JP2001046063A - ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー - Google Patents
ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマーInfo
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１〜１９から選ばれる塩基配列
又は該塩基配列に相補的な配列を有するユーバクテリウ
ム属細菌用及びフソバクテリウム・バリウムグループ細
菌用プライマー又はプローブ、並びにこのプライマーを
使用するユーバクテリウム属細菌菌種及びフソバクテリ
ウム・バリウムグループの同定・検出法。 【効果】 菌の培養が不要で、迅速、簡便にユーバクテ
リウム属細菌菌種等の同定・検出を行うことができる。
又は該塩基配列に相補的な配列を有するユーバクテリウ
ム属細菌用及びフソバクテリウム・バリウムグループ細
菌用プライマー又はプローブ、並びにこのプライマーを
使用するユーバクテリウム属細菌菌種及びフソバクテリ
ウム・バリウムグループの同定・検出法。 【効果】 菌の培養が不要で、迅速、簡便にユーバクテ
リウム属細菌菌種等の同定・検出を行うことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトや動物の腸
内、口腔内に生息するユーバクテリウム（Eubacteriu
m）属細菌菌種及びフソバクテリウム・バリウム（Fusob
acterium varium）グループの同定に有用なＤＮＡプラ
イマー及びこれを用いるユーバクテリウム属細菌菌種及
びフソバクテリウム・バリウムの同定・検出方法に関す
るものである。
内、口腔内に生息するユーバクテリウム（Eubacteriu
m）属細菌菌種及びフソバクテリウム・バリウム（Fusob
acterium varium）グループの同定に有用なＤＮＡプラ
イマー及びこれを用いるユーバクテリウム属細菌菌種及
びフソバクテリウム・バリウムの同定・検出方法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトや動物の腸管内には様々な細菌群が
常在し複雑な腸内菌叢を形成している。これらは宿主が
健康でありさえすれば、安定した状態であることが知ら
れている。その腸内菌叢を形成する最優勢菌群の１つと
してユーバクテリウム属細菌が挙げられる。
常在し複雑な腸内菌叢を形成している。これらは宿主が
健康でありさえすれば、安定した状態であることが知ら
れている。その腸内菌叢を形成する最優勢菌群の１つと
してユーバクテリウム属細菌が挙げられる。
【０００３】ユーバクテリウム属細菌は土壌や泥から分
離されることも多いが、主にヒトや動物の腸管や臨床材
料から分離される。また、ユーバクテリウム属細菌の動
向は腸内の有用細菌であるビフィドバクテリウム属細菌
と類似していることもわかっている。
離されることも多いが、主にヒトや動物の腸管や臨床材
料から分離される。また、ユーバクテリウム属細菌の動
向は腸内の有用細菌であるビフィドバクテリウム属細菌
と類似していることもわかっている。
【０００４】一方、フソバクテリウム属細菌は、グラム
陰性嫌気性桿菌であり、非運動性で、口腔に常在する
が、腸管に見出されることがある。
陰性嫌気性桿菌であり、非運動性で、口腔に常在する
が、腸管に見出されることがある。
【０００５】これらのことから、ヒトや動物の腸管内に
おけるユーバクテリウム属細菌やフソバクテリウム属細
菌の動向は、生体の健康状態に密接に係わっているもの
と考えられている。このため、これらの菌に関するさら
なる研究を行い、生理作用等の知見を蓄積することが要
望されている。また、糞便等からユーバクテリウム属細
菌等を迅速且つ正確に検出し、その動向から個体の健康
状態を把握することも可能であると考えられている。
おけるユーバクテリウム属細菌やフソバクテリウム属細
菌の動向は、生体の健康状態に密接に係わっているもの
と考えられている。このため、これらの菌に関するさら
なる研究を行い、生理作用等の知見を蓄積することが要
望されている。また、糞便等からユーバクテリウム属細
菌等を迅速且つ正確に検出し、その動向から個体の健康
状態を把握することも可能であると考えられている。
【０００６】しかしながら、現状においてユーバクテリ
ウム属細菌やフソバクテリウム属細菌は、菌の形態や発
酵性状等により分類されているのみであり、生理活性等
未知の部分の多い細菌である。また、その検出同定は、
主にコロニー形状や顕微鏡観察、糖分解性状を検査する
ことにより行われており、このような表現形質を元にし
た同定方法は、操作が煩雑であり、試験者の熟練を要す
るものであった。
ウム属細菌やフソバクテリウム属細菌は、菌の形態や発
酵性状等により分類されているのみであり、生理活性等
未知の部分の多い細菌である。また、その検出同定は、
主にコロニー形状や顕微鏡観察、糖分解性状を検査する
ことにより行われており、このような表現形質を元にし
た同定方法は、操作が煩雑であり、試験者の熟練を要す
るものであった。
【０００７】また、近年では、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジ
ーによる判定も行われるようになっている。（Collins,
M.D.,et al(1989)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATI
C BACTERIOLOGY 39,105-108）。しかしながら、この同
定法も長時間を必要とし、迅速な菌種同定を行うには好
ましいものではなかった。
ーによる判定も行われるようになっている。（Collins,
M.D.,et al(1989)INTERNATIONAL JOURNAL of SYSTEMATI
C BACTERIOLOGY 39,105-108）。しかしながら、この同
定法も長時間を必要とし、迅速な菌種同定を行うには好
ましいものではなかった。
【０００８】この様な状況において、より迅速、簡便な
同定方法の試みとして、ある種の菌に特異的なプライマ
ーを用い、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ
反応により、菌の検出同定を行う方法が見出された（特
開平１１−１２３０９３号公報）。
同定方法の試みとして、ある種の菌に特異的なプライマ
ーを用い、検体から抽出した細菌由来のＤＮＡのＰＣＲ
反応により、菌の検出同定を行う方法が見出された（特
開平１１−１２３０９３号公報）。
【０００９】しかしながら、ユーバクテリウム属細菌及
びフソバクテリウム属細菌の同定等に使用するプライマ
ーを見出すには、遺伝子のシークエンシング、アライメ
ント等かなりの手間がかかる作業が必要であり、かつ、
このようにして設計された配列でプライマーを合成して
も他の菌と反応してしまい、上記細菌のみに特異的なプ
ライマーを合成することは困難であった。
びフソバクテリウム属細菌の同定等に使用するプライマ
ーを見出すには、遺伝子のシークエンシング、アライメ
ント等かなりの手間がかかる作業が必要であり、かつ、
このようにして設計された配列でプライマーを合成して
も他の菌と反応してしまい、上記細菌のみに特異的なプ
ライマーを合成することは困難であった。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ヒト腸内や口腔内にて検出されるユーバクテリウム
属細菌やフソバクテリウム属細菌の菌種グループを特異
的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを
用いて該菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供す
ることにある。
は、ヒト腸内や口腔内にて検出されるユーバクテリウム
属細菌やフソバクテリウム属細菌の菌種グループを特異
的に同定できるプライマーを合成し、このプライマーを
用いて該菌を迅速、簡便に同定・解析する方法を提供す
ることにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】斯かる実状に鑑み本発明
者は、多大な労力を投入し該遺伝子のシークエンシン
グ、アライメント等々煩雑な作業を行った結果、ユーバ
クテリウム属細菌の菌種及びフソバクテリウム・バリウ
ムグループに特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマ
ーを見出し、これを用いれば、細菌の糖分解性状の確認
など煩雑な操作を行うことなく、検体から抽出した細菌
由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に菌の
検出同定が可能となることを見出し本発明を完成した。
者は、多大な労力を投入し該遺伝子のシークエンシン
グ、アライメント等々煩雑な作業を行った結果、ユーバ
クテリウム属細菌の菌種及びフソバクテリウム・バリウ
ムグループに特異的な塩基配列を有するＤＮＡプライマ
ーを見出し、これを用いれば、細菌の糖分解性状の確認
など煩雑な操作を行うことなく、検体から抽出した細菌
由来のＤＮＡのＰＣＲ反応により、迅速かつ簡便に菌の
検出同定が可能となることを見出し本発明を完成した。
【００１２】すなわち、本発明は配列番号１〜９及び１
１〜１９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的
な配列を有するユーバクテリウム属細菌用プライマー又
はプローブ、並びに配列番号１０の塩基配列又は該塩基
配列に相補的な配列を有するフソバクテリウム・バリウ
ムグループ細菌用プライマー又はプローブを提供するも
のである。また、本発明は、配列番号１又は２と１１又
は１２、３と１３、４と１４、５と１５、６と１６、７
と１７、８と１８及び９と１９から選ばれる塩基配列の
組合せ又はこれらの塩基配列の組合せに相補的な配列の
組合せを有するユーバクテリウム属細菌菌種検出用プラ
イマーを提供するものである。
１〜１９から選ばれる塩基配列又は該塩基配列に相補的
な配列を有するユーバクテリウム属細菌用プライマー又
はプローブ、並びに配列番号１０の塩基配列又は該塩基
配列に相補的な配列を有するフソバクテリウム・バリウ
ムグループ細菌用プライマー又はプローブを提供するも
のである。また、本発明は、配列番号１又は２と１１又
は１２、３と１３、４と１４、５と１５、６と１６、７
と１７、８と１８及び９と１９から選ばれる塩基配列の
組合せ又はこれらの塩基配列の組合せに相補的な配列の
組合せを有するユーバクテリウム属細菌菌種検出用プラ
イマーを提供するものである。
【００１３】更に、本発明は、上記プライマーの１又は
２以上を使用することを特徴とするユーバクテリウム属
細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグループ細菌
の同定方法を提供するものである。
２以上を使用することを特徴とするユーバクテリウム属
細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグループ細菌
の同定方法を提供するものである。
【００１４】更にまた、本発明は、（１）検体中のＤＮ
Ａを抽出する工程及び（２）上記プライマーの１又は２
以上を用いてＰＣＲ反応を行を工程を含むユーバクテリ
ウム属細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグルー
プ細菌の検出方法を提供するものである。
Ａを抽出する工程及び（２）上記プライマーの１又は２
以上を用いてＰＣＲ反応を行を工程を含むユーバクテリ
ウム属細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグルー
プ細菌の検出方法を提供するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のユーバクテリウム属細菌
用プライマーとは、具体的にはユーバクテリウム・レン
タム（Eubacterium lentum）、ユーバクテリウム・リモ
ーザム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・
レクターレ（Eubacterium rectale）、ユーバクテリウ
ム・シリンドロイデス（Eubacterium cylindroides）、
ユーバクテリウム・トートーサム（Eubacterium tortuo
sum）、ユーバクテリウム・ドリカム（Eubacterium dol
ichum）、ユーバクテリウム・ビフォルメ（Eubacterium
biforme）、ユーバクテリウム・エリジェンス（Eubacte
rium eligens）に菌種特異的プライマーである。
用プライマーとは、具体的にはユーバクテリウム・レン
タム（Eubacterium lentum）、ユーバクテリウム・リモ
ーザム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・
レクターレ（Eubacterium rectale）、ユーバクテリウ
ム・シリンドロイデス（Eubacterium cylindroides）、
ユーバクテリウム・トートーサム（Eubacterium tortuo
sum）、ユーバクテリウム・ドリカム（Eubacterium dol
ichum）、ユーバクテリウム・ビフォルメ（Eubacterium
biforme）、ユーバクテリウム・エリジェンス（Eubacte
rium eligens）に菌種特異的プライマーである。
【００１６】上記のユーバクテリウム属細菌及びフソバ
クテリウム・バリウムグループに特異的なプライマーを
作成するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指
標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同
定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、Ｒ
ＮＡでなくＤＮＡを用いた。
クテリウム・バリウムグループに特異的なプライマーを
作成するにあたり、そのターゲットには、系統分類の指
標として信頼性の高い１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用い、同
定・解析には、ＰＣＲ法等の手段が必要となるため、Ｒ
ＮＡでなくＤＮＡを用いた。
【００１７】プライマーは、本発明者がシークエンスを
行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎ
ｂａｎｋ等）とを比較・検討することにより得たもので
ある。ここで本発明者が比較対象として新たに１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的に
は、ユーバクテリウム・レンタムＪＣＭ９９７９株であ
る。この配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録し
ている。
行って得た塩基配列とデータベース（ＤＤＢＪ、Ｇｅｎ
ｂａｎｋ等）とを比較・検討することにより得たもので
ある。ここで本発明者が比較対象として新たに１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子のシークエンスを行った菌種は、具体的に
は、ユーバクテリウム・レンタムＪＣＭ９９７９株であ
る。この配列は、遺伝研データベースＤＤＢＪに登録し
ている。
【００１８】プライマーの設計の際には、同定の対象と
なる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。すな
わち、ユーバクテリウム属細菌の菌種、及びフソバクテ
リウム・バリウムグループそれぞれに対しバリエーショ
ンのある領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設
計した。
なる菌とその近縁の菌を配列をアライメントした。すな
わち、ユーバクテリウム属細菌の菌種、及びフソバクテ
リウム・バリウムグループそれぞれに対しバリエーショ
ンのある領域をターゲットとしてＰＣＲプライマーを設
計した。
【００１９】また、オリゴヌクレオチドの長さはプライ
マーによって異なっており、２０〜２２ｂ．ｐとなって
いる。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に
際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該
オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配
列を増減させたものを用いても良い。
マーによって異なっており、２０〜２２ｂ．ｐとなって
いる。これらは操作上最も好適な長さであるが、使用に
際しては、各々の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子中において、該
オリゴヌクレオチドに隣接する数〜十数ｂ．ｐの塩基配
列を増減させたものを用いても良い。
【００２０】このようにして得られたプライマーのう
ち、配列番号１、２、１１及び１２記載の塩基配列を有
するものは、ユーバクテリウム・レンタムに特異的なＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行
うためのプライマーやプローブとして使用することがで
きる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライ
マー等と組合せて用いることも可能であるが、その組合
せによっては種特異的な検出を行えないものもあるの
で、配列番号１又は２と１１又は１２の組合せを用いる
ことが望ましい。
ち、配列番号１、２、１１及び１２記載の塩基配列を有
するものは、ユーバクテリウム・レンタムに特異的なＤ
ＮＡオリゴヌクレオチドであり、菌種の同定、解析を行
うためのプライマーやプローブとして使用することがで
きる。プライマーとしては、公知のユニバーサルプライ
マー等と組合せて用いることも可能であるが、その組合
せによっては種特異的な検出を行えないものもあるの
で、配列番号１又は２と１１又は１２の組合せを用いる
ことが望ましい。
【００２１】また、配列番号３及び１３記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・リモーザムに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・リモーザムに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２２】また、配列番号４及び１４記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・レクターレに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・レクターレに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２３】また、配列番号５及び１５記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・シリンドロイデス
に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プラ
イマーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・シリンドロイデス
に特異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プラ
イマーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２４】また、配列番号６及び１６記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・トートーサムに特
異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマ
ーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・トートーサムに特
異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマ
ーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２５】また、配列番号７及び１７記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・ドリカムに特異的
なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーと
しては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・ドリカムに特異的
なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマーと
しては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２６】また、配列番号８及び１８記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・ビフォルメに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・ビフォルメに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマー
としては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２７】また、配列番号９及び１９記載の塩基配列
を有するものは、ユーバクテリウム・エリジェンスに特
異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマ
ーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
を有するものは、ユーバクテリウム・エリジェンスに特
異的なオリゴヌクレオチドである。このため、プライマ
ーとしては両者を組合せて用いることが好ましい。
【００２８】更に、配列番号１０記載の塩基配列を有す
るものは、フソバクテリウム・バリウムグループに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このプライマーは公知
のユニバーサルプライマー等と組合せて用いることで特
異的な検出を行うことができる。
るものは、フソバクテリウム・バリウムグループに特異
的なオリゴヌクレオチドである。このプライマーは公知
のユニバーサルプライマー等と組合せて用いることで特
異的な検出を行うことができる。
【００２９】上記のように設計したオリゴヌクレオチド
プライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機によ
り、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例
に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形
成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌
種の特異性に問題はなかった。
プライマーは、その塩基配列に従い、ＤＮＡ合成機によ
り、人工的に合成される。その特異性は、以下の実施例
に示す近縁種のＤＮＡに対する、プライマーのバンド形
成能を指標として確認した。結果として、上記全ての菌
種の特異性に問題はなかった。
【００３０】一方で、今回新たにシークエンスを行った
ことにより、配列番号１〜１９に示す配列以外にも種特
異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの
配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種
に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しな
い場合も多く、使用上好ましいものではなかった。この
ようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定に
よって種特異的な反応性は達成されるものと考えられる
が、現状ではそのような条件は見出されていない。
ことにより、配列番号１〜１９に示す配列以外にも種特
異的な配列が見出されている。しかしながら、これらの
配列や他の公知のプライマーで同定を行っても、別の種
に属する株と反応したり、目的とする種の株と反応しな
い場合も多く、使用上好ましいものではなかった。この
ようなプライマーを用いてもＰＣＲ反応時の条件設定に
よって種特異的な反応性は達成されるものと考えられる
が、現状ではそのような条件は見出されていない。
【００３１】またこのとき、ＰＣＲ反応の条件について
も検討を行った。すなわち、アニーリング温度を種々変
化させ、サイクル数も２５及び３０サイクルの２種類で
検討した。その結果、ユーバクテリウム・ドリカムでは
６０℃、２５サイクルが、他のものでは６３℃、２５サ
イクルが最も好適な条件であった。本発明のプライマー
は、このようにユーバクテリウム属細菌菌種及びフソバ
クテリウム・バリウムグループへの特異性を有するた
め、これらを用いて腸内細菌、口腔細菌、組織切片等の
菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地（例えば
ユーバクテリウム属細菌であれば、ＥＧ培地（栄研社
製）等）に形成されたコロニーから直接、あるいは培養
した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性
を調べることによって菌の簡易同定を行うことができ
る。
も検討を行った。すなわち、アニーリング温度を種々変
化させ、サイクル数も２５及び３０サイクルの２種類で
検討した。その結果、ユーバクテリウム・ドリカムでは
６０℃、２５サイクルが、他のものでは６３℃、２５サ
イクルが最も好適な条件であった。本発明のプライマー
は、このようにユーバクテリウム属細菌菌種及びフソバ
クテリウム・バリウムグループへの特異性を有するた
め、これらを用いて腸内細菌、口腔細菌、組織切片等の
菌を迅速に同定できる。また、各菌の選択培地（例えば
ユーバクテリウム属細菌であれば、ＥＧ培地（栄研社
製）等）に形成されたコロニーから直接、あるいは培養
した菌体からＤＮＡを抽出し、各プライマーとの反応性
を調べることによって菌の簡易同定を行うことができ
る。
【００３２】また、本発明のプライマーを用いれば、培
養を行うことなく糞便や組織切片等からの菌の同定を行
うことが可能である。例えば、まず、サンプル１mLを遠
心分離して得られるペレットからＤＮＡを抽出し、これ
を鋳型ＤＮＡとする。ＤＮＡを抽出する方法としては、
定法であるＭａｒａｕｒ法、その変法である酵素法、及
び簡便法である塩化ベンジル法が好ましい。これらの方
法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌
種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、純粋培養し
た細菌等から抽出したＤＮＡに対しては、前述の方法の
他、フェノール法等も好適に使用しうる。この鋳型ＤＮ
Ａに本発明のプライマーを組合せ、増幅反応を行うこと
により、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得る
ことができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳
動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を同
定することができる。
養を行うことなく糞便や組織切片等からの菌の同定を行
うことが可能である。例えば、まず、サンプル１mLを遠
心分離して得られるペレットからＤＮＡを抽出し、これ
を鋳型ＤＮＡとする。ＤＮＡを抽出する方法としては、
定法であるＭａｒａｕｒ法、その変法である酵素法、及
び簡便法である塩化ベンジル法が好ましい。これらの方
法は多少煩雑になるものの、酵素法において、幅広い菌
種から収率よくＤＮＡを抽出できる。また、純粋培養し
た細菌等から抽出したＤＮＡに対しては、前述の方法の
他、フェノール法等も好適に使用しうる。この鋳型ＤＮ
Ａに本発明のプライマーを組合せ、増幅反応を行うこと
により、菌に特異的なＤＮＡ配列（ＰＣＲ産物）を得る
ことができる。このようにして得られたＤＮＡを電気泳
動すれば、バンドの有無と用いたプライマーから菌を同
定することができる。
【００３３】このように、コロニーや病変サンプル等か
ら抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用
いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下で
あった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出
することが可能であった。また、ＰＣＲを行う際に、鋳
型のＤＮＡ量を段階希釈し同様の解析を行い、一方で従
来の方法により菌の同定、定量を行い、両者を比較すれ
ば、目的とする菌の定量化も可能である。
ら抽出したＤＮＡを鋳型とし、本発明のプライマーを用
いて菌の同定を行うと、従来の方法では検出限界以下で
あった菌株や種の判別が困難であった菌株も簡便に検出
することが可能であった。また、ＰＣＲを行う際に、鋳
型のＤＮＡ量を段階希釈し同様の解析を行い、一方で従
来の方法により菌の同定、定量を行い、両者を比較すれ
ば、目的とする菌の定量化も可能である。
【００３４】また、本発明のプライマーは、単独でもプ
ローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバー
サルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組合せても用
いることができる。
ローブとして使用できる。これらは他の公知のユニバー
サルプライマーやオリゴヌクレオチド等と組合せても用
いることができる。
【００３５】また、本発明のプライマーを用いれば、ヒ
ト、動物等の腸内細菌叢等の解析を行える。すなわち、
上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他
の多岐にわたる細菌のプライマーと組合せて用いれば、
細菌叢の全体像を把握することも可能である。
ト、動物等の腸内細菌叢等の解析を行える。すなわち、
上記ビフィドバクテリウム属細菌用プライマーやその他
の多岐にわたる細菌のプライマーと組合せて用いれば、
細菌叢の全体像を把握することも可能である。
【００３６】
【発明の効果】本発明のプライマーを使用すれば、菌を
培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に
ユーバクテリウム属細菌及びフソバクテリウムの同定を
行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー
等と組合せて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも
行うことができる。更に、同定、解析の結果から病変部
位の菌や消化管等の状態を把握できるため、種々の疾病
等の予防・治療が容易になる。
培養することなく、迅速、簡便、低コスト且つ高精度に
ユーバクテリウム属細菌及びフソバクテリウムの同定を
行うことができる。また、他の菌に特異的なプライマー
等と組合せて使用することで、腸内細菌叢の解析等をも
行うことができる。更に、同定、解析の結果から病変部
位の菌や消化管等の状態を把握できるため、種々の疾病
等の予防・治療が容易になる。
【００３７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３８】実施例１ プライマーの設計及び合成 （１）ユーバクテリウム属細菌菌種特異的プライマー 系統学的に近隣の位置にあるユーバクテリウム属の各菌
種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者らが解読し
た上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を元に、ユーバクテ
リウム属細菌菌種特異的なプライマーの設計を行った。
その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部
分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプ
ライマーとして８菌種各９組が設計された（表１）。こ
うして設計した塩基配列に従い、プライマーはＰｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｏｌｉｇｏ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓTMに発注し合成した。
種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列と、本発明者らが解読し
た上記の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を元に、ユーバクテ
リウム属細菌菌種特異的なプライマーの設計を行った。
その際、塩基数２０程度、ＧＣ含量が約５０％となる部
分を探索した。その結果、フォワード及びリバースのプ
ライマーとして８菌種各９組が設計された（表１）。こ
うして設計した塩基配列に従い、プライマーはＰｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｏｌｉｇｏ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓTMに発注し合成した。
【００３９】
【表１】
【００４０】（２）フソバクテリウム・バリウムグルー
プ特異的プライマー 系統学的に近隣の位置にあるフソバクテリウム属の各菌
種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
配列を元に、フソバクテリウム・バリウムグループに特
異的なプライマーの設計を行った。その際、塩基数２０
程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その
結果、１種のプライマーが設計された（表２）。こうし
て設計した塩基配列に従い、プライマーはＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ Ｏｌｉｇｏ ＥｘｐｒｅｓｓTM
に発注し合成した。
プ特異的プライマー 系統学的に近隣の位置にあるフソバクテリウム属の各菌
種の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子
配列を元に、フソバクテリウム・バリウムグループに特
異的なプライマーの設計を行った。その際、塩基数２０
程度、ＧＣ含量が約５０％となる部分を探索した。その
結果、１種のプライマーが設計された（表２）。こうし
て設計した塩基配列に従い、プライマーはＰｈａｒｍａ
ｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ Ｏｌｉｇｏ ＥｘｐｒｅｓｓTM
に発注し合成した。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例２ ユーバクテリウム属細菌菌種特
異的プライマーの特異性の確認 本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを
確認するため、近縁の細菌の（基準株及び分離株）とプ
ライマーとの反応性を検討した。 （１）菌株の純粋培養及びコロニーの単離 表３に示す、１９菌種１９株のユーバクテリウム属細菌
をＥＧ培地（栄研社製）にて嫌気的に二晩純粋培養し
た。こうして得た菌体１９種類各々のコロニーをかきと
り、０．５mLのエッペンドルフチューブを用いて、滅菌
水に懸濁した。これを１００℃で５分間ボイルし、熱変
性させた後に本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を
行った。
異的プライマーの特異性の確認 本発明のプライマーが、実際に特異性を有しているかを
確認するため、近縁の細菌の（基準株及び分離株）とプ
ライマーとの反応性を検討した。 （１）菌株の純粋培養及びコロニーの単離 表３に示す、１９菌種１９株のユーバクテリウム属細菌
をＥＧ培地（栄研社製）にて嫌気的に二晩純粋培養し
た。こうして得た菌体１９種類各々のコロニーをかきと
り、０．５mLのエッペンドルフチューブを用いて、滅菌
水に懸濁した。これを１００℃で５分間ボイルし、熱変
性させた後に本発明のプライマーを用いてＰＣＲ反応を
行った。
【００４３】（２）ＰＣＲ反応 総量を１００μＬとし、１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
８．３）、５０mM ＫＣｌ １．５mM ＭｇＣｌ2、２
００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．２ｐ
Ｍプライマー、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡを含む反応液
で、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ｃｏｎｎ．）によ
り、９４℃３分の後、９４℃３０秒、６３℃１分３０
秒、７２℃２分を２５サイクルのＰＣＲ反応を行った。
８．３）、５０mM ＫＣｌ １．５mM ＭｇＣｌ2、２
００μＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅに、各々０．２ｐ
Ｍプライマー、２．５Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（タカラ社製）、鋳型ＤＮＡを含む反応液
で、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍ
ｅｒｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ｃｏｎｎ．）によ
り、９４℃３分の後、９４℃３０秒、６３℃１分３０
秒、７２℃２分を２５サイクルのＰＣＲ反応を行った。
【００４４】（３）プライマーの菌種特異性の検討 （２）で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有
無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合能を確認
し、プライマーの特異性を判定した。２％Ａｇａｒｏｓ
ｅ ＴｙｐｅII（シグマ社製）で、ミューピットにより
１００Ｖ、２５分電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｍ Ｂｒｏ
ｍｉｄｅで染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
その結果、プライマーはユーバクテリウム属細菌の各菌
種特異的にバンドを形成した（表３）。
無によりプライマーと各菌株のＤＮＡとの結合能を確認
し、プライマーの特異性を判定した。２％Ａｇａｒｏｓ
ｅ ＴｙｐｅII（シグマ社製）で、ミューピットにより
１００Ｖ、２５分電気泳動し、ｅｔｈｉｄｉｍ Ｂｒｏ
ｍｉｄｅで染色後、ＵＶランプ下でバンドを観察した。
その結果、プライマーはユーバクテリウム属細菌の各菌
種特異的にバンドを形成した（表３）。
【００４５】
【表３】
【００４６】
<110> 株式会社 ヤクルト本社；財団法人ヤクルト・バ
イオサイエンス研究財団(KABUSHIKI KAISHA YAKULT HON
SHA;ZAIDAN HOJIN YAKULT・BIO SCIENCEKENKYU ZAIDAN) 理化学研究所（RIKEN） <120> Primer for Eubacterium and Fusobacterium <130> P <160> 20 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 catgaagtgg cgaacgggtg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 cttgctccgg acaaccttgg ga 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggatccttc gggtgacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cattgcttct cggtgccgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gagagatcgc atgaactttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggtaacctac ccatgtaact 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ggcttcgagg catctcggag ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ataggtagca gacaagcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccgcataagc gcacaatgtt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 taccggatat tatgactgag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttctgcagg taccgtcgaa tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tctaccgaac tcgagcctcc ca 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctcattgggt accgtcattc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atttgctcgg cttcacagct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 acggatcatt ccctatccgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ggtaagctac cgtcacttgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 actatcatgt cattccctac 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gaacagtttc cagagccagt ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccctcctgca ctccagcctt 20
イオサイエンス研究財団(KABUSHIKI KAISHA YAKULT HON
SHA;ZAIDAN HOJIN YAKULT・BIO SCIENCEKENKYU ZAIDAN) 理化学研究所（RIKEN） <120> Primer for Eubacterium and Fusobacterium <130> P <160> 20 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 catgaagtgg cgaacgggtg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 cttgctccgg acaaccttgg ga 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggatccttc gggtgacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cattgcttct cggtgccgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gagagatcgc atgaactttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggtaacctac ccatgtaact 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ggcttcgagg catctcggag ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ataggtagca gacaagcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccgcataagc gcacaatgtt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 taccggatat tatgactgag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttctgcagg taccgtcgaa tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tctaccgaac tcgagcctcc ca 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctcattgggt accgtcattc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atttgctcgg cttcacagct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 acggatcatt ccctatccgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ggtaagctac cgtcacttgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 actatcatgt cattccctac 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gaacagtttc cagagccagt ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccctcctgca ctccagcctt 20
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年９月２４日（１９９９．９．２
４）
４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】
【配列表】 <110> 財団法人ヤクルト・バイオサイエンス研究財団(Z
AIDAN HOJIN YAKULT・BIO SCIENCE KENKYU ZAIDAN) 理化学研究所（RIKEN） <120> Primer for Eubacterium and Fusobacterium <130> P03281108 <160> 19 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 catgaagtgg cgaacgggtg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 cttgctccgg acaaccttgg ga 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggatccttc gggtgacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cattgcttct cggtgccgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gagagatcgc atgaactttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggtaacctac ccatgtaact 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ggcttcgagg catctcggag ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ataggtagca gacaagcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccgcataagc gcacaatgtt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 taccggatat tatgactgag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttctgcagg taccgtcgaa tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tctaccgaac tcgagcctcc ca 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctcattgggt accgtcattc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atttgctcgg cttcacagct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 acggatcatt ccctatccgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ggtaagctac cgtcacttgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 actatcatgt cattccctac 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gaacagtttc cagagccagt ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccctcctgca ctccagcctt 20
AIDAN HOJIN YAKULT・BIO SCIENCE KENKYU ZAIDAN) 理化学研究所（RIKEN） <120> Primer for Eubacterium and Fusobacterium <130> P03281108 <160> 19 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 catgaagtgg cgaacgggtg a 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 cttgctccgg acaaccttgg ga 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 tggatccttc gggtgacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cattgcttct cggtgccgtc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 gagagatcgc atgaactttc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggtaacctac ccatgtaact 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 ggcttcgagg catctcggag ac 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 ataggtagca gacaagcatt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccgcataagc gcacaatgtt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 taccggatat tatgactgag 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 cttctgcagg taccgtcgaa tt 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 tctaccgaac tcgagcctcc ca 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctcattgggt accgtcattc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 atttgctcgg cttcacagct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 acggatcatt ccctatccgt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 ggtaagctac cgtcacttgt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 actatcatgt cattccctac 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gaacagtttc cagagccagt ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 ccctcctgca ctccagcctt 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 影山 亜紀子 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA20 4B063 QA18 QQ06 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR39 QR55 QR62 QS16 QS25 QX01
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１〜９及び１１〜１９から選ば
れる塩基配列又は該塩基配列に相補的な配列を有するユ
ーバクテリウム属細菌用プライマー又はプローブ。 - 【請求項２】 配列番号１０の塩基配列又は該塩基配列
に相補的な配列を有するフソバクテリウム・バリウムグ
ループ細菌用プライマー又はプローブ。 - 【請求項３】 配列番号１又は２と１１又は１２、３と
１３、４と１４、５と１５、６と１６、７と１７、８と
１８及び９と１９から選ばれる塩基配列の組合せ又はこ
れらの塩基配列の組合せに相補的な配列の組合せを有す
るユーバクテリウム属細菌菌種検出用プライマー。 - 【請求項４】 請求項１、２又は３記載のプライマーの
１又は２以上を使用することを特徴とするユーバクテリ
ウム属細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグルー
プ細菌の同定方法。 - 【請求項５】 （１）検体中のＤＮＡを抽出する工程及
び（２）請求項１、２又は３記載のプライマーの１又は
２以上を用いてＰＣＲ反応を行う工程を含むユーバクテ
リウム属細菌菌種又はフソバクテリウム・バリウムグル
ープ細菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11226176A JP2001046063A (ja) | 1999-08-10 | 1999-08-10 | ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11226176A JP2001046063A (ja) | 1999-08-10 | 1999-08-10 | ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046063A true JP2001046063A (ja) | 2001-02-20 |
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ID=16841084
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11226176A Pending JP2001046063A (ja) | 1999-08-10 | 1999-08-10 | ユーバクテリウム属及びフソバクテリウム・バリウムグループ細菌用プライマー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001046063A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006525812A (ja) | 2003-05-19 | 2006-11-16 | ジェン−プロウブ インコーポレイテッド | 試験サンプルにおいてｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓｖａｇｉｎａｌｉｓの存在を決定するための組成物、方法およびキット |
| JP2007020423A (ja) * | 2005-07-12 | 2007-02-01 | Yakult Honsha Co Ltd | 腸内細菌群検出用核酸断片 |
| CN102940652A (zh) * | 2008-05-28 | 2013-02-27 | 青岛东海药业有限公司 | 两形真杆菌制剂及其应用 |
| JP2015188359A (ja) * | 2014-03-27 | 2015-11-02 | 三菱重工業株式会社 | スフィンゴモナス属細菌の検出方法及びそのプライマー、生物処理槽の活性予測方法 |
-
1999
- 1999-08-10 JP JP11226176A patent/JP2001046063A/ja active Pending
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