KR20180136685A - Lamp를 이용한 장구균 검출용 프라이머 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 장구균을 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 방법을 개시한다. 본원에 따른 프라이머 세트는 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 검체 또는 식품 내 병원체의 감염 또는 오염 여부 검출할 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

Description

LAMP를 이용한 장구균 검출용 프라이머 및 그 용도 {Primers used for LAMP based detection of Enterococcus spp and its use}

본원은 LAMP 방식을 이용한 장구균(Enterococcus)을 정확하고 신속하게 검출하는 프라이머 및 그 용도와 관련된 것이다.

장구균은 조류를 비롯한 다양한 가축, 축산물, 식품 및 사람 그리고 다양한 환경에서 분리되는 구형의 그람양성균이다. 단독, 쌍 혹은 짧은 사슬 모양의 집락 형태를 띠고 있으며 운동성이 없고, 아포를 형성하지 않는 통성 혐기성균이다. 장구균은 조류의 경우 어린 일령에서부터 성숙한 주령에 이르기까지 병원성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 어린 일령에서는 골격계 질병을 비롯하여 세균성 심내막염, 간 육아종, 패혈증 등을 유발한다. 초생추를 입식하여 4주~5주령 사이에 출하하는 어린 일령의 육계 농장에서 경제적 피해를 가져오게 한다. 또한, 계란, 닭고기 등 축산물과 식품의 오염의 균으로도 알려져 있다. 다양한 시료 및 환경에서 분리되는 장구균속 균은 다양한 종(Species)이 알려져 있다. 이들 장구균에 의한 감염원이나 오염원을 정확하게 파악하는 것은 사후 대책 마련과 예방을 위해 중요하다.

장구균을 확인하는 방법으로서 선택배지를 이용한 배양, 생화학적 성상이나 유전학적 성상을 이용하여 최종 동정하게 된다. 이 방법은 배지, 생화학적 시험 장비나 시약, 유전학적 시험에 필요한 장비나 시약이 필요로 하고 시간도 오래 걸린다. 이에 LAMP법을 이용하여 기존의 진단방법보다 특이성이 높고 검출감도가 높으면서도 현장에서의 적용 효율성을 높일 수 있는 진단방법을 개발하고자 하였다. 다양한 시료와 환경으로부터 감염원 혹은 오염원을 명확하게 구명하고 사후 대처 방안을 마련하기 위해서는 다양한 종류의 장구균을 정확하게 검출해 내는 것이 필요하다.

미국 공개특허 2002-0031796 미국 등록특허 6,054,269 미국 등록특허 8,067,207

본원은 높은 민감도와 특이성을 나타내면서도 신속하고 간편하게 장구균(Enterococcus spp)의 감염여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머를 포함하는 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 서열번호 1 내지 4 또는 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus faecium 특이적 프라이머 세트; 서열번호 25 내지 28, 서열번호 37 내지 40 또는 서열번호 43 내지 46으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus faecalis 특이적 프라이머 세트; 서열번호 49 내지 52, 서열번호 55 내지 58 또는 서열번호 61 내지 64로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus hirae 특이적 프라이머 세트; 서열번호 67 내지 70, 서열번호 73 내지 76 또는 서열번호 79 내지 82로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus cecorum 특이적 프라이머 세트; 서열번호 85 내지 88 또는 서열번호 91 내지 94로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus durans 특이적 프라이머 세트; 서열번호 103 내지 106, 서열번호 109 내지 112 또는 서열번호 115 내지 118로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus avium 특이적 프라이머 세트; 서열번호 121 내지 124, 서열번호 127 내지 130 또는 서열번호 133 내지 136으로 표시되는 프라이머를 포함하는 Enterococcus gallinarum 특이적 프라이머 세트.

본원에 따른 프라이머 세트는 신속한 반응을 위해 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 Enterococcus faecium 특이적 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6 또는 17 및 18로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus faecalis 특이적 프라이머 세트는 서열번호 29 및 30, 서열번호 41 및 42 또는 서열번호 47 및 48로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus hirae 특이적 프라이머 세트는 서열번호 53 및 54, 서열번호 59 및 60 또는 서열번호 65 및 66으로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus cecorum 특이적 프라이머 세트는 서열번호 71 및 72, 서열번호 77 및 78 또는 서열번호 83 및 84로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus durans 특이적 프라이머 세트는 서열번호 89 및 90 또는 서열번호 95 및 96으로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus avium 특이적 프라이머 세트는 서열번호 107 및 108, 서열번호 113 및 114 또는 서열번호 119 및 120으로 표시되는 프라이머; 상기 Enterococcus gallinarum 특이적 프라이머 세트는 서열번호 125 및 126, 서열번호 131 및 132 또는 서열번호 137 및 138로 표시되는 프라이머에서 선택된다.

본원에 따른 프라이머 세트는 실시간으로 또는 반응 종결시 증폭산물의 검출을 위해 필요한 경우, 각 세트에 포함된 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 장구균을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 의 감염이 의심되는 대상체의 시료를 제공하는 단계; 본원에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나를 제공하는 단계; 상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 반응 결과물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 이를 장구균의 감염 또는 오염으로 판정하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 프라이머 세트는 장구균의 검출이 필요한 다양한 시료, 예를 들면 가금 농장에서의 골격계 질병 개체, 도축산물에서의 오염개체, 우유 시료, 병원에서의 감염 환자, 다양한 식품 및 환경시료에 대하여 이용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에서 LAMP 반응 결과의 분석은 실시간 또는 반응 종료 후에 모두 가능하며, 증폭 여부는 예를 들면 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용한 측정을 통해 결정되며, 음성 대조군과 비교하여 색이 변화하거나 탁도가 증가한 경우, 증폭이 된 것으로 장구균 양성으로 판단할 수 있다.

본원에 따른 장구균, 즉 엔테로코커스 파에시움, 엔테로코커스 파에칼리스, 엔테로코커스 히레, 엔테로코커스 세코룸, 엔테로코커스 듀란스, 엔테로코커스 아비움 및 엔테로코커스 갈리나리움을 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 장구균 검출 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 감염원 혹은 오염원에서 병원체의 오염 여부를 확인할 수 있다. 이는 수의분야, 식품산업분야, 환경 및 인체분야에서 널리 이용될 수 있으며, 또한 필요한 경우 반응 종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

도 1은 본원의 일 구현예 따른 표 1에 기재된 조합의 엔테로코커스 파에시움 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 2는 본원의 다른 구현예 따른 표 2에 기재된 조합의 엔테로코커스 파에칼리스 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 3은 본원의 또다른 구현예 따른 표 3에 기재된 조합의 엔테로코커스 히레 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 4는 본원의 또다른 구현예 따른 표 4에 기재된 조합의 엔테로코커스 세코룸 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 5는 본원의 또다른 구현예 따른 표 5에 기재된 조합의 엔테로코커스 듀란스 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 6은 본원의 또다른 구현예 따른 표 6에 기재된 조합의 엔테로코커스 아비움 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 7은 본원의 또다른 구현예 따른 표 7에 기재된 조합의 엔테로코커스 갈리나리움 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이도 및 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
상기 각 도면에서 민감도는 적색으로 표시하였다. 각 세트별로 총 7개의 다른 농도 및 음성대조군에서 반응이 수행되었으며 각 농도는 다음과 같다 ; 1:250pg/㎕, 2:50pg/㎕, 3:10pg/㎕, 4:2pg/㎕, 5:400fg/㎕, 6:80fg/㎕, 7:16fg/㎕ 및 8:음성 대조군.

본원은 LAMP 방식을 이용하여 장구균을 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것으로, 본원은 장구균을 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법)으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 장구균 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 검출 방법에 관한 것이다.

한 양태에서 본원은 장구균에 속하는 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3´말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 분석에 사용되는 것이다.

본원에서 용어 “핵산”은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트가 사용되는 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 핵산은 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 일 구현예에서는 DNA를 포함하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 “프라이머”도 “올리고뉴클레오타이드” 및 “폴리뉴클레오타이드”와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.

본원에서 용어 “검출”은 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 오염 또는 감염 여부를 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 분석하는 것으로, 특히 후술하는 LAMP 분석에 기반을 둔 것이다.

본원에서 사용된 용어 “표적” 또는 “표적 핵산”은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.

본원에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. 본원에서는 특히 표 1 내지 표 7에 기재된 각 균주에 특이적인 유전자만을 특이적으로 검출할 수 있다.

LAMP는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법(Notomi, T. et al. 2000. Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체(strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적핵산의 6개 부위 즉, 5′→ 3′방향으로 B3 영역, B2 영역, B1 영역, F1c 영역, F2c 영역 및 F3c 영역 (상기 영역에 상보적인 영역은 B3c, B2c, B1c, F1, F2 및 F3로 표시)에서 특이적으로 고안된 최소 4개 내지 6개의 프라이머 세트가 사용된다 (한국 특허 제612551호; Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고). 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 두 개의 내측 프라이머 FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer)와 두 개의 외측 프라이머 F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer)를 포함한다. 신속한 반응(Accelerated LAMP)을 위해서는 LF(Loop F) 및 LB(Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다.

LAMP 반응은 크게 개시 구조 생산단계, 사이클링 증폭단계와 신장 및 재사용(recycling) 단계를 포함한다. 개시단계에서 내측 프라이머 FIP를 구성하는 F2 부분이 표적핵산의 F2c 영역에 결합하여 반응을 개시한다. 이어 외측 프라이머 F3 프라이머가 표적핵산의 F3c 영역에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 개시되며 이에 따라 단일가닥 핵산이 생성된다. 이 단일가닥은 F1/F1c 결합을 통해 5′말단에 고리를 형성하며, 여기에 두 번째 내측 프라이머 BIP 및 외측 프라이머 B3가 결합하여 DNA 합성 및 가닥교체 DNA 합성이 일어난다. 그 결과 덤벨 모양의 양 말단에 고리가(stem-loop) 형성된 단일가닥이 형성되고, 여기의 F1 영역의 3′말단으로부터 DNA 합성이 시작된다. 이어 사이클링 증폭단계에서는 두 개의 내측 프라이머만이 사용되며, 처음에는 하나의 내측 프라이머가 고리에 결합하여 가닥교체 DNA 합성이 일어나면서 원래의 고리 형성 단일가닥과 고리구조에서 stem 부위가 두 배 늘어난 새로운 고리 형성 단일가닥이 생성되며 이를 주형으로 하여 가닥교체 DNA 합성이 계속 수행되어 증폭산물이 1시간 이내에 약 10⁹개까지 증폭된다. 보다 상세한 원리 및 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB) 프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.

본원에서 용어 “상보적” 또는 “상보성”은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.

본원에서 사용된 용어 “교잡” 또는 “혼성화”는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자 하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것을 참고 할 수 있다.

본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.

본원에서 각 균주에 대한 표적 유전자는 표 1 내지 표 7에 개시된 바와 같으며 각 유전자 부위를 특이적으로 인식하여 높은 민감도로 각 세균을 검출할 수 있도록 디자인 되었다. 본원에서는 상술한 바와 같이 LAMP 반응은 표적 유전자를 검출하기 위해 최소 4개 내지 6개의 프라이머를 디자인하고, 일정한 특이성과 민감도를 만족하도록 프라이머 및 반응 조건을 개시한다.

상술한 바와 같이 표준 LAMP 반응에는 최소 4 종류의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응 (Accelerated LAMP)을 위해서는 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, Loop F 프라이머 (LF), 및 Loop B (LB)프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.

본원에 따른 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 길이가 최소 10 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 15 뉴클레오타이드 이며, FIP와 BIP의 경우 최소 30 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이다. 표적 핵산의 상응하는 부분과 최소 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.

일구현예서 본원에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 138 표시되는 프라이머 및 이와 실질적으로 동일한 것을 포함하며, 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 실질적으로 동일한 서열의 프라이머는 서열번호 1 내지 138로 표시되는 프라이머와 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 특히 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.

본원에 따른 LAMP 프라이머는 표적인 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 핵산에 특이적으로 결합하여 이를 높은 민감도로 검출한다.

본원에 따른 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 히레(Enterococcus hirae), 엔테로코 커스 세코룸(Enterococcus cecorum), 엔테로코커스 듀란스(Enterococcus durans), 엔테로코커스 아비움(Enterococcus avium) 및 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장구균(Enterococcus spp .) 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트는 다음과 같다.

상기 엔테로코커스 파에시움 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 파에칼리스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 19, 25, 31, 37, 또는 43으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 20, 26, 32, 38, 또는 44로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 21, 27, 33, 39, 또는 45로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 22, 28, 34, 40, 또는 46으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 히레 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 세코룸 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 듀란스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 85, 91, 또는 97로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 86, 92, 또는 98로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 87, 93, 또는 99로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 88, 94, 또는 100으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 아비움 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 엔테로코커스 갈리나룸 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시될 수 있으며, 각 균주별 각 프라이머 별로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

선택적으로 상기 각 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함할 수 있다. 상기 엔테로코커스 파에시움 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 또는 17로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12 또는 18로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 엔테로코커스 파에칼리스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 23, 29, 35, 41 또는 47로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 24, 30, 36, 42, 또는 48로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 엔테로코커스 히레 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 53, 59 또는 65로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 54, 60, 또는 66으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 엔테로코커스 세코룸 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 71, 77 또는 83으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 72, 78, 또는 84로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 엔테로코커스 듀란스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 89, 95 또는 101로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 90, 96, 또는 102로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 상기 엔테로코커스 아비움 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 107, 113 또는 119로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 108, 114, 또는 120으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고 상기 엔테로코커스 갈리나룸 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 125, 131 또는 137로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 126, 132, 또는 138로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표시되는 프라이머이며, 각 균주별 각 프라이머 별로 다양한 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus faecium을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus faecium을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 5, 11, 또는 17로 이루어진 군에서 선택되는 LF 및 서열번호 6, 12 또는 18로 이루어진 군에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus faecalis를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 19, 25, 31, 37, 또는 43으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 20, 26, 32, 38, 또는 44로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 21, 27, 33, 39, 또는 45로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 22, 28, 34, 40, 또는 46으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus faecalis를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 19, 25, 31, 37, 또는 43으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 20, 26, 32, 38, 또는 44로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 21, 27, 33, 39, 또는 45로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 22, 28, 34, 40, 또는 46으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 23, 29, 35, 41 또는 47로 이루어진 군에서 선택되는 LF 및 서열번호 24, 30, 36, 42, 또는 48로 이루어진 군에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus hirae를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus hirae를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 53, 59, 또는 65로 이루어진 군에서 선택되는 LF 및 서열번호 54, 60, 또는 66으로 이루어진 군에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus cecorum을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus cecorum을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 71, 77 또는 83에서 선택되는 LF 및 서열번호 72, 78 또는 84에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus durans를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 85, 91, 또는 97로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 86, 92, 또는 98로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 87, 93, 또는 99로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 88, 94, 또는 100으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus durans를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 85, 91, 또는 97로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 86, 92, 또는 98로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 87, 93, 또는 99로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 88, 94, 또는 100으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 89, 95 또는 101에서 선택되는 LF 및 서열번호 90, 96, 또는 102에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus avium을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus avium을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 107, 113, 또는 119에서 선택되는 LF 및 서열번호 108, 114, 또는 120에서 선택되는 LB를 포함한다.

일 구현예에서 본원에서 Enterococcus gallinarum을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP를 포함한다. 다른 구현예에서 Enterococcus gallinarum을 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택되는 F3, 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택되는 B3, 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택되는 FIP 및 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택되는 BIP, 서열번호 125, 131, 또는 137에서 선택되는 LF 및 서열번호 126, 132, 또는 138에서 선택되는 LB를 포함한다.

본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 위해세균의 감염 또는 오염 여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 프라이머 세트 및 방법이 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 가금을 포함한 가축의 병성감정 시료, 도축장 등에서의 도축산물, 각종 축산물 및 축산용수; 식품용수, 음용수, 보존식, 섭취식품, 식재료를 포함하는 각종 식품; 사료; 혈액, 소변, 분변, 또는 체액을 포함하는 가검물; 또는 상수도, 지하수, 공중시설의 물, 도마, 칼, 행주를 포함하는 조리도구 또는 병원에서 사용하는 각종 장비 또는 장치를 포함하는 환경 검체에 대하여 실시될 수 있다.

또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 통상의 시료 수득방법에 의해 직접 수득한 것이거나 또는 미리 분리되어 보관된 것일 수 있다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 시료는 상술한 시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.

본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 방법은 위해 세균이 존재할 가능성이 있는 임의의 시료에서 세균의 검출을 위해 LAMP 방식의 분석에 사용된다.

일 구현예에서 반응물은 총 25 ul에 0.2 uM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 uM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 uM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor) 및 1.0~9.5㎕의 분석이 필요한 시료를 포함한다.

반응물은 이어서 DNA 폴리머라제 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 표적 핵산의 증폭에 적합한 시간으로 반응된다.

증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 정량 또는 정성분석에 사용된다.

또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.

본원에 따른 프라이머 세트는 감염 또는 오염 여부 검출을 위해 위해세균의 감염 또는 오염 여부가 의심되는 다양한 시료에서 오염, 또는 감염 여부의 스크리닝, 존재 유무 검출 및 정량을 위한 다양한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 프라이머를 사용하여 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum을 핵산수준에서 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 핵산의 존재 여부, 핵산 증가, 변화 정도에 따라 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 감염, 오염 또는 항생제 치료를 받는 경우 치료의 효과를 예측할 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.

실시예 1. Enterococcus species 표준균주 확보 및 시료 준비

Enterococcus faecium(ATCC 19434), Enterococcus faecalis(ATCC 29212), Enterococcus hirae(ATCC 8043), Enterococcus cecorum(ATCC 43198), Enterococcus durans(ATCC 19432), Enterococcus avium(ATCC 14025) 및 Enterococcus gallinarum(ATCC 49573)을 ATCC(American Type Culture Collection)와 한국미생물보존센터로부터 확보하여 배양한 후 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)을 제조자의 방법대로 사용하여 DNA를 추출하였다.

실시예 2. Enterococcus species에 특이적인 프라이머 제작

Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 정확한 검출을 위해 RNA polymerase(rpo), aminoglycoside acetyltransferase(aac), D-alanine:D-alanine ligase(ddl), copper ATPase(cop) 및 galactose-1-phosphate uridylyltransferase(galT) 등의 다양한 유전자를 NCBI 및 GenBank에서 수득하여 균주에 특이적인 최종 프라이머를 선정하였다. 구체적으로 E. faecium의 표적으로 D-alanine, D-serine 및 glycine을 세포벽을 통해 이동시키는 역할을 수행하는 유전자 cycA(GenBank accession number, NC_017960), E.faecalis의 표적으로 독소유전자 CylA(GenBank accession number, JQ794947) 및 갈락토오스를 글루코오스로 전환시키는 효소 galactose-1-phosphate uridylyltransferase(GenBank accession number, CP008816), E. hirae의 표적으로 세포 내에서 copper의 항상성을 조절하는 유전자 copper ATPase(GenBank accession number, Z46807), E. cecorum의 표적으로 DNA를 주형가닥으로 이용하여 RNA로 만들어지기 위한 전사과정에서 반드시 필요한 RNA polymerase(GenBank accession number, AJ843524), E. durans의 표적으로 kanamycins A 및 B, neomycin, netilmicin, sisomicin, 및 tobramycin 등의 6‘ 아미노기의 아세틸화를 촉매하는 aminoglycoside N-acetyltransferase 유전자(GenBank accession number, NG_047300), E. avium 및 E. gallinarum의 표적으로 세균의 세포벽을 구성하는 주성분인 펩티도글리칸의 합성에 관여하는 D-alanine:D-alanine ligase(GenBank accession number, EU999032 및 AY971751) 유전자를 기반으로 F3, B3, FIP, BIP, LF 및 LB의 각 프라이머 별로 프라이머를 제작하여 LAMP 증폭용 프라이머 세트를 완성하였다 (표 1 내지 표 7). 각 프라이머 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information), Genbank 및 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)를 이용하여 검증한 결과 해당 균주 외에는 일치하는 염기서열이 존재하지 않았다. 각 프라이머 세트는 LAMP 반응에 최적화되도록 디자인 및 조합된 것으로 특이성 및 민감도 측면에서 우수한 효과를 나타냈다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6]

[표 7]

실시예 3. LAMP 반응의 특이도 및 민감도 확인

우선 6 종류의 프라이머 조합 중 붉은색으로 표시된 1개 조합 (표 1 내지 표 7 참고)을 이용하여 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 균주간의 교차반응을 통해 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 특이도를 확인하였다 (도1a, 도2a, 도3a, 도4a,도5a, 도6a 및 도7a).

이를 위해 실시예 1에서 확보한 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum 과 기타 21종의 균주들 및 3종의 바이러스에서 유전체를 추출한 후 각각의 DNA를 25ng/ul로 준비하였다. 이어 LAMP 분석을 위해 Mmiso DNA amplification kit(Mmonitor)을 사용하여 총 부피 25 μl에서 0.2 μM의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO₄, 1.4 mM dNTPs, 1× ThermoPol reaction buffer (Mmonitor), 8 U Bst DNA polymerase (Mmonitor) 및 1μl의 상기 분리한 DNA를 포함하는 조성의 용액을 사용하였다. 상기 조성으로 63℃에서 35분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.

결과는 도 1a, 도 2a, 도 3a, 도 4a, 도 5a, 도 6a 및 도 7a에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트는 다른 유사한 균주에는 교차반응을 하지 않으며, 해당 균주만 특이적으로 검출하는 것으로 나타났다. 상기 결과는 다른 조합의 프라이머 세트(표 1 내지 표 7)로 특이성도 충분히 나타낼 수 있다.

다음으로 각 조합의 프라이머 세트(표 1 내지 표 7)의 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum에 대한 민감도를 확인하였다. 이를 위해 상기와 같이 준비한 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus hirae, Enterococcus cecorum, Enterococcus durans, Enterococcus avium 및 Enterococcus gallinarum의 유전체를 ㎕ 반응액 중에 250pg, 50pg, 10pg, 2pg, 400fg, 80fg, 16fg의 농도로 사용하여 동일한 조성에서 63℃에서 30~35분 동안 등온증폭을 실시한 뒤 80℃에서 5분간 반응하고 반응물의 색 변화와 전기영동 결과로 민감도를 확인하였다(도1b, 도2b, 도3b, 도4b, 도5b, 도6b 및 도7b).

따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg²⁺ 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화가 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응

본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.

도 1b 내지 도 7b에 기재된 바와 같이 본원에 따른 프라이머 세트를 이용한 균의 검출은 민감도가 Enterococcus faecium의 유전체 DNA를 이용한 경우 10pg 내지 400fg ; Enterococcus faecalis의 유전체 DNA를 이용한 경우 50pg 내지 400fg ; Enterococcus hirae의 유전체 DNA를 이용한 경우 2pg 내지 400fg ; Enterococcus cecorum의 유전체 DNA를 이용한 경우 50pg 내지 2pg ; Enterococcus durans의 유전체 DNA를 이용한 경우 10pg 내지 2pg ; Enterococcus avium의 유전체 DNA를 이용한 경우 2pg 내지 400fg 및 Enterococcus gallinarum의 유전체 DNA를 이용한 경우 50pg 내지 2pg으로 매우 높은 것으로 나타났다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primers for LAMP based detection of Enterococcus and its use <130> DP201704002P <160> 138 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 1 acctaatgca atcagttcag g 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 2 caccaataac cattcttttc tgg 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 3 acctaatgca atcagttcag g 21 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 4 cgatacccag cagaaccaat acgtgcagaa tatcttggca aaaaagc 47 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 5 ggaatgtatg tacgctactg ggc 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 6 tccagccagt gatgaaagcc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 7 cctaacgcac gcataatga 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 8 tgaagagcaa gaactgcag 19 <210> 9 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 9 ggaaagtcta tccagctagc tgaaacagat gcatccagta ataa 44 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 10 gaacctaaaa acaaccccgt tactgaaaaa tagacatgtc caact 45 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 11 cccttcgata ttgctcgcct atc 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 12 ccaatcgctc cgccaataga aat 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 13 tgttaaatcg gccattgcaa 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 14 tcgatattgc tcgcctatct ta 22 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 15 cagaatatct tggcaaaaaa gctcgatacc cagcagaacc aat 43 <210> 16 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 16 tccagaaaag aatggttatt ggtggatgca tctgtttttt cattatgcg 49 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 17 ctttcatcac tggctggacg t 21 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cycA <400> 18 tgataacaga agttcgccta acgc 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 19 cgacgaaaga tttactgtag aag 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 20 cctgcaggac catatataga tac 23 <210> 21 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 21 gtgcttatat cacgcgactc atcattcaga aaagctgtta actatgc 47 <210> 22 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 22 aacatatacc aggaggacta gagtgaatag tcagcaatat caccactc 48 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 23 ttcctgctga tgcaacaatt agaatg 26 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 24 ctgtaattac cgtcggagct aca 23 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 25 aaacgtgagt cttggatcat a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 26 tcaccactct tttttgtagc t 21 <210> 27 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 27 cctgctgatg caacaattag aatgggaaat agacgacgaa agatttac 48 <210> 28 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 28 tgagtcgcgt gatataagca ctcgacggta attacagact cta 43 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 29 gcatagttaa cagcttttct gaatgctt 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 30 ggtaatgaaa aacatatacc aggaggac 28 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 31 acatatacca ggaggactag ag 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 32 ctttgcctag tggagaaact 20 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 33 tgcaggacca tatatagata catttctgta attaccgtcg gagctac 47 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 34 ggaggatatg gtgacaatta caaagcgatg tagggtaata agtcatc 47 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 35 ttagaatagt cagcaatatc accactc 27 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium cylA <400> 36 taacaggaca aattgatgct cgtg 24 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 37 actataatga gcatgcgatt ttc 23 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 38 ccattggaaa tgtatgacgt c 21 <210> 39 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 39 taactccgta attttaagga gcggaccaac aacatcgaga aatg 44 <210> 40 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 40 tccctgaata ttttgtgggc tctgcttggt aatgatcatg agata 45 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 41 cgctggaacg tttttttctc g 21 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 42 gcagatttgc caattgttgg tg 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 43 tatcctgaga taactgctgg ta 22 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 44 gcaattggcg taatcgtatg 20 <210> 45 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 45 taattcggcc gcctcaacta gttttaaaat ggccgatgtc tgtg 44 <210> 46 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 46 gaccaaatgg cgcaattatt ctgggtgtgc catcttctga atagg 45 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 47 ctcttgacga tcactttgaa gacg 24 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus faecium galT <400> 48 gaacgtgtct cagttcggg 19 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 49 gagtggagga ggaataagat g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 50 ttcgatgatc cagttctcat g 21 <210> 51 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 51 gaatctttgc cgtttcttga ataggatagt aattttagga caaagtggc 49 <210> 52 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 52 cccttagatt ttttatggca tgggccataa agttttcttg ctctag 46 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 53 cttgccagtg tcgattttcc ag 22 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 54 gattatagtg aaaaggcaca agtttgg 27 <210> 55 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 55 ttccgcatta gccttctc 18 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 56 ccatttcact aattcgttca tgtc 24 <210> 57 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 57 ttcgtttacg taaccatgaa ggtcgatgca ccactgaaaa tttta 45 <210> 58 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 58 ggaacactcg tcaatggcta tttttgattc caaaaatggg tagt 44 <210> 59 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 59 aacaaattct ggatctgcat ctgc 24 <210> 60 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 60 gactgggatt ttagttagca tcatcat 27 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 61 gtgaagaatc caaaggttgg t 21 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 62 gcaatcgctg gtaagatcat 20 <210> 63 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 63 tactcgactt tgggaaccat tcggtgcttg gtgttttgcc ttt 43 <210> 64 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 64 tgcggctgat cctaaagctt ggcccaacat gatcaaaata attggt 46 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 65 ccagaataca agcaaaagcg gt 22 <210> 66 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus hirae copA, copY, copZ <400> 66 ggttccagtt gatctcaaat gtcg 24 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 67 attgtacgga tctgaagaaa aaac 24 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 68 tcagcttgaa cgtaaccac 19 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 69 tctttgttta agatttcaac atcagtcgat attactggtc cagcagttg 49 <210> 70 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 70 tatgtacatt tgtacagtca gtgaacctgc tttcactttt aggcg 45 <210> 71 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 71 caacgataat gtcacctgca gtta 24 <210> 72 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 72 aggtgctaca ttccgtgct 19 <210> 73 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 73 ccttaaaatt gtacggatct gaag 24 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 74 ttcgtcagct tgaacgtaa 19 <210> 75 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 75 gtttaagatt tcaacatcag aatcgaaatc gatattactg gtccagca 48 <210> 76 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 76 gatatgtaca tttgtacagt cagtacctgc tttcactttt aggcg 45 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 77 cgataatgtc acctgcagtt acaa 24 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 78 gaaggtgcta cattccgtgc 20 <210> 79 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 79 aaggtgctac attccgtg 18 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 80 acttgtcgaa atcatcacga c 21 <210> 81 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 81 ccgattggca tatcttcagt cctaaaagtg aaagcaggtc g 41 <210> 82 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 82 tgttcttcct gttgattcaa tctaacctac acgtgtgttt tcaacttg 48 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 83 cgtcagcttg aacgtaacca 20 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus cecorum rpoA <400> 84 cacacctgtt cgtcgtgtaa a 21 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 85 gagattgact tggccagat 19 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 86 ggtacatact ttcgacgact 20 <210> 87 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 87 gcagagacgg cgatcctttc agaatacggt gaacagccga tg 42 <210> 88 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 88 tcgaaggaga tgagctgatt gggatgcagt tcccaaccag tttg 44 <210> 89 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 89 tcttccagca gtcgctctac ttc 23 <210> 90 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 90 gtcggtgcga ttccacaata tgg 23 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 91 ggatagcggg atgattatca g 21 <210> 92 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 92 gcaccgacaa aaccaatc 18 <210> 93 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 93 ttcatctggc caagtcaatc tctgagtttg atcgtgataa tttggt 46 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 94 gtgaacagcc gatgaaagaa gtactcatct ccttcgattg cag 43 <210> 95 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 95 aaaagatcgg ctaattggtc acgt 24 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 96 cgactgctgg aagatgaaag ga 22 <210> 97 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 97 cgttgtctat ttaggaactg atga 24 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 98 gccatccaaa tatctggctt 20 <210> 99 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 99 ttgaatcgtt tcaagcttgt catgtggaag ggcaaacaag ct 42 <210> 100 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 100 aggaaagatc atccttatga attcccagcc attcgcatcc ggaatta 47 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 101 ttcaaacagg tcttcttcaa tcgc 24 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus durans aac(6') <400> 102 cttggctatc agatcgttgg g 21 <210> 103 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 103 tttgtcaaac cggcgaata 19 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 104 aatgcttctt cctttacgac c 21 <210> 105 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 105 agctcttgaa tcatagcgat aagcgggctc tagcgtagga atttcacg 48 <210> 106 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 106 ttagttgagc aaggcatcga tgctatgtcg tccgcacatc gtcatt 46 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 107 caatgcgttt tgcagttctt cgc 23 <210> 108 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 108 gtgagattga agttgcggtt ttaggc 26 <210> 109 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 109 tgaagatggc acgattcaa 19 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 110 cctcacattt atcaaaaatt tgtttagg 28 <210> 111 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 111 tgtccattgc acaagcactc gttcttagag acattggata tgcct 45 <210> 112 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 112 gacgaaatac attttgcagg cagcttggtt ttttaggact ggaacg 46 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 113 tcattacacc cgcaccaacg 20 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 114 gcatcccgca ggttcctta 19 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 115 ttgataaatg tgagggaacg tt 22 <210> 116 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus avium ddl <400> 116 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gallinarum ddl <400> 122 cataaggcat accgatggtc 20 <210> 123 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 123 ttgatctcac caggttggat caaagaagtg ttgaatctga cgga 44 <210> 124 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 124 gaagaggatg cgattgtttt tccgaaaacc ttggatcgtt ccatctt 47 <210> 125 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 125 cgtcccttgg taagccgaa 19 <210> 126 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 126 tgctccacgg accaaatgg 19 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 127 aaggcagtct tttgtatcca atg 23 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 128 gtacgcacat cttcatttcc a 21 <210> 129 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 129 gtgcattttg caattcttcc cgtttatcaa acccgccaat atggg 45 <210> 130 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 130 gaagcctacc gttatgatac acaacagcga cttcgatttc gcg 43 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 131 cagcttttgt gatcccaaca cttg 24 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 132 cgatcgtaga acaagggatc gaa 23 <210> 133 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 133 caattcgaag tatcttgaca ataag 25 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 134 ggcatcgtgt tcaattcatt 20 <210> 135 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 135 taagcctttt tggcaaactc ttggagatgc agatcccagc tcaaa 45 <210> 136 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 136 tacgatgctt ggaggaagcg gcaggaataa ttcgtttttg ttcgtc 46 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 137 gctttcgctt gtgtctcctc ag 22 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB primer for LAMP detection of Enterococcus gallinarum ddl <400> 138 ctcagccgct gcgacttttt 20

Claims (10)

1. F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머를 포함하는, 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 히 레(Enterococcus hirae), 엔테로코커스 세코룸(Enterococcus cecorum), 엔테로코커스 듀란스(Enterococcus durans), 엔테로코커스 아비움(Enterococcus avium) 및 엔테로코커스 갈리나룸(Enterococcus gallinarum)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 장구균(Enterococcus spp.) 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트로,
   상기 엔테로코커스 파에시움 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 1, 7, 또는 13으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 2, 8, 또는 14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 3, 9, 또는 15로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 4, 10, 또는 16으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 파에칼리스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 19, 25, 31, 37, 또는 43으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 B3 프라이머는 서열번호 20, 26, 32, 38, 또는 44로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고, 상기 FIP 프라이머는 서열번호 21, 27, 33, 39, 또는 45로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고, 상기 BIP 프라이머는 서열번호 22, 28, 34, 40, 또는 46으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 히레 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 49, 55, 또는 61로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 50, 56, 또는 62로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 51, 57, 또는 63으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고; 및 상기 BIP 프라이머는 서열번호 52, 58, 또는 64로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 세코룸 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 67, 73, 또는 79로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 68, 74, 또는 80으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 69, 75, 또는 81로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 70, 76, 또는 82로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 듀란스 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 85, 91, 또는 97로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 86, 92, 또는 98로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 87, 93, 또는 99로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 88, 94, 또는 100으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 아비움 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 103, 109, 또는 115로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 104, 110, 또는 116으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 105, 111, 또는 117로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 106, 112, 또는 118로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고,
   상기 엔테로코커스 갈리나룸 검출을 위한 상기 F3 프라이머는 서열번호 121, 127, 또는 133으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 B3 프라이머는 서열번호 122, 128, 또는 134로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 상기 FIP 프라이머는 서열번호 123, 129, 또는 135로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되고; 그리고 상기 BIP 프라이머는 서열번호 124, 130, 또는 136으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 프라이머로 표시되는 것인, 장구균(Enterococcus spp.) 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는 LF 프라이머 및 LB 프라이머를 추가로 포함하며,
   상기 엔테로코커스 파에시움 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 5, 11, 또는 17로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 6, 12 또는 18로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
   상기 엔테로코커스 파에칼리스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 23, 29, 35, 41 또는 47로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 24, 30, 36, 42, 또는 48로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
   상기 엔테로코커스 히레 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 53, 59, 또는 65로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 54, 60, 또는 66으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
   상기 엔테로코커스 세코룸 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 71, 77, 또는 83으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 72, 78, 또는 84로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
   상기 엔테로코커스 듀란스 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 89, 95 또는 101로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 90, 96, 또는 102로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며;
   상기 엔테로코커스 아비움 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 107, 113, 또는 119로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 108, 114, 또는 120으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이며; 그리고
   상기 엔테로코커스 갈리나룸 검출을 위한 상기 LF 프라이머는 서열번호 125, 131, 또는 137로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머이고, 상기 LB 프라이머는 서열번호 126, 132, 또는 138로 이루어진 군에서 선택된 하나로 표시되는 프라이머인,
   장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나 인, 장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트:
   상기 엔테로코커스 파에시움을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 파에칼리스를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 ; 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 및 서열번호 40으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 ; 또는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45 및 서열번호 46으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 히레를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51 및 서열번호 52로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57 및 서열번호 58로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63 및 서열번호 64로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 세코룸을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69 및 서열번호 70으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75 및 서열번호 76으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81 및 서열번호 82로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 듀란스을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87 및 서열번호 88로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99 및 서열번호 100로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 아비움을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105 및 서열번호 106으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111 및 서열번호 112로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117 및 서열번호 118로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고; 그리고
   상기 엔테로코커스 갈리나룸을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123 및 서열번호 124로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129 및 서열번호 130으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135 및 서열번호 136으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
   
4. 제 2 항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는 다음 중 어느 하나인, 장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트:
   상기 엔테로코커스 파에시움을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 파에칼리스을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 36으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 43, 서열번호 44, 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 히레를 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 53 및 서열번호 54로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59 및 서열번호 60으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65 및 서열번호 66으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 세코룸을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71 및 서열번호 72로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77 및 서열번호 78로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83 및 서열번호 84로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 듀란스을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 85, 서열번호 86, 서열번호 87, 서열번호 88, 서열번호 89 및 서열번호 90으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 93, 서열번호 94, 서열번호 95 및 서열번호 96으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 97, 서열번호 98, 서열번호 99, 서열번호 100, 서열번호 101 및 서열번호 102로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고;
   상기 엔테로코커스 아비움을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 103, 서열번호 104, 서열번호 105, 서열번호 106, 서열번호 107 및 서열번호 108로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 109, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 112, 서열번호 113 및 서열번호 114로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 115, 서열번호 116, 서열번호 117, 서열번호 118, 서열번호 119 및 서열번호 120으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되고; 그리고
   상기 엔테로코커스 갈리나룸을 검출하기 위한 프라이머 세트는 서열번호 121, 서열번호 122, 서열번호 123, 서열번호 124, 서열번호 125 및 서열번호 126으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 서열번호 127, 서열번호 128, 서열번호 129, 서열번호 130, 서열번호 131 및 서열번호 132로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는 서열번호 133, 서열번호 134, 서열번호 135, 서열번호 136, 서열번호 137 및 서열번호 138로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 중에서 선택되는 것인, 장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
   
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것인, 장구균 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
   
6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용한 인비트로에서 LAMP 방식으로 장구균을 검출하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함하는 방법:
   장구균 감염 또는 오염이 의심되는 시료를 제공하는 단계;
   제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 제공하는 단계;
   상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및
   상기 LAMP 반응 중 또는 종료 후에 반응 결과물을 분석하고, 이를 음성 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 장구균 감염 또는 오염으로 판정하는 단계.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 시료는 가금을 포함하는 가축의 병성감정 시료, 도축산물, 축산물 및 축산용수, 우유, 혈액, 분변, 소변 또는 체액을 포함하는 가검물, 식재료, 식품, 사료, 식품용수, 또는 음용수, 또는 공중시설의 물, 조리도구 또는 병원기구를 포함하는 것인, 방법.
   
8. 제 6 항에 있어서,
   상기 LAMP 반응 결과물의 분석은 상기 반응 결과물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
   
9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 방식을 이용한 장구균 검출용 조성물.
   
10. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 LAMP 방식을 이용한 장구균 검출용 키트.

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