KR20170022201A

KR20170022201A - 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 장내 유익균 검출방법

Info

Publication number: KR20170022201A
Application number: KR1020150116912A
Authority: KR
Inventors: 임성식; 김연수
Original assignee: (주)다이오진
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2017-03-02
Also published as: KR101732676B1

Abstract

본 발명은 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 장내 유익균 검출방법에 관한 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 이용하는 다중 중합효소 연쇄반응에 의해 장내 유익균 16종(락토바실러스 속 8종과 비피도박테리움 속 4종, 엔테로코커스 속 2종, 락토코커스 속 1종, 스트렙토코커스 속 1종)을 한 번의 반응으로 신속, 정확하게 동정할 수 있는바, 장내 유익균의 존재 유무에 따른 효과적인 프로바이오틱 제품의 선택, 건강식품 및 의약품의 원료개발 및 프로바이오틱 제품에 대한 신뢰도 상승에 큰 역할을 할 것으로 기대하고 있다.

Description

덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 장내 유익균 검출방법{Primer for nucleic acid amplification having dumbbell structure and method for detection of intestinal beneficial bacteria}

본 발명은 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 및 이를 이용한 장내 유익균 검출방법에 관한 것이다.

장내유익균(프로바이오틱스(probiotics))은 인간에게 기본적인 영양분을 제공할 뿐 아니라 건강에 매우 유용하다고 알려져 있는 미생물이다. 생균제에 관련된 미생물들의 장기능 개선과 면역 증강 및 항돌연변이, 항암 활성 등이 보고되고 있으며(Drisko JA, Altern Med Rev. 8, 143-155., 2003), 이러한 이유로 인하여 프로바이오틱 제품은 오늘날 널리 이용되고 있다.

락토바실러스(Lactobacillus)와 비피도박테리움(bifidobacterium)은 프로바이오틱 제품 중에서 가장 많이 이용되는 유산균으로서 이 중에서도 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)이 국내시장에서 상업적으로 가장 많이 이용되고 있다. 이외에도 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 헬베티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis) 등이 유용한 균주로서 식약처에서 인정받고 있다.

프로바이오틱스 중 락토바실러스와 비피도박테리아 속의 유익한 건강 증진 효과는 오래전부터 인정되어 왔으며 이 두 그룹의 유산균은 사람이나 동물의 장내 방어 장벽, 즉 위산과 담즙산염, 췌장 등에 내성이 있고 장점막에 부착하여 쉽게 군락을 형성할 수 있는 특징을 가지고 있어 위장관과 균총에서 가장 중요한 균주로 여겨지고 있다.

특히, 락토바실러스는 콜레스테롤 저하인자 분비, 과민성 대장증후군에 의한 복통감소, 헬리코박터파이로리 활성억제, 장점막에 부착하여 장질환을 유발하는 유해균 억제효과, 비타민 B합성, 면역조절기능, 유당불내증 개선 효과가 있으며, 비피도박테리움은 백혈구 증식 촉진, 위산에 강함, 비타민 B군 생성, 헬리코박터파이로리균 억제, 페니실린계, 테트라사이클린계 항생제에서도 살아남음, 혈중 콜레스테롤 농도 저하에 효과, 대장의 유해균 억제, 로타 바이러스 감염에 의한 어린이 설사 억제에 도움을 주는 것으로 알려져 있다.

이러한 프로바이오틱스는 장을 정상으로 돌려주는 역할을 하는데, 첫째, 체내의 소화, 흡수, 배설 등의 대사에 관여를 하며 인체의 아주 많은 비율의 체내 효소 생산에 관여하며, 둘째, 해로운 균의 발생이나 증식을 억제하고, 외부로부터 들어온 세균에 대해서는 인체를 보호하고, 셋째, 체내에 있는 물질을 분해하여 독소를 인체 외로 배출하며, 넷째, 소화기관의 질환 뿐만 아니라, 다른 각종 질환, 예를 들어 관절염, 요통, 견비통, 두통, 기관지질환, 피부질환 등에 광범위하게 영향을 미치며 이들의 질환에 직, 간접적으로 작용한다.

장내 유익균보다 유해균이 많아져 미생물 균총의 균형이 깨지면 각종 질병의 위험성이 높아지게 되므로, 각 개인 내에 존재하는 장내 유익균의 정확한 유형을 확인할 수 있다면, 각 개인의 균총을 조절하여 건강을 개선하는데 도움을 줄 수 있을 것이다.

종래의 프로바이오틱스 유산균은 표현형적 특성과 생화학적 특성을 이용하여 동정되어 왔으나, 상기 방법은 그 기준이 모호하고 복잡하여 오늘날에는 거의 이용되고 않고 있으며, 최근에는 rRNA를 이용한 계통발생학적 분석 방법이 많이 이용되고 있다. 16S rRNA 또는 23S rRNA 지역의 염기서열을 이용하여 제작한 프로브와 중합효소연쇄반응(PCR) 프라이머를 이용한 방법들은 매우 성공적으로 유산균을 동정할 수 있는 것으로 보고되고 있으나, 한편으로는 16S rRNA에서 제작되는 프로브와 프라이머들은 미생물의 종간의 관계가 매우 가까울 경우, 각 미생물 종들의 16S rRNA 염기서열이 유사하기 때문에 미생물 동정을 위한 특이적인 유전자로는 적당하지 않다고 보고된 바 있다. 16S rRNA와 비교하여 미생물의 16S rRNA와 23S rRNA 사이 지역 유전자는 비교적 더 큰 다형성 부분이 존재하므로 매우 유사한 종의 동정에 필요한 특이적인 프라이머를 제작하는데 유용하게 쓰일 수 있다. 그리고 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)은 각각의 표적 유전자에 각기 다른 프라이머 쌍을 사용하여 한 번의 반응으로 빠르게 다수의 미생물을 동정할 수 있다는 장점이 있다.

그러나, 종래의 방법들은 락토바실러스 속 균종 간이나 비피도박테리움 속 균종 간의 동정에 한정되었다.

이에 본 발명자들은 여러 종류의 장내 유익균을 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 개발하기 위해서 많은 연구를 수행한 결과, 독특한 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였고, 이를 이용하여 16종의 장내 유익균의 존재 유무를 오류 없이 정확하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

Drisko JA, Altern Med Rev. 8, 143-155., 2003

따라서, 본 발명의 목적은 장내 유익균을 검출하는데 사용될 수 있는 독특한 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용한 표적 핵산의 증폭 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 장내 유익균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 포함하는, 장내 유익균 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 장내 유익균을 검출함으로써, 맞춤형 프로바이오틱 제품을 선택하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 식 I로 표시되는 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머를 제공한다:

[식 I]

5'-Ap-Bq-Cr-3'

상기 식에서,

A는 상기 프라이머의 3'-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 5'-저 Tm 특이성 부위를 나타내고;

B는 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 분할 부위를 나타내며;

C는 표적 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 3'-고 Tm 특이성 부위를 나타내고;

p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 증폭 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계; (2) 상기 시료를 주형으로, 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 반응 산물로부터, 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 장내 유익균을 검출하는 방법을 제공한다:

(a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus); (b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei); (c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri); (d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii); (e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum); (f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); (g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri); (h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus); (i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis); (j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); (k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis); (l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus); (m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); (n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve); (o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및 (p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis).

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 포함하는, 장내 유익균 검출용 키트를 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계; (2) 상기 시료를 주형으로, 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및 (3) 상기 반응 산물로부터, 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 맞춤형 프로바이오틱 제품을 선택하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

본 발명에 따른 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머는 5'-저 Tm 특이성 부위와 3'-고 Tm 특이성 부위가 분할 부위에 분리되어 혼성화 특이성이 이중적으로 결정됨으로써, 종래 핵산 증폭용 프라이머에 비해 매우 향상된 혼성화 특이성을 나타낸다. 따라서, 프라이머가 비-표적 핵산에 미스매칭되어 연장되는 확률을 크게 낮추어 위양성 결과를 거의 발생시키지 않으므로, 보다 정확한 표적 핵산의 검출을 가능하게 한다.

특히, 본 발명에 따른 16쌍의 핵산 증폭용 프라이머는 장내 유익균 DNA 단편에 특이적으로 혼성화되어 유형 특이적인 PCR 증폭 산물을 생성할 수 있는바, 개체의 시료로부터 장내 유익균의 존재 유무를 신속하고 정확하게 그리고 용이하게 검출할 수 있다.

또한, 본 발명에서 합성된 프라이머는 장내 유익균별 게놈과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에 직접적으로 특정 유형의 유산균을 검출할 수 있는 프로브(probe)로 활용될 수 있다.

더욱이, 본 발명에 따른 다수의 프라이머를 조합하여 사용함으로써 1회 PCR 과정만으로 다양한 장내 유익균을 검출할 수 있으며, 장내 유익균 존재 유무를 조기에 진단함으로써, 장내 유익균의 존재 유무에 따른 효과적인 프로바이오틱 제품의 선택, 건강식품 및 의약품의 원료개발 및 프로바이오틱 제품에 대한 신뢰도 상승에 큰 역할을 할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 장내 유익균을 분석하는 서비스의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머를 이용한 표적 의존적 연장 반응의 원리를 나타낸 것이다. (a)는 높은 엄격 조건하에서 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머의 고혼성화 특이성에 기인하여 연장이 일어날 수 없는 경우를 예시하고, (b)는 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머의 성공적인 연장반응이 일어나는 경우를 예시한다.
도 3은 본 발명의 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머 세트(IBB1, IBB2, IBB3)를 이용하여 16종의 장내 유익균 유래의 DNA를 검출한 결과를 나타낸 것이다. 도 3a에서 IBB1 세트의 레인 1은 락토바실러스 델부루엑키 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 락토바실러스 불가리쿠스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 비피도박테리움 롱검 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 엔테로코커스 패칼리스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 엔테로코커스 패시움 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 상기 총 5개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭 후 전기영동한 것이다. 또한, 도 3b에서 IBB2 세트의 레인 1은 락토바실러스 플란타룸 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 비피도박테리움 애니말리스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 락토바실러스 가세리 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 락토바실러스 애시도필러스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 락토바실러스 락티스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 상기 총 5개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭 후 전기영동한 것이다. 또한, 도 3c에서 IBB3 세트의 레인 1은 비피도박테리움 비피덤 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 락토바실러스 퍼멘텀 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 락토바실러스 카세이 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 비피도박테리움 브레베 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 락토바실러스 루테리 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 스트렙토코커스 써모필러스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 7은 상기 총 6개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭 후 전기영동한 것이다.
도 4는 각각의 임상 검체(4a 내지 4k)를 대상으로 IBB1, IBB2 및 IBB3 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭한 후 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

상기 발견에 기초하여, 본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 다음과 같은 수단을 찾아내었다. 즉, 이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 식 I로 표시되는 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머를 제공한다:

[식 I]

5'-Ap-Bq-Cr-3'

상기 식에서,

p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.

본 발명에 따른 핵산 증폭용 프라이머의 기본적인 구조는 본 발명자에 의해 최초로 제안되는 것이고, 덤벨 구조(dumbbell structure) 또는 덤벨 구조 특이성(dumbell structure specificity) 구조로 명명될 수 있다. 이러한 구조를 갖는 프라이머는 덤벨 구조를 갖는 프라이머 또는 덤벨 유사 프라이머(dumbell likely primer: DLP)로 명명된다.

상기 프라이머는 본 발명자에 의하여 개발된 신 개념의 프라이머로서, 분할 구역에 의해 분리된 5'-저 Tm 특이성 구역(5'-low Tm specificity portion)과 3'-고 Tm 특이성 구역(3'-high Tm specificity portion)에 의해 유형 특이적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 프라이머가 뉴클레오티드 변이-포함 표적 서열에 어닐링될 때, 특이성은 종래 프라이머와 같이 프라이머 전체 길이에 의해 결정되는 것이 아니라, 서로 분할된 변이 인접 특이성 구역 및 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 결정된다. 따라서, 상기 프라이머는 표적 서열에 어닐링될 때, 종래의 프라이머와 다른 방식(performance)으로 어닐링되며, 이는 어닐링 특이성을 크게 향상시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 및 상기 염기의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는, 디옥시이노신, 이노신, 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 구역은 연속된 유니버설 염기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 변이 인접 특이성 구역의 길이는 변이 특이성 구역보다 짧다. 상기 변이 인접 특이성 구역은 바람직하게는, 3 내지 15개의 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 3 내지 5개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 상기 변이 특이성 구역은 바람직하게는, 18 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3 내지 5개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3'-고 Tm 특이성 부위의 Tm보다 낮다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할 부위의 Tm은 상기 5'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 및 상기 3'-고 Tm 특이성 부위의 Tm보다 낮다. 구체적으로, 상기 변이 인접 특이성 구역은 10 내지 30℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 5 내지 12℃의 Tm을 갖는다. 바람직하게는, 상기 변이 특이성 구역은 50 내지 65℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3 내지 10℃의 Tm을 갖는다.

본 발명의 프라이머의 변이 특이성 구역은, 뉴클레오티드 변이에 해당하는(corresponding) 또는 상보적인 (complementary) 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 프라이머가 표적 뉴클레오티드 서열의 센스 가닥과 혼성화되는 경우에는, 변이 특이성 구역은 뉴클레오티드 변이에 상보적인 뉴클레오티드를 포함하며, 안티센스 가닥과 혼성화되는 경우에는, 뉴클레오티드 변이에 해당하는 뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오티드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오티드는 변이 특이성 구역의 3'-말단 또는 3'-말단으로부터 1 내지 2 염기 이격된 자리에 위치하며, 보다 바람직하게는 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 1 내지 2 염기 이격된 자리에 위치한다. 가장 바람직하게는 뉴클레오티드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오티드는 변이 특이성 구역의 가운데(center) 또는 그 근처(around the center)에 위치한다. 예컨대, 변이 특이성 구역이 3'-말단으로부터 1 내지 2 염기 이격된 경우, 뉴클레오티드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오티드는 변이 특이성 구역의 5'-말단 또한 1 내지 2 염기 이격된 자리에 위치한다.

본 발명에 따른 프라이머의 변이 특이적 구역에서, 뉴클레오티드 변이에 해당하는 뉴클레오티드가 변이 특이성 구역의 3'-말단으로부터 1 내지 2 염기 이격된 자리에 위치하며 더불어 상보적인 뉴클레오티드 변이 특이성 구역의 5'-말단 또한 1 내지 2 염기 이격된 자리에 위치하면, 다음과 같은 유리한 효과가 발생된다.

예를 들어, 일반적인 프라이머를 이용하여, SNP를 검출할 때에는 변이 발생 부위를 3'-말단에 위치하게 되는데, 이 경우 3'-말단의 염기가 표적 서열에 어닐링될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 크게 차이가 나지 않는다. 따라서 미스매칭될 때에도 어닐링되어 증폭 반응이 일어나 위양성 결과가 나오는 경향이 크다. 반대로, 변이 발생 부위를 가운데에 치우쳐서 위치시키면, 변이 발생 부위가 표적 서열에 어닐링될 때와 되지 않을 때(즉, 미스매칭이 될 때) Tm 값이 어느 정도 크게 차이가 나지만, 대부분의 열안정성 중합효소는 미스매칭되는 부분에서도 중합반응을 촉매하여 위양성 결과를 초래한다.

본 발명에 따르는 경우에는, 상술한 종래 기술의 문제점을 완벽하게 극복할 수 있다. 예컨대, 뉴클레오티드 변이에 해당하는 또는 상보적인 뉴클레오티드가 변이 특이성 구역의 가운데에 치우쳐서 위치하는 경우, 만일이 위치에서 미스매칭이 발생되면, 변이 특이성 구역만으로 볼 때에는 구조의 중앙에서 미스매칭이 발생된 것이기 때문에, 변이 특이성 구역의 Tm 값이 매칭될 때와 비교하여 크게 감소하게 되며, 프라이머 전체 구조로 볼 때에는 5`-말단과 3'-말단에서 동시에 미스매칭이기 때문에, 열안정성 중합효소는 중합반응을 촉매하지 않는다. 따라서, 미스 매칭되는 경우, 위양성 결과가 발생되지 않는다.

본 발명에 따른 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머는 장내 유익균을 검출하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 검출할 수 있는 장내 유익균은 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주일 수 있다:

(a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus);

(b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei);

(c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri);

(d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii);

(e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum);

(f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum);

(g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri);

(h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus);

(i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis);

(j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium);

(k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis);

(l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus);

(m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum);

(n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve);

(o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및

(p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis).

상기 열거한 균주들은 하나의 예시일 뿐, 본 발명의 프라이머는 열거한 균주들 외에도 다른 다양한 균주를 검출하는데 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 프라이머는 전술한 16종의 다양한 균주를 검출하기 위해 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 32로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 가질 수 있다.

본 발명은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 증폭 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 생물학적 시료로부터 장내 유익균을 검출하는 방법을 제공한다:

(1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계;

(2) 상기 시료를 주형으로, 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및

(3) 상기 반응 산물로부터, 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 단계:

본 발명의 방법의 대상인 「개체」는 인간, 개, 고양이, 소, 염소, 돼지, 양 및 원숭이를 포함하는 임의의 포유동물일수 있지만, 인간, 특히 동양인이 가장 바람직한 개체이다.

여기에서 사용되는 「시료」란, 생물 개체로부터 채취한 분변 시료를 말한다. 또한, 「시료」는 필요에 따라 생물 시료를 균질화 및 추출 등의 필요한 임의의 전처리를 실시하여 얻은 시료일 수 있다. 이러한 전처리는 대상이 되는 생물 시료에 따라 당업자에 의해 선택될 수 있을 것이다.

상기 시료로부터 수득되는 핵산은 DNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산은 개체의 시료로부터 수득한 게놈 DNA일 수 있다. 예컨대, 상기 DNA는 개체에서 얻은 분변으로부터 상업적으로 이용가능한 DNA 추출 키트를 사용하여 수득하는 등, 당업계에 널리 알려진 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 뉴클레오티드의 양이 적을 때에는 필요에 따라 뉴클레오티드를 증폭시키는 조작을 실시할 수 있다. 증폭 조작은, 예컨대 DNA 중합효소 등의 효소를 사용한 중합효소 연쇄반응(이하, PCR이라 약칭함)에 의해 실시할 수 있다. 필요에 따라, 추출 조작 및/또는 증폭 조작을 실시한 후에, 상기 16종의 장내 유익균을 검출한다.

본 발명의 방법은 최소 5종 이상의 장내 유익균을 동시에 검출할 수 있으며, 이는 종 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 시스템을 토대로 단일 튜브에서 최소 5종 이상의 서로 다른 크기의 증폭 산물이 생성되도록 함으로써 달성된다.

본 발명은 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 포함하는, 장내 유익균 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 맞춤형 프로바이오틱 제품을 선택하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계;

장내 유익균의 유형을 결정하기 위해 증폭 산물로부터 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 수단으로는 클로닝을 실시한 후에 서열 분석을 실시할 수 있으며, 직접 서열 분석법, SSCP법, 올리고뉴클레오티드 교잡법 및 특이적 프라이머법 등의 일반적으로 사용되는 모든 수단을 사용할 수 있다. 유전자형을 결정하는 더욱 바람직한 방법으로는 제한효소를 사용하여 실시하는 PCR-RFLP(제한효소 절편 길이다형성)법, PCR-SSP(특이 서열 프라이머)법, 도트 플롯법과 PCR을 조합한 PCR-SS0(서열 특이적 올리고뉴클레오티드)법 및 PCR-SSCP법 등의 기타 주지의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 방법에 의해 16종의 장내 유익균 유형을 결정하고, 그 결과를 기초로 하여 각종 프로바이오틱스 제품군에서 개개인에 맞은 효과적인 제품군을 선택할 수 있음을 예측할 수 있는데, 이러한 방법도 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 방법의 경우에서도 결정된 이들의 유형을 기초로, 예컨대 이들의 유형과 프로바이오틱스 제품군을 대응시킨 정보를 나타내는 표를 검색함으로써, 대응하는 프로바이오틱스 제품군을 확인하고, 이에 따라 개인별 맞춤형 프로바이오틱스 제품군을 확인할 수 있다.

상술한 바와 같이, 16종 장내 유익균 유형에 의해 각종 프로바이오틱스 제품군을 선별할 수 있다. 즉, 16종 장내 유익균 존재 유무에 기초하여, 개인별 맞춤형 프로바이오틱스 제품군을 선택할 수 있다. 그러나, 프로바이오틱스 제품군은 16종 유형에만 유일하게 관련되는 것이 아니라, 다른 복합적인 요인들에 의해서도 선택되어질 수 있다.

따라서, 상기 장내 유익균에 관한 정보 외에 다른 요인의 정보를 가미할 수도 있다. 이러한 정보는 예컨대 다른 장내 유익균에 관한 정보나, 환경적 요인, 예컨대 연령, 음식물 섭취 경향 및 기호품 등에 관한 정보일 수 있다. 이와 같은 방법의 경우에서도 마찬가지로 이들 요인과 장내 유익균 정보를 대응시켜 표로 사용할 수 있다. 이와 같은 예측 방법도 본 발명의 범위내에 포함된다.

또한, 상술한 본 발명에 따른 방법은 원하는 경우에 따라 본원발명의 범위를 벗어나지 않는 범위내에서 변경할 수 있다.

또한, 본 발명은 16종의 장내 유익균을 분자생물학적 방법을 통하여 정확히 검출할 수 있는 분자유전학적 진단법 및 진단 키트 제공을 통한 개인별 맞춤형 프로바이오틱스 제품군을 선택할 수 있는 기회를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 장내 유익균 검출을 위한 프라이머의 제조

중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 장내 유익균을 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머를 제조하기 위해, 장내 유익균 각각의 독특한 표적 핵산 서열과 상보적으로 결합하여 이를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 설계하였다.

먼저, 표적이 되는 장내 유익균으로서, 16종의 대표적인 프로바이오틱스 균을 선택하였다. 상기 균주는 다음과 같다: (a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)(ATCC 53544); (b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)(ATCC 39392); (c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri)(ATCC 33323D-5); (d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii)(ATCC 11842D-5); (e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(ATCC 9338); (f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)(ATCC 8014D-5); (g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)(ATCC 53609); (h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)(ATCC 10705); (i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis)(ATCC 19435D-5); (j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium)(ATCC 51836); (k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis)(ATCC 27792); (l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)(ATCC 19258); (m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)(ATCC 29521); (n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)(ATCC 15700); (o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)(ATCC 55817); (p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis)(ATCC 25527).

한편, 다수 유전자를 한 튜브 내에서 증폭하기 위한 프라이머를 장내 유익균 특이적 부위를 포함하는 코딩 서열에 기초로 하여, 전방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머를 설계하고 종래의 프라이머 디자인 방법을 변형하여 충분히 PCR 특이성을 발휘될 수 있는 서열을 선택하였다.

상기 균주 특이적 프라이머는 전술한 식 I의 구조를 갖도록 설계하여, 매우 높은 특이성으로 표적 서열과 혼성화되도록 하였다. 상기 식 I에서 분할 부위는 디옥시이노신으로 설계하였다. 이러한 식 I의 구조를 갖는 프라이머에서 5'-저 Tm 특이성 부위(변이 인접 특이성 구역)과 3'-고 Tm 특이성 부위(변이 특이성 구역)는 분할 구역에 의해 물리적으로 그리고 기능적으로 분할되며, 프라이머 전체 구조의 혼성화 특이성은 변이 인접 특이성 구역과 변이 특이성 구역에 의해 이중적으로 조절된다. 또한, 뉴클레오티드 변이에 해당되거나 또는 뉴클레오티드 변이에 혼성화되는 염기는 변이 특이성 구역의 중앙 부분에 위치하도록 하여 미스매치에 따른 Tm 값 차이를 크게 하면서도 미스매치시 Taq 중합효소에 의한 표적 핵산의 연장이 일어나지 않도록 하였다. 상기 프라이머를 덤벨 유사 프라이머(dumbell likely primer(DLP™))로 명명하였다.

본 발명에 사용된, 16종의 장내 유익균에 특이적인 각각의 덤벨 유사 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

장내 유익균	5'-프라이머 / 3'-프라이머
락토바실러스 애시도필러스	CTGCAIIIGCACCGCTGCGTATATTGATGCAG (서열번호 1)
	GGTTGIIIGCGACCTTAAATGGTGGAGCAACC (서열번호 2)
락토바실러스 카세이	CATTCIIICTGCCGCCTATATTGATGCCGAGAATG (서열번호 3)
	CCGGTIIIGCAATCGTTTTTGTCTTATTGATGGAACCGG (서열번호 4)
락토바실러스 델부루엑키	GAGATIIIGCAAATCGCGGACACCTTGATCTC (서열번호 5)
	GCCAAIIIGATGGCAATGGTCTTGGTCTTGGC (서열번호 6)
락토바실러스 불가리쿠스	CAGTGIIICCAATTGATCCTGTCTCAGCCAAACACTG (서열번호 7)
	CAAGAIIIGATCTGGTTGATGAAGATGGCAATGGTCTTG (서열번호 8)
락토바실러스 퍼멘텀	GCAAGIIICCATACATGATGTCTACTTCGGCCTTGC (서열번호 9)
	GTTGAIIIGACCAAGACGATCGCCATCTTCATCAAC (서열번호 10)
락토바실러스 플란타룸	CTAGGIIITAGACCCCGTTTATGCGGAACACCTAG (서열번호 11)
	GTGACIIICTTGTAACCCAACGTGTGCGTCAC (서열번호 12)
락토바실러스 루테리	GGTCAIIIGCAGAAGCCTTRGGTGTTAATATTGATGACC (서열번호 13)
	GTGAGIIIGCAATTCACCAGTCTTAGAGATTCCCTCAC (서열번호 14)
락토바실러스 가세리	GCATCIIIGGAGGAACAGCTGCATACATTGATGC (서열번호 15)
	CAGAAIIICACGACCACCAGGGGTAGTTTCTG (서열번호 16)
락토바실러스 락티스	CGTGCIIICTGATAGAAAGTTCCATCCACCTTTTGCACG (서열번호 17)
	GAAGGIIIGCATCGATAAAGGCTGCAATTCCACCTTC (서열번호 18)
엔테로코커스 패시움	AAGGAIIICTGCTGGTGTGCCGCAAGTTCCTT (서열번호 19)
	CCAGTIIIGATTGACGCTGATGGTATCGATTCATTCCTAACTGG (서열번호 20)
엔테로코커스 패칼리스	GCTAAIIIGCCTTATGTAGGCGCGGGTGTCTTAGC (서열번호 21)
	CGATTIIICTGGAACATGCGCTGGGATTTGCATTTCAATCG (서열번호 22)
스트렙토코커스 써모필러스	CTCAGIIIGACAGATAGTGATTACGATGCGCTACTGAG (서열번호 23)
	GGAGAIIIGAAGTCCTACATGACTGTCACCAATATCTCC (서열번호 24)
비피도박테리움 비피덤	GAGACIIIGTCGACACCGATTCCCTGATCGTCTC (서열번호 25)
	GATATIIIGACCGACATGGCTGTCACCCATATC (서열번호 26)
비피도박테리움 브레베	CATGTIIICTCTAGCAGCCTACCCGATGACATG (서열번호 27)
	CCAAAIIICCATCAGTGCCTATACTGGGTGTTTGG (서열번호 28)
비피도박테리움 롱검	CTCACIIICATCTTCATCAACCAGCTGCGTGAG (서열번호 29)
	GAAGTIIICATAGGTGAACCACGAACCGGACTTC (서열번호 30)
비피도박테리움 애니말리스	CACCGIIICTTGACGTCATCGTCATCGATTCGGTG (서열번호 31)
	CATCCIIICTCGTCCTTGTCTTTCAACGTCTGGATG (서열번호 32)

실시예 2: 본 발명의 덤벨 유사 프라이머를 이용한 다중 중합효소 연쇄반응을 통한 장내 유익균 분석

실시예 1에서 제조된 덤벨 유사 프라이머의 장내 유익균 검출능을 살펴보기 위하여, 실시예 1에 열거된 표준 균주를 대상으로 상기 덤벨 유사 프라이머를 이용한 PCR을 통해 상기 프라이머의 장내 유익균 검출능을 일차적으로 확인하였다. 상기 프라이머는 각각의 표준 균주의 게놈 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 것으로 확인되었다.

이차적으로, 아래의 조건에 따라 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 수행하여 본 발명의 프라이머의 장내 유익균 검출능을 확인하였다.

상기와 같은 유형의 장내 유익균 플라즈미드 DNA를 함유하는 각 대장균(E.coli) 균주를 37℃ LB 액체 배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 주형 DNA로 활용하였고 클론들은 다음의 방법을 토대로 획득하였다. 즉, 1 ㎕의 염 용액, 0.5 ㎕의 벡터,4.5 ㎕의 주형 DNA를 넣은 후 혼합하여 22℃에서 30분간 방치한 다음 컴피턴트 세포(Competent cell) 17 ㎕를 넣고 섞은 후 30분간 얼음에 방치하였다. 이후 42℃에서 30초간 열 충격(heat shock)을 가한 후, 얼음에서 5분간 방치하였다. 이후 즉시 SOC 용액 200 ㎕을 넣어 37℃ 배양기에서 200 rpm으로 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 상기 배양액을 암피실린(50 ㎍/ml), X-Gal(40 mg/ml) 및 100 mM IPTG가 포함된 LB 배지에 스프레딩한 후, 밤새 배양(Invitrogen TOPO TA cloning vector 사용)한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat.No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하였다. 상기 분리된 DNA를 10 ng/㎕로 농도로 조정하여 주형 DNA로 활용하였다.

PCR 반응용액은 200 ng 게놈 DNA, 25 pM의 각 프라이머, 0.2 mM dNTPs, 75 mM Tris-HCl(pH 9.0), 15 mM 암모니움 설페이트, 0.1 ㎍/㎕ BSA, 2.5 mM MgCl₂, 및 1 단위의 Taq 중합효소(Neurotics사)를 혼합한 후 증류수로 최종 부피를 20 ㎕로 맞추어 준비하였다. PCR 반응은 상기 반응용액을 94℃에서 10분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 67℃에서 60초, 및 72℃에서 60초의 반응을 35회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 5분간 증폭시켰다.

이로부터 얻은 각각의 PCR 산물 5 ㎕를 1.5% 아가로스 겔에 전기영동하여 사이즈 마커 대비 PCR 산물의 크기별로 각 유산균종이 특이적으로 증폭됨을 확인하였다.(도 3 참조).

상기 실시예 2의 프로바이오틱스 원인균 분석 결과에서 수득된 전기영동 결과 모식도를 도 3에 나타내었다(도 3a~3c).

도 3은 본 발명에서 합성된 총 16쌍의 프라이머를 임의로 조합한 3개의 프라이머 세트, 즉 IBB1, IBB2 및 IBB3의 프라이머 세트를 사용하여 각각 16종의 장내 유익균을 대상 DNA로 하여 PCR 증폭 실험을 행한 후 전기영동한 사진이다. 도면에서 좌측은 표준 마커이고 레인 각각은 IBB1, IBB2 및 IBB3의 프라이머 세트를 사용한 결과이고, 측면은 사이즈별 유익균 증폭능을 나타낸다.

도 3a에서 IBB1 세트의 레인 1은 락토바실러스 델부루엑키 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 락토바실러스 불가리쿠스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 비피도박테리움 롱검 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 엔테로코커스 패칼리스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 엔테로코커스 패시움 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 본 실시예에서 사용된 총 5개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭실험 후 전기영동한 것이다.

도 3b에서 IBB2 세트의 레인 1은 락토바실러스 플란타룸 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 비피도박테리움 애니말리스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 락토바실러스 가세리 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 락토바실러스 애시도필러스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 락토바실러스 락티스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 본 실시예에서 사용된 총 5개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭실험 후 전기영동한 것이다.

도 3c에서 IBB3 세트의 레인 1은 비피도박테리움 비피덤 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 2는 락토바실러스 퍼멘텀 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 3은 락토바실러스 카세이 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 4는 비피도박테리움 브레베 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 5는 락토바실러스 루테리 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 6은 스트렙토코커스 써모필러스 DNA가 삽입된 플라스미드가 포함된 균주, 레인 7은 본 실시예에서 사용된 총 6개 유형의 장내 유익균 DNA가 삽입된 플라스미드가 각각 포함된 균주를 혼합한 상태에서 PCR 증폭실험 후 전기영동한 것이다.

하기 표 2에 기재된, 예측되는 DNA 증폭산물의 크기와 비교하여, 실시예 2의 전기영동 결과는 예측된 크기와 일치하였다.

유형	IBB1	IBB2	IBB3
엔테로코커스 패시움	630bp	-*	-
엔테로코커스 패칼리스	480bp	-	-
비피도박테리움 롱검	314bp	-	-
락토바실러스 불가리쿠스	250bp	-	-
락토바실러스 델부루엑키	193bp	-	-
락토바실러스 락티스	-	723bp	-
락토바실러스 애시도필러스	-	500bp	-
락토바실러스 가세리	-	382bp	-
비피도박테리움 애니말리스	-	297bp	-
락토바실러스 플란타룸	-	200bp	-
스트렙토코커스 써모필러스	-	-	787bp
락토바실러스 루테리	-	-	514bp
비피도박테리움 브레베	-	-	408bp
락토바실러스 카세이	-	-	301bp
락토바실러스 퍼멘텀	-	-	243bp
비피도박테리움 비피덤	-	-	172bp

* : 증폭산물 없음.

이러한 실험 결과를 종합하면, 본 발명의 방법에 따르는 경우에는, 멀티플렉스 PCR의 조건에서도 위양성 및 위음성 오류없이 인간 유전자의 단일염기서열다양성(Single Nucleotide Polymorphism)을 정확히 구분해 낼 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 3: 임상 검체에서 다중 중합효소 연쇄반응을 통한 장내 유익균 분석

실제 인간의 임상 검체를 대상으로, 본 발명에 따른 프라이머쌍을 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다.

<3-1> DNA 추출

총 10명의 실험자로부터 분변 200 mg을 채취하여 1.5 ml 튜브로 옮기고, 여기에 200 ul의 SPL 버퍼를 첨가한 후 1분간 혼합하고 70~80℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후 IR 스핀 컬럼에 새 1.5 ml 튜브를 결합하고, 여기에 상기 반응액을 옮긴 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 컬럼을 제거하였다. 반응액이 들어있는 1.5 ml 튜브에 200 ul의 SL 버퍼와 10 ul의 프로티나아제 K 및 5 ul의 RNase A를 첨가하고 혼합한 다음 65℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 종류 후 200 ul SB 버퍼를 첨가하여 혼합한 후 여기에 250 ul의 80% 에탄올을 첨가하여 혼합하였다. 상기 반응액 750 ul를 2.0 ml의 수집 튜브와 결합된 스핀 컬럼으로 옮긴 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 원심분리 후 컬럼을 새 튜브에 옮기고 여기에 700 ul의 SWA 버퍼를 첨가하고 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 다시 컬럼을 빈 튜브로 옮겨 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하고 건조시켰다. 건조 후 컬럼을 1.5ml 튜브로 옮기고 여기에 50 ul의 SE 버퍼를 첨가하고 실온에서 1분간 방치한 후 13,000 rpm에서 1분간 원심하여 DNA를 수득하였다.

<3-2> 다중 중합효소 연쇄반응

각 실험자로부터 얻은 시료를 대상으로, 본 발명에서 합성된 총 16쌍의 프라이머를 임의로 조합한 3개의 프라이머 세트, 즉 IBB1, IBB2 및 IBB3의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후, 상기 PCR 산물을 전기영동하였다.

상기 장내 유익균 분석 결과에서 수득된 전기영동 결과 모식도를 도 4a~4j에 나타내었다(도 4a~4j). 각 도면에서 맨 좌측은 표준 마커이고 레인 1은 IBB1, 레인 2는 IBB2, 레인 3는 IBB3의 병용 프라이머 세트를 사용한 결과를 나타낸다.

도 4a는 임상검체 1번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 1번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 불가리쿠스와 락토바실러스 델부루엑키 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4b는 임상검체 2번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 2번 수검자의 장내에는 현재 엔테로코커스 패시움과 락토바실러스 가세리 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4c는 임상검체 3번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 3번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 퍼멘텀 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4d는 임상검체 4번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 4번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 카세이 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4e는 임상검체 5번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 5번 수검자의 장내에는 현재 비피도박테리움 롱검과 비피도박테리움 비피덤 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4f는 임상검체 6번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 6번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 락티스 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4g는 임상검체 7번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 7번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 애시도필러스와 비피도박테리움 브레베 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4h는 임상검체 8번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 8번 수검자의 장내에는 현재 락토바실러스 루테리 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4i는 임상검체 9번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 9번 수검자의 장내에는 현재 엔테로코커스 패시움과 락토바실러스 퍼멘텀 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4j는 임상검체 10번을 대상으로 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 10번 수검자의 장내에는 현재 엔테로코커스 패칼리스 유익균이 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

도 4k는 음성 대조군으로 인간 섬유아세포에서 DNA를 추출한 다음, 상기에서 조합된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 후 전기영동한 것으로서, 상기 음성대조군에서는 16종의 장내 유익균을 확인할 수 없었다.

상기 결과는, 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 16종의 유익균을 위양성 및 위음성 오류 없이 정확히 구분해 낼 수 있음을 보여준다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

Claims

하기 식 I로 표시되는 덤벨 구조를 갖는 핵산 증폭용 프라이머:
[식 I]
5'-Ap-Bq-Cr-3'
상기 식에서,
A는 상기 프라이머의 3'-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 5'-저 Tm 특이성 부위를 나타내고;
B는 유니버설 염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 분할 부위를 나타내며;
C는 표적 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 3'-고 Tm 특이성 부위를 나타내고;
p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.
제1항에 있어서,
상기 p는 3 내지 5인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 q는 3 내지 5인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 r은 18 내지 30인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 5'-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 상기 3'-고 Tm 특이성 부위의 Tm보다 낮은 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 분할 부위의 Tm은 상기 5'-저 Tm 특이성 부위의 Tm 및 상기 3'-고 Tm 특이성 부위의 Tm보다 낮은 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 5'-저 Tm 특이성 부위의 Tm은 10 내지 30℃인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 분할 부위의 Tm은 3 내지 10℃인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 3'-고 Tm 특이성 부위의 Tm은 50 내지 65℃인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서,
상기 핵산 증폭용 프라이머가 장내 유익균을 검출하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제11항에 있어서,
상기 장내 유익균이 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 프라이머:
(a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus);
(b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei);
(c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri);
(d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii);
(e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum);
(f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum);
(g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri);
(h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus);
(i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis);
(j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium);
(k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis);
(l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus);
(m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum);
(n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve);
(o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및
(p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis).
제12항에 있어서,
상기 프라이머가 서열번호 1 내지 32로 이루어지는 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 증폭 방법.
(1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계;
(2) 상기 시료를 주형으로, 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 반응 산물로부터, 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 단계
를 포함하는, 생물학적 시료로부터 장내 유익균을 검출하는 방법:
(a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus); (b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei); (c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri); (d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii); (e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum); (f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); (g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri); (h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus); (i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis); (j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); (k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis); (l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus); (m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); (n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve); (o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및 (p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis).
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 핵산 증폭용 프라이머를 포함하는, 장내 유익균 검출용 키트.
(1) 개체로부터 핵산을 포함하는 시료를 채취하는 단계;
(2) 상기 시료를 주형으로, 전술한 핵산 증폭용 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계; 및
(3) 상기 반응 산물로부터, 하기 (a) 내지 (p)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균주로부터 유래된 핵산의 존재 여부를 확인하는 단계
를 포함하는, 맞춤형 프로바이오틱 제품을 선택하기 위한 정보를 제공하는 방법:
(a) 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus); (b) 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei); (c) 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri); (d) 락토바실러스 델부루엑키(Lactobacillus delbrueckii); (e) 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum); (f) 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum); (g) 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri); (h) 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus); (i) 락토바실러스 락티스(Lactococcus lactis); (j) 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium); (k) 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis); (l) 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus); (m) 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum); (n) 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve); (o) 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum); 및 (p) 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis).