KR101299627B1

KR101299627B1 - 식중독 세균 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101299627B1
Application number: KR1020100020733A
Authority: KR
Inventors: 이규호; 성문희; 조재창; 이현정; 김한석; 이미애; 이경조; 김정아; 김한신
Original assignee: 국민대학교산학협력단; 한국외국어대학교 연구산학협력단
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2013-08-23
Also published as: KR20110101612A

Abstract

본 발명은 주요 식품 위해 세균으로 인식되고 있는 세 가지 그람양성 식중독 세균인, 바실러스 세균(Bacillus cereus), 포도상구균(Stapylococcus aureus) 및 리스테리아 세균(Listeria monocytogenesis)의 유무, 특히 포도상구균(Stapylococcus aureus)의 존재 여부를 시료에서 간편하게 탐지할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

식중독 세균 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도 {Primers for simultaneous detection of foodborne bacteria and use thereof}

본원은 식중독 유발 세균의 검출분야이다.

생활수준이 향상되고, 의료기술이 발달하였음에도 불구하고 식중독은 크게 줄지 않고 있으며, 오히려 병원성 대장균 O157:H7, 리스테리아 등과 같이 새로운 원인균에 의한 식중독 발생은 증가추세이다 (국내외식중독 발생 및 관리 동향, 농식품안전정보서비스 운영/관리사업, 2008년 4월). 최근 들어서는 식중독이 계절에 상관없이 발생하고, 급식의 보급으로 규모도 점차 대형화하고 있어 식중독 발생의 감소 및 억제를 위한 모니터링 및 신속검사법 개발이 필요하다.

우리나라에서 식중독을 유발하는 주요 위해 세균으로 주목된 것은 세 가지 그람 양성균, 즉, 바실러스 세균(Bacillus cereus), 포도상구균(Stapylococcus aureus), 그리고 리스테리아 세균(Listeria monocytogenesis)이다. 이와 같은 식중독 유발세균에 대한 검출을 신속하게 수행하는 방법은 크게 항원-항체 반응을 기본으로 하는 것과 핵산 접합 반응을 이용하는 것이다. 전자는 분석물질로서 단백질을 검출하는 것이고, 후자는 유전자를 이루는 핵산을 검출하는 것이다. 이중 핵산은 단백질과 달리 적은 양으로도 검출이 가능하며 안정한 성질을 가지고 있어, 항원-항체를 기본으로 하는 면역학적 방법에 비해 장점을 가지고 있으나, 현재까지 개발된 것은 모두 후자를 기본으로 하는 것이며, 여기에 증균을 통한 균학적 성질의 특징 검사법이 추가되기도 한다 (ibid).

분석물질로서 핵산만이 갖는 장점을 이용하여 식중독 세균의 존재 유무를 신속하고도 효율적으로 확인할 수 있는 탐지 방법의 개발이 요구된다.

본원은 핵산 검출을 기본으로 하는 식중독균을 동시에 신속하게 탐지할 수 있는 시스템을 개발하고자 한다.

한 양태에서 본원은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바실러스 세리우스 검출용 올리고뉴클레오타이드; 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테필로코커스 오리우스 올리고뉴클레오타이드; 및 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 리스테리아 모노사이토제네시스 검출용 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 그람양성 식중독 세균 검출용 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 서열번호 1과 2, 3과 4, 및 5와 6으로 이루어지는 제 1군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 바실러스 세리우스 (Bacillus cereus) 검출용 프라이머; 서열번호 7과 8, 9와 10 및 11과 12로 이루어지는 제 2군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 스테필로코커스 오리우스 (Stapylococcus aureus) 검출용 프라이머; 및 서열번호 13과 14 및 15와 16으로 이루어지는 제 3군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 리스테리아 모노사이토제네시스 (Listeria monocytogenesis) 검출용 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 쌍 이상의 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 제공한다.

다른 양태에서 본원은 상기 한 쌍 이상의 그림양성 식중독균 검출용 프라이머가 상기 각 군에 선택된 한 쌍의 프라이머를 포함하는 하기 조합 중 어느 하나 인, 식중독균 검출용 프라이머를 제공한다:

조합-1: nheA 185bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp;

조합-2: hblC 199bp, inlJ 318bp, sbi 199bp;

조합-3: hblC 199bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp;

조합-4: cytK 282bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp;

조합-5: nheA 185bp, inlJ 318bp, sbi 199bp;

조합-6: cytK 282bp, inlJ 318bp, sbi 199bp;

조합-7: nheA 185bp, inlJ 318bp, eta 233bp;

조합-8: hblC 199bp, inlJ 318bp, eta 233bp;

조합-9: cytK 282bp, inlJ 318bp, eta 233bp;

조합-10: nheA 185bp, prfA 270bp, fnbA 235bp;

조합-11: hblC 199bp, prfA 270bp, fnbA 235bp;

조합-12: nheA 185bp, prfA 270bp, sbi 199bp;

조합-13: hblC 199bp, prfA 270bp, sbi 199bp;

조합-14: nheA 185bp, prfA 270bp, eta 233bp;

조합-15: hblC 199bp, prfA 270bp, eta 233bp;

조합-16: nheA 185bp, inlJ 318bp;

조합-17: hblC 199bp, inlJ 318bp;

조합-18: inlJ 318bp, fnbA 235bp;

조합-19: inlJ 318bp, sbi 231bp;

조합-20: inlJ 318bp, eta 233bp;

조합-21: nheA 185bp, eta 233bp;

조합-22: hblC 199bp, fnbA 235bp;

조합-23: hblC 199bp, sbi 231bp;

조합-24: hblC 199bp, eta 233bp;

조합-25: cytK 282bp, fnbA 235bp 또는

조합-26: cytK 282bp, eta 233bp.

또 다른 양태에서 본원은 상기 조합은 상기 조합-1, 조합-2 또는 조합 16 내지 26 중 어느 하나인 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 프라이머를 포함하는 그람 양성 식중독균 검출용 중합효소연쇄반응 분석 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 프라이머를 포함하는 그람 양성 식중독균 검출용 중합효소연쇄반응 분석 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 다중 (multiplex) PCR로 상기 다중 PCR을 위해 상기 프라이머 중 두 종 이상의 다른 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 동시에 사용하는 그람양성 식중독균 검출용 중합효소연쇄반응 분석 키트를 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 프라이머를 제공하는 단계; 상기 프라이머를 시료와 혼합하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식중독 세균의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 그람양성 식중독균 검출 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 중합효소연쇄반응은 다중 (multiplex) PCR로 상기 다중 PCR을 위해 상기 프라이머 중 두 종 이상의 다른 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 동시에 사용하는 것인 그람양성 식중독균 검출 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 제 1군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머, 제 2군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머 및 제 3군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머의 조합을 포함하는 그람양성 식중독균의 동시 검출을 위한 다중 중합효소연쇄반응용 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 상기 제 1군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머 및 제 2군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머의 조합; 제 1군에서 선택된 한 쌍의 프라이머 및 제 3군에서 선택된 한 쌍의 프라이머의 조합; 또는 제 2군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머 및 제 3군에서 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머의 조합 중 어느 하나의 조합을 포함하는 그람양성 식중독균의 동시 검출을 위한 다중 중합효소연쇄반응용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 바실러스 세리우스의 ctyK, nheA 또는 hblC 유전자 중 하나 이상, 스테필로코커스 오리우스의 eta, fnbA 또는 sbi 유전자 중 하나 이상, 또는 리스테리아 모노사이토제네시스의 prfA 또는 inlJ 유전자 중 하나 이상의 검출을 포함하는 그람양성 식중독균 검출방법을 제공한다.
또다른 양태에서 본원은 스테필로코커스 오리우스(Stapylococcus aureus) 검출용 올리고 뉴클레오타이드에 관한 것으로, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 그람양성 식중독 균인 스테필로코커스 오리우스 검출용 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 서열번호 7과 8, 9와 10 및 11과 12로 이루어지는 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 스테필로코커스 오리우스 검출용 프라이머를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 구성되는 군으로부터 선택되는 제 1 올리고뉴클레오타이드 및 서열번호 8, 10 및 12로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제 2 올리고뉴클레오타이드로 구성되는 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 스테필로코커스 오리우스 검출용 프라이머를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 중 하나 이상을 포함하는 스테필로코커스 오리우스 검출용 중합효소연쇄반응 분석 조성물을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 중 하나 이상을 포함하는 스테필로코커스 오리우스 검출용 중합효소연쇄반응 분석 키트를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 다중 (multiplex) PCR로 상기 다중 PCR을 위해 상기 프라이머 중 두 종 이상의 프라이머를 동시에 사용하는 스테필로코커스 오리우스 검출용 중합효소연쇄반응 분석 키트를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 중 하나 이상을 제공하는 단계; 상기 프라이머를 시료와 혼합하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA를 이용하여 스테필로코커스 오리우스의 존재 여부 및 이에 따른 식중독균 감염여부를 확인하는 단계를 포함하는 스테필로코커스 오리우스 검출 방법을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 상기 중합효소연쇄반응은 다중 (multiplex) PCR로 상기 다중 PCR을 위해 본원에 개시된 프라이머 중 두 종 이상의 프라이머를 동시에 사용하는 것인 스테필로코커스 오리우스 검출 방법을 제공한다.

본원의 조성물 및 방법을 이용하면 여러 가지 식중독 세균의 유무를 한 번의 검사로 신속하고 정확하게 검출할 수 있다.

도 1은 B. cereus에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다: lane 1: 100bp ladder size marker, lane 2: C. jejuni NCTC12662, lane 3: V. cholerae ATCC14035, lane 4: V. parahaemolyticus, lane 5: V. vulnificus MO6-24/O, lane 6: Y. enterocolitica NCCP12713, lane7: B. cereus. 사이즈마커는 100bp 단위로 증가한다.
도 2는 S. aureus에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다: lane 1: 100bp size marker, lane 2: B. cereus, lane 3: C. jejuni NCTC12662, lane 4: L. monocytogenesis, lane 5: S. aureus, lane 6: V. cholerae ATCC14035, lane 7: V. parahaemolyticus, lane 8: V. vulnificus MO6-24/O, lane 9: Y. enterocolitica NCCP12713.
도 3은 L. monocytogenesis에 특이적인 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker, lane 2: B. cereus, lane 3: C. jejuni NCTC12662, lane 4: L. monocytogenesis, lane 5: V. cholerae ATCC14035, lane 6: V. parahaemolyticus, lane 7: V. vulnificus MO6-24/O, lane 8: Y. enterocolitica NCCP12713.
도 4는 B. cereus, L. monocytogenesis, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (185 + 318 + 235 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus nheA 185bp; lane 4: L. monocytogenesis inlJ 318bp; lane 5: S. aureus fnbA 235bp.
도 5는 B. cereus, L. monocytogenesis, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (199 + 318 + 231 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus hblC 199bp; lane 4: L. monocytogenesis inlJ 318bp; lane 5: S. aureus sbi 231bp.
도 6은 B. cereus, 및 L. monocytogenesis 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (185 + 318 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus nheA 185bp; lane 4: L. monocytogenesis inlJ 318bp.
도 7은 B. cereus, 및 L. monocytogenesis 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (199 + 318 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus hblC 199bp; lane 4: L. monocytogenesis inlJ 318bp.
도 8은 L. monocytogenesis, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (318 + 235 bp DNA 조각); lane 3: L. monocytogenesis inlJ 318bp; lane 4: S. aureus fnbA 235bp.
도 9는 L. monocytogenesis, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (318 + 231 bp DNA 조각); lane 3: L. monocytogenesis inlJ 318bp; lane 4: S. aureus sbi 231bp.
도 10은 L. monocytogenesis, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (318 + 233 bp DNA 조각); lane 3: L. monocytogenesis inlJ 318bp; lane 4: S. aureus eta 233bp.
도 11은 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (185 + 233 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus nheA 185bp; lane 4: S. aureus eta 233bp.
도 12는 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (199 + 235 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus hblC 199bp; lane 4: S. aureus fnbA 235bp.
도 13은 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (199 + 231 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus hblC 199bp; lane 4: S. aureus sbi 231bp.
도 14는 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (199 + 233 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus hblC 199bp; lane 4: S. aureus eta 233bp.
도 15는 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (282 + 235 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus cytK 282bp; lane 4: S. aureus fnbA 235bp.
도 16은 B. cereus, 및 S. aureus 의 동시 탐지를 위한 다중 PCR 결과를 분석한 아가로스젤 사진이다. 각 레인은 다음과 같다:lane 1: 100bp size marker; lane 2: 3 그람 양성 세균-다중 PCR (282 + 233 bp DNA 조각); lane 3: B. cereus cytK 282bp; lane 4: S. aureus eta 233bp.

본원에서 사용된 용어 “올리고뉴클레오타이드”는 임의의 길이의 라이보뉴클레오타이드 또는 데옥시라이보뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로, 단일가닥 및 이중가닥을 모두 포함하는 것으로, 프라이머, 프로브를 모두 포함하는 개념이다. 본원에서 사용된 용어 “프라이머”는 본원에서 검출하는 각 균주에 특이한 유전자의 적어도 일부분에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 말하며, 중합효소연쇄반응과 같은 폴리머라제를 사용한 중합반응에서 중합의 시작점이 된다.

본원의 올리고뉴클레오타이드는 바실러스 세균(Bacillus cereus), 포도상구균(Stapylococcus aureus), 그리고 리스테리아세균(Listeria monocytogenesis)의 각각에 특이한 핵산 부위에 결합하여 이들 각 세균을 특이적으로 검출할 수 있도록 고안된 것이다 (표 1 참조). 각 세균에 특이적 핵산 부위를 알아내기 위하여 GenBank database로부터 B. cereus, S. aureus, L. monocytogenesis 세균의 유전체 DNA 서열을 입수한 후 이를 nucleotide BLAST를 사용하여 비교분석하였다. 비교분석을 통해 각 균주에 특이적 서열을 탐색한 결과 각 그람 양성 식중독세균에 특이적으로 존재하는 표 1에 기재된 것과 같은 핵산서열 (유전자)를 찾아내었다. 본원을 통하여 각 균을 특이적으로 검출할 수 있는 것으로 밝혀진 표 1의 유전자는 독력을 나타내는 부위로 상기 유전자를 각 세균의 검출에 사용한 것은 본원이 최초이다.

본원에서 사용된 용어“검출”은 핵산의 존재여부 또는 존재할 경우 그 양을 검출하는 것을 의미하는 것으로서 산 특이적 DNA-DNA, RNA-DNA 혼성화 반응을 기본으로는 하는 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 노던블랏분석, 서던블랏 분석, 마이크로칩분석, PCR (정량적 및 정성적 PCR, 실시간 정량적 정성적 PCR 포함)같은 당업계의 다양한 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

B. cereus, S. aureus, L. monocytogenesis 세균을 특이적으로 검출할 수 있는 유전자
균주	유전자 명칭 ( GenBank No .)	단백질 명칭
*Bacillus* *cereus*	cytK (BCZK1009)	Cytotoxin K
	nheA (BCZK1698)	non-hemolytic enterotoxin A
	hblC (BC3103)	hemolysin BL lytic component
*Staphylococcus* *aureu* s	eta (NWMN_1082)	exfoliative toxin A
	fnbA (NWMN_2399)	fibronectin-binding protein FnbA
	sbi (NWMN_2317)	immunoglobulin G-binding protein Sbi
*Listeria* *monocytogenesis*	prfA (lmo2543)	Transcriptional regulator for virulence factor
*Listeria* *monocytogenesis*	inlJ (lmo2820)	protein of the internalin family

본원에서는 표 1과 같은 유전자를 선별한 후, 각 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 디자인하였으며, 그 결과를 표 2에 표시하였으며, 각 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 16으로 본 명세서에 첨부하였다. 본원에서는 검출의 편리성과 신속성을 위하여 프라이머를 이용하여 증폭된 산물의 길이가 약 100 내지 400 bp가 되도록 각 유전자에의 프라이머의 결합위치를 조정하여 고안하였다(PREMIER Biosoft International사의 ArrayDesigner 4.25 사용). 본원의 프라이머의 결합온도는 약 50℃ 내지 약 70℃ 이며, MgCl₂의 농도는 약 1.5 내지 약 2.5mM 이나, 상기 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니나 그런 경우는 결합특이성이 떨어질 수 있다. 본원의 프라이머 명칭에서 "F"는 해당 유전자의 5' upstream에 결합하는 프라이머를 말하고, "R"은 해당 유전자의 3' downstream에 결합하는 프라이머를 말한다.

그람양성 식중독 세균 검출용 프라이머
균주	서열 번호	프라이머 명칭	프라이머 서열	PCR 시 증폭물 크기( bp )
B. *cereus*	1	cytK-F	5‘-CACTTGGTCTGACTCTGTAAGC -3’	282
	2	cytK-R	5‘- ACAACAGCAATCATACCAGGAG -3’	282
	3	nheA-F	5‘- TCTACGAGTTGCTTCATTCCTG -3’	185
	4	nheA-R	5‘- ACCTTAATGTCTGGCTGTTGC -3’	185
	5	hblC-F	5‘- ACAGGCAACGATTCCACAAC -3’	199
	6	hblC-R	5‘- CGAGAGTCCACCAACAACAG -3’	199
S. *aureus*	7	eta-F	5‘- GAAACTTCAAAAAGCACCTC -3’	233
	8	eta-R	5‘- AAAAGCCAGACATGAAAAAT -3’	233
	9	fnbA-F	5‘- TATCGTACAGTAATGCCAGG -3’	235
	10	fnbA-R	5‘- GCTTCTGGTAATGTTGATGA -3’	235
	11	sbi-F	5‘- CAAATGATGCAATCTCAAAA -3’	231
	12	sbi-R	5‘- GTGATTGAATTTGAGGGACT -3'	231
L. *monocytogenesis*	13	prfA-F	5‘- ACCACTTGAATATCCTAACTCC -3’	270
	14	prfA-R	5‘- GAACAGGCTACCGCATACG -3’	270
	15	inlJ-F	5‘- TTCTGGAACAGTAGGCGATAAC -3’	318
	16	inlJ-R	5‘- TGTGAGTTGCTTGTGAATTGTC -3’	318

이러한 맥락에서 본원은 서열번호 1과 2, 3과 4, 및 5와 6으로 이루어지는 제 1군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 바실러스 세리우스 검출용 프라이머; 서열번호 7과 8, 9와 10 및 11과 12로 이루어지는 제 2군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 스테필로코커스 오리우스 검출용 프라이머; 및 서열번호 13과 14 및 15와 16으로 이루어지는 제 3군의 프라이머 쌍으로부터 선택되는 적어도 한 쌍의 리스테리아 모노사이토제네시스 검출용 프라이머로 구성되는 군으로부터 선택되는 한 쌍 이상의 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 제공한다.

본원의 상기 프라이머는 이와 높은 서열유사성을 갖는 것을 또한 포함한다. 높은 서열유사성이란, GCG FastA (Genetics Computer Group, Madison, Wis.USA), MacVector 4.5 (Kodak/iBI software package) 또는 기타 당업계에 공지된 서열분석 방법 또는 프로그램을 이용하여, 적어도 70% 이상의 서열유사성이 있는 것을 말한다. 프라이머는 당업계의 공지된 방법 또는 합성회사를 통하여 합성할 수 있으며, 길이는 적어도 약 5개 뉴클레오타이드이다.

상기 언급한 세 종류의 세균은 우리나라에서 발생하는 식중독을 일으키는 주요 원인균으로서 본원의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 위해세균의 감염여부가 의심되는 다양한 시료에서 이들 균에 의한 감염여부의 스크리닝, 존재 유무의 검출 및 정량을 위한 다양한 실험에서 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 본원의 프라이머는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 사용될 수 있다. 본 방법은 미생물이 발견될 수 있는 다양한 물질을 대상으로 실시될 수 있으며, 예를 들면 식품, 사료 또는 가검물에 대하여 실시될 수 있으며, 시료를 채취하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면 식중독균이 오염되었다고 의심되는 시료를 채취한 후, 이를 멸균수 또는 0.85% 생리식염수에 현탁한 후 프로테나제 K(Proteinase K)를 처리한 후 펠렛을 회수한 후 열수추출하여, PCR 반응에 필요한 시료를 준비하고, PCR을 실시한다. PCR 결과는 통상적인 PCR 검출 수단, 예컨대 전기영동 등의 방법으로 실시된다. 상기 열수추출은 통상적인 DNA 분리방법으로, 예컨대 상기 펠렛을 멸균수로 부유하고 여기에 페놀/클로로포름(1:1) 혼합액을 처리한 다음 상등액을 수득하고, 상기 상등액에 에탄올을 가한 후 원심분리하여 DNA 펠렛을 수득하는 방법이다. 구체적인 반응조건 및 시간은 통상적인 바에 따른다.

대안적으로, 본원의 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 검출하는 방법에 따라 시각화 할 수 있는 적절한 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지물질은 방사선동위원소, 폴리펩타이드성 표지물질, 형광물질, 발색물질 등과 같은 것을 포함한다. 이러한 표지물질은 올리고뉴클레오타이드 합성시에 그 자체에 도입될 수 도 있고, PCR을 사용하는 경우 중합과정에서 도입될 수 있다. 방사선물질은 베타, 감마 및 알파선 방출체를 포함하는 것으로, ³²P, ³⁵S 및 ¹²⁵I를 포함한다. 형광물질은 에너지를 흡수하면 여기되고, 여기상태에서 기저상태로 되돌아가면서 가시광선을 방출하는 물질로 플로세신 및 로다민을 예로 들 수 있다. 폴리펩타이드성 표지물질은 바이오틴, 디그옥시제닌과 같은 항원성 물질과 호스레디쉬퍼옥시다제와 같은 효소를 포함한다. 발색물질은 화학반응으로 흡수한 에너지를 방출하는 화학발광물질 예를 들면 옥시루미네슨스와 같은 것을 포함한다.

본원의 프리아머를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 상기 언급한 바와 같이 핵산의 상보적 결합을 기본으로 하는 다양한 방법에 사용될 수 있으며, 아울러 단독으로 두 개 이상의 조합으로 상기 세균을 검출하기 위한 다양한 정성 및 정량분석에 사용될 수 있다. 한 예로 PCR에 사용될 수 있으며, PCR 반응의 경우, 적어도 한 가지의 프라이머 세트, 적어도 두 가지의 프라이머 세트, 특히 적어도 세 가지 프라이머 세트의 동시 사용을 포함한다. 상기 각 프라이머 세트는 개별적으로 또는 동시에 다중으로 사용 시 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스의 특이적 검출 및 정량에 사용할 수 있다. 예를 들면 상기 두 종류 이상의 균을 동시에 PCR로 검출하기 위하여 각 세균에 특이적인 프라이머 세트를 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 예를 들면 세 종류의 균을 동시에 PCR로 검출하기 위해서 각 세균을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트의 조합을 사용할 수 있다. 하기의 조합에서 "bp (base pair)"는 증폭된 염기의 크기이고, 그 바로 앞의 명칭은 상응하는 명칭의 유전자 부위를 증폭할 수 있는 표 2의 프라이머쌍을 나타낸다.

1. 조합-1: nheA 185bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp

2. 조합-2: hblC 199bp, inlJ 318bp, sbi 231bp

3. 조합-3: hblC 199bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp

4. 조합-4: cytK 282bp, inlJ 318bp, fnbA 235bp

5. 조합-5: nheA 185bp, inlJ 318bp, sbi 231bp

6. 조합-6: cytK 282bp, inlJ 318bp, sbi 231bp

7. 조합-7: nheA 185bp, inlJ 318bp, eta 233bp

8. 조합-8: hblC 199bp, inlJ 318bp, eta 233bp

9. 조합-9: cytK 282bp, inlJ 318bp, eta 233bp

10. 조합-10: nheA 185bp, prfA 270bp, fnbA 235bp

11. 조합-11: hblC 199bp, prfA 270bp, fnbA 235bp

12. 조합-12: nheA 185bp, prfA 270bp, sbi 231bp

13. 조합-13: hblC 199bp, prfA 270bp, sbi 231bp

14. 조합-14: nheA 185bp, prfA 270bp, eta 233bp

15. 조합-15: hblC 199bp, prfA 270bp, eta 233bp

16. 조합-16: nheA 185bp, inlJ 318bp

17. 조합-17: hblC 199bp, inlJ 318bp

18. 조합-18: inlJ 318bp, fnbA 235bp

19. 조합-19: inlJ 318bp, sbi 231bp

20. 조합-20: inlJ 318bp, eta 233bp

21. 조합-21: nheA 185bp, eta 233bp

22. 조합-22: hblC 199bp, fnbA 235bp

23. 조합-23: hblC 199bp, sbi 231bp

24. 조합-24: hblC 199bp, eta 233bp

25. 조합-25: cytK 282bp, fnbA 235bp

26. 조합-26: cytK 282bp, eta 233bp

따라서 본원은 상기와 같은 각 식중독 세균을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍으로 이루어지는 각 군에 선택된 프라이머의 조합 중 어느 하나 인, 식중독균 검출용 프라이머를 제공한다. 상기의 조합은 다중 (multiplex) PCR을 고려한 조합으로, 다중 PCR을 이용할 경우 두 종류 또는 세 종류의 식중독균의 동시 검출이 가능하다. 다중 PCR 후 아가로스젤 전기영동으로 증폭물을 분석할 경우를 고려하여 각 균을 특징짓는 증폭물의 크기가 서로 다르도록 조합한 것이다. 따라서 다중 PCR을 위해 프라이머를 상기 조합만으로 한정하는 것은 아니며, 그 이외의 다양한 조합이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면 프라이머에 상기 언급한 표지물질, 예를 들어 형광물질을 붙여 실시간 PCR로 분석할 경우에는 각 프라이머 세트를 다른 파장의 빛을 내는 형광물질로 표지하여, 증폭물의 크기에 구애를 받지 않고 조합을 선정하여 사용할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 “PCR (Polymerase Chain Reaction)”은 중합효소를 사용하여 핵산을 연쇄적으로 합성하여 개시 핵산물질을 기하급수적으로 증폭하는 방법으로 당업계에 널리 공지된 방법으로, 특정 핵산의 존재 유무를 확인하는 정성분석 PCR, 특정핵산의 양을 측정하는 정량 PCR 및 PCR 과정을 실시간으로 추적하여 정성 및 정량 분석을 가능하게 하는 실시간 PCR을 모두 포함하는 개념이다.

상기 언급한 바와 같이 본원의 프라이머 쌍은 각자 별개로 또는 서로 조합하여 다중 (multiplex) PCR에 사용될 수 있다. 다중 PCR은 한 번의 PCR 반응으로 여러 종류의 균주의 존재 유무 또는 정량을 동시에 할 수 있는 신속한 방법이다. 다중 PCR에서는 통상의 PCR과 달리 두 종류의 이상의 균을 검출할 수 있는 두 종류 이상의 프라이머 쌍이 포함되며 민감도 및 특이도에 영향을 미치지 않으면서 이들 모두를 하나의 조건에서 반응시키기 위한 적정한 반응 조건 예를 들면 적절한 프라이머의 어닐링 온도, 어닐링 시간, MgCl2의 농도 등의 정립이 필요하다. 본원에서는 실시예에 기재한 바와 같이 상기 개시한 조합의 프라이머를 한 가지 조건에서 사용할 수 있는 PCR 반응조건을 정립하였다.

이러한 맥락에서 본원은 본원의 다양한 프라이머 또는 프라이머의 조합을 포함하는 그람 양성 식중독균 검출용 중합효소연쇄반응 분석 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 또는 본원의 다양한 프라이머 또는 프라이머의 조합을 포함하는 그람 양성 식중독균 검출용 중합효소연쇄반응 분석 키트를 제공한다.

한 구현예에서 상기 각 균주를 개별적으로 검출할 수 있는 상기 언급한 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는 바실러스 세리우스 검출용 PCR 분석 조성물, 스테필로코커스 오리우스 검출용 PCR 분석 조성물 또는 리스테리아 모노사이토제네시스 검출용 PCR 분석 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.

다른 구현예에서 상기 균주 중 적어도 두 종류를 동시에 검출할 수 있는 PCR 분석 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 개시한 각 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 각 균주 검출용 프라이머 세트의 군 (표 2 참조)에서 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는, 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스로 구성되는 군으로부터 선택되는 두 종류 이상의 식중독균 동시 검출용 다중 PCR 분석 조성물 및 이러한 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 예를 들면 상기 조성물은 앞서 개시한 프라이머 세트의 조합-1 내지 26 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 한 구현예에서 상기 조성물은 프라이머 세트의 조합 1 내지 15 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서는 프라이머 세트 조합-1을 포함한다. 다른 구현예에서 프라이머 세트 조합-2를 포함한다. 다른 구현예에서 상기 조성물은 프라이머 세트 조합 16 내지 26 중 어느 하나를 포함한다. 상기 조성물은 PCR의 반응에 필요한 완충액, Taq 폴리머라제 및 MgCl₂를 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 완충액이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Tris-HCl, pH 9.0 완충액이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. Taq 폴리머라제는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, USA)와 같은 것을 사용할 수 있으며, 적절한 농도 예를 들면 1.5mM 내지 2.5mM의 MgCl2가 포함될 수 있다.

나아가 본원은 상기 개시한 각 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트의 군 (표 2 참조)에서 선택되는 적어도 한 쌍의 프라이머를 포함하는 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스로 구성되는 균주 중 두 종류 이상 또는 세 종류 동시 검출용 또는 적어도 한 쌍의 각 균주 특이적 프라이머 세트를 포함하는 각 균주 검출용 키트를 제공한다. 예를 들면 상기 두 종류 이상의 그람양성 식중독 세균 검출용 키트는 앞서 개시한 프라이머 세트의 조합-1 내지 26 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 한 구현예에서 상기 조성물은 프라이머 세트 조합-1을 포함한다. 다른 구현예에서 프라이머 세트 조합-2를 포함한다. 또 다른 구현예에서 상기 키트는 조합 16 내지 26 중 어느 하나를 포함한다. 상기 키트는 프라이머의 특이적 결합을 통한 검출을 기본으로 하는 다양한 방법, 예를 들면 컬럼을 기본으로 하는 분석, 서던블랏 분석, 마이크로칩분석, PCR (정량적 및 정성적 PCR, 실시간 정량적 정성적 PCR 포함) 등에 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서 상기 키트는 다중 PCR 방법을 이용하여 각 균의 존재 유무를 한 번에 검출하는데 사용된다.

본원에서 개시한 상기 키트 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군은 검출대상이 아닌 다른 종류의 그람양성균의 DNA를 사용할 수 있으며, 양상대조군은 검출대상 그람양성균의 게놈 DNA 또는 검출대상 그람양성균의 독력유전자를 포함하는 플라스미드를 사용할 수 있다.

PCR에 의해 증폭된 산물(amplicon)은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서 예를 들면 젤 전기영동, 실시간 PCR 분석, SSCP (single strand conformational polymorphism), RFLP(restriction fragment length polymorphism), CZE(capillary zone electrophoresis), WAVE (HPLC-based nucleic acid analyzing technology), 마이크로칩을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원의 한 구현예에서는 사이즈마커와 함께 PCR 산물을 아가로스 젤에서 전기영동하여 분석하였다.

본원의 중합효소연쇄반응을 이용한 그람양성 식중독 세균 검출용 키트는 상기 그람양성 식중독 세균 검출용 프라이머 쌍 및 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적인 구성성분은 PCR에 필요한 반응완충액, Taq DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있으며, SYBR Green I을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응의 경우, SYBR Green I를 추가로 포함할 수 있다.

한예로 본원의 키트는 (i) 상기 표 2의 각 세균별 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 (ii) Taq DNA 중합효소(polymerase) 및 SYBR Green I을 포함하는 2X PCR Master Mix; 및 (iii) 양성대조군 주형 DNA를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 조성물 및 키트는 중합효소연쇄반응용 기기에 사용될 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응용 기기는 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기, 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR)용 기기, 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR)용 기기일 수 있다. 이러한 기기는 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면, 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기(ABI사, USA), 9600 Amplifier를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

나아가 본원은 그람양성 식중독 세균을 특이적으로 검출할 수 있는 표 1의 유전자의 발견을 기초로 한 것이다. 따라서 본원은 바실러스 세리우스의 ctyK, nheA 또는 hblC 유전자 중 하나 이상, 스테필로코커스 오리우스의 eta, fnbA 또는 sbi 유전자 중 하나 이상, 또는 리스테리아 모노사이토제네시스의 prfA 또는 inlJ 유전자 중 하나 이상의 검출을 포함하는 그람양성 식중독균 검출방법을 제공한다. 상기 각 식중독 세균에 관한 검출은 본원에 개시된 프라이머 및 앞서 언급한 다양한 방법 등을 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 본원은 본원에 개시된 것과 같은 본원의 프라이머를 제공하는 단계; 상기 프라이머를 시료와 혼합하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식중독 세균의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 그람양성 식중독균 검출 방법에 관한 것이다.

상기 식중독 세균은 언급한 바와 같이 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "시료"는 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스 균 자체, 또는 이들에서 추출된 유전체 DNA 또는 이들 균의 감염이 의심되는 것으로서, 이러한 시료는 예를 들면 음료수, 육류, 가공식품, 유제품, 채소 등을 포함하는 식재료 및 조리된 음식 자체 또는 이로부터 추출된 것, 또는 조리기구를 포함하는 각종 기구, 기계 및 장비를 와이프(wipe)한 것 등을 포함한다. 상기 시료를 직접 또는 이로부터 유전체 DNA를 공지의 방법으로 추출하여 본원의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 방법으로 각 균의 존재 유무 및 각 균의 양을 정량할 수 있다. 본 방법에서 음성대조군 및 양성대조군을 사용할 수 있으며, 이의 종류는 앞서 언급한 바와 같다. 정량을 위해 일련의 알려진 양의 양성대조군에 대하여 PCR을 수행한 후 표준그래프를 그리고 시료의 PCR결과를 그래프에 외삽하여 시료 중의 세균의 양을 정량할 수 있다. 특정 미생물의 존재여부는 증폭된 DNA의 크기가 표 2의 상응하는 프라이머 옆에 기재된 증폭된 DNA 산물의 크기와 일치하는지 여부로 확인할 수 있다. 증폭된 DNA 산물의 크기는 증폭된 산물을 전기영동하여 확인할 수 있다.

각 그람양성균의 검출을 위해 표 2의 프라이머 쌍에서 선택되는 적어도 한 쌍, 또는 두 종류, 또는 세 종류의 각 세균에 선택된 적어도 한 쌍의 프라이머를 이용하여PCR를 수행하여 표 1에 기재된 것과 같은 각 균에 특이적인 유전자 DNA(Deoxyribonucleic acid)를 증폭할 수 있다. 이런 맥락에서 상기 중합효소연쇄반응은 다중 (multiplex) PCR로 상기 다중 PCR을 위해 상기 프라이머 중 두 종 이상의 다른 그람양성 식중독균 검출용 프라이머를 동시에 사용하는 것인 그람양성 식중독균 검출 방법을 제공한다.

상기 PCR은 통상의 중합효소연쇄반응일 수 있으며 또는 실시간중합효소연쇄반응((Real time PCR)일 수 있다. 상기 통상의 중합효소연쇄반응은 특정 DNA를 증폭한 후에, 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 중합효소연쇄반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭 여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 있다. 상기 실시간 중합효소연쇄반응은 시중의 SYBR Green과 같은 형광물질을 이용한 중합효소연쇄반응으로 증폭 후 추가의 확인절차 없이 증폭과 동시에 형광정도를 측정할 수 있거나, 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer,FRET)을 측정하는 방법으로 증폭 여부를 확인할 수 있으며, 추가로, 증폭된 DNA 산물의 이중나선이 분리되는 온도(melting temperature)를 확인하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.

또한, 검출하고자 하는 세균이 두 종류 이상일 경우, 상기 표 2의 각 세균별 프라이머 쌍의 군에서 선택되는, 두 쌍 이상의 프라이머를 동시에 사용하는 다중 중합효소연쇄반응을 수행할 수 있다. 한 구현예에서는 프라이머 조합 16 내지 26 중 어느 한 조합을 이용하는 이중 PCR이다. 다른 구현예에서는 프라이머 조합 1 내지 15 중 어느 한 조합을 이용하는 삼중 PCR이다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 1994); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985)을 참고할 수 있다.

실시예 1. 고안된 프라이머의 PCR 특이성 조사

각 세균에 특이적으로 검출할 수 있는 유전자의 발견 및 이를 검출할 수 있는 프라이머의 고안은 앞서 기재한 바와 같다 (프라이머 서열은 표 1 참조).

고안된 프라이머가 각 세균을 특이적으로 검출할 수 있는지 여부를 다음과 같이 조사하였다. 총 8종의 세균(Vibrio vulnificus MO6-24/O, Vibrio cholerae ATCC14035, Vibrio parahaemolyticus ATCC27519, Campylobacter jejuni NCTC12662, Yersinia enterocolitica NCCP12713, Bacillus cereus (environment sample,Strain: IAM 12605), Staphylococcus aureus (ATCC6538), Listeria monocytogenesis (ATCC19117)을 PCR의 주형으로 사용하였다. 이를 위하여, 각 세균을 액체 배지 [vibrio종은 LBS (1% Bacto tryptone, 0.5%. Bacto yeast extract, 3% NaCl) 배지 사용, 나머지는 LB (Luria-Bertani,1% Bacto tryptone, 0.5%. Bacto yeast extract)에서 37℃ (vibrio종은 30℃)에서 12시간 배양한 후, OD₆₀₀에서 흡광도를 측정하여 1x10⁸ CFU 세포를 취하여 원심분리한 후 멸균된 3차 증류수 100㎕ 에 현탁한 후 얼림과 녹임을 3회 반복하여 세포를 파쇄하였다. 상기 균주 중 Campylobacter jejuni 와 Staphylococcus aureus는 유전체 DNA를 사용하였다. 유전체 DNA 추출은 김석하 등, 한국생물공학회지 제18권 제3호, 2003, pp190-196)에 기재된 대로 수행하였다. 상기 파쇄한 세포 및 유전체 DNA을 주형으로 하여 다음과 같은 조건에서 PCR을 수행하였다. 표 2에 기재된 프라이머 세트를 실험에 사용하였으며, 각 프라이머는 바이오니아 (한국) 사에서 합성하였다.

(A) PCR 반응 buffer 조성

10mM Tris-HCl, 40mM KCl, 1.5mM MgCl₂ (pH9.0)

dNTP [각 0.25mM]

Taq DNA polymerase [1.0 Unit](AmpliTaq Gold, Applied Biosystems)

Forward primer [20 pmoles]

Reverse primer [20 pmoles]

주형 DNA [~ 10⁴ cells 또는 이에 해당되는 2.5×10^-4 pmol/㎕)]

(B) 반응온도 및 반응시간

I. 95^OC for 5 min

II. 30 cycles [95^OC for 1 min; 55^OC for 1 min; 72^OC for 30 sec]

III. 72^OC for 10 min

상기와 같은 조건으로 PCR을 수행한 후, 결과물을 1.5% 아가로스 젤에 로딩한 후 전기영동하여 에씨디움브로마이드 용액으로 염색한 후 UV 하에서 관찰하였다. 결과는 도 1 내지 3에 기재되어 있다. 도 1 내지 3에서와 같이 B. cereus (도 1), S. aureus (도 2), L. monocytogenesis (도 3) 세균 각각에 특이적인 밴드가 생성되었으나, 타 세균에서는 이러한 크기의 DNA가 생성되지 않은 것으로 나타났다. 이는 표 2에 기재된 각 프라이머 세트가 B. cereus (도 1), S. aureus (도 2), L. monocytogenesis (도 3) 각각의 세균을 특이적으로 검출할 수 있음을 증명하는 것이다.

실시예 2 그람 양성 식중독 세균의 검출을 위한 다중 PCR

본원에 개시된 세 종류의 세균을 검출할 수 있는 프라이머 세트의 조합 1 내지 26 중 조합 1 및 조합 2과 조합 16 내지 26을 사용하여 다음과 같이 다중 PCR을 수행하였다.

먼저 마이크로타이터 플레이트의 한 웰에 B. cereus , S. aureus , L. monocytogenesis, 3 가지 균주를 각각 10⁴ CFU씩 첨가하였다. 이후 이를 냉동과 얼림을 반복하여 세포 파쇄액을 만든 후, 이중 3㎕를 취하여 PCR을 주형으로 사용하였다. PCR 조건은 위와 같다. 결과는 도 4 및 5 (각각 조합 1 및 조합 2), 도 6 내지 16 (각각 조합 16 내지 26)에 있다. 도 4 및 5와 도 6 내지 도 16의 각각의 젤 사진의 상응하는 lane 2에서와 같이 3가지 그람 양성 식중독 세균종의 존재를 보여주는 세 가지 크기, 또는 두 가지 크기의 DNA 밴드가 동시에 증폭되었다. 이는 단일 PCR로서 B. cereus, S. aureus, L. monocytogenesis의 존재를 동시에 탐지할 수 있음을 의미한다.

실시예 3. 음식물에서 세균의 검출

양상추에 실험실 조건에서 배양한 3종의 그람 양성균인 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스 균을 각 각 10⁴ cell을 넣어서 섞는다. 그 다음 이 샘플을 1ml의 3차 증류수로 씻어내어 그 증류수를 회수한다. 회수한 증류수의 부피를 줄이기 위해 미생물은 통과하지 못하는 필터(pore size 0.2㎛ syringe filter, Nalgene) 를 사용하여 시료의 부피를 100㎕로 농축을 한다. 이어서 1㎕의 시료를 이용하여 프라이머 조합 1 내지 26 중 어느 하나를 사용해서 실시예 1에 기재된 바와 같이 다중 PCR 반응을 실시한 후 전기영동을 하여 바실러스 세리우스, 스테필로코커스 오리우스 및/또는 리스테리아 모노사이토제네시스를 검출한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10 또는 서열번호 11과 12의 프라이머 쌍 중 어느 하나의 스테필로코커스 오리우스 검출용 프라이머 쌍;
서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4 또는 서열번호 5와 6의 프라이머 쌍 중 어느 하나의 바실러스 세리우스 검출용 프라이머 쌍; 및
서열번호 14와 15 또는 서열번호 16과 17 중 어느 하나의 리스테리아 모노사이토제네시스 검출용 프라이머 쌍을 포함하는,
스테필로코커스 오리우스, 바실러스 세리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스 동시 검출용, 프라이머 쌍.
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제 1 항에 따른 프라이머 쌍을 제공하는 단계;
상기 프라이머 쌍을 시료와 혼합하여 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 DNA를 이용하여 스테필로코커스 오리우스의 존재 여부 및 이에 따른 식중독균 감염여부를 확인하는 단계를 포함하는 다중 PCR을 이용한 스테필로코커스 오리우스, 바실러스 세리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스 동시 검출 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 다중 PCR은 상기 프라이머의 결합온도 50℃ 내지 70℃, 상기 다중 PCR의 반응용액의 MgCl₂의 농도는 1.5 내지 2.5mM에서 수행되는 것인, 스테필로코커스 오리우스, 바실러스 세리우스 및 리스테리아 모노사이토제네시스 동시 검출 방법.
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