JP6398719B2 - 食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Description
このような従来の方法では、食中毒菌の培養とその検出に、多大な時間とコスト、手間がかかるという問題があった。
そこで、食中毒菌の培養及び検出における省力化や迅速化、消耗品廃棄の減少を目的とし、複数の食中毒菌を同一の培地で同時に培養する技術の研究開発が行われている。
また、特許文献2に記載の方法では、増殖させることが難しいリステリアを含む複数の食中毒菌を同時に培養可能にしたことが記載されている。
また、特許文献2において用いられている培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖させることができず、これを適切に検出できないという問題があった。
さらに、特許文献1及び2では、対象菌を103cfu/ml以上に増殖させることが目的であるため、迅速検査法などに応用するためには感度が足りず、汎用性に欠けるという問題があった。
また、本発明の食中毒菌の検出方法は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた食中毒菌からDNAを抽出し、食中毒菌のDNAの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをPCR用溶液に加えて、PCRにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する方法である。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有することを特徴とする。本実施形態の食中毒菌の培養培地によれば、このような構成によって、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させることができ、特に大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に適切に増殖させることが可能である。
(大腸菌)
大腸菌(Escherichia coli)は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌である。腸内細菌の一種であり、多くのものは無害であるが、一部に腹痛や下痢等を起こすものが存在しており、これらは病原性大腸菌と呼ばれている。O157などで有名な腸管出血性大腸菌(EHEC,enterohemorrhagic E.coli)の生育pH(至適pH)は4.4〜9.0(6.0〜7.6)、生育温度(至適温度)は、7.0〜46.0(35〜40)である。培養培地としては、一般にmEC培地が用いられる。
サルモネラ属菌(Salmonella sp.)は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌であり、腸内細菌の一種であるが、一部に感染型食中毒を起こすものが存在する。サルモネラ属菌の生育pH(至適pH)は3.8〜9.5(7.0〜7.5)、生育温度(至適温度)は、5.2〜46.2(35〜43)である。培養培地としては、一般に緩衝ペプトン水が用いられる。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)は、ブドウ球菌の一種であり、グラム陽性で通性嫌気性の球菌である。人体の皮膚や鼻腔、腸内に常在し、健常者に対しても病気を起こし得るが、菌が少なければ通常その毒性は弱い。食中毒を引き起こすほか、表皮感染症、肺炎、髄膜炎などの各種感染症の起因菌でもある。黄色ブドウ球菌の生育pH(至適pH)は4.2〜9.3(7.0〜7.5)、生育温度(至適温度)は、6.5〜46.0(30〜37)である。培養培地としては、一般に食塩添加トリプトソイブイヨン培地が用いられる。
腸炎ビブリオ(Vibrio parahaemolyticus)は、グラム陰性で好塩性の桿菌である。主として海水中に生息し、ヒトに感染すると、食中毒を発症させる。腸炎ビブリオの生育pH(至適pH)は5.5〜9.6(7.6〜8.0)、生育温度(至適温度)は、10.0〜43.0(35〜37)である。培養培地としては、一般にアルカリペプトン水が用いられる。
すなわち、これらの複数の食中毒菌を同一の培養培地で同時に培養すると、大腸菌とサルモネラ属菌が先に大量に増殖し、その結果として、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオの生育が抑制され、特に黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないという問題があった。また、腸炎ビブリオの生育には塩化ナトリウムが必須であるが、培養培地における塩化ナトリウム濃度はその他の菌の生育にも影響する。
このため、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、これら4菌種の増殖がバランス良く行えるように、その組成に工夫を凝らしたものとなっている。
(ペプトン)
ペプトンは、動物性または植物性の蛋白質をアミノ酸や、低分子量のペプチドまで加水分解したものである。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のBacto Tryptoneを使用した。
本実施形態では、培養培地のペプトン濃度を1w/v%(質量対容積百分率)以上にすることが好ましい。ペプトン濃度が1w/v%未満だと腸炎ビブリオを十分に増殖できないためである。一方、ペプトン濃度が5w/v%以上であっても、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを十分に増殖させることができる。このため、培養培地のペプトン濃度としては、例えば1w/v%〜5w/v%とすることが好ましい。
酵母エキスは、酵母を自己消化させ、又は酵素や熱水処理などにより酵母から抽出したエキスのことであり、アミノ酸や核酸、ミネラル、ビタミン類等が含まれる。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のBacto Yeast Extractを使用した。
本実施形態では、酵母エキスを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また0.6w/v%未満の濃度で含有させることが好ましい。酵母エキスには難溶性成分が含まれているため、培養培地の酵母エキス濃度が0.6w/v%より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が105cfu/ml以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の酵母エキス濃度を例えば0.0001w/v%〜0.6w/v%とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
硫酸マグネシウムは、硫酸とマグネシウムの塩であり、本実施形態では硫酸マグネシウム七水和物を用いている。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の硫酸マグネシウム七水和物を使用した。
本実施形態では、硫酸マグネシウムを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また0.1w/v%未満の濃度で含有させることが好ましい。硫酸マグネシウムは、培養培地に過剰に含有させると、食中毒菌の生育に悪影響を及ぼす。また、硫酸マグネシウムは、リン酸塩と反応して析出する。このため、培養培地の硫酸マグネシウム濃度が0.1w/v%より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が105cfu/ml以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の硫酸マグネシウム濃度を例えば0.0001w/v%〜0.1w/v%とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
塩化ナトリウム(NaCl)は、腸炎ビブリオの生育に必須である。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の塩化ナトリウムを使用した。
本実施形態では、培養培地の塩化ナトリウム濃度を、0.5w/v%〜3.0w/v%とすることが好ましい。0.5w/v%未満だと腸炎ビブリオが生育できず、3.0w/v%より大きいと大腸菌やサルモネラ属菌の生育に影響がでるためである。特に、塩化ナトリウム濃度を1.5w/v%〜3.0w/v%とすると、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオを良好に増殖できるため好ましく、塩化ナトリウム濃度を1.5w/v%〜2.0w/v%とすると、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの増殖のバランスが最も良くなるため、さらに好ましい。
本実施形態では、培養培地のその他の成分として、リン酸塩(0.35w/v%リン酸水素二ナトリウム+0.15w/v%リン酸二水素カリウム)を使用している。培養培地におけるリン酸塩の濃度は、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオが好適に生育できる範囲であれば良く、特に限定されない。また、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素カリウムの割合についても、これらの食中毒菌が好適に生育できる範囲であれば良い。
その他、本実施形態の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有してれば特に限定されず、その他の成分を含有していても良い。
本実施形態では、培養培地のpHを6.5〜7.5にすることが好ましい。培養培地のpHがこの範囲であれば、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖可能であるが、pHがこの範囲より小さい場合やより大きい場合には、黄色ブドウ球菌の増殖が不十分となるからである。
本実施形態の培養培地は、例えば、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを混合し、この混合物をpH7.0に調整して、121℃で15分間オートクレーブ滅菌することにより製造することができる。
本実施形態の培養培地は、例えば以下の方法で使用することができる。
検体試料中の大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを、これらの検出に必要な菌数にまで増殖させるための使用方法が挙げられる。検体としては、食品、臨床検体(糞便、嘔吐物)などが挙げられる。
例えば、食品を検体とする場合には、培地225mLに食品検体25gを加えて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを37℃で20時間培養し、各食中毒菌を選択的に検出する手法を用いることにより食中毒菌の有無を検査することができる。このとき、培養された各食中毒菌の菌数の計数及び定性判定などを行うことができる。
食中毒菌の計数は、食中毒菌毎の選択培地に培養液の段階希釈液を添加し、一定時間培養した後に、各菌の典型コロニー数を測定することなどによって行うことができる。また、定性判定は、培地や免疫学的な選択方法を用いて菌を選択することにより行うことができる。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の検出は、本実施形態の培養培地を用いて、以下のような方法で行うことができる。
すなわち、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた複数の食中毒菌からDNAを抽出し、複数の食中毒菌のDNAの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをPCR用溶液に加えて、PCRにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する。
(1)95℃ 2分
(2)95℃ 10秒(DNA鎖の乖離工程)
(3)68℃ 30秒(アニーリング工程)
(4)72℃ 30秒(DNA合成工程)
(5)72℃ 2分
(2)〜(4)を40サイクル
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオのそれぞれ想定される増幅産物の塩基配列長は、大腸菌が158bp、サルモネラ属菌が177bp、黄色ブドウ球菌が238bp、腸炎ビブリオが380bpである。ここで、PCRによる増幅産物を電気泳動する場合、電気泳動を行う装置に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
なお、電気泳動に代えて、DNAチップやDNAマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することもできる。これらは通常の方法により行うことが可能である。
したがって、本実施形態の食中毒菌の検出方法によれば、本実施形態の食中毒菌の培養培地を用いて同時に培養された複数の食中毒菌を、精度高く検出することが可能になっている。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した実施例の培養培地と、これらの一部のみを用いた比較例の培養培地により、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養して、20時間培養後の菌数を測定した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、pHを7.0に調製した。なお、残りの成分は滅菌水である(以下の試験においても同様)。そして、得られた培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン :0g又は10g
酵母エキス :0g又は5g
硫酸マグネシウム七水和物:0g又は0.5g
塩化ナトリウム :15g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
・大腸菌 Escherichia coli NCTC12923株
・サルモネラ属菌 Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Abony NCTC6017株
・黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus NCTC10788株
・腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus RIMD2210050株
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲された(以下の試験においても同様)。
・NCTC National Collection of Type Culture(イギリス)
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
したがって、培養培地にペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖させ得ることがわかる。
ペプトンを様々な濃度で混合して得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、pHを7.0に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン :0g,10g,20g,30g,40g,50g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0.5g
塩化ナトリウム :15g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
したがって、培養培地に、ペプトンを1w/v%以上含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に塩化ナトリウムを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、pHを7.0に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン :10g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0.5g
塩化ナトリウム :0,5g,10g,15g,20g,25g,30g,35g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、グルコースを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを、それぞれ以下の組成で混合し、pHを7.0に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン :30g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0.5g
塩化ナトリウム :15g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
グルコース :0g,5g,10g
したがって、本発明の実施形態に係る培養培地には、グルコースを含有させないことが好ましい。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地のpHを様々な値に調整し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、pHを6.0,6.5,7.0,7.5,8.0にそれぞれ調整して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン :30g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0.5g
塩化ナトリウム :15g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0
したがって、培養培地のpHを6.5〜7.5にすることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と、既存の食中毒菌の培養培地(特許文献2のNo.17の培地,TA10 Broth プリマハム株式会社製)を用いて、各々により大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
本発明の実施形態の食中毒菌の培養培地と既存の食中毒菌の培養培地の組成は以下の通りであり、それぞれ得られた培養培地を121℃で、15分間オートクレーブにより滅菌した。
(1Lあたり)
ペプトン :30g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0.5g
塩化ナトリウム :15g
リン酸水素二ナトリウム :3.5g
リン酸二水素カリウム :1.5g
pH7.0
(1Lあたり)
ペプトン :10g
酵母エキス :5g
硫酸マグネシウム七水和物:0g
塩化ナトリウム :5g
リン酸水素二ナトリウム :7g
リン酸二水素カリウム :15g
肉エキス :5g
ブドウ糖 :0.5g
塩類 :0.95g
pH6.3
このように、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養する場合、既存の食中毒菌の培養培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないが、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、これらの4菌種の全てを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、夾雑菌として枯草菌(Bacillus subtilis)1.2×107cfuを接種して、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。培養培地には、試験6で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
したがって、この培養培地によれば、夾雑菌が含まれている場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
一般に、培養培地に食品を添加すると、食品夾雑物や夾雑菌の影響によって、微生物の培養終了時の菌数は低下する。そこで、本発明の実施形態に係る培養培地が、食品を添加した場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に十分に増殖できるかを検証した。
培養培地には、試験6で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
そして、培養培地225gに対して、細断した食品を25g添加し、上記4種類の菌株を10〜50cfuずつ接種して、ストマッカーで60秒間混和した。これを37℃で20時間培養し、試験1と同様にして菌数を計測した。このときの培地組成の割合と培養後の菌数を図8に示す。
したがって、この培養培地に、生ハム、米飯、牛乳、サーモン、レタスのいずれかの食品が添加された場合でも大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
試験1の実施例1及び比較例1−3の4種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを37℃で同時に20時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、DNAを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のDNAの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスPCRにより同時に増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
EDTA,1.2%TritonX−100)を加えて、37℃で30分間溶菌処理を行った。さらに、DNeasy Blood&Tissue Kit(株式会社キアゲン製)を用いて、カラム精製を行うことにより、DNA抽出液を得た。このDNA抽出液をマルチプレックスPCRにおいて使用する試料とした。
・核酸合成基質(dNTP Mixture) (1.6μl)
・大腸菌用primerF(配列番号1) (0.2μl)
・大腸菌用primerR(配列番号2) (0.2μl)
・サルモネラ属菌用primerF(配列番号3) (0.2μl)
・サルモネラ属菌用primerR(配列番号4) (0.2μl)
・黄色ブドウ球菌用primerF(配列番号5) (0.2μl)
・黄色ブドウ球菌用primerR(配列番号6) (0.2μl)
・腸炎ビブリオ用primerF(配列番号7) (0.2μl)
・腸炎ビブリオ用primerR(配列番号8) (0.2μl)
・TaKaRa Ex Taq Hot Start Version (0.1μl)
・試料のDNA (1.0μl)
・滅菌水 (13.7μl)
(全量 20μl)
(1)95℃ 2分
(2)95℃ 10秒(DNA鎖の乖離工程)
(3)68℃ 10秒(アニーリング工程)
(4)72℃ 30秒(DNA合成工程)
(5)72℃ 2分
(2)〜(4)を40サイクル
同図において、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムが含まれる実施例1の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら4種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、図10(a)のグラフにおいて、推定塩基長177のピークが大腸菌、同187のピークがサルモネラ属菌、同232のピークが黄色ブドウ球菌、同337のピークが腸炎ビブリオを示している。
試験3の実施例7−12及び参考例1,2の8種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを37℃で同時に20時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、DNAを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のDNAの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスPCRにより増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。培養培地以外については、試験9と同様にして行った。その結果を図11及び図12に示す。
以上の通り、塩化ナトリウム濃度別に比較した場合、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの4菌種全てが特に良好に検出されるのは、塩化ナトリウム濃度が1.5〜3.0%である。
Claims (4)
- ペプトンを1.0w/v%以上3.0w/v%未満、酵母エキスを0.0001w/v%〜0.6w/v%、塩化ナトリウムを1.5w/v%〜3.0w/v%、及び硫酸マグネシウムを0.0001w/v%〜0.1w/v%含有し、
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの各々1cfu/mlを、20時間でそれぞれ105cfu/ml以上に同時増殖させ、
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの各々1cfu/mlを、20時間増殖させたときに、最も菌数が少ない菌の菌数に対する最も菌数が多い菌の菌数の比が、102cfu/ml未満になるように増殖させる
ことを特徴とする大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖させるための培養培地。 - 請求項1に記載の培養培地に、糖を含有させないことを特徴とする培養培地。
- さらにリン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを含有させ、pHを6.5〜7.5としたことを特徴とする請求項1又は2に記載の培養培地。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、
増殖させた前記複数の食中毒菌からDNAを抽出し、前記複数の食中毒菌のDNAの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをPCR用溶液に加えて、PCRにより前記増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する
ことを特徴とする食中毒菌の検出方法。
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