JPWO2014049938A1 - 食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 - Google Patents
食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2014049938A1 JPWO2014049938A1 JP2014538106A JP2014538106A JPWO2014049938A1 JP WO2014049938 A1 JPWO2014049938 A1 JP WO2014049938A1 JP 2014538106 A JP2014538106 A JP 2014538106A JP 2014538106 A JP2014538106 A JP 2014538106A JP WO2014049938 A1 JPWO2014049938 A1 JP WO2014049938A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture medium
- food poisoning
- bacteria
- poisoning bacteria
- salmonella
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同一の培養培地により同時に適切に増殖させることを可能とする。食中毒菌の培養培地を、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する構成とする。また、食中毒菌の検出方法を、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた複数の食中毒菌からＤＮＡを抽出し、複数の食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する方法とする。
Description
本発明は、食中毒菌を培養する技術に関し、特に複数の食中毒菌を同一の培養培地で同時に培養する技術に関する。
近年、毎年千件を超える食中毒事件が発生している。食中毒事件が起きた場合、原因となる食中毒菌を特定するために、対象菌の増殖を行い、その種類を判定する作業が行われている。対象菌の増殖にあたっては、保健所の技士の経験をもとに、原因と推定される対象菌を、全て単独培養することが行われている。この単独培養では、対象菌ごとに複数の培地や培養条件などを考慮する必要がある。
このような従来の方法では、食中毒菌の培養とその検出に、多大な時間とコスト、手間がかかるという問題があった。
そこで、食中毒菌の培養及び検出における省力化や迅速化、消耗品廃棄の減少を目的とし、複数の食中毒菌を同一の培地で同時に培養する技術の研究開発が行われている。
このような従来の方法では、食中毒菌の培養とその検出に、多大な時間とコスト、手間がかかるという問題があった。
そこで、食中毒菌の培養及び検出における省力化や迅速化、消耗品廃棄の減少を目的とし、複数の食中毒菌を同一の培地で同時に培養する技術の研究開発が行われている。
例えば、特許文献１に記載の方法によれば、黄色ブドウ球菌、サルモネラ、大腸菌、ビブリオ、セレウス、及びリステリアの６種類の食中毒菌を同時に培養可能とされている。
また、特許文献２に記載の方法では、増殖させることが難しいリステリアを含む複数の食中毒菌を同時に培養可能にしたことが記載されている。
また、特許文献２に記載の方法では、増殖させることが難しいリステリアを含む複数の食中毒菌を同時に培養可能にしたことが記載されている。
しかしながら、特許文献１において用いられている培地では、対象菌を安定的に培養することが難しいという問題があった。特に、倍加速度が早い対象菌や夾雑菌などの非対象菌が含まれている場合には、その影響によって対象菌の一部の倍加速度が遅くなり、適切に増殖できなくなるという問題があった。
また、特許文献２において用いられている培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖させることができず、これを適切に検出できないという問題があった。
さらに、特許文献１及び２では、対象菌を１０３ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖させることが目的であるため、迅速検査法などに応用するためには感度が足りず、汎用性に欠けるという問題があった。
また、特許文献２において用いられている培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖させることができず、これを適切に検出できないという問題があった。
さらに、特許文献１及び２では、対象菌を１０３ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖させることが目的であるため、迅速検査法などに応用するためには感度が足りず、汎用性に欠けるという問題があった。
そこで、本発明者らは、鋭意研究し、食品検査、疫学的環境検査、環境検査並びに臨床試験、家畜衛生において重要である４種類の食中毒細菌、すなわち大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖させることができる培養培地を開発することに成功した。
ここで、一般的な迅速検査法（イムノクロマト法、ＥＬＩＳＡ法など）の検出下限は１０５ｃｆｕ／ｍｌであるため、これらの検査法の培地として利用する場合を考慮すれば、実用的な培養時間内に対象菌を１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖させることが望ましい。また、食中毒菌は生化学試験において毒素産生の評価をする必要があるところ、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの過去の食中毒発生事例では、対象菌が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上存在する場合に毒素を産生し、食中毒を発症させている。このため、このような観点からも、対象菌を１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖させることが望ましい。
さらに、複数の食中毒菌を同時に検査するにあたっては、異なる種類の食中毒菌間の菌数の差が重要である。すなわち、マルチプレックスＰＣＲなどを用いた迅速検査法では、菌数の差が１０３ｃｆｕ／ｍｌ以上に大きくなると、複数の食中毒菌を同時に増幅する場合、相対的に少ない菌が適切に増幅できず、検出が困難になる。このため、菌数の差が１０３ｃｆｕ／ｍｌ未満になるように増殖させることが望ましい。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に適切に増殖させることが可能な食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法の提供を目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の食中毒菌の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する構成としてある。
また、本発明の食中毒菌の検出方法は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた食中毒菌からＤＮＡを抽出し、食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する方法である。
また、本発明の食中毒菌の検出方法は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた食中毒菌からＤＮＡを抽出し、食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する方法である。
本発明によれば、黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同一の培養培地により同時に適切に増殖させることが可能となる。
以下、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法について、詳細に説明する。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有することを特徴とする。本実施形態の食中毒菌の培養培地によれば、このような構成によって、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させることができ、特に大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に適切に増殖させることが可能である。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有することを特徴とする。本実施形態の食中毒菌の培養培地によれば、このような構成によって、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させることができ、特に大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に適切に増殖させることが可能である。
［検出対象菌］
（大腸菌）
大腸菌（Escherichia coli）は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌である。腸内細菌の一種であり、多くのものは無害であるが、一部に腹痛や下痢等を起こすものが存在しており、これらは病原性大腸菌と呼ばれている。O157などで有名な腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ，enterohemorrhagic E.coli）の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は４．４〜９．０（６．０〜７．６）、生育温度（至適温度）は、７．０〜４６．０（３５〜４０）である。培養培地としては、一般にｍＥＣ培地が用いられる。
（大腸菌）
大腸菌（Escherichia coli）は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌である。腸内細菌の一種であり、多くのものは無害であるが、一部に腹痛や下痢等を起こすものが存在しており、これらは病原性大腸菌と呼ばれている。O157などで有名な腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ，enterohemorrhagic E.coli）の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は４．４〜９．０（６．０〜７．６）、生育温度（至適温度）は、７．０〜４６．０（３５〜４０）である。培養培地としては、一般にｍＥＣ培地が用いられる。
（サルモネラ属菌）
サルモネラ属菌（Salmonella sp.）は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌であり、腸内細菌の一種であるが、一部に感染型食中毒を起こすものが存在する。サルモネラ属菌の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は３．８〜９．５（７．０〜７．５）、生育温度（至適温度）は、５．２〜４６．２（３５〜４３）である。培養培地としては、一般に緩衝ペプトン水が用いられる。
サルモネラ属菌（Salmonella sp.）は、グラム陰性で通性嫌気性の桿菌であり、腸内細菌の一種であるが、一部に感染型食中毒を起こすものが存在する。サルモネラ属菌の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は３．８〜９．５（７．０〜７．５）、生育温度（至適温度）は、５．２〜４６．２（３５〜４３）である。培養培地としては、一般に緩衝ペプトン水が用いられる。
（黄色ブドウ球菌）
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、ブドウ球菌の一種であり、グラム陽性で通性嫌気性の球菌である。人体の皮膚や鼻腔、腸内に常在し、健常者に対しても病気を起こし得るが、菌が少なければ通常その毒性は弱い。食中毒を引き起こすほか、表皮感染症、肺炎、髄膜炎などの各種感染症の起因菌でもある。黄色ブドウ球菌の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は４．２〜９．３（７．０〜７．５）、生育温度（至適温度）は、６．５〜４６．０（３０〜３７）である。培養培地としては、一般に食塩添加トリプトソイブイヨン培地が用いられる。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、ブドウ球菌の一種であり、グラム陽性で通性嫌気性の球菌である。人体の皮膚や鼻腔、腸内に常在し、健常者に対しても病気を起こし得るが、菌が少なければ通常その毒性は弱い。食中毒を引き起こすほか、表皮感染症、肺炎、髄膜炎などの各種感染症の起因菌でもある。黄色ブドウ球菌の生育ｐＨ（至適ｐＨ）は４．２〜９．３（７．０〜７．５）、生育温度（至適温度）は、６．５〜４６．０（３０〜３７）である。培養培地としては、一般に食塩添加トリプトソイブイヨン培地が用いられる。
（腸炎ビブリオ）
腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）は、グラム陰性で好塩性の桿菌である。主として海水中に生息し、ヒトに感染すると、食中毒を発症させる。腸炎ビブリオの生育ｐＨ（至適ｐＨ）は５．５〜９．６（７．６〜８．０）、生育温度（至適温度）は、１０．０〜４３．０（３５〜３７）である。培養培地としては、一般にアルカリペプトン水が用いられる。
腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）は、グラム陰性で好塩性の桿菌である。主として海水中に生息し、ヒトに感染すると、食中毒を発症させる。腸炎ビブリオの生育ｐＨ（至適ｐＨ）は５．５〜９．６（７．６〜８．０）、生育温度（至適温度）は、１０．０〜４３．０（３５〜３７）である。培養培地としては、一般にアルカリペプトン水が用いられる。
これらの食中毒菌のうち、黄色ブドウ球菌のみがグラム陽性であるが、グラム陽性菌は、グラム陰性菌に比較して増殖速度が遅いため、これらを同一の培養培地で同時に培養することは、従来は非常に難しかった。
すなわち、これらの複数の食中毒菌を同一の培養培地で同時に培養すると、大腸菌とサルモネラ属菌が先に大量に増殖し、その結果として、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオの生育が抑制され、特に黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないという問題があった。また、腸炎ビブリオの生育には塩化ナトリウムが必須であるが、培養培地における塩化ナトリウム濃度はその他の菌の生育にも影響する。
このため、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、これら４菌種の増殖がバランス良く行えるように、その組成に工夫を凝らしたものとなっている。
すなわち、これらの複数の食中毒菌を同一の培養培地で同時に培養すると、大腸菌とサルモネラ属菌が先に大量に増殖し、その結果として、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオの生育が抑制され、特に黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないという問題があった。また、腸炎ビブリオの生育には塩化ナトリウムが必須であるが、培養培地における塩化ナトリウム濃度はその他の菌の生育にも影響する。
このため、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地は、これら４菌種の増殖がバランス良く行えるように、その組成に工夫を凝らしたものとなっている。
［培養培地の組成］
（ペプトン）
ペプトンは、動物性または植物性の蛋白質をアミノ酸や、低分子量のペプチドまで加水分解したものである。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを使用した。
本実施形態では、培養培地のペプトン濃度を１ｗ／ｖ％（質量対容積百分率）以上にすることが好ましい。ペプトン濃度が１ｗ／ｖ％未満だと腸炎ビブリオを十分に増殖できないためである。一方、ペプトン濃度が５ｗ／ｖ％以上であっても、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを十分に増殖させることができる。このため、培養培地のペプトン濃度としては、例えば１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％とすることが好ましい。
（ペプトン）
ペプトンは、動物性または植物性の蛋白質をアミノ酸や、低分子量のペプチドまで加水分解したものである。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のＢａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎｅを使用した。
本実施形態では、培養培地のペプトン濃度を１ｗ／ｖ％（質量対容積百分率）以上にすることが好ましい。ペプトン濃度が１ｗ／ｖ％未満だと腸炎ビブリオを十分に増殖できないためである。一方、ペプトン濃度が５ｗ／ｖ％以上であっても、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを十分に増殖させることができる。このため、培養培地のペプトン濃度としては、例えば１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％とすることが好ましい。
（酵母エキス）
酵母エキスは、酵母を自己消化させ、又は酵素や熱水処理などにより酵母から抽出したエキスのことであり、アミノ酸や核酸、ミネラル、ビタミン類等が含まれる。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを使用した。
本実施形態では、酵母エキスを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また０．６ｗ／ｖ％未満の濃度で含有させることが好ましい。酵母エキスには難溶性成分が含まれているため、培養培地の酵母エキス濃度が０．６ｗ／ｖ％より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の酵母エキス濃度を例えば０．０００１ｗ／ｖ％〜０．６ｗ／ｖ％とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
酵母エキスは、酵母を自己消化させ、又は酵素や熱水処理などにより酵母から抽出したエキスのことであり、アミノ酸や核酸、ミネラル、ビタミン類等が含まれる。以下の実施例では、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製のＢａｃｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔを使用した。
本実施形態では、酵母エキスを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また０．６ｗ／ｖ％未満の濃度で含有させることが好ましい。酵母エキスには難溶性成分が含まれているため、培養培地の酵母エキス濃度が０．６ｗ／ｖ％より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の酵母エキス濃度を例えば０．０００１ｗ／ｖ％〜０．６ｗ／ｖ％とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
（硫酸マグネシウム）
硫酸マグネシウムは、硫酸とマグネシウムの塩であり、本実施形態では硫酸マグネシウム七水和物を用いている。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の硫酸マグネシウム七水和物を使用した。
本実施形態では、硫酸マグネシウムを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また０．１ｗ／ｖ％未満の濃度で含有させることが好ましい。硫酸マグネシウムは、培養培地に過剰に含有させると、食中毒菌の生育に悪影響を及ぼす。また、硫酸マグネシウムは、リン酸塩と反応して析出する。このため、培養培地の硫酸マグネシウム濃度が０．１ｗ／ｖ％より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の硫酸マグネシウム濃度を例えば０．０００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
硫酸マグネシウムは、硫酸とマグネシウムの塩であり、本実施形態では硫酸マグネシウム七水和物を用いている。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の硫酸マグネシウム七水和物を使用した。
本実施形態では、硫酸マグネシウムを培養培地にわずかでも含有させることが好ましく、また０．１ｗ／ｖ％未満の濃度で含有させることが好ましい。硫酸マグネシウムは、培養培地に過剰に含有させると、食中毒菌の生育に悪影響を及ぼす。また、硫酸マグネシウムは、リン酸塩と反応して析出する。このため、培養培地の硫酸マグネシウム濃度が０．１ｗ／ｖ％より大きいと、オートクレーブ後に析出し、対象菌が１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に増殖しないか、又は増殖が不安定になるためである。したがって、培養培地の硫酸マグネシウム濃度を例えば０．０００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％とすることで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを好適に同一の培養培地で同時に増殖させることが可能となる。
（塩化ナトリウム）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、腸炎ビブリオの生育に必須である。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の塩化ナトリウムを使用した。
本実施形態では、培養培地の塩化ナトリウム濃度を、０．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％とすることが好ましい。０．５ｗ／ｖ％未満だと腸炎ビブリオが生育できず、３．０ｗ／ｖ％より大きいと大腸菌やサルモネラ属菌の生育に影響がでるためである。特に、塩化ナトリウム濃度を１．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％とすると、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオを良好に増殖できるため好ましく、塩化ナトリウム濃度を１．５ｗ／ｖ％〜２．０ｗ／ｖ％とすると、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの増殖のバランスが最も良くなるため、さらに好ましい。
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、腸炎ビブリオの生育に必須である。以下の実施例では、和光純薬工業株式会社製の塩化ナトリウムを使用した。
本実施形態では、培養培地の塩化ナトリウム濃度を、０．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％とすることが好ましい。０．５ｗ／ｖ％未満だと腸炎ビブリオが生育できず、３．０ｗ／ｖ％より大きいと大腸菌やサルモネラ属菌の生育に影響がでるためである。特に、塩化ナトリウム濃度を１．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％とすると、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオを良好に増殖できるため好ましく、塩化ナトリウム濃度を１．５ｗ／ｖ％〜２．０ｗ／ｖ％とすると、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの増殖のバランスが最も良くなるため、さらに好ましい。
（その他の成分）
本実施形態では、培養培地のその他の成分として、リン酸塩（０．３５ｗ／ｖ％リン酸水素二ナトリウム＋０．１５ｗ／ｖ％リン酸二水素カリウム）を使用している。培養培地におけるリン酸塩の濃度は、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオが好適に生育できる範囲であれば良く、特に限定されない。また、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素カリウムの割合についても、これらの食中毒菌が好適に生育できる範囲であれば良い。
その他、本実施形態の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有してれば特に限定されず、その他の成分を含有していても良い。
本実施形態では、培養培地のその他の成分として、リン酸塩（０．３５ｗ／ｖ％リン酸水素二ナトリウム＋０．１５ｗ／ｖ％リン酸二水素カリウム）を使用している。培養培地におけるリン酸塩の濃度は、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオが好適に生育できる範囲であれば良く、特に限定されない。また、リン酸水素二ナトリウム及びリン酸二水素カリウムの割合についても、これらの食中毒菌が好適に生育できる範囲であれば良い。
その他、本実施形態の培養培地は、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有してれば特に限定されず、その他の成分を含有していても良い。
［培養培地のｐＨ］
本実施形態では、培養培地のｐＨを６．５〜７．５にすることが好ましい。培養培地のｐＨがこの範囲であれば、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖可能であるが、ｐＨがこの範囲より小さい場合やより大きい場合には、黄色ブドウ球菌の増殖が不十分となるからである。
本実施形態では、培養培地のｐＨを６．５〜７．５にすることが好ましい。培養培地のｐＨがこの範囲であれば、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖可能であるが、ｐＨがこの範囲より小さい場合やより大きい場合には、黄色ブドウ球菌の増殖が不十分となるからである。
［培養培地の製造方法］
本実施形態の培養培地は、例えば、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを混合し、この混合物をｐＨ７．０に調整して、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌することにより製造することができる。
本実施形態の培養培地は、例えば、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを混合し、この混合物をｐＨ７．０に調整して、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌することにより製造することができる。
［培養培地の使用方法］
本実施形態の培養培地は、例えば以下の方法で使用することができる。
検体試料中の大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを、これらの検出に必要な菌数にまで増殖させるための使用方法が挙げられる。検体としては、食品、臨床検体（糞便、嘔吐物）などが挙げられる。
例えば、食品を検体とする場合には、培地２２５ｍＬに食品検体２５ｇを加えて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で２０時間培養し、各食中毒菌を選択的に検出する手法を用いることにより食中毒菌の有無を検査することができる。このとき、培養された各食中毒菌の菌数の計数及び定性判定などを行うことができる。
食中毒菌の計数は、食中毒菌毎の選択培地に培養液の段階希釈液を添加し、一定時間培養した後に、各菌の典型コロニー数を測定することなどによって行うことができる。また、定性判定は、培地や免疫学的な選択方法を用いて菌を選択することにより行うことができる。
本実施形態の培養培地は、例えば以下の方法で使用することができる。
検体試料中の大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを、これらの検出に必要な菌数にまで増殖させるための使用方法が挙げられる。検体としては、食品、臨床検体（糞便、嘔吐物）などが挙げられる。
例えば、食品を検体とする場合には、培地２２５ｍＬに食品検体２５ｇを加えて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で２０時間培養し、各食中毒菌を選択的に検出する手法を用いることにより食中毒菌の有無を検査することができる。このとき、培養された各食中毒菌の菌数の計数及び定性判定などを行うことができる。
食中毒菌の計数は、食中毒菌毎の選択培地に培養液の段階希釈液を添加し、一定時間培養した後に、各菌の典型コロニー数を測定することなどによって行うことができる。また、定性判定は、培地や免疫学的な選択方法を用いて菌を選択することにより行うことができる。
［食中毒菌の検出方法］
本発明の実施形態に係る食中毒菌の検出は、本実施形態の培養培地を用いて、以下のような方法で行うことができる。
すなわち、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた複数の食中毒菌からＤＮＡを抽出し、複数の食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の検出は、本実施形態の培養培地を用いて、以下のような方法で行うことができる。
すなわち、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、増殖させた複数の食中毒菌からＤＮＡを抽出し、複数の食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する。
具体的には、食中毒菌の培養を行った培養培地（培養液）を回収して、遠心分離を行う。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、グラム陽性の溶菌に望ましいリゾチーム溶液を加えて、溶菌処理を行う。次いで、タンパク質分解とカラム精製を行うことによりＤＮＡ抽出液を得て、このＤＮＡ抽出液をマルチプレックスＰＣＲによる増幅のための試料とする。
次いで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオのＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅することができるプライマーセットを含有するＰＣＲ用反応液を作製する。ＰＣＲ用反応液としては、緩衝液、核酸合成基質（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、プライマーセット（フォワードプライマー，リバースプライマー）、核酸合成酵素、食中毒菌のＤＮＡ、及び水からなるものを用いることができる。このとき、プライマーセットとしては、図９に示すように、大腸菌用として配列番号１及び２、サルモネラ属菌用として配列番号３及び４、黄色ブドウ球菌用として配列番号５及び６、腸炎ビブリオ用として配列番号７及び８に対応する塩基配列からなるものを好適に用いることができる。
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、サーマルサイクラーなどのＰＣＲ装置を用いて行うことができ、例えば次の条件で行うことができる。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
次に、マイクロキャピラリーなどを用いた電気泳動により、ＰＣＲによる増幅産物を泳動させ、正しい増幅産物が得られているか否かを確認する。
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオのそれぞれ想定される増幅産物の塩基配列長は、大腸菌が１５８ｂｐ、サルモネラ属菌が１７７ｂｐ、黄色ブドウ球菌が２３８ｂｐ、腸炎ビブリオが３８０ｂｐである。ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動する場合、電気泳動を行う装置に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
なお、電気泳動に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することもできる。これらは通常の方法により行うことが可能である。
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオのそれぞれ想定される増幅産物の塩基配列長は、大腸菌が１５８ｂｐ、サルモネラ属菌が１７７ｂｐ、黄色ブドウ球菌が２３８ｂｐ、腸炎ビブリオが３８０ｂｐである。ここで、ＰＣＲによる増幅産物を電気泳動する場合、電気泳動を行う装置に用いる試薬などの影響から、理論上の増幅産物の塩基配列と完全には一致せず、近似する値の結果が得られる。
なお、電気泳動に代えて、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイなどを用いて、正しい増幅産物が得られているか否かを確認することもできる。これらは通常の方法により行うことが可能である。
本実施形態の食中毒菌の培養培地によれば、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培地で同時に培養することができ、これにより比較的短い時間で、これら４種類の全ての菌を、検出に十分な菌数に増殖させることができる。具体的には、各々１ｃｆｕ／ｍｌの食中毒菌を２０時間後に、それぞれ１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に生育させることができる。また、対象菌の菌数が最も多い菌と最も少ない菌の菌数の差が、１０３ｃｆｕ／ｍｌ未満になるように生育させることができる。
したがって、本実施形態の食中毒菌の検出方法によれば、本実施形態の食中毒菌の培養培地を用いて同時に培養された複数の食中毒菌を、精度高く検出することが可能になっている。
したがって、本実施形態の食中毒菌の検出方法によれば、本実施形態の食中毒菌の培養培地を用いて同時に培養された複数の食中毒菌を、精度高く検出することが可能になっている。
＜試験１：ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地の検証＞
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した実施例の培養培地と、これらの一部のみを用いた比較例の培養培地により、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養して、２０時間培養後の菌数を測定した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製した。なお、残りの成分は滅菌水である（以下の試験においても同様）。そして、得られた培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した実施例の培養培地と、これらの一部のみを用いた比較例の培養培地により、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養して、２０時間培養後の菌数を測定した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製した。なお、残りの成分は滅菌水である（以下の試験においても同様）。そして、得られた培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
（１Lあたり）
ペプトン ：０ｇ又は１０ｇ
酵母エキス ：０ｇ又は５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０ｇ又は０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ペプトン ：０ｇ又は１０ｇ
酵母エキス ：０ｇ又は５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０ｇ又は０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
また、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオは、それぞれ以下の菌株を使用した。
・大腸菌 Escherichia coli NCTC12923株
・サルモネラ属菌 Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Abony NCTC6017株
・黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus NCTC10788株
・腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus RIMD2210050株
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲された（以下の試験においても同様）。
・NCTC National Collection of Type Culture（イギリス）
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
・大腸菌 Escherichia coli NCTC12923株
・サルモネラ属菌 Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Abony NCTC6017株
・黄色ブドウ球菌 Staphylococcus aureus NCTC10788株
・腸炎ビブリオ Vibrio parahaemolyticus RIMD2210050株
これらの食中毒菌の菌株は、次の機関から分譲された（以下の試験においても同様）。
・NCTC National Collection of Type Culture（イギリス）
・RIMD 大阪大学微生物病研究所
実施例及び比較例の各培養培地２５０ｍＬに、上記４菌株をそれぞれ１０〜５０ｃｆｕずつ接種した。３７℃で２０時間培養し、それぞれの菌数を計数した。計数を行うための選択培地として、大腸菌はコンパクトドライＥＣ（日水製薬株式会社製）、サルモネラ属菌はＤＨＬ寒天培地（極東製薬工業株式会社製）、黄色ブドウ球菌はマンニットソルト卵黄寒天培地（極東製薬工業株式会社製）、腸炎ビブリオはＴＣＢＳ寒天培地（極東製薬工業株式会社製）をそれぞれ使用した。そして、各選択培地に培養液の段階希釈液を添加し、３５℃で２０〜２４時間（黄色ブドウ球菌は４８時間）培養後に各菌の典型コロニー数を測定した。培地組成の割合と培養後の菌数を図１に示す。
同図に示すように、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する実施例１の培養培地では、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオが、いずれも１０６以上の菌数に増殖している。一方、酵母エキス又は硫酸マグネシウムの少なくともいずれかを欠いた比較例１−３では、黄色ブドウ球菌の菌数が１０５未満となっており、検出可能な程度に増殖していない。また、ペプトンを欠いた比較例４では、腸炎ビブリオの菌数が１０５未満であり、同様に十分に増殖していない。
したがって、培養培地にペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖させ得ることがわかる。
したがって、培養培地にペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖させ得ることがわかる。
＜試験２：培養培地の最適なペプトン濃度の検証＞
ペプトンを様々な濃度で混合して得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトンを様々な濃度で混合して得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
（１Lあたり）
ペプトン ：０ｇ，１０ｇ，２０ｇ，３０ｇ，４０ｇ，５０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ペプトン ：０ｇ，１０ｇ，２０ｇ，３０ｇ，４０ｇ，５０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用して、これらの食中毒菌を同時に培養し、試験１と同様に菌数を計測した。培地組成の割合と培養後の菌数を図２に示す。
同図に示すように、培養培地のペプトン濃度が０％の場合、腸炎ビブリオの菌数が１０５未満であり、十分に増殖していない。一方、培養培地のペプトン濃度が１ｗ／ｖ％以上の場合、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖していることがわかる。
したがって、培養培地に、ペプトンを１ｗ／ｖ％以上含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
したがって、培養培地に、ペプトンを１ｗ／ｖ％以上含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
＜試験３：培養培地の最適な塩化ナトリウム濃度の検証＞
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に塩化ナトリウムを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に塩化ナトリウムを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
（１Lあたり）
ペプトン ：１０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：０，５ｇ，１０ｇ，１５ｇ，２０ｇ，２５ｇ，３０ｇ，３５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ペプトン ：１０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：０，５ｇ，１０ｇ，１５ｇ，２０ｇ，２５ｇ，３０ｇ，３５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用して、これらの食中毒菌を同時に培養し、試験１と同様に菌数を計測した。培地組成の割合と培養後の菌数を図３に示す。
同図に示すように、培養培地の塩化ナトリウム濃度が０ｗ／ｖ％の場合、腸炎ビブリオの菌数が１０２未満であり、生育が極端に悪い。一方、培養培地の塩化ナトリウム濃度が０．５〜３．０ｗ／ｖ％の場合は、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖している。そして、培養培地の塩化ナトリウム濃度が３．５ｗ／ｖ％の場合、サルモネラ属菌の菌数が１０4未満であり、十分に増殖していない。
したがって、培養培地に、塩化ナトリウムを０．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％含有させることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。特に、塩化ナトリウム濃度が１．５ｗ／ｖ％〜２．５ｗ／ｖ％の範囲では、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオが良好に増殖している。また、塩化ナトリウム濃度が１．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％の範囲では、いずれの菌も１０６以上の菌数に増殖しており、これらの４菌種を特にバランス良く増殖させることができている。
＜試験４：培養培地の最適な糖濃度の検証＞
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、グルコースを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、グルコースを様々な濃度で混合し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、及びグルコースを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを７．０に調製して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
（１Lあたり）
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
グルコース ：０ｇ，５ｇ，１０ｇ
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
グルコース ：０ｇ，５ｇ，１０ｇ
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用して、これらの食中毒菌を同時に培養し、試験１と同様に菌数を計測した。培地組成の割合と培養後の菌数を図４に示す。
同図に示すように、培養培地のグルコース濃度が０ｗ／ｖ％の場合は、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖している。これに対して、培養培地のグルコース濃度が０．５ｗ／ｖ％、１．０ｗ／ｖ％の場合、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオは、十分に増殖していない。これは、培養培地におけるグルコースの濃度が高いと、倍加時間が早くなり、先に増殖する大腸菌とサルモネラ属菌が急速に増加して代謝や発酵が行われ、有機酸などが生産され、その影響によって黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオの増殖が、阻害されたためと考えられる。
すなわち、グルコースは、一般的に増殖促進のために培養培地に含有されるが、黄色ブドウ球菌と腸炎ビブリオを、大腸菌とサルモネラ属菌と同一の培養培地で同時に培養する場合には、グルコースはむしろ増殖を阻害する要素となることが明らかとなった。
したがって、本発明の実施形態に係る培養培地には、グルコースを含有させないことが好ましい。
したがって、本発明の実施形態に係る培養培地には、グルコースを含有させないことが好ましい。
＜試験５：培養培地の最適なｐＨの検証＞
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地のｐＨを様々な値に調整し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを６．０，６．５，７．０，７．５，８．０にそれぞれ調整して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地のｐＨを様々な値に調整し、得られた培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
具体的には、ペプトン、酵母エキス、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムを、それぞれ以下の組成で混合し、ｐＨを６．０，６．５，７．０，７．５，８．０にそれぞれ調整して、培養培地を得た。そして、得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
（１Lあたり）
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用して、これらの食中毒菌を同時に培養し、試験１と同様に菌数を計測した。培地組成の割合と培養後の菌数を図５に示す。
同図に示すように、培養培地のｐＨが６．０の場合は、黄色ブドウ球菌の菌数が１０５未満であり、十分に増殖していない。一方、培養培地のｐＨが６．５〜７．５の場合は、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖している。そして、培養培地のｐＨが８．０の場合、黄色ブドウ球菌の菌数が１０５未満であり、十分に増殖していない。
したがって、培養培地のｐＨを６．５〜７．５にすることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
したがって、培養培地のｐＨを６．５〜７．５にすることにより、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
＜試験６：本発明の実施形態に係る培養培地と既存培地による培養終了時の菌数の検証＞
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と、既存の食中毒菌の培養培地（特許文献２のＮｏ．１７の培地，ＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈ プリマハム株式会社製）を用いて、各々により大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
本発明の実施形態の食中毒菌の培養培地と既存の食中毒菌の培養培地の組成は以下の通りであり、それぞれ得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と、既存の食中毒菌の培養培地（特許文献２のＮｏ．１７の培地，ＴＡ１０ Ｂｒｏｔｈ プリマハム株式会社製）を用いて、各々により大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。
本発明の実施形態の食中毒菌の培養培地と既存の食中毒菌の培養培地の組成は以下の通りであり、それぞれ得られた培養培地を１２１℃で、１５分間オートクレーブにより滅菌した。
〔本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地〕
（１Lあたり）
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ｐＨ７．０
（１Lあたり）
ペプトン ：３０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０．５ｇ
塩化ナトリウム ：１５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：３．５ｇ
リン酸二水素カリウム ：１．５ｇ
ｐＨ７．０
〔既存の食中毒菌の培養培地〕
（１Lあたり）
ペプトン ：１０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０ｇ
塩化ナトリウム ：５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：７ｇ
リン酸二水素カリウム ：１５ｇ
肉エキス ：５ｇ
ブドウ糖 ：０．５ｇ
塩類 ：０．９５ｇ
ｐＨ６．３
（１Lあたり）
ペプトン ：１０ｇ
酵母エキス ：５ｇ
硫酸マグネシウム七水和物：０ｇ
塩化ナトリウム ：５ｇ
リン酸水素二ナトリウム ：７ｇ
リン酸二水素カリウム ：１５ｇ
肉エキス ：５ｇ
ブドウ糖 ：０．５ｇ
塩類 ：０．９５ｇ
ｐＨ６．３
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用して、これらの食中毒菌を同時に培養し、試験１と同様に菌数を計測した。これらの培地組成の割合と培養後の菌数を図６に示す。
同図に示すように、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地では、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖している。これに対して、既存の食中毒菌の培養培地では、黄色ブドウ球菌の生育が極端に悪くなっている。
このように、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養する場合、既存の食中毒菌の培養培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないが、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、これらの４菌種の全てを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
このように、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養する場合、既存の食中毒菌の培養培地では、黄色ブドウ球菌を十分に増殖できないが、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、これらの４菌種の全てを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
＜試験７：夾雑菌を混入した場合の培養培地の検証＞
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、夾雑菌として枯草菌（Bacillus subtilis）１．２×１０７ｃｆｕを接種して、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。培養培地には、試験６で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した培養培地に、夾雑菌として枯草菌（Bacillus subtilis）１．２×１０７ｃｆｕを接種して、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合に、好適に増殖できるかを検証した。培養培地には、試験６で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用した。そして、これら４種類の食中毒菌を培養培地に１０〜５０ｃｆｕずつ接種すると共に枯草菌を接種し、当該夾雑菌の存在下で４種類の食中毒菌を同時に培養して、試験１と同様に菌数を計測した。培地組成の割合と培養後の菌数を図７に示す。
同図に示すように、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、いずれの菌も１０５以上の菌数に増殖している。
したがって、この培養培地によれば、夾雑菌が含まれている場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
したがって、この培養培地によれば、夾雑菌が含まれている場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
＜試験８：食品を添加した場合の培養培地の検証＞
一般に、培養培地に食品を添加すると、食品夾雑物や夾雑菌の影響によって、微生物の培養終了時の菌数は低下する。そこで、本発明の実施形態に係る培養培地が、食品を添加した場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に十分に増殖できるかを検証した。
培養培地には、試験６で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
一般に、培養培地に食品を添加すると、食品夾雑物や夾雑菌の影響によって、微生物の培養終了時の菌数は低下する。そこで、本発明の実施形態に係る培養培地が、食品を添加した場合でも、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に十分に増殖できるかを検証した。
培養培地には、試験６で用いた本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地と同様のものを使用した。
大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの菌株には、試験１と同じものを使用した。食品としては、生ハム、米飯、及び牛乳、サーモン、レタスを個別に使用した。
そして、培養培地２２５ｇに対して、細断した食品を２５ｇ添加し、上記４種類の菌株を１０〜５０ｃｆｕずつ接種して、ストマッカーで６０秒間混和した。これを３７℃で２０時間培養し、試験１と同様にして菌数を計測した。このときの培地組成の割合と培養後の菌数を図８に示す。
そして、培養培地２２５ｇに対して、細断した食品を２５ｇ添加し、上記４種類の菌株を１０〜５０ｃｆｕずつ接種して、ストマッカーで６０秒間混和した。これを３７℃で２０時間培養し、試験１と同様にして菌数を計測した。このときの培地組成の割合と培養後の菌数を図８に示す。
同図に示すように、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、いずれの食品を添加した場合も、全ての菌が１０５以上の菌数に増殖している。
したがって、この培養培地に、生ハム、米飯、牛乳、サーモン、レタスのいずれかの食品が添加された場合でも大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
したがって、この培養培地に、生ハム、米飯、牛乳、サーモン、レタスのいずれかの食品が添加された場合でも大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同一の培養培地で同時に好適に増殖できることがわかる。
＜試験９：迅速検査法での食中毒菌の検出の検証（１）＞
試験１の実施例１及び比較例１−３の４種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で同時に２０時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、ＤＮＡを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
試験１の実施例１及び比較例１−３の４種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で同時に２０時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、ＤＮＡを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
培養後の上記４種類の培養培地をそれぞれ１ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ
ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する試料とした。
ＥＤＴＡ,１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液をマルチプレックスＰＣＲにおいて使用する試料とした。
次に、ＰＣＲ用反応液を以下の組成で調整した。プライマーはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。
・緩衝液（10×Ex Taq buffer） (2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture） （1.6μl）
・大腸菌用primerF（配列番号１） （0.2μl）
・大腸菌用primerR（配列番号２） （0.2μl）
・サルモネラ属菌用primerF（配列番号３） （0.2μl）
・サルモネラ属菌用primerR（配列番号４） （0.2μl）
・黄色ブドウ球菌用primerF（配列番号５） （0.2μl）
・黄色ブドウ球菌用primerR（配列番号６） （0.2μl）
・腸炎ビブリオ用primerF（配列番号７） （0.2μl）
・腸炎ビブリオ用primerR（配列番号８） （0.2μl）
・TaKaRa Ex Taq Hot Start Version （0.1μl）
・試料のＤＮＡ （1.0μl）
・滅菌水 （13.7μl）
（全量 20μl）
・核酸合成基質（dNTP Mixture） （1.6μl）
・大腸菌用primerF（配列番号１） （0.2μl）
・大腸菌用primerR（配列番号２） （0.2μl）
・サルモネラ属菌用primerF（配列番号３） （0.2μl）
・サルモネラ属菌用primerR（配列番号４） （0.2μl）
・黄色ブドウ球菌用primerF（配列番号５） （0.2μl）
・黄色ブドウ球菌用primerR（配列番号６） （0.2μl）
・腸炎ビブリオ用primerF（配列番号７） （0.2μl）
・腸炎ビブリオ用primerR（配列番号８） （0.2μl）
・TaKaRa Ex Taq Hot Start Version （0.1μl）
・試料のＤＮＡ （1.0μl）
・滅菌水 （13.7μl）
（全量 20μl）
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ １０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
（１）９５℃ ２分
（２）９５℃ １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃ １０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃ ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃ ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
次に、ＰＣＲ用反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図１０に示す。
同図において、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムが含まれる実施例１の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、図１０（ａ）のグラフにおいて、推定塩基長１７７のピークが大腸菌、同１８７のピークがサルモネラ属菌、同２３２のピークが黄色ブドウ球菌、同３３７のピークが腸炎ビブリオを示している。
同図において、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムが含まれる実施例１の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、図１０（ａ）のグラフにおいて、推定塩基長１７７のピークが大腸菌、同１８７のピークがサルモネラ属菌、同２３２のピークが黄色ブドウ球菌、同３３７のピークが腸炎ビブリオを示している。
ここで、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオのそれぞれ想定される増幅産物の塩基配列長は、大腸菌が１５７ｂｐ、サルモネラ属菌が１８０ｂｐ、黄色ブドウ球菌が２３６ｂｐ、腸炎ビブリオが３８０ｂｐであり、上記の推定塩基長と数ｂｐ〜数十ｂｐ程度相違しているが、これは電気泳動における泳動誤差によるものと考えられる。
次に、ペプトンを含み、酵母エキスと硫酸マグネシウムを含まない比較例１の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、黄色ブドウ球菌が十分に検出できていないことがわかる。すなわち、図１０（ｂ）のグラフにおいて、推定塩基長１７１のピークが大腸菌、同１８１のピークがサルモネラ属菌、同３４６のピークが腸炎ビブリオを示しているが、黄色ブドウ球菌には、ピークが見られない。
また、ペプトンと酵母エキスを含み、硫酸マグネシウムを含まない比較例２の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、黄色ブドウ球菌が十分に検出できていないことがわかる。すなわち、図１０（ｃ）のグラフにおいて、推定塩基長１７１のピークが大腸菌、同１８２のピークがサルモネラ属菌、同３４７のピークが腸炎ビブリオを示しているが、黄色ブドウ球菌には、ピークが見られない。
また、ペプトンと硫酸マグネシウムを含み、酵母エキスを含まない比較例３の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、黄色ブドウ球菌が十分に検出できていないことがわかる。すなわち、図１０（ｄ）のグラフにおいて、推定塩基長１７２のピークが大腸菌、同１８２のピークがサルモネラ属菌、同３４８のピークが腸炎ビブリオを示しているが、黄色ブドウ球菌には、ピークが見られない。
以上の通り、ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを併用した本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に十分に培養でき、上記のようなマルチプレックスＰＣＲ及び電気泳動を用いた迅速検査法によって、これら４種類の菌を全て検出できることが明らかとなった。
＜試験１０：迅速検査法での食中毒菌の検出の検証（２）＞
試験３の実施例７−１２及び参考例１，２の８種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で同時に２０時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、ＤＮＡを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。培養培地以外については、試験９と同様にして行った。その結果を図１１及び図１２に示す。
試験３の実施例７−１２及び参考例１，２の８種類の培養培地によって、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを３７℃で同時に２０時間培養した。そして、増殖させた食中毒菌を培養培地毎に混合し、ＤＮＡを抽出した。
次に、これらの食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーを用いて、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより増殖させ、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。培養培地以外については、試験９と同様にして行った。その結果を図１１及び図１２に示す。
図１１（ａ）において、塩化ナトリウム濃度が０％の参考例１の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、腸炎ビブリオが十分に検出できていないことがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１６５のピークが大腸菌、同１７９のピークがサルモネラ属菌、同２３２のピークが黄色ブドウ球菌を示しているが、腸炎ビブリオには、ピークが見られない。
これに対して、図１１（ｂ）において、塩化ナトリウム濃度が０．５％の実施例７の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１６５のピークが大腸菌、同１８０のピークがサルモネラ属菌を示している。また、大腸菌とサルモネラ属菌に比べてピークが小さいものの、同２３５のピークが黄色ブドウ球菌、同３６９のピークが腸炎ビブリオを示している。
また、図１１（ｃ）において、塩化ナトリウム濃度が１．０％の実施例８の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１７０のピークが大腸菌、同１８５のピークがサルモネラ属菌、同３６９のピークが腸炎ビブリオを示している。また、大腸菌とサルモネラ属菌と腸炎ビブリオに比べてピークが小さいものの、同２４０のピークが黄色ブドウ球菌を示している。
また、図１１（ｄ）において、塩化ナトリウム濃度が１．５％の実施例９の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１６９のピークが大腸菌、同１８４のピークがサルモネラ属菌、同２３５のピークが黄色ブドウ球菌、同３６１のピークが腸炎ビブリオを示している。
また、図１２（ｅ）において、塩化ナトリウム濃度が２．０％の実施例１０の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１７０のピークが大腸菌、同１８５のピークがサルモネラ属菌、同２３６のピークが黄色ブドウ球菌、同３６２のピークが腸炎ビブリオを示している。
また、図１２（ｆ）において、塩化ナトリウム濃度が２．５％の実施例１１の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１７３のピークが大腸菌、同１８７のピークがサルモネラ属菌、同２４０のピークが黄色ブドウ球菌、同３６４のピークが腸炎ビブリオを示している。
また、図１２（ｇ）において、塩化ナトリウム濃度が３．０％の実施例１２の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、これら４種類の菌が全て十分に検出できていることがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１７１のピークが大腸菌、同１８６のピークがサルモネラ属菌、同２３７のピークが黄色ブドウ球菌、同３６２のピークが腸炎ビブリオを示している。
一方、図１２（ｈ）において、塩化ナトリウム濃度が３．５％の参考例２の培養培地を用いて、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に培養した場合、サルモネラ属菌が十分に検出できていないことがわかる。すなわち、同図において、推定塩基長１７３のピークが大腸菌、同２４４のピークが黄色ブドウ球菌、同３６７のピークが腸炎ビブリオを示している。また、同１８９のわずかなピークが、サルモネラ属菌を示しているものの、そのピークは非常に小さい。
以上の通り、塩化ナトリウム濃度別に比較した場合、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの４菌種全てが特に良好に検出されるのは、塩化ナトリウム濃度が１．５〜３．０％である。
以上の通り、塩化ナトリウム濃度別に比較した場合、大腸菌、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオの４菌種全てが特に良好に検出されるのは、塩化ナトリウム濃度が１．５〜３．０％である。
このように、本発明の実施形態に係る食中毒菌の培養培地によれば、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に十分に増殖させることができるため、上記のようなマルチプレックスＰＣＲ及び電気泳動を用いた迅速検査法によって、これら４種類の菌を全て検出できることがわかる。
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査並びに臨床試験、家畜衛生において、大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に適切に増殖可能として、少なくともこれらのいずれかを検出する場合に好適に利用することが可能である。
Claims (10)
- ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有することを特徴とする培養培地。
- 請求項１に記載の培養培地に、塩化ナトリウムを１．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％含有させたことを特徴とする培養培地。
- 請求項１又は２に記載の培養培地に、糖を含有させないことを特徴とする培養培地。
- 前記ペプトンを１．０ｗ／ｖ％以上含有させ、さらにリン酸水素二ナトリウム、及びリン酸二水素カリウムを含有させ、ｐＨを６．５〜７．５としたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の培養培地。
- 少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させるため請求項１〜４のいずれかに記載の培養培地。
- 大腸菌、サルモネラ属菌、黄色ブドウ球菌、及び腸炎ビブリオを同時に増殖させるため請求項１〜５のいずれかに記載の培養培地。
- 前記複数の食中毒菌の各々１ｃｆｕ／ｍｌを、２０時間でそれぞれ１０５ｃｆｕ／ｍｌ以上に同時増殖させることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の培養培地。
- 前記複数の食中毒菌の各々１ｃｆｕ／ｍｌを、２０時間増殖させたときに、最も菌数が多い菌と最も菌数が少ない菌の菌数の差が、１０３ｃｆｕ／ｍｌ未満になるように増殖させることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の培養培地。
- ペプトン、酵母エキス、及び硫酸マグネシウムを含有する培養培地を用いて、少なくとも黄色ブドウ球菌を含む複数の食中毒菌を同時に増殖させ、
増殖させた前記複数の食中毒菌からＤＮＡを抽出し、前記複数の食中毒菌のＤＮＡの増幅対象領域を特異的に増幅させるためのプライマーをＰＣＲ用溶液に加えて、ＰＣＲにより前記増幅対象領域を増幅させ、得られた増幅産物を検出する
ことを特徴とする食中毒菌の検出方法。 - 前記培養培地に、塩化ナトリウムを１．５ｗ／ｖ％〜３．０ｗ／ｖ％含有させることを特徴とする請求項９に記載の食中毒菌の検出方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012212231 | 2012-09-26 | ||
| JP2012212231 | 2012-09-26 | ||
| PCT/JP2013/004834 WO2014049938A1 (ja) | 2012-09-26 | 2013-08-12 | 食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2014049938A1 true JPWO2014049938A1 (ja) | 2016-08-22 |
| JP6398719B2 JP6398719B2 (ja) | 2018-10-03 |
Family
ID=50387388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2014538106A Active JP6398719B2 (ja) | 2012-09-26 | 2013-08-12 | 食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20150218621A1 (ja) |
| EP (1) | EP2902479A4 (ja) |
| JP (1) | JP6398719B2 (ja) |
| KR (1) | KR20150036615A (ja) |
| CN (1) | CN104662146A (ja) |
| WO (1) | WO2014049938A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015190106A1 (ja) * | 2014-06-11 | 2015-12-17 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、食中毒菌検出用キット、食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| JP2016000016A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌の検出方法、及び食中毒菌用ｐｃｒ反応液 |
| JP2016000015A (ja) * | 2014-06-11 | 2016-01-07 | 東洋製罐グループホールディングス株式会社 | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌検出用キット |
| CA2960331A1 (en) * | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Antibiotx Aps | Antibacterial use of halogenated salicylanilides |
| WO2016079304A1 (en) * | 2015-02-17 | 2016-05-26 | Danmarks Tekniske Universitet | Rapid method for detection of salmonella in meat |
| JP2021166470A (ja) * | 2018-05-25 | 2021-10-21 | Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 | ビブリオ属細菌の培地 |
| CN110819624A (zh) * | 2019-11-13 | 2020-02-21 | 湖南融健基因生物科技有限公司 | 一种用于粪便中细菌dna快速提取的裂解液及方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH101498A (ja) * | 1996-06-13 | 1998-01-06 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
| JP2008048670A (ja) * | 2006-08-24 | 2008-03-06 | Kyushu Univ | 食中毒細菌の同時培養方法、及び検出方法 |
| JP2009195222A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-09-03 | Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology | 新規なアルカリアルギン酸リアーゼとその利用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4621919B2 (ja) | 2003-12-26 | 2011-02-02 | プリマハム株式会社 | 微生物の多重検出方法 |
| JP2007222162A (ja) * | 2006-01-26 | 2007-09-06 | Bioproject Co Ltd | 新規フラボバクテリア属細菌および新規シュードモナス属細菌ならびにそれを含有する飼料 |
| JP5014018B2 (ja) * | 2006-10-18 | 2012-08-29 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | ピロリ菌の抑制剤または静菌剤 |
| CN101851676B (zh) * | 2010-04-21 | 2013-07-24 | 吉林农业大学 | 沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌复合增菌培养基及其制备方法和应用 |
| JP5758093B2 (ja) * | 2010-08-25 | 2015-08-05 | 株式会社明治 | 細菌検出方法 |
| JP6104242B2 (ja) * | 2011-07-12 | 2017-03-29 | フードチェク・システムズ・インコーポレイテッドＦｏｏｄｃｈｅｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． | サルモネラおよび大腸菌を培養するための培養培地、方法、ならびにサルモネラおよび大腸菌を検出するための方法 |
-
2013
- 2013-08-12 JP JP2014538106A patent/JP6398719B2/ja active Active
- 2013-08-12 EP EP13842015.3A patent/EP2902479A4/en not_active Withdrawn
- 2013-08-12 WO PCT/JP2013/004834 patent/WO2014049938A1/ja active Application Filing
- 2013-08-12 CN CN201380049663.6A patent/CN104662146A/zh active Pending
- 2013-08-12 KR KR1020157003892A patent/KR20150036615A/ko not_active Application Discontinuation
-
2015
- 2015-03-26 US US14/669,967 patent/US20150218621A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH101498A (ja) * | 1996-06-13 | 1998-01-06 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 抗菌性ペプチドおよび抗菌剤 |
| JP2008048670A (ja) * | 2006-08-24 | 2008-03-06 | Kyushu Univ | 食中毒細菌の同時培養方法、及び検出方法 |
| JP2009195222A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-09-03 | Japan Agengy For Marine-Earth Science & Technology | 新規なアルカリアルギン酸リアーゼとその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6398719B2 (ja) | 2018-10-03 |
| US20150218621A1 (en) | 2015-08-06 |
| CN104662146A (zh) | 2015-05-27 |
| KR20150036615A (ko) | 2015-04-07 |
| EP2902479A4 (en) | 2016-06-08 |
| WO2014049938A1 (ja) | 2014-04-03 |
| EP2902479A1 (en) | 2015-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6398719B2 (ja) | 食中毒菌の培養培地、及び食中毒菌の検出方法 | |
| Lyon | TaqMan PCR for detection of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and non-O139 in pure cultures, raw oysters, and synthetic seawater | |
| Gurjar et al. | Real-time multiplex PCR assay for rapid detection and toxintyping of Clostridium perfringens toxin producing strains in feces of dairy cattle | |
| de Melo Pereira et al. | An updated review on bacterial community composition of traditional fermented milk products: what next-generation sequencing has revealed so far? | |
| Pal et al. | Rapid detection and differentiation of Erysipelothrix spp. by a novel multiplex real‐time PCR assay | |
| Bjornsdottir-Butler et al. | Development of a real-time PCR assay with an internal amplification control for detection of Gram-negative histamine-producing bacteria in fish | |
| Fujimoto et al. | Quantitative detection of viable Bifidobacterium bifidum BF-1 cells in human feces by using propidium monoazide and strain-specific primers | |
| Mejri et al. | Characterization and selection of Lactobacillus plantarum species isolated from dry fermented sausage reformulated with camel meat and hump fat | |
| Shams et al. | Evaluation of a Multiplex PCR Assay for the Identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | |
| US20170088882A1 (en) | Carrier for detecting foodborne-illness-causing bacteria, kit for detecting foodborne-illness-causing bacteria, method for detecting foodborne-illness-causing bacteria, and pcr reaction solution for foodborne-illness-causing bacteria | |
| Lyhs | Microbiological methods | |
| KR101496835B1 (ko) | 살모넬라균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물 및 이를 이용한 살모넬라균의 검출 방법 | |
| Senachai et al. | Application of tetraplex PCR for detection of Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and V. mimicus in cockle | |
| Islam et al. | Evaluation of immunomagnetic separation and PCR for the detection of Escherichia coli O157 in animal feces and meats | |
| Rotundo et al. | Evaluation of PCR-based methods for the identification of enteroaggregative hemorrhagic Escherichia coli in sprouts | |
| Shimizu et al. | Fluorescent in situ hybridization in combination with filter cultivation (FISHFC) method for specific detection and enumeration of viable Clostridium perfringens | |
| Neumann et al. | Quantitative real-time PCR assay for Clostridium septicum in poultry gangrenous dermatitis associated samples | |
| Yassin et al. | Detection of listeria monocytogenes in several types of frozen meat in Baghdad city | |
| KR101261412B1 (ko) | 주요 병원성 미생물 신속검출용 멀티플렉스 ｐｃｒ 방법 및 이를 위한 ｐｃｒ 프라이머 | |
| Balakrishna et al. | A novel multiplex polymerase chain reaction for simultaneous detection of Yersinia enterocolitica, Staphylococcus aureus, Aeromonas and Salmonella from chicken meat and milk samples | |
| JP2016000015A (ja) | 食中毒菌検出用担体、及び食中毒菌検出用キット | |
| JP5006607B2 (ja) | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 | |
| Ahmed et al. | Detection of Salmonella Spp. in Meat and Meat Products by Culture, Biochemical and Molecular Characterization in Duhok City | |
| Yadav et al. | Prevalence of Listeria spp including Listeria monocytogenes from apparently healthy sheep of Gujarat State, India | |
| Park et al. | Detection Strategies for Foodborne Salmonella and Prospects for Utilization of Whole Genome Sequencing Approaches |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160719 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170620 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7421 Effective date: 20170630 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170821 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170825 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180116 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180316 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180807 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180820 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6398719 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |