KR102108432B1 - 리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아의 동시 검출을 위한 프라이머세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 - Google Patents

리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아의 동시 검출을 위한 프라이머세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)의 동시 검출을 위한 프라이머세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것으로, 본 발명에서 개발한 PCR 키트 (PCR kit)는, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 모두를 간섭없이 검출함으로써, 리스테리아 모노사이토제니스와 동일 특성을 갖는 균주의 위양성 오류를 최소화할 수 있는 장점이 있다.

Description

리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아의 동시 검출을 위한 프라이머세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트 {Primer sets for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua, polymerase chain reaction kit thereof}
본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)의 동시 검출을 위한 프라이머세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다.
식중독이란 식품의 섭취에 연관된 인체에 유해한 미생물 혹은 유독 물질에 의해 발생했거나 발생한 것으로 판단되는 감염성 또는 독소형 질환(식품위생법 제2조 제10호)을 말하는 것으로, 생활수준이 향상되고, 의료기술이 발달하였음에도 불구하고 식중독은 크게 줄지 않고 있는 추세이다(국내외식중독 발생 및 관리동향, 농식품안전정보서비스 운영/관리사업, 2008년 4월). 식품의약품안전청의 통계자료에 따르면 매년 최대 510건의 식중독이 발생하며, 약 1만여 명이 식중독 미생물에 감염된다고 한다(식약청, 식중독 통계시스템).
리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 어디에나 존재할 수 있는 병원균으로, 토양과 식물 및 동물을 비롯한 환경에 널리 존재한다. 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)는 다른 주요 식중독균과 달리 저온에서 자랄 수 있는 특징을 지니며(-0.39℃=31.3℉), 고온(45℃=113℉)에서도 생장할 수 있다. 또한, 4.39의 낮은 pH와 9.4의 높은 pH 조건에서도 생장할 수 있는 특징이 있다고 알려졌다(Todar, K. (2008). "Listeria monocytogenes". Todar's Online Textbook of Bacteriology. Retrieved January 28, 2009.). 이 균은 1920년에 처음 밝혀졌으며, 1983년에 음식물에 의해 사람에게 감염될 수 있다는 것이 밝혀졌고, 면역력이 낮아진 환자 및 임산부와 영유아, 노인이 특히 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)가 유발하는 리스테리아증(Listeriosis)에 취약한 것으로 알려졌다(Listeria monocytogenes Regulations, Food Safety and Inspection Service).
리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)는 식품 중에 빈번히 존재하는 리스테리아 속의 한 종으로 사람이 섭취하여도 식중독 등과 같은 병을 일으키지 않는 비병원성균으로 알려졌다(Jemmi, T. and Stephan, R. “monocytogenes: food-borne pathogen and hygiene indicator”Review Science Magazine. 2006. Volume 25. p. 571-80.). 그런데 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)와 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 모두 에스쿨리나아제(esculinase)를 보유하고 있으므로 식품 중에 이 두 균주가 같이 존재하게 될 경우, 식중독 미생물검출을 위한 배양법 수행시 허위양성(false positive)결과를 나타낼 수 있어 추가 확정실험이 필요한 실정이다.
식품공전상 리스테리아 모노사이토제니스를 확인하기 위한 미생물시험법은 다음과 같다. 가공식품 및 수산물에 대해서는 증균배지로 리스테리아 증균배지(배지 35)를 사용하며, 검체 25g(㎖)을 취하여 225㎖의 리스테리아 증균배지에 가한 후, 30℃에서 48시간 동안 배양한다. 유가공품, 식육가공품, 알가공품, 식육 및 가금류는 25g(㎖)을 리스테리아 증균배지(배지 35), PALCAM 배지(broth) 또는 UVM-modified 리스테리아 증균배지(배지 36) 225㎖에 접종하여 30℃에서 24±2시간 동안 증균 배양한다. 이후, 배양액 0.1㎖를 10㎖의 Fraser 배지(broth)에 접종하여 35~37℃에서 24~48시간 동안 2차 증균을 실시한다. 증균배양액을 Oxford 한천배지(배지 38) 또는 LPM 한천배지(배지 39) 또는 PALCAM 한천배지(배지 65)에 접종하여 35~37℃에서 24~48시간 동안 배양한다.
의심집락이 확인되면 이를 0.6% 효모추출물(yeast extract)이 포함된 Tryptic soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24~48시간 동안 배양한다. 그 후, 분리배양한 의심집락을 확인하는데, 그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 용혈작용(hemolysis), 운동성(motility), 카탈라아제(catalase), CAMP 시험 및 만니톨(mannitol), 람노스(rhamnose), 자일로오스(xylose)의 당분해시험을 실시한다. 그 결과, β-용혈작용을 나타내고, 카탈라아제 및 운동성 양성을 나타내며, CAMP 시험결과, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ATCC 25923)에서 양성, 로도코쿠스 에쿠이(Rhodococcus equi ATCC 6939)에서 음성으로 나타나는 동시에 당분해시험 결과 만니톨 비분해, 람노스 분해, 자일로오스 비분해의 결과를 보일 경우 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 양성으로 판정한다. 상기 방법은 많은 비용 및 노동력이 소요된다.
위와 같이 식중독 세균 (Foodborne Pathogen)의 탐지법 중에 가장 많이 사용되어온 방법은 배양법 (culture-based method)으로, 정확도는 높지만, 많은 샘플을 동시에 처리하기가 어려우며, 최소 24시간 이상의 농화배양(enrichment culture)을 필요로 하고, 농화배양 후에도 선택 배양, 확정 시험단계를 필요로 하기 때문에 이러한 전통적인 배양법은 노동 집약적이며 많은 시간이 소요된다는 단점이 있다.
이 외에도 최근에 배양을 이용한 방법 (culture-based method)을 대체하는 방법으로, 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 및 항체를 이용한 면역학적 탐지법이 개발되었지만, 면역학적 방법은 실험과정이 간편한 반면 민감도가 낮고, 다양한 병원균을 탐지하는 데 신뢰할 만한 도구로 사용되어 온 중합효소연쇄반응, 특히 다중중합효소연쇄반응 (multiplex polymerase chain reaction, multiplex PCR)은 다수의 타겟을 동시에 탐지할 수 있는 장점을 갖고 있지만 다중중합효소연쇄반응을 포함한 전통적인 중합효소연쇄반응방법 역시 증폭 산물(amplification product)의 분석을 위한 전기영동 (gel electrophoresis) 과정이 수반되므로 시간이 많이 소모되고 노동 집약적이다.
반면, 실시간중합효소연쇄반응 (Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR) 기법은 증폭 산물 (product)로부터 발생하는 형광의 강도(세기)를 탐지하는 방법으로, 전통적인 중합효소연쇄반응방법에 비해 더 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있으며 분석이 매우 간단하다. 또한, 증폭 산물을 분석하기 위한 전기영동 (gel electrophresis), DNA간 혼성 (DNA-DNA hybridization), 시퀀싱 (sequencing)과 같은 추가적인 실험이 필요하지 않다는 장점이 있다.
대한민국등록특허 제10-1846952호(2018.04.03)에는, 리스테리아 모노사이토제니스, 장출혈성 대장균, 가스괴저균의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관하여 기재되어 있다.
본 발명은 기존 배양법에 의한 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 양성 여부 판정시, 리스테리아 모노사이토제니스와 동일 특성을 나타내는 비독성 균주에 대한 위양성 판정을 배제하기 위하여, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 비독성 균주의 동시 검출이 가능한 프라이머 세트 및 이를 포함한 PCR 키트를 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 내에 존재하는 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 prfA 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 A와, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 내에 존재하는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 lin2693 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 내에 존재하는 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 prfA 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 A와, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 내에 존재하는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 lin2693 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 중합효소연쇄반응 키트 (polymerase chain reaction kits)를 제공한다.
본 발명의 중합효소연쇄반응 키트 (polymerase chain reaction kits)에 있어, 상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것이 좋다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 프라이머 세트 A는, 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 B는, 바람직하게 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5에 기재된 역방향 프라이머로 구성되는 것이 좋다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 프라이머 세트 A는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 B는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 6-FAM이 태깅 (tagging)되어 있는 것이 좋고, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 CY5가 태깅 (tagging)되어 있는 것이 좋다.
본 발명에서 개발한 PCR 키트 (PCR kit)는, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 모두를 간섭없이 검출함으로써, 리스테리아 모노사이토제니스와 동일 특성을 갖는 균주의 위양성 오류를 최소화할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua)의 옥스포드(Oxford) 한천배지 배양 결과이다.
도 2는 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 위양성 검증 결과이다.
도 3은 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 리스테리아 모노사이토제니스의 최소 검출한계 검증 결과이다.
도 4는 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 리스테리아 이노쿠아의 최소 검출한계 검증 결과이다.
도 5는 소시지에서의 위양성 검증 결과이다 (A: 보일링 방법(Boiling methods)을 이용한 DNA 추출, B: Genelix rapid DNA extraction kit를 이용한 DNA 추출).
도 6은 닭고기에서의 위양성 검증 결과이다 (A: 보일링 방법(Boiling methods)을 이용한 DNA 추출, B: Genelix rapid DNA extraction kit를 이용한 DNA 추출).
본 발명은 기존 배양법에 의한 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes) 양성 여부 판정시, 리스테리아 모노사이토제니스와 동일 특성을 나타내는 비독성 균주에 대한 위양성 판정을 배제하기 위하여 예의 노력하였으며, 그 결과 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 비독성 균주인 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)를 다른 균들 및 이들 균주와의 간섭없이 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다.
본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 내에 존재하는 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 prfA 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 A와, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 내에 존재하는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 lin2693 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 리스테리아 이노쿠아 대비 리스테리아 모노사이토제니스를 특이적으로 검출할 타겟 유전자인 prfA(서열번호 7)와, 리스테리아 모노사이토제니스 대비 리스테리아 이노쿠아를 특이적으로 검출할 타겟 유전자인 lin2693(서열번호 8)를 선정하였다.
타겟 유전자의 염기서열
유전자 이름 염기서열
prfA (서열번호 7) ATGAACGCTCAAGCAGAAGAATTCAAAAAATATTTAGAAACTAACGGGATAAAACCAAAACAATTTCATAAAAAAGAACTTATTTTTAACCAATGGGATCCACAAGAATATTGTATTTTTCTATATGATGGTATCACAAAGCTCACGAGTATTAGCGAGAACGGGACCATCATGAATTTACAATACTACAAAGGGGCTTTCGTTATAATGTCTGGCTTTATTGATACAGAAACATCGGTTGGCTATTATAATTTAGAAGTCATTAGCGAGCAGGCTACCGCATACGTTATCAAAATAAACGAACTAAAAGAACTACTGAGCAAAAATCTTACGCACTTTTTCTATGTTTTCCAAACCCTACAAAAACAAGTTTCATACAGTCTAGCTAAATTTAATGATTTTTCGATTAACGGGAAGCTTGGCTCTATTTGCGGTCAACTTTTAATCCTGACCTATGTGTATGGTAAAGAAACTCCTGATGGCATCAAGATTACACTGGATAATTTAACAATGCAGGAGTTAGGATATTCAAGTGGCATCGCACATAGCTCAGCTGTTAGCAGAATTATTTCCAAATTAAAGCAAGAGAAAGTTATCGTGTATAAAAATTCATGCTTTTATGTACAAAATCTTGATTATCTCAAAAGATATGCCCCTAAATTAGATGAATGGTTTTATTTAGCATGTCCTGCTACTTGGGGAAAATTAAATTAA
lin2693(서열번호 8) TTACTTAGGCGCATTTTTAAGTTCTATATCTTTAGGTAAGTTAAAGAAAATCTTGAAGTTATCTGCTTGGAATCCAGGAATCATTAACCTACTATTCCATAAGAATTTCTCATGTTTTAGTGGTTTAACAGTTACCACTTTTTTACCTTCGTCAATTTGTTTTTGAATACTATCCATTCTGTCATTATCAGATATTTTTATTTGAGCAAAAATAATACCATACGCGACTACTAAAGATAAAGAAAGCGTTATAATCGGAACACTGATAGCATTTAGATTAACATATCCCTCATCCACAAAATAAACAAGAAGTCGTATAATAAATAAAACAAAAAATGTATAGGAAATAATAAAACATCTTGATCCAAAAGGAGTTACAAAGAATAACGGTCCTGCAACGAATACTGCAGAAATTAGATAAAAACTTAGCTCCACTTTTAAAGAACTCTTTCGGAAAAATAAAATGATAGTAAATAGAATAGTTAAGTAAAATAATAATGAAATCCAAGCTTCAAGTTCTGAAGTCTTAGCTACATCCGTAAAAATACTTAACTGCATTCTATCAACAATAAGTGGTCGATAGAAAGGATATATAGTTAGTATTACCATGAAAATGTTTTTAACCCATACCTTCCAAATAGGTAGATTAGTTCCAATTTTCACTAACAAGAAAATACAAAATATAGCCAATGCAAAGTTCAATAAAATATTGTTCATAATTAAAAACTTATACATGCTAGTTGAGAAAATTGAATAAATTTTTTCAAAAATTCCCATATCAGTATCAATTGTTCGATAATTATCTGCGCCAGTAAATATTTTTACATAGGCACCATTAGAAAACATTATAACTGCTCCGATGAGGGCTGAAATAAGGTATACAATATGGAAATAAAAGAACTTTCTAAATTTCATAAAGCTATAAATTATAACAAACGCACCAGCAAATACATTATAAATTGTAGCATGTTCTACAAACAATTGAGAGCCAATTCCAAGTGGAACAGCAAATATTACCAACCAAACTGAATAACTAGGATTTTTTTCATAAAAAATATTCTTCACAATTAGTAAATATACTAAAATACAAATCGTTGCAGTATTATAGTTAGCAAAACCAGCTGCCCACGCAAAAGTAGAAGAAAACATATCACTGGAAACACCTAGCATCAAGAATAGACTTAGAAAAGCGATAGTTAACTTTGTTGCTTTTGCAATTAAAAGGGGTATTACTACTATTGCAGCTCCAAATACTCCCATGATTAAAAAGCGGAACCAATCTACTCTAGTAATTATTAATTCACATATATTACCAAAATAACGACCATTATAGTCTTTAAAACCATCATAAAAACGATTCATTCCAAGTCGTATGCCCCAAGTCCAGTCATCATGAGTTAACGGGGTACAATAAGACAGATATAAGTAAAACAAAAAAACAATAAAACTAAAAATTCCAATCTTGACGCCATCTTTTTTTATGCTATTTATCATAGATACACATCCC
이후, 이들 유전자를 타겟으로 검출하기 위한 프라이머를 설계하고, 위양성 검사를 수행한 결과, 본 발명의 프라이머 세트를 이용할 시, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 비독성 균주인 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)를 다른 균들 및 이들 균주와의 간섭없이 검출할 수 있었다.
즉, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes)를 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua)로부터 특이적으로 검출할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 내에 존재하는 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 prfA 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 A와, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 내에 존재하는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 lin2693 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 중합효소연쇄반응 키트 (polymerase chain reaction kits)를 제공한다.
상기 본 발명에서 개발한 프라이머 세트는 PCR에 사용되는데, 검체를 대상으로 하여 PCR을 수행할 경우, 상기 2개의 균주를 검출할 수 있게 된다. PCR용 키트에는 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 외에 버퍼, dNTP 등이 첨가될 수 있는데, 이는 공지의 것을 특별한 것에 한정하지 않고 사용할 수 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.
본 발명에서 개발한 PCR 키트 (PCR kit)는, 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)와 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 모두를 간섭없이 검출함으로써, 리스테리아 모노사이토제니스와 동일 특성을 갖는 균주의 위양성 오류를 최소화할 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응 키트 (polymerase chain reaction kits)에 있어, 상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것이 좋다. Real-Time PCR을 수행하면, 연쇄중합반응 결과 산물을 실시간에 정량적으로 확인할 수 있어, 현장에서 병원성 미생물의 감염여부를 즉시 확인할 수 있는 장점이 있다.
한편, 본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 프라이머 세트 A는, 바람직하게 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 B는, 바람직하게 서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5에 기재된 역방향 프라이머로 구성되는 것이 좋다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 프라이머 세트 A는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋고, 상기 프라이머 세트 B는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것이 좋다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어, 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 6-FAM이 태깅 (tagging)되어 있는 것이 좋고, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은, 바람직하게 5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 CY5가 태깅 (tagging)되어 있는 것이 좋다.
상기와 같은 형광염료의 태깅에 의해, 타겟 미생물의 감염 여부를 형광 분석기를 통해 확인할 수 있는데, 본 발명에서 타겟 미생물들에 대해 사용한 상기 형광염료 조합에 의해, 리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아의 검출 감도를 높일 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실험예 1: 옥스포드 (Oxford) 한천배지 배양을 통한 리스테리아 ( Listeria ) 속 균주의 위양성 확인]
옥스포드(Oxford) 한천배지에 표 2의 리스테리아(Listeria)속 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 배양하여 식중독균 검출 유무를 판정하였다 (도 1, 표 2). 표 2의 균주는 KCTC 에서 분양받아 이용하였다. 도 1은 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua)의 옥스포드(Oxford) 한천배지 배양 결과이다.
리스테리아 속 균주의 옥스포드 한천배지 배양 결과
균주 이름 균주 번호 양성/음성
L. monocytogenes ATCC 15313 양성
L. monocytogenes ATCC 19111 양성
L. monocytogenes ATCC 19115 양성
L. innocua KCTC 3586 양성
L. grayi KCTC 3443 양성
L. marthii KCTC 13854 양성
L. rocourtiae KCTC 13856 음성
L. seeligeri KCTC 3591 양성
L. welshimeri KCTC 3587 양성
실험 결과, 식중독균인 리스테리아 모노사이토제니스와 동일한 특성을 나타내는 경우, 비병원성(비식중독 유발)의 리스테리아 속 균주들이 양성으로 나타나는, 위양성 판정 결과에 따라, 배지법의 한계를 확인할 수 있었다.
[ 실시예 1: 본 발명의 프라이머 세트의 제작]
리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아의 정확한 검출을 위하여 하기 표 3와 같이 프라이머와 탐침의 염기서열을 디자인하였다.
리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출을 위한 프라이머(primer) 및 탐침(probe)의 염기서열
Pathogen target gene Primer sequence(5'-3')
L. monocytogenes prfA F-Primer
(서열번호 1)		 TGCTCAGTAGTTCTTTTAGTTC
R-Primer
(서열번호 2)		 CTCACGAGTATTAGCGAGA
Probe
(서열번호 3)		 6-FAM-CGTATGCGGTAGCCTGCTC
L. innocua lin2693 F-Primer
(서열번호 4)		 CCGTTAACTCATGATGACTG
R-Primer
(서열번호 5)		 GACCATTATAGTCTTTAAAACCATC
Probe
(서열번호 6)		 CY5-ACGATTCATTCCAAGTCGTATGCC
[ 실험예 2: 실시예 1의 프라이머 세트를 사용하여 리스테리아 모노사이토제 니스( Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이노쿠아 ( Listeria innocua )의 위양성 검증]
실시예 1에서 제작한 프라이머세트를 이용하여 다중실시간중합효소연쇄반응을 수행함으로써, 표 4에 기재된 균주를 대상으로 위양성 검증 실험을 수행하였다. 표 4의 균주는 각각 한국세포주은행(ATCC), 한국생명공학연구원(KCTC), 국가병원체자원은행(NCCP)에서 분양받아 이용하였다.
위양성 검증 실험 균주 목록
균주 이름 균주 번호
Listeria monocytogenes ATCC 15313
Listeria innocua KCTC 3586
Listeria grayi KCTC 3443
Listeria marthii KCTC 13854
Listeria rocourtiae KCTC 13856
Listeria seeligeri KCTC 3591
Listeria welshimeri KCTC 3587
Campylobacter jejuni KCTC 15212
Campylobacter coli NCTC 11168
Clostridium perfringens NCCP 15911
Vibrio vulnificus ATCC 27562
Vibrio parahaemolyticus KCTC 2471
Vibrio cholerae NCCP 14552
Salmonella Typhimurium ATCC 700720
Bacillus cereus KCTC 3624
Yersinia enterocolitica ATCC 55076
Staphylococcus aureus ATCC 6358
EHEC ATCC 43895
EAEC NCCP 14039
ETEC NCCP 15732
EPEC NCCP 15661
EIEC NCCP 15663
Cronobacter sakazakii ATCC 12868
실험 결과, 총 23개의 균주를 대상으로, 본 발명자가 제작한 prfA 프라이머 및 탐침과 lin2693 프라이머 및 탐침을 이용한 다중실시간중합효소연쇄반응 수행시, 리스테리아 모노사이토제니스, 리스테리아 이노쿠아만이 검출되고, 그 외 종에서 40 사이클 이내 위양성 결과가 검출되지 않았다 (도 2). 도 2는 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 위양성 검증 결과이다.
[ 실험예 3: 실시예 1의 프라이머 세트를 사용하여 리스테리아 모노사이토제니스 ( Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이노쿠아 ( Listeria innocua )의 최소 검출한계 검증]
실시예 1에서 제작한 프라이머세트를 이용하여 다중실시간중합효소연쇄반응 수행 시, 최소 검출 가능한 균 수를 측정하였다. prfA 및 lin2693은 각각 102 CFU/㎖ 수준의 검출한계를 나타내었다. 실험결과, 초기 균의 농도는 리스테리아 모노사이토제니스의 경우 1.9×109 CFU/㎖, 리스테리아 이노쿠아의 경우 2.3×109 CFU/㎖로 나타났다 (도 3 내지 4). 도 3은 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 리스테리아 모노사이토제니스의 최소 검출한계 검증 결과이고, 도 4는 본 발명의 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트를 이용한 리스테리아 이노쿠아의 최소 검출한계 검증 결과이다.
[ 실험예 4: 식품에서 리스테리아 모노사이토제니스 ( Listeria monocytogenes ), 리스테리아 이노쿠아 ( Listeria innocua )의 위양성 검증]
시판용 육가공 제품인 소시지와 닭고기에 리스테리아 모노사이토제니스와 리스테리아 이노쿠아를 동시에 접종한 후, 37℃에서 증균한 배양액에서 DNA 추출(extraction)을 수행하였다. DNA 추출은 식품공전상 보일링 방법(Boiling methods)과 Genelix rapid DNA extraction kit(세니젠®)를 이용한 2가지 방법으로 수행하였다. 실험 결과, 상기 2가지 방법을 이용하여 소시지와 닭고기에서 각각 추출한 DNA 추출액은 모두 위양성 결과가 검출되지 않았다 (도 5 내지 6). 도 5는 소시지에서의 위양성 검증 결과이고, 도 6은 닭고기에서의 위양성 검증 결과이다 (A: 보일링 방법(Boiling methods)을 이용한 DNA 추출, B: Genelix rapid DNA extraction kit를 이용한 DNA 추출).
<110> Sanigen Co.,Ltd. <120> Primer sets for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua, polymerase chain reaction kit thereof <130> YP-18-243 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of prfA gene. <400> 1 tgctcagtag ttcttttagt tc 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of prfA gene. <400> 2 ctcacgagta ttagcgaga 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe. <400> 3 cgtatgcggt agcctgctc 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplification of lin2693 gene. <400> 4 ccgttaactc atgatgactg 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplification of lin2693 gene. <400> 5 gaccattata gtctttaaaa ccatc 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe. <400> 6 acgattcatt ccaagtcgta tgcc 24 <210> 7 <211> 714 <212> DNA <213> Listeria monocytogenes <400> 7 atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60 caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120 ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180 caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240 ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300 gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360 caaaaacaag tttcatacag tctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa cgggaagctt 420 ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480 ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540 gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600 tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat cttgattatc tcaaaagata tgcccctaaa 660 ttagatgaat ggttttattt agcatgtcct gctacttggg gaaaattaaa ttaa 714 <210> 8 <211> 1507 <212> DNA <213> Listeria innocua <400> 8 ttacttaggc gcatttttaa gttctatatc tttaggtaag ttaaagaaaa tcttgaagtt 60 atctgcttgg aatccaggaa tcattaacct actattccat aagaatttct catgttttag 120 tggtttaaca gttaccactt ttttaccttc gtcaatttgt ttttgaatac tatccattct 180 gtcattatca gatattttta tttgagcaaa aataatacca tacgcgacta ctaaagataa 240 agaaagcgtt ataatcggaa cactgatagc atttagatta acatatccct catccacaaa 300 ataaacaaga agtcgtataa taaataaaac aaaaaatgta taggaaataa taaaacatct 360 tgatccaaaa ggagttacaa agaataacgg tcctgcaacg aatactgcag aaattagata 420 aaaacttagc tccactttta aagaactctt tcggaaaaat aaaatgatag taaatagaat 480 agttaagtaa aataataatg aaatccaagc ttcaagttct gaagtcttag ctacatccgt 540 aaaaatactt aactgcattc tatcaacaat aagtggtcga tagaaaggat atatagttag 600 tattaccatg aaaatgtttt taacccatac cttccaaata ggtagattag ttccaatttt 660 cactaacaag aaaatacaaa atatagccaa tgcaaagttc aataaaatat tgttcataat 720 taaaaactta tacatgctag ttgagaaaat tgaataaatt ttttcaaaaa ttcccatatc 780 agtatcaatt gttcgataat tatctgcgcc agtaaatatt tttacatagg caccattaga 840 aaacattata actgctccga tgagggctga aataaggtat acaatatgga aataaaagaa 900 ctttctaaat ttcataaagc tataaattat aacaaacgca ccagcaaata cattataaat 960 tgtagcatgt tctacaaaca attgagagcc aattccaagt ggaacagcaa atattaccaa 1020 ccaaactgaa taactaggat ttttttcata aaaaatattc ttcacaatta gtaaatatac 1080 taaaatacaa atcgttgcag tattatagtt agcaaaacca gctgcccacg caaaagtaga 1140 agaaaacata tcactggaaa cacctagcat caagaataga cttagaaaag cgatagttaa 1200 ctttgttgct tttgcaatta aaaggggtat tactactatt gcagctccaa atactcccat 1260 gattaaaaag cggaaccaat ctactctagt aattattaat tcacatatat taccaaaata 1320 acgaccatta tagtctttaa aaccatcata aaaacgattc attccaagtc gtatgcccca 1380 agtccagtca tcatgagtta acggggtaca ataagacaga tataagtaaa acaaaaaaac 1440 aataaaacta aaaattccaa tcttgacgcc atcttttttt atgctattta tcatagatac 1500 acatccc 1507

Claims (6)

  1. 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 내에 존재하는 서열번호 7의 핵산서열로 이루어진 prfA 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 A와, 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 내에 존재하는 서열번호 8의 핵산서열로 이루어진 lin2693 유전자의 전체 또는 일부를 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 세트 B를 포함하며,
    상기 프라이머 세트 A는,
    서열번호 1에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하고,
    상기 프라이머 세트 B는,
    서열번호 4에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5에 기재된 역방향 프라이머로 구성되는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 멀티플렉스 프라이머 세트.
  2. 제1항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응 키트 (polymerase chain reaction kits).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)은,
    실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)인 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction)용 키트.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트 A는,
    서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하고,
    상기 프라이머 세트 B는,
    서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)을 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 멀티플렉스 프라이머 세트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은,
    5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 6-FAM이 태깅 (tagging)되어 있는 것을 특징으로 하고,
    상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침 (probe)은,
    5' 말단에 형광염료 (fluorescence dye)로 CY5가 태깅 (tagging)되어 있는 것을 특징으로 하는 리스테리아 모노사이토제니스 (Listeria monocytogenes) 및 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua) 검출용 멀티플렉스 프라이머 세트.
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