KR101261412B1 - 주요 병원성 미생물 신속검출용 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 및 이를 위한 ｐｃｒ 프라이머 - Google Patents

주요 병원성 미생물 신속검출용 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 및 이를 위한 ｐｃｒ 프라이머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 공중보건학 상 위해가 큰 병원성 미생물 5종(Bacilllus cereus , Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus , Salmonella spp., Listeria monocytogenes)을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 기법에 활용 가능한 프라이머 및 이 프라이머를 사용한 멀티플렉스 PCR 방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머는 각 병원성 미생물에 존재하는 특이적인 유전자를 대상으로 제작하였으며, 그 결과 병원성 미생물에 특이적으로 반응하여 병원성 미생물과 기타 미생물을 구분해 내는데 효과적이다. 멀티플렉스 PCR의 민감도 향상을 위해 개발된 BSA 첨가 PCR 키트는 PCR 반응을 억제하는 몇몇 물질로부터 Taq DNA 중합효소가 안정적으로 반응하도록 도와주며, PCR 반응이 안정적으로 일어나 병원성 미생물을 검출하는데 있어 민감하게 작용할 수 있도록 한다. 따라서 멀티플렉스 PCR의 민감도를 향상시킬 수 있었고, 기존의 PCR 키트를 사용하였을 경우 유전자 증폭산물을 얻기 위해 필요한 최소한의 DNA보다 적은 농도의 DNA가 존재하더라도 충분히 유전자 증폭산물을 얻을 수 있다. 이것은 1개의 콜로니에서 얻을 수 있는 DNA 양(10 pg 정도)보다 적은 양으로 존재해도 신속하고 민감하게 병원성 미생물을 검출할 수 있다는 것을 의미한다.

Description

주요 병원성 미생물 신속검출용 멀티플렉스 ＰＣＲ 방법 및 이를 위한 ＰＣＲ 프라이머 {Multiplex PCR assays for detecting pathogenic bacteria and PCR primer for PCR Assays}
본 발명은 병원성 미생물을 검출하기 위한 신규한 프라이머 및 이 프라이머를 사용하여 병원성 미생물을 검출하는 PCR 방법에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 아주 적은 양의 DNA 만으로도 특정 부위의 DNA 염기서열을 기하급수적으로 증폭시킬 수 있는 간단하고 편리한 방법으로, 증폭하고자 하는 DNA에 특이적으로 결합하여 고온에서도 안정한 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 변성(denaturation), 결합(annealing), 연장(extension)의 과정을 반복적으로 실행함으로써 특정 DNA를 증폭시키게 된다. PCR을 이용한 병원성 미생물의 검출은 목적 미생물의 특이 유전자를 인식하는 프라이머를 이용하여 PCR로서 이를 증폭·확인하는 것이며, 이 방법의 장점으로는 검출 효율이 높아 검체 중에 미량으로 존재하는 병원성 미생물도 검출할 수 있다는 것이다. 특히, 멀티플렉스(multiplex) PCR법은 한 번의 반응으로 여러 개의 원하는 유전자를 동시에 증폭시킬 수 있는 장점이 있다.
현재 멀티플렉스 PCR 방법을 이용하여 여러 미생물을 검출하고 확인하는 많은 연구가 진행되고 있다. 대한민국 등록 특허 제10-0662429호는 약독화 독감 바이러스주의 유전자와 독성 바이러스주의 대응하는 유전자의 염기서열 중 상호 간의 변이가 많은 부분에 해당하는 프라이머를 제작하고 하나의 반응에서 2 내지 3개의 중합효소 연쇄반응이 동시에 진행되도록 함으로써 약독화 독감 바이러스주의 6개의 유전자와 독성바이러스의 2개의 유전자를 갖는 6:2 재조합 바이러스를 멀티플렉스 PCR 방법으로 효과적으로 스크리닝하는 방법에 관한 것이며, 대한민국 특허 공개 번호 제10-2009-0072008호는 한번의 PCR 반응에 동시에 적용할 수 있는 3종의 PCR 프라이머 세트를 개발하고 이들 프라이머 세트들을 동시에 적용하여 정확하고 신속하게 다수의 비브리오균을 분리할 수 있고 분리균의 오진율을 낮출 수 있는 비브리오균 신속 분류를 위한 멀티플렉스 PCR 기법 및 이를 위한 PCR 프라이머에 관하여 기재하고 있다.
최근 식당, 주문 배달업체, 급식센터, 패스트푸드점 등 대량으로 음식물을 공급하는 시설과 이를 이용하는 소비자가 증가함에 따라 집단 식중독의 발생은 식품 공급업체와 소비자 모두에게 중대한 문제가 된다. 이러한 세균성 식중독은 식품에 오염된 후 식품 내에서 증식하면서 독소를 생성하는 독소형 식중독과 식중독 원인균이 식품을 통해 섭취된 후 체내에서 독소를 생성하는 감염형 식중독으로 나눌 수 있는데, 식중독의 증상이 나타날 때까지 인지하지 못하는 경우가 많아 감염 후 치료하는 경우가 많고, 특히 E. coli O157:H7과 같은 고병원성 식중독균의 경우 사망으로 이어지는 경우도 있다. 따라서, 이러한 병원성 식중독 원인균의 신속한 검출은 식품 안전을 지키기 위해 절실히 필요하다고 할 수 있다.
세균성 식중독의 원인균을 검출·확인하는 방법으로는, 채취한 검체를 선택배지를 이용하여 배양하고, 배지에 형성된 콜로니를 육안으로 관찰하거나, 기타 탐지확인 수단을 이용하여 확인하는 방법 등이 있으며, 최근에는 PCR을 이용한 검사법이 개발·사용되고 있다. 특히, Listeria monocytogenes는 자연계에 널리 존재하고 감염되면 패혈증, 수막염, 뇌 수막염 등을 일으키는 것으로 보고되어 있으며, 저온성 식품인 유제품, 피자 등에서 발생된 사례가 있다. L. monocytogenes가 가지고 있는 actA를 코드화하는 유전자를 목표로 하는 PCR법은 인위적으로 오염된 물과 우유 등에서 L. monocytogenes 만을 특이적으로 신속하게 검출해 낼 수 있다. Bacillus cereus 역시 자연계에 널리 존재하여 식품에 오염 기회가 많으며 주로 설사와 구토를 일으킨다. 이러한 증상을 일으키는 독소를 생산하는 유전자 가운데 하나인 HBL 유전자는 장내 용혈성 독소를 생산하여 식중독을 일으킨다. 따라서 HBL 유전자를 대상으로 하는 PCR은 B. cereus의 신속 검출을 위한 효과적인 방법이라 할 수 있다. 그리고 Escherichia coli O157:H7은 인체 내에서 독소를 생산하여 식중독을 일으키는 미생물로 전염성이 강하며, 이로 인한 질병은 제1군 법정 전염병으로 분류되고 있다. 이러한 E. coli O157:H7에 운동성을 부여하는 편모형성 유전자 fliCh7를 이용한 PCR 분석법은 혈청학적 검사방법과 마찬가지로 비슷하게 민감하고 특이적으로 검출이 가능하다. Salmonella spp.는 주로 2차 오염된 달걀, 식육 및 그 가공품과 같은 동물성 식품을 통해 감염이 되며, invA 유전자에 의해 장내에 침입하여 급성 위장염을 주 증상으로 구토, 복통, 설사 등을 일으킨다. invA 유전자는 Salmonella spp.의 고유 염기 서열을 포함하고 있기 때문에 PCR 대상으로 적합하며, 이 유전자를 활용한 PCR은 Salmonella spp.의 신속한 검출법으로 적합하다고 할 수 있다. Staphylococcus aureus는 사람과 동물의 인후, 비강, 피부의 상재균으로, 자연환경에 대한 저항성이 강하고, 손이나 조리 기구 등을 통하여 2차 오염된다. Gram-positive 합성 유전자 그룹의 많은 특징을 보여주는 S. aureus의 ileS 유전자는 mRNA에 포함되어 isoleucyl-tRNA 합성효소를 코드화하는 유전자로, 이 유전자를 대상으로 하는 PCR법은 S. aureus를 검출해 내는데 효과적이라 할 수 있다. 따라서 각 병원성 미생물들이 가지고 있는 특이적인 유전자를 이용한 PCR 분석방법은 병원성 미생물을 신속하고 특이적으로 검출하는데 효과적인 방법이 될 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로, 병원성 미생물을 검출하는데 있어서 종래 PCR 방법보다 민감하고 특이적으로 병원성 미생물을 확인할 수 있는 멀티플렉스 PCR 방법 및 이 PCR에 사용하는 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 본 발명은 보다 신속하고 정확한 멀티플렉스 PCR 방법을 위한 PCR 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 상기 목적은 병원성 미생물에 특이적인 프라이머를 제작하고, 이 프라이머를 사용해 멀티플렉스 PCR 방법을 실시하여 병원성 미생물에 대한 프라이머의 특이성 및 민감성을 측정함으로써 달성하였다.
본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법 및 이 PCR 방법에 사용되는 프라이머는 종래의 PCR 방법 및 프라이머에 비해 특이성 및 민감성이 우수할 뿐만 아니라 빠르고 정확하게 병원성 미생물을 검출할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머 및 멀티플렉스 PCR 키트를 이용한 병원성 미생물에 대한 특이성을 나타낸 것이다. (A)병원성 미생물 그룹 (B. cereus , S. aureus ,) 레인 M; 1 kb 사이즈 마커, 레인 1-3; B. cereus 그룹(437 bp), 레인 4-6; S. aureus 그룹(227 bp), (B)병원성 미생물 그룹 (E. coli O157:H7). 레인 M; 1 kb size 마커, 레인 1-5; E. coli O157:H7 그룹(519 bp), (C)병원성 미생물 그룹 (L. monocytogenes) 레인 M; 1 kb 사이즈 마커, 레인 1-6; L. monocytogenes 그룹(611 bp). (D)병원성 미생물 그룹 (Salmonella spp.) 레인 M; 1 kb size 마커, 레인 1-9; Salmonella spp. 그룹 (338 bp).
도 2는 본 발명의 프라이머 및 멀티플렉스 PCR 키트를 이용해 비 병원성 미생물 그룹에 대한 특이성을 나타낸 것이다. 레인 M; 1 kb size 마커, 레인 1; Bacillus 그룹, 레인 2; E. coli 그룹, 레인 3; Staphylococcus 그룹. 비 병원성 미생물 그룹에서는 유전자 증폭 산물이 없음을 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명의 프라이머 및 멀티플렉스 PCR 키트를 이용한 DNA 농도별 민감도를 확인한 것이다. 레인 M; 1 kb size 마커, 레인 1; 10 ng/㎕, 레인 2; 1 ng/㎕, 레인 3; 100 pg/㎕, 레인 4; 10 pg/㎕ 레인 5; 1 pg/㎕, 레인 6; 100 fg/㎕, 레인 7; 10 fg/㎕.
도 4는 본 발명의 프라이머 및 멀티플렉스 PCR 키트를 이용하여 각 병원성 미생물 DNA의 농도 별 민감도를 확인한 것이다. (A); B. cereus (437 bp), (B); E. coli O157:H7 (519 bp), (C); S. aureus (227 bp), (D); Salmonella spp. (338 bp), (E); L. monocytogenes (611 bp). 레인 M; 1 kb size 마커, 레인 1; 10 ng/㎕, 레인 2; 1 ng/㎕, 레인 3; 100 pg/㎕, 레인 4; 10 pg/㎕ 레인 5; 1 g/㎕, 레인 6; 100 fg/㎕, 레인 7; 10 fg/㎕.
실시예 1. 프라이머의 제작
프라이머는 병원성 미생물 5종(Bacillus cereus , Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus , Salmonella spp., Listeria monocytogenes)에 대해서 B. cereu가 가지는 hbl 유전자, E. coli O157:H7은 fliCh7, S. aureus는 ileS, Salmonella spp.는 invA, L. monocytogenes는 actA 유전자를 대상으로 하여 GenBank database에 기탁된 염기서열을 바탕으로 증폭되는 산물의 크기가 약 100 bp 정도 차이를 갖도록 5쌍의 프라이머를 제작했다(표 1).
PCR 프라이머의 제작은 FastPCR 프로그램을 이용하여 제작하였다. 병원성 미생물의 탐지에 사용된 각각의 유전자 염기서열에 대해, 프라이머 반응 온도와 증폭 산물의 크기를 고려하여 프라이머를 설계하였다.
첫 번째 PCR 프라이머쌍 LMp1/LMp2는 L. monocytogenes를 특이적으로 탐지 할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 611 bp 이다.
두 번째 PCR 프라이머쌍 ECp1/ECp2는 E. coli O157:H7를 특이적으로 탐지 할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 519 bp 이다.
세 번째 PCR 프라이머쌍 BCp2/BCp4는 B. cereus를 특이적으로 탐지 할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 437 bp 이다.
네 번째 PCR 프라이머쌍 SSp3/SSp4는 Salmonella spp.를 특이적으로 탐지 할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 338 bp 이다.
다섯 번째 PCR 프라이머쌍 SAp1/SAp2는 S. aureus를 특이적으로 탐지 할 수 있도록 설계하였고, 증폭 산물의 크기는 227 bp 이다.
병원성 미생물 프라이머 서열번호 표적 유전자
(산물 크기)
L. monocytogenes LMp1 TAGTTCGCTGAATAGTGGCGA 서열번호 1 actA (611 bp )
LMp2 TTGCTTTTTCGTCTTCTGCAC 서열번호 2
E. coli O157:H7 ECp1 ACATCTTTACTCACTGTAGCCTG 서열번호 3 fliC h7 (519 bp )
ECp2 AACTACCGATGCTGCATTCGA 서열번호 4
B. cereus BCp3 TCATTGATTTGCCGTTGCGTAT 서열번호 5 hbl (437 bp )
BCp4 GTCACATCCATTGTAACTGGAGGA 서열번호 6
Salmonella spp. SSp3 TTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAG 서열번호 7 invA (338 bp )
SSp4 TCCATCAGCAAGGTAGCAGTC 서열번호 8
S. aureus SAp1 CATACAGCACCAGGTCACGGGGAA 서열번호 9 ileS (227 bp )
SAp2 GTTCTCCAGTCGTGTGGATAGC 서열번호 10
실시예 2. 사용 균주 및 DNA 추출
본 발명에 사용한 균주는 개발된 프라이머의 특이성 및 민감도를 확인하기 위하여 병원성 및 비 병원성 균주를 선택하여 사용하였고(표 2), 각 균주는 tryptic soy broth(TSB)를 사용하여 35℃, 200 rpm으로 18시간 배양하였다. 배양한 균주는 PCR을 수행하기 위하여 boiling법 및 DNA 추출 키트법을 사용하여 genomic DNA를 추출하였다.
Boiling 법
TSB에 미생물을 접종하여 순수배양된 배양액 1 ㎖을 원심 집균하여 멸균된 2차 증류수를 이용하여 1회 원심 수세하였다. 수거된 펠렛을 멸균된 Tris-EDTA 완충용액(pH 8.0) 100 ㎕를 첨가하여 펠렛과 잘 섞어 부유시켜 100℃, 10분 간 중탕하여 균체를 파괴하고 얼음 속에서 15분간 방치하였다. 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 침전물이 섞이지 않도록 조심스럽게 상층액을 옮겨 4℃에 보관하며, 이를 주형 DNA로 사용한다.
DNA 추출 키트법
DNA 추출 키트법을 이용한 DNA 추출은 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer)를 사용하였다.
병원성 박테리아 비-병원성 박테리아
Bacillus spp. Bacillus cereus
Bacillus cereus KCCM 11341
Bacillus cereus KCCM 40935		 Bacillus subtilis IFO 12113
Bacillus subtilis BR40
Bacillus thuringiensis
Bacillus spp. MY2
Bacillus amyloliquefaciens KU801
E. coli E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 FRIK125
E. coli O157:H7 ATCC 43894
E. coli O157:H7 ATCC 43895
E. coli O157:H7 93-062		 E. coli KCCM 32396
E. coli ATCC 25922
E. coli (-) control
E. coli ATCC 10536
E. coli DH5a
Staphylococcus
spp.		 Staphylococcus aureus
KCCM 32395
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Staphylococcus aureus
KCCM 40510		 Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228
Staphylococcus chromogenes 19
Staphylococcus xylosus 29
Staphylococcus hylococcus 54
Staphylococcus simulans 78
Salmonella
spp.		 Salmonella enteritidis
KCCM 12021
Salmonella typhimurium
Salmonella gallinarum
ATCC 9184
Salmonella enteritidis
ATCC 13076
Salmonella enteritidis
ATCC 1370
Salmonella st. paul
Salmonella typhimurium
ATCC 14802
Salmonella gaminara 8324
Salmonella oranienbury 9329
Listeria spp. Listeria monocytogenes
ATCC 15313
Listeria monocytogenes Scott A
Listeria monocytogenes H7969
Listeria monocytogenes H7962
Listeria monocytogenes H7596
Listeria monocytogenes H7762
실시예 3. PCR 키트 준비 및 PCR 의 반응조건
멀티플렉스 PCR을 위한 키트는 주형 DNA 각 1 ㎕, 프라이머 각 1 ㎕ (10 pmoles/㎕), dNTP 400 μM, 10× 완충용액 5 ㎕, Taq DNA 폴리머라아제(5 u/㎕) 5 u을 각각 넣어주고, 멸균 증류수를 이용하여 최종 50 ㎕가 되게 하였다.
또한 본 발명의 신규한 프라이머의 민감도를 증가시키기 위하여 BSA를 첨가한 키트를 개발하였다. 본 발명의 PCR 키트의 조성은 주형 DNA 각 1 ㎕, 프라이머 각 1 ㎕ (10 pmoles/㎕), dNTP 400 μM, 10× 완충용액 5 ㎕, Taq DNA 폴리머라아제(5 u/㎕) 5 u 및 BSA 30 ㎍을 넣어주고, 멸균 증류수를 이용하여 최종 50 ㎕가 되게 하였다.
94℃에서 5분간 초기 변성(initial denaturation) 과정을 거친 뒤, 다음의 과정을 40회 반복하였다; 변성(denaturation)(95℃, 30초), 결합(annealing)(55℃, 30초), 연장(extention)(72℃, 30초). 마지막으로 최종-연장(final-extention)(72℃, 5분) 과정을 거친 뒤, 4℃에서 보관하였다. 이 반응 조건은 특이성 확인과 민감도 확인 PCR 실험에 동일하게 적용되었다. PCR 증폭산물 10 ㎕를 EtBr(ethidium bromide)를 포함하는 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 증폭 유무와 밴드의 크기를 관찰했다.
실시예 4. 프라이머의 특이성 및 민감도 확인
특이성 확인
본 발명의 프라이머의 특이성은 표 2에 나와있는 병원성 및 비 병원성 미생물 41종의 DNA를 활용하여 확인하였다. 키트의 주형 DNA는 boiling법으로 추출한 DNA를 사용하였고, 표 2의 병원성 미생물 및 비병원성 미생물에 대하여 각각 PCR 을 수행하였다.
그 결과 병원성을 나타내는 미생물에 대해서는 B. cereus(437 bp), E. coli O157:H7(519 bp), S. aureus(227 bp), Salmonella spp.(338 bp), L. monocytogenes(611 bp)의 특이 유전자 증폭 산물이 확인되었으며, 병원성을 나타내지 않는 기타 미생물에 대해서는 전혀 유전자 증폭 산물이 형성되지 않아, 본 발명의 프라이머를 사용하여 멀티플렉스 PCR을 활용할 경우 병원성 미생물인 B. cereus, E. coli O157:H7, S. aureus , Salmonella spp., L. monocytogenes와 기타 비 병원성 미생물을 신속히 구분하여 검출할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).
민감도 확인
본 발명의 프라이머의 민감도는 DNA 추출 키트법으로 추출한 주형 DNA를 사용하였고, 5종류의 병원성 미생물의 DNA 농도를 흡광도 측정법(260 nm)으로 측정한 다음, 1 ㎕ 당 10 ng이 되도록 DNA 농도를 조정하였다. 10 ng/㎕로 조정된 DNA는 단계 희석을 통해 10 ng/㎕ 부터 10 fg/㎕까지 총 7단계로 희석하여 PCR을 실시하였다.
민감도의 확인은 병원성 미생물 각 5종에서 추출된 각각의 DNA용액의 농도를 측정하여 10 ng/㎕ 부터 10 fg/㎕까지 단계 희석을 하여 각각 희석된 DNA를 1 ㎕씩 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과, BSA를 첨가한 경우 DNA용액의 농도가 1 pg/㎕ 수준까지 5종류의 유전자 증폭 산물이 확인되었다. 또한, 병원성 미생물 한 종류의 DNA를 확인하는데 멀티플 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR을 실시한 결과 BSA를 첨가한 방법이 종래 PCR 방법에서 유전자 증폭 산물을 얻을 수 있는 최소한의 DNA보다 더 적은 양의 DNA농도에서도 유전자 증폭 산물을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).
본 발명의 멀티플렉스 PCR 방법 및 이 PCR 방법에 사용되는 프라이머는 종래의 PCR 방법 및 프라이머에 비해 특이성 및 민감성이 우수할 뿐만 아니라 신속하고 정확하게 병원성 미생물을 검출해내는 뛰어난 특징이 있으므로, 의학 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> Multiplex PCR assay for detecting pathogen bacteria and PCR primer for PCR assay <130> YEIL001 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMp1 primer designed from L. monocytogenes <400> 1 tagttcgctg aatagtggcg a 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LMp2 primer designed from L. monocytogenes <400> 2 acatctttac tcactgtagc ctg 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ECp1 primer designed from E.coli O157:H7 <400> 3 ttgctttttc gtcttctgca c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ECp2 primer designed form E. coli O157:H7 <400> 4 aactaccgat gctgcattcg a 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCp3 primer designed from B. cereus <400> 5 tcattgattt gccgttgcgt at 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCp4 primer designed from B. cereus <400> 6 gtcacatcca ttgtaactgg agga 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSp3 primer designed from Salmonella spp. <400> 7 ttctcttggc gcccacaatg cgag 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SSp4 primer designed from Salmonella spp. <400> 8 tccatcagca aggtagcagt c 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAp1 primer designed from S. aureus <400> 9 catacagcac caggtcacgg ggaa 24 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAp2 primer designed from S. aureus <400> 10 gttctccagt cgtgtggata gc 22

Claims (3)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 L.monocytogenes 유래 actA 유전자 검출용 프라이머 쌍,
    서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 E.coli 0157:H7 유래 fliCh7 유전자 검출용 프라이머 쌍,
    서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 B. cereus 유래 HBL 유전자 검출용 프라이머 쌍,
    서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 Salmonella spp. 유래 invA 유전자 검출용 프라이머 쌍 및
    서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 S.aureus 유래 ileS 유전자 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진
    군을 모두 포함하는 것이 특징인 5종의 병원성 미생물 동시 검출용 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제 1항 기재의 멀티플렉스 PCR 프라이머 서열번호 1 및 2, 서열번호 3 및 4, 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 및 8, 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트, dNTP, 10X Tris-EDTA 완충용액, Taq DNA 폴리머라아제에 BSA(bovine serum albumin)를 더 포함하여 병원성 미생물 검출 민감도를 증대한 것이 특징인 5종의 병원성 미생물 동시 검출용 멀티플렉스 PCR 키트.
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