种既能同时快速检测多种海水养殖动物病原菌，又能对病原菌的毒力进行分析的检测技术是生产和科研的迫切需求，本发明就是在此情况下应运而生的。

发明内容

. 本发明的目的是提供一种检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片及应用，即可平行高通量的检测多种海水养殖动物病原性细菌，又可初歩分析细菌毒力，使基因芯片技术更好地应用于海水养殖动物病原菌的高通量检测。

本发明的技术方案包括：

一、基因芯片上的探针选择

1、动物病原菌特征基因探针

本发明选择海水养殖动物常见病原菌作为检测对象，包括：

弧菌属的鳗弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、费氏弧菌、灿烂弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、非 01型霍乱弧菌、拟态弧菌、杀鲑弧菌；

气单胞菌属的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌：

爱德华氏菌属的迟缓爱德华氏菌、鲇鱼爱德华氏菌；

替换页 (细则第 26条）鲑鱼肾杆菌、海洋分枝杆菌、假单胞菌属及链球菌属细菌等。

特征基因大致为病原菌的管家基因、部分毒力相关基因及菌体特征基因，其核酸信息如下（基因名后面为 Genbank的序列号）：

(1)用于鉴定鳗弧菌（f¾ o a«gM //arara)的特征基因包括： toxR基因（AB042547)、 angM 基因（AY312585)、 empA基因（EU360910)、 vahl基因（S83534)、 virA基因（L08012)、 virC基因（U17054)、 fatA基因（AY255699)、 vac基因（AB004934)、 flaA基因（L47122)、 tonB2基因（AY644719)、 vah4基因（AB189397)。

(2)用于鉴定溶藻胶弧菌（ Vibrio alginolyticus)的特征基因包括： toxR基因（FM202715、 AF170882 ) , tlh基因（AY829371 )、 pyrH基因（EU251673 )、 flaA基因（EF125175)、 dnaJ 基因（AB263020)。

(3)用于鉴定副溶血弧菌（ Vibrio parahaemolyticus ) 的特征基因包括： toxR 基因 (AB029915)、 tdh基因（AY044110)、 trhl基因（M88112)、 trh2基因（AB 112353 )、 tlh基因（EF640375)、 pR72H基因（L03116)、 vppC基因（DQ479431 )、 spa24基因 (EU185084) . lafA基因（L06176)。

(4)用于鉴定哈维氏弧菌 ( Vibrio harveyi) 的特征基因包括： toxR基因（DQ503438)、 vhh-l基因（AF217649)、vhhA基因（ AF293430)、pap6基因（AF508306)、dam基因（EF421460)。

(5)用于鉴定创伤弧菌（ Vibrio vulnificus 的特征基因包括： toxR基因（ AF170883 )、 vvhA 基因（AB 1248303、 M34670)、 vvp基因（DQ923325、 U48780)、 vuuA基因（AF156494)、 vlly基因（U97357)、 gyrB基因（EF642630)、 tolC基因（DQ296642)、 rtxE基因（ AM293860)。

(6)用于鉴定非 01型霍乱弧菌（Non-01 Vibrio cholerae) 的特征基因包括： toxR基因 (DQ774024 ) , stn基因（L03220)、 recA基因（AF301127)、 ctxA基因（EU487781 )、 ctxB 基因（U25679)、 ace基因（AF542089)、 zot基因（AF175708)、 tagA基因（U12265)、 mdh 基因（EU085335)、 ompW基因（DQ776044)、 hlyA基因（X51746)、 hk基因（DQ775819)、 flaA基因（DQ774943 )、 tcpA基因（EU622529)。

(7)用于鉴定河流弧菌 i Vibriofluvialis 的特征基因包括： hupO基因（AY560602)、 vfh 基因（AF348455)、 vfpA基因（AB071709)。

(8)用于鉴定费氏弧菌 Vibrw flscheri) 的特征基因包括： toxR基因（L29053 )、 ampC 基因（AY438037 )、 hemolysin基因（AB 105805 )、 vhh/tlh基因（DQ839418 )、 gacA基因

( AY377390 ) , recA基因（AJ580909)、 cnfl基因 ( AF023157 )„

(9)用于鉴定灿烂弧菌 Vibrio spkndid 的特征基因包括： aerV基因（AM157713 )、 als基因（AM157713 )、 vsm基因（DQ987707、 EU349013 )、 toxR基因（AY751344)。

(10)用于鉴定拟态弧菌 Vibrio mimicu^的特征基因包括： toxR基因（EF693743 )、 vmc 基因（AF004832)、 vmhA基因（U68271 )、 hlyA基因（EF187437)、 mhuA基因（AB048382)、 mhuB基因（AB048382)、 zot基因（AF207857)。 (11) 包括可用于鉴定杀鲑弧菌 (Vibrio salmonicida) 的特征基因包括： luxC 基因 (AF452135)、 luxD基因（AF452135)、 luxE基因（AF452135)、 luxl基因（AF452135)、 toxR 基因（FM178379)。

(12)包括可用于鉴定嗜水气单胞菌 eromonas hydrop cd的特征基因包括： aerA基因（DQ186611)、 alt基因（L77573)、 ahal基因（DQ302125)、 ahpA基因（DQ189993)、 ompTS 基因（AF276639)、 lip基因（U63543)。

(13)包括可用于鉴定温和气单胞菌 eromonas sobria 的特征基因包括： extracellular serine protease gene基因 ( AF253471 ) metalloprotease gene基因 (DQ784565)。

(14) 包括可用于鉴定杀鲑气单胞菌 Aeromo salmonicida 的特征基因包括： vapA 基因（M64655、 AJ749890)、 fstA基因（X87995)。

(15) 包括可用于鉴定迟缓爱德华氏菌 Edwardsie tarda) 的特征基因包括： evpA基因（AY424360)、 esaV基因（AY643478)、 esrB基因（AY643478)、 mukF基因（AY078510)、 ethA基因（D89876)、 ethB基因（D89876)、 hlyB基因 (AB231542), katB基因（AY178620)、 gadB基因（AY078505)、 pstS基因（AF491965)、 for基因（EF197912)、 fimA基因（DQ914634、 AB100170)。

(16)包括可用于鉴定鲇鱼爱德华氏菌 iEdwardsiella ictalurO 的特征基因包括： eihA基因（AY338755)、 eihB基因（AY338755)、 eipl8基因（AF037441)、 eipl9基因（AF037441)、 eip20基因（AF037441)、 eip55基因（AF037441)。

(17) 包括可用于鉴定鲑鱼肾杆菌 iRenibacterium salmoninarum) 的特征基因包括： p57 gene基因（Z12174)、 hly基因（AF428067)、 RRSA01248 gene基因（EF426716)、 ITS基因

(AF239195)、 lysB基因（AF428066)。

(18) 包括可用于鉴定海洋分枝杆菌 (Mycobacterium marinum) 的特征基因包括： dnaJ 基因（ AB292549 )、 rpoB基因（ AF057476、 AM885925 )、 virulence protein gene基因（ AY517551 )、 hsp65基因（AF547855)。

(19) 包括可用于鉴定假单胞菌属 Pseudomo sp) 的特征基因包括： rpoD 基因 (EF044537)、 gyrB基因 (AB178862) mucA基因（L14760)、 algD基因（M63283)、 pfhR 基因（AF 127222)、 algU基因（EF540906)、 aprX基因（AY298902)。

(20)包括可用于鉴定链球菌属 (Streptococcus, sp)的特征基因包括： tuf基因（EU156909、 AF274742) sodA基因 (Y12224 EU661272), sly基因（EU043374)、 ef基因 (DQ410864), cps2J基因（DQ410853)、 aroA基因（DQ279120)、 dpr基因（AJ833016)、 gki基因（AJ491513)、 gyrB基因（AF175042)、 IctO基因（EU086699)、 IctP基因（Y07622)、 mrp基因（AM493977、 AM493986)„

通过在线 BLAST对上述基因逐一比对及生物学软件的多重性分析筛选出上述病原菌基因的特征性核酸片段。将所获得的核酸片段在基因芯片设计软件中用统一的参数进行引物和探针的设计，获得了用来制备基因芯片上的探针和引物序列。

表 1. 海水养殖动物常见病原菌特征基因的探针、引物序列信息:

L8 ON QI ss J 乙 8 ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

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01

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II ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

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..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

其中： "a-d"表示针对同一个基因的一至两条序列设计的四套探针信息； "F"表示正向引物序列； "R"表示反向引物序列； "P "表示探针序列；

2、质控系统的基因探针

采用同样的方法，设计并筛选得到质控系统的 9种特征基因，分别为细菌 16S rRNA的保守性片段、牛的特征基因以及拟南芥的特征基因等，其核酸信息如下（基因名后面为 Genbank的序列号）：

( 1 ) 杂交阳性内对照质控 QC2采用的细菌 16S rRNA基因（X76337)。

( 2 ) 杂交阳性外对照质控 QC3 采用的牛的特征基因包括： β-珠蛋白 ΗΒΒ 基因 (DQ277007 , Χ00376 ) , 胸腺素 α 原 ProTa基因（DQ333385 )、 on-珠蛋白 HBAl 基因 (AJ242799)、生长激素 GH基因（AF117346)、抗菌肽因子 HAMP基因（EU863791 )。

(3 )阴性对照质控 QC4采用的拟南芥的特征基因包括：编码 TCP主要蛋白 TCP10的基因（EU550966、NM_128662)、调控花分生组织启动的相关基因 LFY ( AF056550、 EF598403 ) 决定苗端分生组织特征的关键基因 STM (1132344、 EF598777)。表 2. 质控系统特征基因的探针和引物序列信息

LI ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

其中： "a-Γ表示针对同一个特征基因的一条至两条序列设计的多套探针信息； "F"表示正向引物序列； "R"表示反向引物序列； "P"表示探针序列。

二、探针点制到基因芯片上

将 3'端氨基修饰合成的探针溶解成终浓度 10〜100μΜ的溶液后，与 30〜60%的 DMSO (二甲基亚砜）混合稀释制成探针终浓度为 10〜30μΜ的点样样品，采用个人点样仪点制到芯片上。探针点样后并按照醛基基片或氨基基片固定过程的说明书对其进行固定。

三、本发明基因芯片的应用

本发明基因芯片的应用包括如下步骤：

( 1 ) 待检样品 DNA的提取

采用细菌基因组 DNA提取试剂盒或传统方法提取待检样品的基因组 DNA，并稀释成为 1.0 ng^L作为 PCR反应模板。

(2) PCR同歩扩增特征基因及质控系统基因的靶序列

用选定的引物同时对待检样品 DNA进行扩增，每一个 PCR管中分别添加单独的引物对。在 10〜10(^L的扩增反应液里包含待检 DNA溶液 0.5〜2.0 μ 、 0.1〜1.0 μΜ—种或多种病原菌的特征性基因或毒力相关基因的正向引物和 0.1〜1.0 μΜ反向引物、 0.01〜0.5单位的 Taq DNA聚合酶、 0.1〜1.0 mM dNTP、 1.0〜8.0 mM Mg²⁺、 50〜200 mM单价金属盐离子， pH6.5〜 8.5。扩增程序可包括： 90〜98°C 2〜10min—次； 90〜98°C 10〜60s, 50〜65°C 10— 60s, 70— 75 °C 10〜60s， 25〜40个循环； 70〜75 °C 延伸 5〜20 min。所得的 PCR产物用于后续的芯片杂交试验。

( 3 ) PCR产物与芯片杂交

杂交液为 10〜30 L体系： 2〜4 x柠檬酸盐溶液（SSC)、 10%〜50%去离子甲酰胺、 2〜 10 X封闭剂（Denhardts'等）、 0.05 %〜0.5%十二烷基硫酸钠（SDS)、 0.2〜2.0 杂交阳性对照质控 PCR产物、混合 PCR产物液（样品的混合 PCR产物液是将出质控系统外的所有引物扩增产物等份混合而成）。将杂交液混合均匀后，利用 PCR仪或恒温水浴锅 90〜98 °C热变性 2〜10min，冰上骤变 10s以上，加入盖片上每个方阵对应的点样孔内，放入杂交炉或恒温水浴锅中， 37〜55 °C孵育 0.5〜4h。

(4 ) 芯片杂交后的处理

玻片分别在以下两种洗液中， 37〜55 °C，清洗 l〜10min。其中洗液 I成分有 0.2〜0.5 x SSC 和 0.1%〜0.3% SDS，洗液 II成分只是 0.04〜0.1 x SSC。清洗后，将玻片放入 50ml锥形离心管中，以转速 500〜1500r/min，离心 l〜5min甩干。

( 5 ) 芯片的扫描及结果判读

利用扫描仪的绿色通道进行信号的采集，扫描参数一般为 PMT=90-95、 Power=650-800_o 各个探针位点在 532nm处的信号值与周围背景值之比是信噪比 (Signal to Noise Ratio, SNR), 该越大表示阳性信号越强，也可利用荧光显影照相等技术进行信号数据的读取。在检测的病原中，每种病原有一条以上目标基因探针作为检测点，一条以上探针为阳性，则判读为阳性点；每个目标基因的探针有三个重复检测点，两个以上为阳性即判读为阳性点。

本发明的检测对象覆盖了蓝皮书、国际兽疫局 (OIE)水生动物疾病名录、亚太水产养殖中心网络 (NACA)水生动物疾病名录等文献资料中记录的海水养殖鲽形目鱼类、鲈形目鱼类、对虾类和双壳贝类等海洋水产养殖动物的主要病原性原核菌，共计 Ί个属的 20种海水养殖动物病原菌，充分利用了了基因芯片技术高通量的特点。另外本发明中选用了多种与病原菌致病力及致病机制密切相关的特征基因，在实现病原菌准确鉴定的同时也可进行该菌毒力的初步分析，更有助于海水养殖动物疾病的临床诊断及有效的防控。加之全方位的、高灵敏性的质控系统基因设计，避免了以有基因芯片检测中的假阳性和假阴性问题，使芯片更具实用性。附图说明

图 1 : 检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片上探针布局示意图（24 x 24 方阵）。图 2: 利用基因芯片检测鳗弧菌基因组 DNA的结果示意图。

其中：图 1的每个圆圈代表一个探针点，每三个探针点为一组探针，共计 192组探针；其中灰色背景的探针为质控系统的基因探针组；

图 2中显示 24组探针，分别对应 QC1、 QC2-16S rRNA (a), QC3-HBB (a), QC4-TCP10,鳗弧菌的 toxR (a；)、鳗弧菌的 toxR (b)、鳗弧菌的 angM、鳗弧菌的 empA、 QC2-16S rRNA (b)、鳗弧菌的 vahl (a), 鳗弧菌的 vahl (b)、鳗弧菌的 virA、鳗弧菌的 virC；、鳗弧菌的 fatA (a：)、鳗弧菌的 fatA (b)、鳗弧菌的 vac、 QC3-HBB (b), 鳗弧菌的 flaA、鳗弧菌的 tonB2、鳗弧菌的 vah4、溶藻胶弧菌的 toxR 、溶藻胶弧菌的 toxR (b)、溶藻胶弧菌的 tlh(a)、溶藻胶弧菌 tlh(b);灰色背景点表示该探针位点为阳性信号，无背景颜色即为阴性信号。具体实施方式

利用上述中的 20种属病原菌的 134种特征基因及其核酸信息，在统一参数下设计出 170 组较优的正向引物序列、反向引物序列及对应寡核苷酸探针序列，构建可平行检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片；利用上述的 9种质控系统基因及其核酸信息，在统一参数下设计出 19组较优的正向引物序列、反向引物序列及对应的寡核苷酸探针序列，组成多种海水养殖动物病原菌基因芯片的杂交阳性内对照、杂交阳性外对照及杂交阴性对照的质控系统；另外加入 3组荧光标记用的 HEX染料作为表面化学质控，构建出可平行检测 7个属 20种海水养殖动物病原菌的基因芯片，该芯片上探针布局为 24x24的方阵，即 576个探针点，其中每 3个点为一组探针；即含有上述序列表中的 20种海水养殖动物病原菌中 134种特征基因和质控系统 9种基因的 189组探针和 3组表面化学质控位点。该芯片的上 192个探针组的位置示意图见表 3，其中灰色背景的位置为质控系统各基因探针所在处。

表 3.检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片上各组探针的位置表:

'( h ¾ 2* m * 表 1: 3 表 1: 7 表 1: 11 表 1: 15 a 1： 1 表 1： 20 表 1: 24 表 1: 28 表 1: 31 表 1: 36 表 1: 39 表 1: 42

1： i 表 1： 45 表 1: 48 表 1: 51 表 1: 54 表 1: 58 表 1: 62 表 1: 65

：: ：; 表 1： 69 表 1: 72 表 1: 75 表 1: 78 表 1: 82 表 1: 86 表 1: 89 表 1: 92 表 1: 95 表 1: 98 表 1: 101 表 1: 104 表 1: 107 表 1: 110 表 1: 113 表 1: 118 表 1: 123 表 1: 127 表 1: 130 表 1: 135 表 1: 138 表 1: 141 表 1: 144 表 1: 147 表 1: 150 表 1: 153 表 1: 156 表 1: 159 表 1: 162 表 1: 166 表 1: 170 表 1: 173 表 1: 176 表 1: 179 表 1: 182 表 1: 185 表 1: 188 表 1: 191 表 1: 194 表 1: 197 表 1: 200 表 1： 203 表 1: 206 表 1： 209 表 1: 212 表 1: 215 表 1: 218 表 1: 221 表 1： 224 表 1： 227 表 1: 232 表 1: 235 表 1: 238 表 1: 241 表 1： 244 表 1： 247 表 1: 250 表 1: 253 1« I 2： H 1表 1: 256 表 1： 260 表 1： 264 表 1： 269 表 1： 272 1： ¾!¾2* 71 «^E. ->：表 1： 275 表 1： 279 表 1： 282 表 1: 285 表 1: 288 ？, t 一 ΐ ~ I- ;：;：; 表 1: 291 表 1： 294 表 1： 297 表 1: 300 表 1: 303 表 1: 306 表 1: 309 表 1: 312 表 1: 315 表 1: 318 表 1: 322 表 1: 325 表 1: 328 表 1: 332 表 1: 336 表 1： 339 表 1: 342 表 1： 345 表 1: 348 表 1: 351 表 1: 355 表 1： 358 表 1: 361 表 1: 364 表 1： 370 表 1： 373 表 1: 376 表 1： 379 表 1: 383 表 1: 387 表 1： 390 表 1: 393 表 1: 396 表 1： 399 表 1： 402

该表格为基因芯片上探针的阵列示意表，即每一个单元格代表一组探针（三个探针重复点）；除" QC1" 代表 HEX荧光标记染料作为表面化学质控，每一个单元格里的数字对应探针信息表 1或 2的相应数字序号的探针，例如 "表 2: 3"表示该芯片此处点制的是探针信息表 2中序号为 3的 16SrRNA探针； "表 1: 3"表示该芯片此处点制的是探针信息表 1中序列为 3的鳗弧菌 toxR基因的探针。

在设计的过程中，有些基因设计了多组探针，该基因在基因芯片上的位置及选用的、可替换探针的信息情况见表 4:

表 4.同一个基因的多组探针替换情况:

探针组探针编号宿主（类型）：基因替换探针编号位置

表 3: 3 表 2: 24 QC3: HBB 表 2: 25

表 3: 4 表 2: 50 QC4: TCP 10 表 2: 51、 52 表 3: 5 表 1: 3 V.anguillarum： toxR 表 1: 4

表 3: 6 表 1: 7 V.anguillarum ： toxR 表 1: 8

表 3: 7 表 1: 11 V.anguillarum ： angM 表 1: 12

表 3: 8 表 1: 15 V.anguillarum ： empA 表 1: 15、 16、 17 表 3: 9 表 2: 6 QC2: 16SrRNA 表 2: 7、 8、 9 表 3: 10 表 1: 20 V.anguillarum ： vahl 表 1: 21

表 3: 11 表 1: 24 V.anguillarum ： vahl 表 1: 25

表 3: 13 表 1: 31 V.anguillarum ： virC 表 1: 32、 33 表 3: 17 表 2: 28 QC3: HBB 表 2: 29

表 3: 21 表 1: 54 V.alginolyticus： toxR 表 1: 55

表 3: 22 表 1: 58 V.alginolyticus ： toxR 表 1: 59

表 3: 24 表 1: 65 V.alginolyticus ： tlh 表 1: 66

表 3: 29 表 1: 78 V.parahaemolyticus toxR 表 1: 79 表 3: 30 表 1: 82 V.parahaemolyticus： tdh 表 1: 83 表 3: 40 表 1: 113 V.harveyi： vhh- 1 表 1： 114、 115 表 3: 41 表 1: 118 V.harveyi: vhhA 表 1: 119、 120 表 3: 42 表 1: 123 V.harveyi: pap6 表 1: 124 表 3: 44 表 1: 130 V.vulnificus: toxR 表 1: 131、 132 表 3: 54 表 1: 162 Non-Ol V.cholerae： toxR 表 1: 163 表 3: 55 表 1: 166 Non-Ol V.cholerae： stn 表 1: 167 表 3: 75 表 1： 227 V.fischeri： ampC 表 1: 228、 229 表 3: 86 表 1: 256 V.splendidu ： aerV 表 1: 257 表 3: 87 表 1: 260 V.splendidu ： als 表 1: 261 表 3: 88 表 1： 264 V.splendidu ： als 表 1: 265、 266 表 3: 92 表 2: 67 QC4: STM 表 2: 68 表 3: 93 表 2: 71 QC4: STM 表 2: 72 表 3: 95 表 1： 275 V.splendidu ： toxR 表 1: 276 表 3: 100 表 2: 43 QC3: bGH 表 2: 44 表 3: 111 表 1: 318 A. hydrophila: aerA 表 1: 319 表 3: 114 表 1: 328 A. hydrophila: ahal 表 1: 329 表 3: 115 表 1: 332 A. hydrophila: ahpA 表 1: 333 表 3: 121 表 1: 351 A.salmonicida-. vapA 表 1: 352 表 3: 125 表 1: 364 E. tarda-. evpA 表 1: 365、 366、 367 表 3: 129 表 1: 379 E. tarda-. mukF 表 1: 380 表 3: 130 表 1: 383 E. tarda-. ethA 表 1: 384 表 3: 149 表 1: 441 R. salmoninarum： p57 gene 表 1: 442、 443 表 3: 159 表 1： 473 M.marinum: hsp65 表 1： 474 表 3: 167 表 1： 498 S.sp: tuf 表 1： 499、 500 表 3: 168 表 2: 63 QC4: LFY 表 2: 64 表 3: 176 表 2: 36 QC3: HBA1 表 2: 37 表 3: 189 表 2: 58 QC4: LFY 表 2: 59、 60 表 3: 190 表 2: 32 QC3: ProTa 表 2: 33 然后按照以下具体步骤进行芯片的制备、样品的制备、芯片杂交及杂交结果的获取分析: 一、芯片制备：

将 3'端氨基修饰的探针溶解成终浓度 10〜100 μΜ，与 30〜60%的 DMSO (二甲基亚砜）混合、稀释成探针终浓度为 10〜30 μΜ的点样样品，采用个人点样仪进行芯片的点制，芯片上探针阵列布局见表 3。探针点样后并按照醛基基片或氨基基片固定过程的说明书对其进行固定。

二、芯片的应用

实施例 1: 芯片的效果检测

(1)待检样品 DNA的提取- 随机选择 8种海水养殖动物病原菌：鳗弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、费氏弧菌、灿烂弧菌、嗜水气单胞菌、杀鲑气单胞菌、迟缓爱德华氏菌，及小牛胸腺 DNA进行基因芯片的效果检验。

用液体培养基在适宜温度下过夜培养病原菌，采用细菌基因组 DNA提取试剂盒或传统方法提取细菌基因组 DNA，并稀释成为 1.0 ng/ L作为 PCR反应模板。

随机选择 8种病原菌的 14种特征基因、质控系统的 3种基因进行同步的基因芯片检验，这 17种基因对应的引物及探针信息如下：

表 5、 8种海水养殖动物病原菌的 14种基因对应的引物及探针信息

其中： "F'表示正向引物序列； "R"表示反向弓 I物序列； "P"表示探针序列;

表 6. 随机选取质控系统的 3种基因对应的引物及探针信息:

用选定的引物同时对待检模板进行扩增，每一个 PCR管中分别添加单独的引物对。扩增反应液包括模板 1.0 ，正向引物 (10μΜ)和反向引物 (10μΜ)各 1.0 \xL, lO ^x Taq buffer 2.5 \xL, Ex Taq (5 unit/ L) 0.3 μL, 2.5mM dNTP 2.0 μL, 无菌水补齐到 25 μ!^。 PCR扩增程序： 94 °C 4min; 94 °C 30s, 58 °C 30s, 72 °C 40s, 35 个循环； 72°C 延伸 10 min。将 PCR产物测序确定，所得的 PCR产物用于后续的芯片杂交试验。

(2) PCR产物与芯片杂交：

杂交液为 15 μί体系： 20 X柠檬酸盐溶液（SSC) 2.25 L, 去离子甲酰胺 3.75 μί，封闭剂（50xDenhardts' ) 1.5 μί, 10%十二烷基硫酸钠（SDS) 0.3 ，杂交阳性对照质控 PCR 产物 0.2 L，用样品的混合 PCR产物液补齐到 15 L。将杂交液混合均匀后，利用 PCR仪或恒温水浴锅 94°C热变性 4min，冰上骤变 lmin，加入盖片上每个方阵对应的点样孔内，放入杂交炉或恒温水浴锅中， 42°C孵育 2h。

(3) 芯片杂交后的处理：

玻片分别在以下两种洗液中，42 °C，清洗 2min。其中洗液 I成分有 0.3 x SSC和 0.1% SDS，洗液 Π成分只是 0.06 X SSC。清洗后，将玻片放入 50ml锥形离心管中，以转速 1500r/min，离心 3min甩干。

(4) 芯片的扫描及结果判读- 采用博奥生物有限公司的 LuxScan 10K-A扫描仪进行信号采集，扫描参数 PMT=90、 Power=700,扫描前打开绿光通道。如果芯片上有污浊、太脏或探针点不规整、连点等情况时，该芯片杂交结果不可用；然后根据质控体系的表面化学质控对照、阳性内对照、阳性外对照以及阴性对照的信号情况来判断芯片制备、杂交及清洗的质量好坏；根据子阵中每种细菌对应探针点的显色情况，并计算扫描数据的相对信噪比，对被检 DNA模板做出判定。

结果表明：表面化学质控的信号显示良好，说明点样成功； 3 个质控系统探针位点信号显示正常，杂交结果可信；从 8种病原菌基因的 PCR产物与芯片杂交后的信号可以看出，靶基因的 PCR产物与探针有特异性的结合，并且阳性信号的信噪比都大于 0。验证结果分析如下：

a) 试验结果证实利用鳗弧菌的 toxR基因引物（表 5 : 1、 2)、 angM基因引物（表 5 : 4、 5)、 empA基因引物（表 5: 7、 8 )可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（分别对应表 5 : 3、 6、 9)特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出鳗弧菌的基因组 DNA;

b) 试验结果证实溶藻胶弧菌的特征基因 toxR (引物对应表 5: 10、 11 )与副溶血弧菌的特征基因 toxR (引物对应表 5 : 16、 17)非常近源，其 PCR产物及探针（对应表 5 : 12、 18) 间有相互结合反应，但都不与其他几种病原菌的 PCR产物有交叉，因此可以首先将溶藻胶弧菌、副溶血弧菌的基因组 DNA与其他病原基因组 DNA区分开来；

c) 试验结果证实溶藻胶弧菌特征基因 tlh的引物（表 5 : 13、 14)、副溶血弧菌特征基因 tdh的引物（表 5 : 19、 20)扩增出的 PCR产物只与其对应的寡核苷酸探针（分别对应于表 5: 15、 21 )特异性地结合，由此可将溶藻胶弧菌基因组 DNA与副溶血弧菌基因组 DNA区分开； d) 试验结果证实利用费氏弧菌 ampC基因引物（表 5 : 22、 23 )可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（表 5: 24) 特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出费氏弧菌基因组 DNA;

e) 试验结果证实利用灿烂弧菌 als基因引物（表 5 : 25、 26)可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（表 5 : 27) 特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出灿烂弧菌基因组 DNA;

f) 试验结果证实利用嗜水气单胞菌的 aerA基因引物（表 5 : 28、 29)、 ahal基因引物（表 5： 31、 32 )可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（分别对应于表 5 : 30、 33 ) 特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出嗜水气单胞菌基因组 DNA;

g) 试验结果证实利用杀鲑气单胞菌 vapA基因引物（表 5 : 34、 35 ) 可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（表 5 : 36 ) 特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出杀鲑气单胞菌基因组 DNA;

h) 试验结果证实利用迟缓爱德华氏菌 evpA基因引物（表 5 : 37、 38)、 mukF基因引物 (表 5 : 40、 41 )可以扩增出目的产物，且只与其对应的寡核苷酸探针（分别对应于表 5 : 39、

42 ) 特异性地结合，因此该基因芯片可以特异性地检测出迟缓爱德华氏菌基因组 DNA。

上述结果表明该基因芯片可以准确地鉴定出海水养殖动物病原菌的种类，与细菌的 16S rRNA分子测序、 API试剂条及其他一些生化试验鉴定的结果一致，且大大缩短了检测时间；加之随机选择的毒力相关基因的检测，可对该病原菌进行初步的毒力分析，更加有益于海水养殖动物疾病的防治。

实施例 2: 芯片的应用

(1)待检样品 DNA的提取

取山东某养殖场患病大菱鲆的鳃组织，其中一半利用天根生化科技有限公司生产的海洋动物组织基因组 DNA提取试剂盒提取该组织基因组 DNA; 另一半在 2216E海水培养基上进行细菌的培养及单菌落筛选，保留其中一株优势菌，并利用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取该细菌的基因组 DNA，同样用于基因芯片的检测。

(2) PCR同步扩增特征基因及质控系统基因的靶序列：

用表 5中所有引物及表 6中 16S rRNA的引物同时对待检模板进行扩增，每一个 PCR管中分别添加单独的引物对。扩增反应液包括大菱鲆鳃组织基因组 DNA、优势菌基因组 DNA 1.0 μί，正向引物（ΙΟμΜ)和反向引物 (ΙΟμΜ)各 Ι .Ο μΙ^ lO ^x Taq buffer 2.5 Ex Taq (5 υηίΐ/μί) 0.3 2.5mM dNTP 2.0 μί，无菌水补齐到 25 μ!^。 PCR扩增程序： 94 °C 4min_; 94 "C 30s, 58 V 30s, 72 °C 40s, 35 个循环； 72°C 延伸 10 min。将 PCR产物测序，确定没有发生假阳性扩增，所得的 PCR产物用于后续的芯片杂交试验。

(3) PCR产物与芯片杂交：

杂交液为 15 μί体系： 20 X柠檬酸盐溶液（SSC) 2.25 L, 去离子甲酰胺 3.75 μί，封闭剂（50xDenhardts' ) 1.5 μί, 10 %十二烷基硫酸钠（SDS ) 0.3 ，杂交阳性对照质控 PCR 产物 0.2 μί，用样品的混合 PCR产物液补齐到 15 将杂交液混合均匀后，利用 PCR仪或恒温水浴锅 94°C热变性 4min，冰上骤变 lmin，加入盖片上每个方阵对应的点样孔内，放入杂交炉或恒温水浴锅中， 42°C孵育 2h。

(4) 芯片杂交后的处理：玻片分别在以下两种洗液中，42 °C，清洗 2min。其中洗液 I成分有 0.3 x SSC和 0.1% SDS，洗液 Π成分只是 0.06 x SSC。清洗后，将玻片放入 50ml锥形离心管中，以转速 1500r/min，离心 3min甩干。

(5) 芯片的扫描及结果判读- 采用博奥生物有限公司的 LuxScan 10K-A扫描仪进行信号采集，扫描参数 PMT=90、 Power=700, 扫描前打开绿光通道。

结果表明：表面化学质控的信号显示良好，说明点样成功； 3 个质控系统探针位点信号显示正常，杂交结果可信；病原组织基因组 DNA与细菌基因组 DNA的 PCR产物与芯片杂交的结果一致，都是在鳗弧菌的 toxR基因、 angM基因、 empA基因的探针位点处出现杂交阳性信号，表明该致病菌为鳗弧菌，并且基因芯片的检测结果同该细菌的 16S rRNA测序结果一致，证实该患病大菱鲆感染有鳗弧菌。并且，应用本基因芯片，可在 5-6h内鉴定出病原菌的种类，而传统的鉴定方法及测序方法需要至少 24h才能出结果。因此，本发明的基因芯片可以准确、快速的进行海水养殖动物病原菌的鉴定。

工业实用性

本发明根据搜集到的目前海水养殖动物的 7个属 20种病原菌及质控系统基因的生物学信息，分析并设计出可用于构建多种海水养殖动物病原菌基因芯片的特征基因及质控系统基因的引物及其对应寡核苷酸探针序列，该芯片信息量大，可以快速的、高通量地对海水养殖动物常见的疾病进行诊断，起到确定有效的预警作用，可以有力地保障海水养殖业的健康、可持续发展。

Claims

权利要求书

1、一种检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片，其特征在于将鳗弧菌 toxR, angM, empA, vahl , virA, virC, fat A, vac, flaA, tonB2， vah4基因对应的探针；溶藻胶弧菌 toxR, tlh， pyrH, flaA, dnaJ基因对应的探针；副溶血弧菌 toxR, tdh, trhl , trh2, tlh， pR72H， vppC, spa24， lafA基因对应的探针；哈维氏弧菌 toxR, vhh-1 , vhhA, pap6， dam基因对应的探针；创伤弧菌 toxR, whA, wp, vuuA, vlly, gyrB, tolC, rtxE基因对应的探针；非 01型霍乱弧菌 toxR, stn， recA, ctxA, ctxB, ace, zot， tag A, mdh， ompW， hlyA， hlx， flaA, tcpA基因对应的探针；河流弧菌 hupO, vfh, vfpA基因对应的探针；费氏弧菌 toxR, ampC, hemolysin gene, vhh/tlh, gacA, recA, cnfl基因对应的探针；灿烂弧菌 aerV， als， vsm， toxR基因对应的探针；拟态弧菌 toxR, vmc， vmhA, hlyA， mhuA, mhuB, zot基因对应的探针；杀鲑弧菌 luxC， luxD, luxE, luxl, tox 基因对应的探针；嗜水气单胞菌 aerA， alt, ahal , ahpA, ompTS, lip基因对应的探针；温和气单胞菌丝氨酸蛋白酶基因，金属蛋白酶基因对应的探针；杀鲑气单胞菌 vapA, fstA基因对应的探针；迟缓爱德华氏菌 evpA, esaV, esrB, mukF， ethA, ethB , hlyB, katB, gadB, pstS, fur, fimA基因对应的探针；鲇鱼爱德华氏菌 eihA, eihB, eipl8， eipl9， eip20， eip55基因对应的探针；鲑鱼肾杆菌 p57 gene, lily, RRSA01248 gene, ITS, lysB基因对应的探针；海洋分枝杆菌 dnaJ, φθΒ, virulence protein gene, hsp65基因对应的探针； ί叚单胞菌 rpoD， gyrB, mucA, algD, pfhR, algU, aprX基因对应的探针；链球菌 tuf， sodA, sly, ef， cps2J, aroA, dpr, gki， gyrB, IctO, IctP, mrp基因对应的探针点制到同一个芯片上，各探针的序列信息如下：序列

病原菌特征基因表编探针序列 (5'— 3')

口

鳗弧菌 toxR (a) 3 P: aacatagttgtgaatacgcccatcaatcatccagacctaaacaaatggttaccttct

Vibrio anguillarum toxR (b) 7 P: aacatagttgtgaatacgcccatcaatcatccagacctaaacaaatggttaccttct angM 11 P: caatggtagcttactacctatagaggttgaaccgtgtgggagagccatatctactgg empA 15 P: atcagtacggaacagatttcccagggttagtgataaataaagtaggcaacacctgta vahl (a) 20 P: tcaatgtttggatggacaatcactgggtcaattacaaccttgtagttcgagtttagt vahl (b) 24 P: cggcctaatactgattatgaatgtacgtttaataactcacatctttgggatcgaggt virA 28 P: tggggaaatacagatagcaaccaagtaaaatatcactatcagagttacctgtttgga virC 31 P: agactatggttaacttagccgataatttattaaatcaaggtgagacagaagatgcct fatA (a) 36 P: gtgagcttgttactctcgatgtgttagccaaagatggcgatgatattgaagagctag

6Z ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

οε

..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

ην (B)_Vraij ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV gyrB 533 P: tgatcttgaaattatcggtgatactgacttatcaggaacaacagttcactttacgcc

IctO 536 P: cacaaattagccaatgagcaaggggaaatcgcaagtgccaaaggtgttaaagaattt

IctP (a) 539 P: cacaaattagccaatgagcaaggggaaatcgcaagtgccaaaggtgttaaagaattt

IctP (b) 542 P: ggtactttagggacttttattacagggagtgacacctctgctaatgttttgtttggt mrp (a) 545 P: acgaccaagcagttcttaaattctattatttagatcctacctataagggtgaagtag mrp (b) 548 P: actcctaagtcagctcttggcacagagtataatacagatgtggaccgtagaccagcc mrp (c) 551 P: actggtggtaagtatggaagaatctacatttctaaacaagtttggacaactgcgaaa mrp (d) 554 P: ctacaaagatacagaaggtaatgtgattaaagatccagaaacggatgtgtctgatgc

2、如权利要求 1所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片，其特征在于在上述芯片上点制了质控系统的杂交阳性内对照质控 QC2的 16S rRNA基因对应的探针；杂交阳性外对照质控 QC3的 HBB， ProTa, HBA1 , bGH, HAMP 基因对应的探针；杂交阴性对照质控 QC4的 TCP10， LFY, STM基因对应的探针，探针的序列信息如下：

3、如权利要求 1所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片，其特征在于在上述芯片上加入 3组荧光标记用的 HEX染料作为表面化学质控。

4、如权利要求 1所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片，其特征在于鳗弧菌的 toxR基因探针、 angM基因的探针、 empA基因的探针、 vahl基因的探针、 virC基因的探针；溶藻胶弧菌 toxR基因的探针、 tlh基因的探针；副溶血弧菌 toxR基因的探针、 tdh基因的探针；哈维氏弧菌 vhh-1基因的探针、 vhhA 基因的探针、 pap6基因的探针；创伤弧菌 toxR基因的探针；非 01型霍乱弧菌 toxR基因的探针、 stn基因的探针；费氏弧菌 ampC基因的探针；灿烂弧菌 aerV 基因的探针、 als基因的探针、 toxR基因的探针；嗜水气单胞菌 aerA基因的探针、 ahal基因的探针、 ahpA基因的探针；杀鲑气单胞菌 vapA基因的探针；迟缓爱德华氏菌 evpA基因的探针、 mukF基因的探针、 ethA基因的探针；鲑鱼肾杆菌 p57基因的探针；海洋分枝杆菌 hsp65基因的探针；链球菌属 tuf基因的探针，能由下列替补探针代替，探针的序列信息如下：

在序列表

病原菌特征基因替补探针序列 (5 '— 3 ')

中的编号

toxR (a) 4 P： gcaaattgatgttggttgtggctcttttcttacctattctggctctcctattgacta toxR (b) 8 P： gcaaattgatgttggttgtggctcttttcttacctattctggctctcctattgacta angM 12 P: aaatgacaatggtagcttactacctatagaggttgaaccgtgtgggagagccatatc 鳗弧菌 16 PI : gatttcccagggttagtgataaataaagtaggcaacacctgtagcatggtgaatagc empA

Vibrio 17 P2： ttctttattgatgcgaactctggtgacgtattacaaacttgggaagggttaaaccat anguillarum vahl (a) 21 P： tgggtcaattacaaccttgtagttcgagtttagtccagcgttgggaatggatagaaa vahl (b) 25 P： tctcaatgactcttgattatcgtcaatcaggtgctgattacgtgacattagatgctt

32 PI : tgcttttgatagagcgatgaaaacaggttctaaacagttgcagtttaagactatggt virC

33 P2： caatgttgaacttgcttttgatagagcgatgaaaacaggttctaaacagttgcagtt 溶藻胶弧菌 toxR (a) 55 P： caattccgtcagattggtgagtatcaaaatgtaccagtgatgacacctgtaaatcac

Vibrio toxR (b) 59 P： gtatcatgctgcttctcgctattttgatgcctttgtgcgtcattctatttaccaatc alginolyticus tlh (b) 66 Pxaccacagttccaatactcaacacaggaagaaattgaaacgattcgtgcgaaagtat 副溶血弧菌 toxR 79 P： ctgtaaatcacccgcaaatcaacaactggttgccttctattgagcagtgcattgaac Vibrio

tdh 83 P： acgaagatgtttatggtcaatcagtattcacaacgtcaggtactaaatggttgacat parahaemolyticus

114 P 1： caacgatgcttagtgacatggataatgaaaagctcgataaaaacgccactgccaaag vhh-1

115 P2： cgatgcttagtgacatggataatgaaaagctcgataaaaacgccactgccaaagtag 哈维氏弧菌

119 PI : aactacaagcctgctaataccctgtttacccttgagtttggtctaaatgacttcatg Vibrio harveyi vhhA

120 P2:gatgcaacacgtgcaccacagtttacctactcgactcaagaagaaatcaacaagatc pap6 124 P： ggtacaaacttacaatggctatggtaatgtggaactttatgtagcaattgatcgccc 创伤弧菌 131 PI : atcctcgtcagaaattggtagagatgtcgcgcataatgctggcacgtcaacaaagat toxR

Vibrio vulnificus 132 P2： tcaaccaacaacgtgaatgacgcagcttctgaagcattagatcaagaagaattagaa 非 01型霍乱弧 toxR 163 P: tattactgctcactaacccgagccaaaccagctttaaacccctaacggttgtcgatg 菌

Non-01 Vibrio stn 167 P： agaaaacgataccaaaacagtgcagcaaccacaacaaattgaaagcaaggtaaatat cholerae

费氏弧菌 228 PI : tgaacaaacattaaaatcttggatgatgaataacaaagtgtctgacccactactgcg ampC

Vibrio fischeri 229 P2： gtctcaaacactcaacgctttgttatttggtaacactttaaacccacaggatgaaca 灿烂弧菌 aerV (b) 257 P： caaacagagaatacgtttaagtggcctcttgttggcgaaactaagctcaccattaag Vibrio splendidus als (a) 261 P： tattcaatctatcgctaaggtggcagggaaagttgttcctactatggcggttatgta

265 PI : tattcaatctatcgctaaggtggcagggaaagttgttcctactatggcggttatgta als (b)

266 P2： ttgtcgcatgtttaagcgttctgatttcaaatgcagaccaactgttgaatgctatta toxR 276 P: actgaagctgtcgagcccgagtcaattacaaagtttcaagaaaccaaagttgaagtg 嗜水气单胞菌 aerA (a) 319 P: caattttgcgtacaacctggaccctgacagcttcaaacatggtgatgtgacccagtc

Aeromonas ahal 329 P： tcagatcatctactccaacacctacggtggcttcaaaggcaaactgtcctatcaaac hydrophila ahpA 333 P： gtcctgcccaagctgccgttcgagaacagcaacatagacccctccaacagcaacttc 杀鲑气单胞菌

Aeromonas vapA (a) 352 P： taactatcactgaatatgcagatcatgctgccaatggtcgtggtgaaggtactgtat salmonicida

365 PI : aagctgaaagagcgcaaattcgtttcgattgatcgcgacaacttcaacgatgttatc 迟缓爱德华氏菌 evpA 366 P2： atacgttggatcgagtccgctcgccaagagtgcagattacctatgatgttgaaattg

Edwardsiella 367 P3： attgatcgcgacaacttcaacgatgttatcaaaggggtgcatccccatctgtcattc tarda mukF 380 P: gatctggtcgacgtattccgtcatgtcagcaagacatttgaacagacgcacgaaacc ethA (a) 384 P:taacctgacggtgcagaacgtcgccaaccgtaagacggagatcgacaaccacaccta 鲑鱼肾杆菌 442 PI : gttacagtcactaaccccggtggggagacggtaacgtacgagagtttccactacttc

Renibacterium p57 gene (a)

443 P2： ctgtaaaaacaccagcagtagatgccgctggcccggtaaaggttacagtcactaacc salmoninarum

海洋分枝杆菌

Mycobacterium hsp65 474 P： atcgagaaggcagtcgagaaggtcaccgagaccttgctcaagtcggccaaagaggtc marinum

链球菌属 499 PI : ccagtcgaagatgtattctcaatcacaggtcgtggtacagttgcttcaggacgtatc tuf (a)

Streptococcus, sp 500 P2： aaccattacttcttccagtcgaagatgtattctcaatcacaggtcgtggtacagttg o

5、如权利要求 2所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片，其特征在于质控系统的杂交阳性内对照质控 QC2的 16S rRNA基因的探针，杂交阳性外对照质控 QC3的 HBB基因的探针、 ProTa基因的探针、 HBA1基因的探针、 bGH基因的探针，杂交阴性对照质控 QC4的 TCP10基因的探针、 LFY基因的探针、 STM基因的探针，可由下列探针序列代替，替补探针的序列信息如下：

561 PI : gtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttg 阳性内对照质控

16S rRNA (b) 562 P2： cttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgtatacagagggcagcgaatacc

QC2-16S rR A

563 P3： cgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatccttgtttg

HBB (a) 579 P： catggcaagaaggtgctagattcctttagtaatggcatgaagcatctcgatgacctc

HBB (b) 583 P： cctgggcaggtaggtatcccacttacaaggcaggtttaaggagagtgaaatgcacct 杂交阳性外对照质控

ProTa 587 P： ggcagctgaagatgacgaggataacgatgtggataccaagaagcagaagactgataa QC3- Bos taurus

HBA1 (a) 591 P： ctgacttactcccttccgttctcaagacagctgacggactcttacaggatgcaggag bGH 598 P： tatagagcacacaggtcgggggaaagggagagagagaagaagccagggtataaaaat 阴性对照质控 605 PI : tcaacaacaagaacaagaagaaaggagtaatggtggtttcatggtgaatcatcatcc

TCP 10 (a)

QC4- Arabidopsis thaliana 606 P2： tcatcatcagaatcaagcttcttcgatgtttgcttcatcatcacagtatggttctca 613 PI : aatagacctagtgcaagaagtacgaggattaatgtcatgtacaggaattcaaagagt

LFY (a)

614 P2： acttgtatgatattgatttagagctactgtgtcgatagagtatgcagtcatagtctg

LFY (b) 618 P： ggagcttgaagagatgatgaatagtctctctcatatctttcgttgggagcttcttgt

STM (a) 622 P: cagggtgtcttggtgaagatccagggcttgatcaattcatggaagcttactgtgaaa

STM (b) 626 P： gaagaagaggaagaaaggaaagctccctaaagaagctcgtcaacaactgcttgattg

6、权利要求 1所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片的制备，是将人工合成的 3'端氨基修饰的探针溶解成终浓度为 10〜100μΜ的溶液，与 30〜 60%的二甲基亚砜混合制成探针终浓度为 10〜30μΜ 的点样样品后进行芯片的点制，固定。

7、权利要求 1或 2所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片的应用，包括如下的步骤：（1 )待检样品 DNA的提取；（2) PCR同步扩增特征基因及质控系统基因的靶序列：待检 DNA溶液 0.5〜2.0 μ , 在 10〜100μΙ^的扩增反应液里还各含有 0.1〜1.0 μΜ用于样品 PCR扩增的正向引物和反向引物、0.01〜0.5 单位的 Taq DNA聚合酶、 0.1〜： 1.0 mM dNTPs、 1.0〜8.0 mM Mg²⁺、 50〜200 mM 单价金属盐离子， pH6.5〜8.5; 扩增程序包括： 90〜98°C 2〜10mm—次； 90〜 98 °C 10〜60s, 50〜65°C 10〜60s, 70〜75°C 10〜60s， 25〜40个循环； 70〜75 °C 延伸 5〜20 min; (3 )PCR产物与芯片杂交：杂交液为 10〜30 体系：2〜4 x SSC、 10%〜50%去离子甲酰胺、 2〜10 x Denhardts，液， 0.05%〜0.5% SDS、 0.2-2.0 杂交阳性对照质控 PCR产物，用待测样品的混合 PCR产物补齐制成杂交液，将杂交液混合均勾后，利用 PCR仪或恒温水浴锅 90°C -98°C热变性 2-10mm，冰上骤变 10s以上，加入盖片上每个方阵对应的点样孔内，放入杂交炉或恒温水浴锅中， 37-55°C孵育 0.5-4h; (4 ) 芯片杂交后的处理：玻片分别在以下两种洗液中， 37-55 °C，清洗 l-10min; 其中洗液 I成分有 0.2-0.5 x SSC和 0.1%-0.3% SDS , 洗液 Π成分只是 0.04-0.1 X SSC; 清洗后，将玻片放入 50ml锥形离心管中，以转速 500-1500r/mm，离心 l-5min甩干；（5)芯片的扫描及结果判读：用芯片扫描仪进行基因芯片的结果判读或进行荧光显影照相。

8、如权利要求 7 所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片的应用，其特征在于上述的用于样品 PCR扩增的正向引物和反向引 ^ 序列信息如下：在序列表中

病原菌特征基因引物序列 (5'— 3') 的编号

鳗弧菌 1 F: aacgagcctgaagaggaacc toxR (a)

Vibrio anguillarum 2 R: tgcttaggtgccagttctcc toxR (b) 5 F: acccgaagagacaacatccc

..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

8ε

..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

6C

..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV

0

..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV 287 R: caccaaccaacaactcaggag

289 F: gccgcatgtcgctttctac hlyA

290 R: gcatctccactgacttcaacc

292 F: cacgctaacctgggcaatg mhuA

293 R: gtcacgctcacgcatacg

295 F: gctcattgctggttgttcac mhuB

296 R: cgagtgcggattcaggatg

298 F: agaggcggcggagatagg zot

299 R: tgactgaggctcggattgc

301 F: acggttggacagcgatgg luxC

302 R: actggagactaaagcggtagc

304 F: tgagtagcggtgacattaacg luxD

305 R: ccaacgagtcattgtctaaagc 杀鲑弧菌 307 F: agcctgttactgatggtgaac luxE

Vibrio salmonicida 308 R: tcagtgaacttgccatagagag

310 F: tggatgctggcgtttaatacc luxl

311 R: gctcaattgctgtcgatgtaac

313 F: gcacctgtagactctgatgttg toxR

314 R: ctctgatcgctgtattcgctac

316 F: gtggcaaataagcggtctgg aerA (a)

317 R: tggtggcggtatcgtaacg

320 F: acaaggctgacatctcctatcc aerA (b)

321 R: tctgctgtatggtccagttcc

323 F: tatcagcacggcgtcacc alt

324 R: cgaacttgaacagggcatcc

326 F: gttgatggtgagctggttgg ahal

嗜水气单胞菌 327 R: ttgtcgtcgttggtttgatagg Aeromonas hydrophila 330 F: gtggtgaccggcagtagc ahpA

331 R: ttccgtcggcgttgatgg

334 F: ctggctacaaggatgttgatgg ompTS (a)

335 R: tgtcgtcgttggtctgatagg

337 F: ggtgacgcaggtaacttctatg ompTS (b)

338 R: tggatcttgtactcggtgtagg

340 F: atgatagtggcgaccgatacc

H

341 R: tgccttgaacagcccttcc extracellular serine 343 F: gctgatgtccgcctaccc 温和气单胞菌 protease gene 344 R: tcacctgaaccgcttctacc Aeromonas sob a 346 F: tggtggtggctgacaagag metalloprotease gene

347 R: gcgtggttgaggttgatgg 杀鲑气单胞菌 349 F: gccaacctcatccacattcg vapA (a)

Aeromonas salmonicida 350 R: cgtcagcagcaacatcagc vapA (b) 353 F: cgcttcttacactgctgatcc 354 R: tccaaccgaggctaacacc

356 F: accagaccaagcagtatgagg fstA (a)

357 R: aggagccgagccagtagg

359 F: gggattgagtgggatctgtttg fstA (b)

360 R: aggagccgagccagtagg

362 F: agtgaaagcaagcagcatacg evpA

363 R: tctcggtgcggaatgacag

368 F: gccagcgagacgagatagg esaV (a)

369 R: gagcgaccacgacgagag

371 F: cggacaggatggcgtagg esaV (b)

372 R: tgctgatgatggcggtctac

374 F: gcggtgacgacaacgatac esrB

375 R: atggcatccgtaatctcttgg

377 F: ttgctggctatcgctaccc mukF

378 R: cgctgacggatatagtaatcgg

381 F: ggaggtgctgctggatgg ethA (a)

382 R: cctggctatgattgttgtctcg

385 F: atggcggcggactatgtg ethA (b)

386 R: cggcggtgttgatgatgc

388 F: cggtgagcgagacaacaatc ethA (c)

389 R: gctgccgttgacctgaatatc 迟缓爱德华氏菌 391 F: gccgacgatgtctatctgttc ethB (a)

Edwardsiella tarda 392 R: tacgccactctgccatcc

394 F: ccgccctgtatctggagaag ethB (b)

395 R: atgtaggcacggctgtagc

397 F: ggcaccgaggcattaccc hlyB

398 R: cgcagatccagcacattcc

400 F: ccgctatcctatcgcaatatgg katB

401 R: cagaccttcgtggcatcaag

403 F: tcccgctttggttcagagg gadB

404 R: cgaacttatgccagcagacc

406 F: gtcaacgcacagtggaagag pstS

407 R: cggcagggtcgcatagtc

409 F: cccgtctcaagattctggaag fur

410 R: atcgtggtggtgctgttg

412 F: cttgtcaggtgagtggtgattc

413 R: atggtgaacgggctggtc

415 F: tgtgagtggtcaggcaagc

416 R: gtgttggcgtaagagcgatag 鲇鱼爱德华氏菌 418 F: gactattacggcgacggataag eihA

Edwardsiella ictaluri 419 R: tcctggctgctgcgattc eihB (a) 421 F: gtcggcggttcggtgatc 422 R: atgtaggcacggctgtagc

424 F: gccgacgatgtctatctgttc

425 R: tacgccactctgccatcc

427 F: ttactgcccgccttaccg p 18

428 R: ctggaagtggagatttgtaccc

430 F: atccagaacggcatcaaatacc eipl9

431 R: ggaacagaacggacatcagatc

433 F: tgtgccgctattcgctcag eip20

434 R: gtccgctcgccaagagtg

436 F: cctggcgttggcattagc eip55

437 R: ggaatgttcggactggatagc

439 F: ggatggcagcaacctattcg p57 gene (a)

440 R: cattcaccttcaccacagtacc

444 F: ccgcaggaggaccagttg p57 gene (b)

445 R: atccaccttcaccacagtacc

447 F: tgaccaccgacgacattacc hly

鲑鱼肾杆菌 448 R: tgccgactgccttgatgg

Renihacterium salmoninarum 450 F: ctaacgcagacggattctatgg

RRSA01248 gene

451 R: cttgaccttggactggaacttc

453 F: gctggttctgttctcggattg

ITS

454 R: tcaaacaacaacacccactcc

456 F: ccagaaccagtccgagcag lysB

457 R: caggtccacgccgttagc

459 F: ggagaccgagaccgaactg dnaJ

460 R: ggcaccgaaagcgttgag

462 F: cggtgggtgagctgatcc rpoB (a)

463 R: agagcgggttgttctggtc 海洋分枝杆菌 465 F: caagaagctcggcctgaac rpoB (b)

Mycobacterium marinum 466 R: cgtcctgggtggtcatcc

468 F: tttcgggacgggacttactac virulence protein gene

469 R: gcgaatgcgagagtcttgc

471 F: aaggaagttgccaagaagacc hsp65

472 R: tgcccaccttgtccatcg 假单胞菌属 475 F: gctggcaacggatgatgtc rpoD

Pseudomonas. sp 476 R: cgaagacgaagaagcggaag

478 F: agtgggcgacagtgaatcc gyrB

479 R: ggcgaggttgttcttcttgg

481 F: ggataacgaagcggatgaactc mucA

482 R: taccactgacggcggattg

484 F: cctactcaaccgttcgtctg algD

485 R: ccgttaaatgcctgccaatg pfhR 487 F: gccaagaccgaccagacc

ft ..9S.0/0T0ZN3/X3d 雕 Ϊ0Ζ OAV 553 R: ttggctcgtctggctctg

555 F: ttggaaacgatggctaataccg

16S rR A (a)

556 R: cgctacacctgaaattctaccc

558 F: gtcgtcagctcgtgttgtg

16S rR A (b)

559 R: ttgcgattactagcgattccg

564 F: ggcagcacagaggaacttg

16S rR A (c)

565 R: agcccttacctcaccaactag 阳性内对照质控 QC2-16S rRNA

567 F: tgagtaatgcctgggaaattgc

16S rR A (d)

568 R: ggtgcttcttctgtaggtaacg

570 F: gcaagcgttaatcggaattac

16S rR A (e)

571 R: tgagtgtcagtatctgtccag

573 F: cgcaacccttatccttgtttg

16S rR A (f)

574 R: cgtattcaccgcaacattctg

576 F: accatgctgactgctgagg

HBB (a)

577 R: cacaccattcaccaccttctg

580 F: ctatcatcgttcaagcctcacc

HBB (b)

581 R: cagcatcagcagtggacaag

584 F: aacgaggtagacgaagaagagg

ProTa

585 R: gggaagtggagggtgaatagg

588 F: tcaatcgcccgttcattcac 杂交阳性外对照质控 taurus HBA1 (a)

589 R: gttcttgcttccaccgtctg

592 F: ccgtgctgacctccaaatac

HBA1 (b)

593 R: cctccaccctctcactcttag

595 F: gggaacaggatgagtgagagg bGH

596 R: gcgaatggaggggattttagc

599 F: ccagacagacggcacaatg

HAMP

600 R: ctttacgacagcagccacag

9、如权利要求 8所述的检测多种海水养殖动物病原菌的基因芯片的应用，其特征在于上述的正向引物的 5'端进行 HEX标记。