KR101999070B1 - 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome)과 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus) 병원체의 동시 진단용 멀티플렉스(Multiplex) PCR 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome)과 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus) 병원체의 동시 진단용 멀티플렉스(Multiplex) PCR 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공함으로써 양식 새우에서 빈번하게 발생하는 AHPND/EMS와 WSSV를 동시에 진단할 수 있어 조기 질병에 대한 대책 마련을 할 수 있음은 물론, 조기에 검출로 피해를 줄일 수 있는 효과가 있다.

Description

새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome)과 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus) 병원체의 동시 진단용 멀티플렉스(Multiplex) PCR 프라이머 세트 및 이의 용도 {multiplex PCR primer set and methods for diagnosing White spot syndrome virus and Early mortality syndrome}
본 발명은 새우 양식에 큰 피해를 입히는 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS, 급성간췌장 괴사증 Acute hepatopancreatic necrosis disease; AHPND)와 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus; WSSV) 병원체를 Multiplex PCR로 동시에 검출하여 새우양식 초기에 발생하는 두 질병을 조기에 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.
세계 새우양식장에서 심각한 피해를 입히고 있는 AHPND(Acute hepatopancreatic necrosis disease)는 '조기치사증후군 (Early mortality syndrome; EMS)'라는 질병의 원인으로 알려져 있다. 새우 종자를 입식하고 나서 30일 이내에 발생하는 초기 대량 폐사를 통칭하여 붙여진 명칭이었으며, 이후 질병의 원인체가 밝혀져 AHPND라는 질병명이 공식화되었다.
EMS/AHPND는 치하 입식 후 30일 이내에 100% 치사하는 경우도 있으며, 주된 증상으론 비정상적인 유영 또는 호지의 바닥 근처에서 유영하고, 성장이 둔화되고 간췌장이 흰색으로 변하면서 크기도 작아진다. 외골격도 부드러워지고 간췌장에 흑색 반점이나 줄이 생긴다. 2009년 중국을 시작으로 베트남, 말레이시아, 태국등에서 질병이 보고되었고 최근 필리핀도 양성국가로 분류됨에 따라 우리나라도 질병관리가 시급하다.
이 병은 해수상존 세균 중 하나인 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 의 감염에 의해 발생한다. 비브리오 파라헤모라이티쿠스는 대표적인 해수 새균으로 전 세계의 하구와 해양 환경에서 분리되기도 하며, 정상 새우도 존재한다. 일부는 내열성 장독소 (enterotoxin)를 가지고 있어서 사람에게 식중독을 일으키는 병원체인 '장염비브리오균'으로도 불린다.
비브리오 파라헤모라이티쿠스는 세균 플라스미드를 가지고 있고, 이 플라스미드 내에는 특이적으로 곤충 독소를 만드는 유전자가 존재한다. 새우와 곤충은 먼 친척관계이므로, 변형된 곤충 독소가 새우에서 간췌장을 공격하여 폐사를 일으킨다.
감염 경로로는 주로 새우의 구강을 통해 감염되어 위에 붙어서 증식하며 독소를 형성하고, 위에서부터 EMS의 주요 장기인 간췌장으로 독소가 이동하여 장기를 망가뜨림으로써 새우가 사료를 섭취 및 소화하지 못하며 폐사한다.
따라서 EMS는 독성물질 발현 유전자를 가지고 있는 경우에만 병원성을 가지기 때문에 단순하게 비브리오를 검출하는 진단방법으로는 검출하기 어렵고, 플라스미드를 증폭하는 방법이 보고되기도 했지만 비브리오가 플라스미드는 가지고 있지만 독소 유전자가 없는 경우가 있어 100%정확하다고 판단하기는 어렵다.
AHPND 균주에서는 인간에 병원성을 나타내는 내열성 용혈소 관련 유전자는 발현하지 않았고, Type VI secretion system (T6SS)에 관여하는 두 가지 유전자 (Pir A/B toxin genes)가 발현하여 이 유전자가 AHPND의 병원성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한 기존에 원인체로 보고된 "V. parahaemolyticus (VPAHPND) 뿐만 아니라 Pir toxin (PirA, PirB)을 생성하는 plasmid를 가지고 있는 비브리오 하베이(V. harveyi) 균에 의한 감염"이라고 정의하고 있다.
최근 흰다리새우에서 종자를 입식한 후 대량 폐사가 발생하여 전 세계적으로 생산량과 가격의 변동을 가져오고 있다. 때문에 전 세계 새우 생산량과 가격의 변동이 매우 심했는데, 주요 원인으로 새우전염병인 급성간췌장괴사증 (AHPND)이 지목되었기 때문에 이를 해결하고자 하는 연구가 필요하다. 또한 AHPND의 경우 높은 감염률과 높은 폐사율로 인해 적은양의 원인균이라도 심각한 피해를 입을 수 있으므로 초기에 고강도로 신속하게 진단할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
한편, 새우 양식의 생산성 저하의 주요 원인중 하나인 새우 흰반점 증후군(White spot syndrome)은 White spot syndrome virus에 의해 감염되며 전 세계의 새우양식장에 전파되어 심각한 손실을 가져오고 있다.
WSSV는 새우류 뿐만 아니라 가재류, 게류등에도 감염되어 숙주 범위가 매우 넓다. White spot syndrome virus는 Whispovirus속의 이중나선 형태의 dsDNA virus로 유전체 크기는 약 290~305kb이다. WSSV 균주를 주사하여 공격실험 할 경우 WSSV에 감염 된 새우는 외골격과 표피에 흰 반점이 생기며 3일~10일안에 100% 폐사하기도 한다.
WSSV를 억제하기 위한 대안으로 복합양식을 하기도 하는데 틸라피아, 숭어, 밀크피쉬등의 어류나 가리맛조개, 바지락 등의 패류를 이용하기도 한다. 복합 양식 시 새우의 먹이 찌꺼기나 미세 유기물입자를 여과 섭식해 수질 안정화에 기여하거나 육식성 어류의 경우 활력이 저하된 새우를 포식하여 질병 확산을 억제시키기도 한다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 아직까지 WSSV는 새우 양식장에서 빈번하게 발생되어 새우 양식에 있어 해결되어야 할 큰 문제점이다.
WSSV는 전염성이 강하고 대량 폐사하기 때문에 조기 진단을 목적으로 in situ hybridizaton, 면역학적방법, PCR등이 개발되고 있으나 민감도와 정량화 부분에서 제약이 있어왔다.
따라서 새우 양식에서 가장 큰 문제점을 가지는 AHPND(EMS)와 WSSV를 동시에 검사할 수 있도록 multiplex PCR을 이용하여 조기에 질병 감염 여부를 확인해 적절한 초기 조치를 취할 수 있도록 하는 것이 폐사율을 낮추는데 기여할 것으로 사료된다. 이와 관련된 선행문헌으로는 Diseases of Aquatic Organisms에 게재된 'Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp' 독소 유전자만을 증폭하여 EMS를 진단하는 구성이 게시된 논문이 있고, 국내 등록특허번호 제10-1503511호에는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트에 관하여 게시되어 있으나, 상기 선행문헌은 본 발명의 AHPND/EMS와 WSSV 원인체인 Vibrio parahaemolyticus와 White spot syndrome virus를 동시에 검출할 수 있는 구성에 관하여 게시되어 있지 않아 차이를 보인다.
국내 등록특허번호 제10-1503511호에는 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용될 수 있는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다. Photorhabdus insect-related (Pir) toxin-like genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus, the causative agent of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) of shrimp. Diseases of Aquatic Organisms. Han 외 3명. 113(1):33-40 ㅇ February 국내 등록특허번호 제10-1392305호에는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 WSSV(white spot syndrome virus) 및 HPV(hepatopancreatic parvovirus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 및 HPV의 동시 진단용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 WSSV와 HPV를 동시에 진단하는 방법, 서열번호 1 및 2로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 진단용 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 HPV 진단용 프라이머 세트에 관하여 개시하고 있다. 국내 등록특허번호 제10-1521381호에는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트는 리얼타임 PCR을 이용하고, 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 표적 유전자인 tlh 유전자를 이용하여 종 수준에서 확인할 수 있고 tdh 유전자 및 trh 유전자를 이용하여 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위한 정량적 분석도 가능한 리얼타임 ＰＣＲ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트에 관하여 개시하고 있다.
본 발명은 AHPND/EMS와 WSSV 원인체인 Vibrio parahaemolyticus와 White spot syndrome virus를 각각 검사하여 확인함에 따라 소요되는 시간을 줄이고자 두가지 병원체를 동시에 검출 할 수 있는 Multiplex PCR을 이용하여 신속하게 분자생물학적으로 진단하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트는 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease)의 원인체인 Vibrio parahaemolyticus에 특이적인 서열번호 1 및 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus; WSSV)에 특이적인 서열번호 5 및 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 키트는 상기 프라이머 세트 및 멀티플렉스 중합연쇄효소반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)을 동시에 진단하는 방법은 (a)새우에서 DNA를 분리하는 단계; (b)상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제를 첨가하여 상기 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및(c)상기 (b)단계의 증폭 산물을 동정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus) 진단을 위한 멀티플렉스 중합연쇄효소반응용 조성물은 상기 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 멀티플렉스 프라이머 세트는 양식 새우에서 빈번하게 발생하는 AHPND/EMS와 WSSV를 동시에 진단할 수 있어 조기 질병에 대한 대책 마련을 할 수 있음은 물론, 조기에 검출로 피해를 줄일 수 있는 효과가 있다.
도 1은 AHPND/EMS와 WSSV multiplex PCR 산물 전기영동 결과를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어지는 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어, "진단"이란 감염이 의심되는 개체를 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 조성물로 테스트하여 감염여부를 판단하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 감염이 의심되는 개체는 새우일 수 있다.
본 발명의 용어 "프라이머 쌍(a pair of primers)"이란 진단대상 유전자를 PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 쌍을 이루어 반응하여 PCR 산물을합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 쌍이 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.
본 발명의 용어 "멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction)"이란 커다란 유전자에서 결실 또는 중복을 빠르게 검출하기 위하여 고안된 변형된 PCR을 말한다. 상기 과정은 복수의 프라이머 쌍과 온도-매개 DNA 중합효소를 이용하여 열적 순환에 의해 유전체 DNA(genomic DNA)를 증폭시킨다.
즉, 온도를 주기적으로 변화시키면서 온도에 따른 DNA 중합효소의 활성에 의해 DNA를 증폭시키는 것으로 기본적인 작용기전은 PCR과 동일하다. 최초의 멀티플렉스 PCR은 디스트로핀 유전자의 결실을 검출하기 위하여 고안되었으나, 이후 SNP 분석 등에도 활용되고 있다. 멀티플렉스 PCR은 각기 다른 DNA 서열에 특이적으로 반응하여 다양한 크기의 증폭산물을 생산할 수 있는 프라이머 쌍을 복수 개로 포함하여 구성된다. 한번에 복수의 유전자를 표적으로 함으로써 단회 시험으로 서너번 반복하여 수행한 것과 같이 추가적인 유전자 정보를 획득할 수 있다.
이하, 본 발명의 새우 조기폐사 증후군(Early mortality syndrome; EMS), 급성간췌장 괴사증 (Acute hepatopancreatic necrosis disease; AHPND)와 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus; WSSV) 병원체의 동시 진단용 멀티플렉스(Multiplex) PCR 프라이머 세트 및 이의 용도와 관련한 실험 실시예에 의해 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실험예 1> 병원체 유전자 클로닝 Cloning
AHPND/EMS와 WSSV 검출을 위한 감염된 개체 샘플링 및 병원체 유전자 클로닝 AHPND/EMS 원인체인 Vibrio parahaemolyticus를 클로닝 하기 위한 primer는 GenBank accession numbers: AB972427.1를 이용하여 제작하였으며, WSSV를 클로닝 하기 위한 primer는 GenBank accession numbers: AF369029.2를 사용하여 제작하였다.
하기의 표 1은 AHPND 클로닝용 primer를 나타내고 표 2는 AHPND 클로닝 결과를 나타낸다. 또한, 표 3은 WSSV 클로닝용 primer를 나타내고, 표 4는 WSSV 클로닝 결과를 나타낸다.
AHPND 클로닝용 primer
No. Primer Name Sequence (5'-3') Len. 농도
(umol) 		Size
1 EMS_F GAGTTAAACGGCGCTTAC 18 10 193
2 EMS_R GGCAACTTTGTCAGAACCT 19 10
AHPND/EMS 클로닝 결과
AHPND/EMS Cloning sequence CGGCAAAAGATGATTACATTGGTTTAGTTACTCATTACTTGATTGGACTTGAAGAGAACTTTAAGCGCGAGCTAGACGGTGATGAATGGCTTGGTTATGCGATATTGCCTCTATTAGCAACAACTGTAAGTCTTCAAATTACTTACATGGCTTGTGGTCTGGATTATAAGGATGAATTCGGTTTCACCGATTC
No. Primer Name Sequence (5'-3') Len. 농도
(umol) 		Size
1 WSSV_F TAGAAACACCGGATGGGCTA 20 10 193
2 WSSV_R GCAGCATCTTTTGTTCCACA 19 10
WSSV 클로닝용 primer
WSSV 클로닝 결과
WSSV Cloning sequence TAGAAACACCGGATGGGCTAAGCCAACCAAGCACCCGTTCAGGGAAGAAATAGACCATGTTATCGCACTAGATGCATCATTCTTAACTGAAAATGGAGCATATGTATTCCCTGAAGACGGAGGACCCAAATCGAAATATAAGGCCTACGCACCAATCTGTGGAACAAAAGATGCTGC
<실험예 2> cDNA합성
AHPND/EMS와 WSSV에 감염 된 새우의 간췌장 total RNA를 분리하여 병원체 유전자 클로닝을 위한 주형 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성에는 TOPscriptTM cDNA synthesis Kit (enzynomics)를 사용하여 5 ㎍의 total RNA를 nuclease-free water에 희석하여 총 부피 8 ㎕가 되게 하였다.
희석된 RNA에 1 ㎕의 oligo(dt)와 1 ㎕의 Randome hexamer를 더하여 70 ℃에서 5분간 반응한 후 10X buffer 2 ㎕, RTase 1 ㎕, dNTP 2 ㎕, RNase inhibitor 0.5 ㎕, nuclease-free water 4.5 ㎕를 더하여 50 ℃에서 1시간 반응 후 95 ℃에서 5분간 가열하여 cDNA합성을 중지시키고, 30 ㎕의 nuclease-free water를 더해 최종 부피 50 ㎕가 되게 희석하였다.
합성 한 cDNA를 주형으로 AHPND/EMS와 WSSV의 클로닝용 프라이머를 사용하여 PCR로 유전자 증폭 한 후 1% agarose gel에 100volt에서 25분간 전기영동 하여 산물의 크기를 확인하고 HiGeneTM Gel&PCR Purification System(BIOFACT)를 이용하여 산물을 분리하였다.
분리 된 산물은 TOPclonerTM TA-Blunt Kit (enzynomics)를 이용하여 클로닝 하였다. 분리 된 산물 4 ㎕에 vector 1 ㎕(10ng/㎕)와 6XT-Blunt buffer 1 ㎕를 더하여 4 ℃에서 overnignt하였다(Ligation).
Overnignt 한 Ligation 산물에 Competent cell (DH5α Chemically Competent E.coli, enzynomics) 50 ㎕를 더하여 얼음에 20분간 방치한 후 42 ℃에서 1분간 반응하고 얼음에서 5분간 안정화 하여 S.O.C broth 300 ㎕에 37.5 ℃, 200rpm에서 1시간 30분간 배양하였다.
배양한 Competent cell은 암피실린과 카나마이신, Xgal이 첨가 된 LB agar에 50 ㎕, 150 ㎕, 200 ㎕ 씩 37.5 ℃ 18시간 배양하였다. 18시간 후 LB agar에 자란 하얀색 콜로니를 골라 암피실린과 카나마이신이 첨가 된 5ml LB broth에 37.5 ℃ 10시간 배양하였다.
10시간 뒤 배양액은 Hybrid-QTM Plasmid (GeneAll)을 이용하여 plasmid DNA를 분리하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열이 확인 된 plasmid DNA는 NanoDrop 2000C (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 정량하였으며, multiplex PCR에 이용하였다.
<실험예 3> AHPND/EMS와 WSSV의 multiplex PCR
하기의 표 5는 서열번호 1 내지 4를 포함하는 AHPND/EMS multiplex용 primer를 나타내고, 표 6은 서열번호 5 내지 6을 포함하는 WSSV multiplex용 primer를 나타낸다.
AHPND/EMS multiplex용 primer.
No. Primer Name Sequence (5'-3') Len. 농도
(umol) 		Size
1 EMS_M_F1 GAGCTAGACGGTGATGAA (서열번호 1) 18 10 386
2 EMS_M_R1 CCAACAGCAGGTGAATATG (서열번호 2) 19 10
3 EMS_M_F2 GGTTTCACCGATTCTGATG (서열번호 3) 19 10 480
4 EMS_M_R2 AGCCTTGCCTAGTTCTAC (서열번호 4) 18 10
WSSV multiplex용 primer.
No. Primer Name Sequence (5'-3') Len. 농도
(umol) 		Size
5 WSSV_F ATAGAAACACCGGATGGG (서열번호 5) 18 10 153
6 WSSV_R GTGCGTAGGCCTTATATTTC (서열번호 6) 20 10
AHPND/EMS와 WSSV를 동시에 검출하기 위해 제작 된 multiplex PCR primer의 검출능을 확인하기 위해 primer test를 수행하였으며, multiplex PCR은 AccuPower(R) Gold Multiplex PCR PreMix(Bioneer, Korea)와 AllInOneCycler (Bioneer, Korea)를 이용하여 수행하였다.
AHPND/EMS와 WSSV를 동시 검출하기 위해 클로닝한 DNA는 20ng/㎍으로 농도를 맞추어 각각 1㎕씩 multiplex PCR에 사용하였으며, AHPND/EMS 검출용 multiplex PCR primer는 F와 R 각각 1.0 ㎕(10 pmol) WSSV 검출용 multiplex PCR primer는 F와 R 각각 0.5 ㎕(10 pmol)를 사용하였다.
PCR반응은 94 ℃에서 10분간 pre-denaturation 후, 94 ℃에 5분간 denaturation, 55 ℃에서 1분간 annealing, 72 ℃에서 1분간 extention하여 35cycle 반복하여 수행하였으며 추가로 72 ℃에서 7분간 반응하였다. PCR산물은 Ethidium Bromide (EtBr)을 포함한 2% agarose gel을 이용하여 100volt에서 30분 간 전기영동 하여 증폭된 산물의 크기를 확인하였다.
도 1은 서열번호 1 내지 6을 이용하여 AHPND/EMS와 WSSV multiplex PCR 산물 전기영동 결과를 나타낸다. 1레인은 서열번호 1 내지 2로 이루어지는 AHPND/EMS multiplex primer set와 서열번호 5 내지 6으로 이루어지는 WSSV multiplex primer set를 사용하였고, 2레인은 서열번호 3 내지 4로 이루어지는 AHPND/EMS multiplex primer set와 서열번호 5 내지 6으로 이루어진 WSSV multiplex primer set를 사용하였다.
그 결과, 도 1에 제시된 바와 같이 상기 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 프라이머 세트는 표적 유전자를 성공적으로 증폭하여 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 멀티플렉스 PCR은 Vibrio parahaemolyticus 및 White spot syndrome virus(WSS)의 두 종의 병원체를 동시에 검출이 가능한 것으로 사료된다.
본 발명은 새우 양식에서 큰 문제가 되고 있는 AHPND/EMS와 WSSV를 동시에 검출하여 여러 가지 병원체 검출에 소요되는 시간을 줄여 단시간 내에 병원체 감염 여부를 확인한다. 따라서 본 발명에서 제시된 방법으로 조기에 감염을 진단하여 빠른 초기 대처로 폐사율을 줄여 새우 양식 산업 발전에 이바지 할 수 있다.
<110> solforto <120> multiplex PCR primer set and methods for diagnosing <130> p18-0521126 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMS_M foward primer <400> 1 gagctagacg gtgatgaa 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMS_M reverse primer <400> 2 ccaacagcag gtgaatatg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMS_M foward primer <400> 3 ggtttcaccg attctgatg 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EMS_M reverse primer <400> 4 agccttgcct agttctac 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSSV foward primer <400> 5 atagaaacac cggatggg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WSSV reverse primer <400> 6 gtgcgtaggc cttatatttc 20

Claims (3)

  1. 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease)의 원인체인 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 특이적인 서열번호 1 및 2로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 3 및 4로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와
    새우흰점바이러스(White spot syndrome virus; WSSV)에 특이적인 서열번호 5 및 6으로 표시되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 것인 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease)과 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트
  2. 제1항에 따른 프라이머 세트 및 멀티플렉스 중합연쇄효소반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease) 및 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)의 동시 진단용 키트
  3. (a)새우에서 DNA를 분리하는 단계;
    (b)상기 (a)단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, DNA 폴리머라제를 첨가하여 상기 제1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c)상기 (b)단계의 증폭 산물을 동정하여 새우종자의 급성간췌장괴상증(Acute hepatopancreatic necrosis disease)과 새우흰점바이러스(White spot syndrome virus)를 동시에 진단하는 방법
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국내 등록특허번호 제10-1392305호에는 서열번호 1 내지 4로 표시된 2 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 WSSV(white spot syndrome virus) 및 HPV(hepatopancreatic parvovirus)의 동시 진단용 멀티플렉스 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 및 HPV의 동시 진단용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 WSSV와 HPV를 동시에 진단하는 방법, 서열번호 1 및 2로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 WSSV 진단용 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4로 표시된 프라이머 세트를 포함하는 HPV 진단용 프라이머 세트에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1503511호에는 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용될 수 있는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트에 관하여 개시하고 있다.
국내 등록특허번호 제10-1521381호에는 새우조기폐사증후군을 진단하는 방법 및 키트는 리얼타임 PCR을 이용하고, 새우 환경 샘플 등으로부터 새우조기폐사증후군의 원인균인 비브리오 파라헤모라이티쿠스를 표적 유전자인 tlh 유전자를 이용하여 종 수준에서 확인할 수 있고 tdh 유전자 및 trh 유전자를 이용하여 병원성 여부의 판정이 가능하면서도 새우 양식 환경 등에서 새우조기폐사증후군의 발병 위험성을 조기에 예측하기 위한 정량적 분석도 가능한 리얼타임 ＰＣＲ을 이용한 새우조기폐사증후군 진단 방법 및 키트에 관하여 개시하고 있다.

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