KR102029595B1 - 엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 pcr 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase, BSH)에서 유래된 엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것으로, 상기 담즙산염 가수분해효소 (BSH)에서 유래된 4개의 프라이머는 다양한 균들이 혼합된 시료에서 E. faecalis의 오염 여부를 신속하고 정확하게 구별할 수 있으며, nested PCR을 통한 재확인이 가능하여 E. faecalis에 대한 향상된 검출 신뢰도를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 프라이머는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머로 제공될 수 있으며, 상기 프라이머를 이용한 엔테로코쿠스 페칼리스 검출방법 및 검출용 키트로 사용될 수 있다.

Description

엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 PCR 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set of polymerase chain reaction for detecting enterococcus faecalis and uses thereof}
본 발명은 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase, BSH)에서 유래된 엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출방법에 관한 것이다.
간에서 콜레스테롤로부터 만들어진 담즙산은 글리신(glycine) 또는 타우린(taurine)과 결합이 되어 십이지장으로 배출된다. 담즙으로 분비되는 담즙산은 소화장관의 전역에서 흡수되거나 회장 하부로부터 재흡수되어 간장으로 돌아오는 간문맥순환계를 통한 장간 순환(entero hepatic circulation, EHC)을 하는데, 이 때 담즙산의 97%가 이 경로로 재흡수된다.
담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase, BSH, EC 3.5.1.24)의 작용에 의해 분리된 유리형 담즙산은 물에 대한 용해도가 떨어지고 장간 순환에 의하여 재흡수되기보다는 주로 분변으로 배출되는 데, 체내에는 일정량의 담즙산이 유지되어야 하기 때문에 분변으로 배출된 양만큼의 담즙산이 생성되며, 이때 담즙산의 전구체인 콜레스테롤을 이용하게 되므로, 장내 미생물의 BSH 활성은 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 역할을 할 수도 있다고 보고되었다(McAuliffe et al., 2005; Sridevi et al., 2009). 이러한 작용은 담즙산 가수분해효소(BSH)가 아미노기와 카르복실기의 아미드 결합을 끊어주는 역할을 하여 일어난다. 이런 BSH는 장내 균총인 Bifidobacterium bifidum (Kim et al., 2004), Lactobacillus plantarum (McAuliffe et al., 2005), L. acidophilus (Oh et al., 2008; Pinto et al., 2006), Enterococcus (Franz et al., 2001; Knarrebog et al., 2002), Clostridium perfringens (Gospal-Srivastava and Hylemon, 1988), Bacteroides fragilis (Stelling and Hylemon, 1976)에서 생성되는 것으로 보고되었다.
장내에는 여러 종류의 균주들이 존재하는데 그중에서도 유산균의 분포가 특별히 다양하다. E. faecalis는 유산균 중에서도 환경에 따라 병원성을 나타내는 것으로 보고되어 있어 식품 속에서, 또는 장내 세균들 중에서, 그리고 발효 제품 속에서 E. faecalis의 존재를 신속, 정확하게 구별하는 것은 식품 보존 및 건강상 이유로 매우 중요하다.
혼합 균주 속에서 E. faecalis를 신속하게 검출하려면 유전자 차원에서의 분석이 필수적이나, 기존의 당 발효 방법은 배양이 필요하기 때문에 시간이 오래 소요되는 문제가 있다. 따라서 식품 오염 검사 등 신속함이 필요한 검사에서는 바람직하지 않으며, 현재까지는 PCR을 이용한 유전자 분석이 현재로서는 가장 추천할만한 접근 방법이다.
그러나 E. faecalis가 다른 유산균들의 염기서열과 상당히 유사하다는 문제점이 있어 E. faecalis PCR 검출을 위한 특이적인 프라이머 세트의 제작이 요구되고 있다.
대한민국등록특허 제10-0894617호 (2009. 04. 16. 공고)
본 발명은 다양한 미생물균이 혼합된 시료에서 다른 유산균들과 상당히 유사한 염기서열을 가진 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis)를 신속하고 정확하게 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계); 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계); 및 상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제3단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법을 제공한다.
본 발명은 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계); 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계); 상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 제2단계에서 이용한 프라이머 세트에 대한 네스티드 프라이머 (nested primer) 세트를 이용하여 네스티드 PCR (nested PCR)을 수행하는 단계 (제3단계); 및 상기 제3단계의 네스티드 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제4단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 담즙산염 가수분해효소 (BSH)에서 유래된 4개의 프라이머는 다양한 균들이 혼합된 시료에서 E. faecalis의 오염 여부를 신속하고 정확하게 구별할 수 있으며, nested PCR을 통한 재확인이 가능하여 E. faecalis에 대한 향상된 검출 신뢰도를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상기 프라이머는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머로 제공될 수 있으며, 상기 프라이머를 이용한 엔테로코쿠스 페칼리스 검출방법 및 검출용 키트로 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 균들의 gDNA(genomic DNA)에서 1차 프라이머 세트(1F 및 1R)을 이용한 PCR 반응을 수행하여 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis)의 특이적인 밴드를 확인한 결과이다.
도 2는 1차 프라이머 세트(1F 및 1R)와 1차 프라이머 세트에 대한 네스티드 프라이머(2F 및 2R)로 이루어진 4가지 조합의 프라이머 세트로 PCR 반응을 수행하여 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis)의 특이적인 밴드를 확인한 결과이다.
도 3은 다양한 유산균이 혼합된 시료에서 담즙산염 가수분해효소 (BSH)에서 유래된 프라이머 1F 및 2R 세트를 이용한 PCR 반응을 수행하여 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis)의 특이적인 밴드를 확인한 결과이다.
도 4는 E. faecalis의 BSH 유전자 염기서열로 1차 프라이머 세트(1F, 1R) 및 2차 네스티드 PCR 프라이머 세트 (2F, 2R)의 상대적 위치를 표시한 도면이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 1 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머 세트를 제공할 수 있다.
상기 엔테로코쿠스 페칼리스 검출용 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다.
보다 상세하게 상기 프라이머 세트는 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase, BSH)에서 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis; E. faecalis ) BSH 유전자 (GenBank assesion number NP_814299) 염기서열을 바탕으로 표 1과 같이 4개의 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase; BSH) 프라미어를 제작하였다. 프라이머 1F 및 1R (1차 프라이머 세트)는 각각 가장 바깥쪽에 위치하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 전기영동 상에서 약 466 bp의 DNA 밴드를 나타낼 것으로 예상되었으며, 상기 범위 내에서 2차 프라이머 세트(nested primer)인 프라이머 2F 및 2R을 제작하였다.
각각의 균주들이 포함된 소 분변에서 16s rRNA 시퀀싱으로 균들을 유전자 차원에서 동정하고, 이들의 gDNA (게놈 DNA)을 분리한 후 상기 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다.
1차 프라이머 세트인 1F 및 1R의 PCR 반응 후 전기영동 확인 결과, 도 1과 같이 E. faecalis 로 확인된 11번 균주의 PCR 산물에서만 약 466bp의 DNA 밴드가 형성된 것을 확인할 수 있었다. 또한, E. faecalis로 확인된 소 분면 샘플 1종 (11번)을 4가지 조합의 PCR 프라이머 세트 (1F와 1R, 1F와 2R, 2F와 1R 및 2F 및 2R)로 각각 PCR 증폭하였다.
상기 1F와 2R, 2F와 1R 및 2F 및 2R 프라이머 세트는 nested PCR로서 1F와 1R로 증폭한 PCR 산물을 이용하여 신속하고 정확하게 재확인하기 위한 것으로, 전기영동 결과 도 2와 같이 각각 466 bp, 304 bp, 226 bp 및 64 bp DNA 밴드가 확인됨에 따라, 상기 4개의 프라이머는 E. faecalis의 오염 여부를 특이적으로 신속하고 정확하게 구별할 수 있으며, nested PCR을 통한 재확인이 가능하므로, E. faecalis 검출 신뢰도를 향상시킬 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계); 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계); 및 상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제3단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계); 상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계); 상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 제2단계에서 이용한 프라이머 세트에 대한 네스티드 프라이머(nested primer) 세트를 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하는 단계 (제3단계); 및 상기 제3단계의 네스티드 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제4단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법을 제공할 수 있다.
보다 상세하게 상기 네스티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, "네스티드 PCR (Nested polymerase chain reaction; nested PCR)" 은 PCR의 변형으로 타겟 이외의 염기서열에 프라이머가 붙는 비 특이적 결합의 증폭을 줄이기 위한 방법으로, 기존의 PCR은 타겟 DNA 염기서열 끝에 상보적인 프라이머를 필요로 하며, PCR 산물들은 사이클에 따라 증폭되는 데, 일반적으로 프라이머가 타겟 주형 염기 부분이 아닌 부정확한 염기서열 부위에 부착되어 원치않은 가닥을 만들어 내는 문제점이 나타나며, 이러한 문제는 PCR 사이클이 증가할 수록 나타난다. 네스티드 PCR은 특이적인 DNA 증폭을 향상시키기 위해 두 세트의 프라이머가 연속적인 PCR에 사용되는데, 첫번째 PCR 증폭산물은 비 타겟 증폭을 포함할 수 있으므로, 첫번째 PCR 증폭산물을 두번째 PCR의 주형으로 사용한다. 두번째 PCR은 첫번째 PCR 증폭산물 내에 위치하는(nested) 염기서열에 부착하는 이너 프라이머를 사용하여 ‘hemi,semi-nesting’ 방법으로 특이성을 향상시킨다. 이를 통하여 첫번째 PCR 증폭수를 낮추어 사이클 증가에 따른 비 특이적 증폭산물 생성을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> PCR 실험
PCR master mix는 각 균의 DNA 1 ㎕ (250 ng)당 멸균수 13.8 ㎕, 10X Taq 버퍼 2 ㎕, dNTP (10 mM) 1 ㎕, 정방향 프라이머(forward primer; 100 pmole/㎕), 역방향 프라이머(reverse primer; 100 pmole/㎕) 각각 1 ㎕, Taq DNA 중합효소(5 units/㎕) 0.2 ㎕이 첨가될 수 있도록 제작하였다.
사전변성(Pre-denaturation)은 95℃에서 5분간, 변성(denaturation)은 95℃에서 30초, 풀림(annealing)은 47℃에서 30초, 확장(extension)은 72℃에서 30초 반응시켰다. 이 과정을 총 40회 반복한 후, 사후연장(post-extension)을 72℃에서 7분간 수행하였다.
< 실험예 2> 콜로니 PCR 실험
1. 콜로니 DNA 분리
미리 준비해둔 2차 멸균수 10㎕가 담겨있는 1.5ml microfuge 튜브에 멸균된 이쑤시개로 배양된 콜로니를 각각 따서 흔들어 희석하였다. 각각의 microfuge 튜브를 15초씩 볼텍스 믹스한 후 95℃ 열수에서 4분간 고온처리하여 세포벽을 파괴하였다. 그 후, 고온처리한 각각의 microfuge 튜브를 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하고, 상층액을 새 microfuge 튜브에 옮긴 후 4℃에서 보관하였다.
그 후 상기 실험예 1과 같은 과정으로 PCR을 수행하였다.
2. gDNA 분리
각각의 유산균 gDNA 분리를 위해 Macherey-Nagel (Germany)의 Nucleospin microbial DNA kit를 사용하였다.
먼저, microfuge 튜브에 각각 멸균수 30 ㎕를 넣고 각각의 유산균 배양 플레이트에서 멸균된 이쑤시개를 이용하여 콜로니를 따서 접종한 후 1분간 원심분리하고 상층액을 버렸다. 라이소자임(Lysozyme) 극소량을 2차 증류수 100 ㎕에 희석시켜 준비한 다음, kit 내의 용리(Elution) 버퍼 BE 90 ㎕와 라이소자임 10 ㎕를 상층액이 제거된 각각의 microfuge 튜브에 넣고 파이펫팅으로 재현탁하였다. 상온에서 1분 대기한 후, kit의 설명서에 따라 실험을 진행하였으며, 분리해낸 gDNA는 4℃에서 보관하였다.
< 실시예 1> 프라이머 제작 및 확인
엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis; E. faecalis ) BSH 유전자 (GenBank assesion number NP_814299) 염기서열을 바탕으로 표 1과 같이 4개의 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase; BSH) 프라미어를 제작하였다.
프라이머 1F 및 1R (1차 프라이머 세트)는 각각 가장 바깥쪽에 위치하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 전기영동 상에서 약 466 bp의 DNA 밴드를 나타낼 것으로 예상되었으며, 상기 범위 내에서 2차 프라이머 세트(nested primer)인 프라이머 2F 및 2R을 제작하였다.
각각의 균주들이 포함된 소 분변에서 16s rRNA 시퀀싱으로 균들을 유전자 차원에서 동정하고, 이들의 gDNA (게놈 DNA)을 분리하여 PCR 반응을 수행하였다.
1차 프라이머 세트인 1F 및 1R의 PCR 반응 후 전기영동 확인 결과, 도 1과 같이 E. faecalis 로 확인된 11번 균주의 PCR 산물에서만 예상된 바와 같이 약 466bp의 DNA 밴드가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
앞서 E. faecalis로 확인된 소 분면 샘플 1종 (11번)을 4가지 조합의 1F와 1R, 1F와 2R, 2F와 1R 및 2F 및 2R PCR 프라이머 세트로 각각 PCR 증폭하였다.
상기 1F와 2R, 2F와 1R 및 2F 및 2R 프라이머 세트는 nested PCR로서 1F와 1R로 증폭한 PCR 산물을 이용하여 신속하고 정확하게 재확인하기 위한 것으로, 1F와 1R로 증폭한 PCR 산물을 주형으로 하여 상기와 동일한 과정으로 각각의 네스티드 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다.
전기영동 결과 도 2와 같이 각각 466 bp, 304 bp, 226 bp 및 64 bp DNA 밴드가 확인되었다.
한편, PCR 산물을 정제하여 염기서열을 분석한 결과, GenBank에 보고된 E. faecalis BSH 유전자 서열과 99% 이상 일치하는 것으로 확인되었으며, 약간의 차이를 나타낸 이유는 자동 염기서열분석을 수행하여 생긴 오차범위로 추정된다.
Name DNA sequence
(5'→ 3')		 서열번호 Size (bp) TM
(℃)		 GC%
bsh_1F GAA TTC GCT GGG ATT GCT GAT T 1 22 50.85 50
bsh_1R GAA TTC GCA ACC CAA TAC CAC C 2 22 51.66 56.25
bsh_2F GAA TTC CTC CAT TGG CTG TTG G 3 22 51.68 56.25
bsh_2R GAA TTC GTA AGC CTT CTT TCG 4 21 44.66 46.67
< 실시예 2> 혼합 균주를 이용한 프라이머 정확도 확인
다양한 유산균들로 혼합되고 오염되어 있는 상태에서 담즙산염 가수분해효소 (BSH) 프라이머를 이용한 E. faecalis 구별 여부를 확인하였다.
미리 준비해둔 2차 멸균수 50 μl가 담겨있는 두 개의 1.5 ml microfuge 튜브를 준비한 후 각각 멸균된 이쑤시개로 5종의 유산균 (E. faecium , E. gallinarum, L. brevis , L. paracasei , L. plantarum)들의 콜로니를 따서 함께 섞었으며, 다른 하나는 E. faecalis 를 섞지 않았다.
각각의 튜브를 15초간 혼합하고, 95℃ 열수에서 4분간 고온처리하여 세포벽을 파괴한 후 고온처리한 각각의 튜브를 13,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 그 후 상층액을 새 microfuge 튜브에 옮긴 후 4℃에서 보관하였다.
그 후, BSH 프라이머 1F와 2R를 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 3을 참고하면 예상된 바와 같이 E. faecalis 가 섞여있는 콜로니 DNA에서만 304bp의 밴드가 형성된 반면, E. faecalis 가 혼합되지 않은 반응물에서는 비특이적인 밴드 및 프라이머 다이머들로 추정되는 크고 작은 밴드들만 확인되었다.
상기 결과들로부터 상기 BSH 프라이머 1F, 2F, 2R 및 1R와 같은 4개의 프라이머는 E. faecalis 의 오염 여부를 특이적으로 신속하고 정확하게 구별할 수 있으며, nested PCR로 재확인이 가능하여 높은 신뢰도를 나타낼 수 있음이 확인되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION KEIMYUNG UNIVERSITY <120> Primer set of polymerase chain reaction for detecting enterococcus faecalis and uses thereof <130> ADP-2018-0236 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSH 1F <400> 1 gaattcgctg ggattgctga tt 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSH 1R <400> 2 gaattcgcaa cccaatacca cc 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSH 2F <400> 3 gaattcctcc attggctgtt gg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BSH 2R <400> 4 gaattcgtaa gccttctttc g 21

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트로 이루어진 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 프라이머 세트는 담즙산염 가수분해효소 (Bile salt hydrolase, BSH)에서 유래된 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출용 PCR 프라이머 세트.
  4. 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계);
    상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계); 및
    상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제3단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법.
  5. 시료로부터 RNA를 분리하는 단계 (제1단계);
    상기 제1단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 청구항 1의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하는 단계 (제2단계);
    상기 제2단계에서 얻어진 PCR 산물을 주형으로 하고, 상기 제2단계에서 이용한 프라이머 세트에 대한 네스티드 프라이머 (nested primer) 세트를 이용하여 네스티드 PCR(nested PCR)을 수행하는 단계 (제3단계); 및
    상기 제3단계의 네스티드 PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계 (제4단계)를 포함하는 시료로부터 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 네스티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 서열번호 3 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열의 쌍으로 이루어진 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (E. faecalis) 검출방법.
  7. 청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis; E. faecalis) 검출용 키트.
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