JP2021166470A - ビブリオ属細菌の培地 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ビブリオ属細菌の培養において、従来用いられてきた培地よりも、倍加時間が短く、且つ、到達生菌密度を高めることができる培地を提供することを目的とする。【解決手段】本発明のビブリオ属細菌を培養するための培地は、リン酸イオン換算濃度が８．８〜２６６ｍＭであるリン（Ｐ）を含むことを特徴とする。【選択図】図１

Description

本発明は、ビブリオ属細菌の培地に関する。

微生物を用いて有用物質を大量生産する場合、使用する微生物は、短時間に大量に増殖する能力をもつことが望ましい。ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属細菌は増殖速度が速いものが多く、中でもビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）の倍加速度は、一般的に物質発酵生産に利用される大腸菌よりも速いことが知られている（非特許文献１、２）。したがって、Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ等のビブリオ属細菌は、大腸菌に代わる新たな有用物質の生産宿主として期待されている。

一方で、有用物質の生産性を高めるためには、ビブリオを効率よく培養する必要がある。これまでビブリオ属細菌の培地として、一般的な微生物発酵用培地（特許文献１）を用いることが知られている。また、微生物研究に広く用いられている天然培地若しくは最少培地に海水若しくは塩化ナトリウムを添加した培地（非特許文献１、２）を用いることも知られている。

しかしながら、ビブリオ属細菌の培地の組成は必ずしも最適化されていないのが現状である。ビブリオ属細菌の生育特性を十分に発揮させるためには、ビブリオ属細菌に最適な培養方法、とりわけ培養培地の開発が必要である。

特開２０１２−１９６１４４号公報

Henry H.Lee et al., "Vibrio natriegens, a new genomic powerhouse." bioRxiv preprintfirst posted online Jun. 12, 2016 (https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2016/06/12/058487.full.pdf) MatthewT Weinstock et al., "Vibrio natriegens as a fast-growing host for molecularbiology." Nature Methods 13, 849-851 (2016)

本発明は、ビブリオ属細菌の培養において、従来用いられてきた培地よりも、倍加時間が短く、且つ、到達生菌密度を高めることができる培地を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記従来技術の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ビブリオ属細菌の増殖は、培地中のリン（Ｐ）濃度によって影響され、そして、所定のリン（Ｐ）濃度を有する培地でビブリオ属細菌を培養することでビブリオ属細菌の増殖が促進されたことを見出した。

すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
リン酸イオン換算濃度が８．８〜２６６ｍＭであるリン（Ｐ）を含むことを特徴とする、ビブリオ属細菌を培養するための培地。
［２］
上記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）である、［１］の培地。
［３］
リン酸イオン換算濃度が８．８〜７９.８ｍＭであるリン（Ｐ）を含む、［１］又は［２］の培地。
［４］
上記リンがリン酸イオンである、［１］〜［３］のいずれかの培地。
［５］
上記リンがアルカリ金属リン酸塩に由来する、［１］〜［４］のいずれかの培地。
［６］
上記培地が無機物質を含む、［１］〜［５］のいずれかの培地。
［７］
上記培地が少なくとも一種類のビタミン類を含む、［１］〜［６］のいずれかの培地。
［８］
［１］〜［７］のいずれかの培地を用いて、ビブリオ属細菌を培養することを含む、ビブリオ属細菌の培養方法。
［９］
［１］〜［７］のいずれかの培地を用いて、ビブリオ属細菌を培養することを含む、微生物製剤の製造方法。
［１０］
上記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）である、［９］の微生物製剤の製造方法。

培地に所定濃度のリン（Ｐ）を添加することによって、ビブリオ属細菌の培養における生育特性を向上させることができる。それによって、ビブリオ属細菌の培養時間を短縮でき、かつ、菌体をより増殖することができる。

Ｖｎ培地１〜３を用いたＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖曲線（実施例１）を示す。 Ｖｎ培地３〜５を用いたＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖曲線（実施例２）を示す。 Ｖｎ培地６〜１０を用いたＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖曲線（実施例３）を示す。 Ｖｎ培地１１〜１３を用いたＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖曲線（実施例４）を示す。 Ｖｎ培地１４〜１６を用いたＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖曲線（実施例５）を示す。 Ｅｃ培地１〜３を用いたＥ．ｃｏｌｉの増殖曲線（比較例１）を示す。

＜培地＞
本発明のビブリオ属細菌を培養するための培地（以下、場合によって「ビブリオ属細菌の培養用培地」という）の一実施形態は、リン酸イオン換算濃度が７．４〜２２０ｍＭであるリン（Ｐ）を含む培地であり、液体培地であってもよく、固体培地であってもよい。

本実施形態において、リン（Ｐ）は元素のリン（燐）を指し、リンを含むリン源として無機リン化合物及び有機リン化合物が挙げられる。

無機リン化合物としては、リン酸塩が好適に用いられる。例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属のリン酸塩、リン酸アンモニウム塩が挙げられ、リン源がアルカリ金属リン酸塩であることが好ましい。リン酸ナトリウム塩としては、例えば、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、ペンタポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、ウルトラポリンが挙げられる。リン酸カリウム塩としては、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三カリウムが挙げられる。リン酸カルシウム塩としては、例えば、リン酸カルシウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素カルシウム一水和物、リン酸水素カルシウム、リン酸水素カルシウム二水和物、リン酸三カルシウム、リン酸八カルシウム、水酸アパタイト、フッ素アパタイト、塩素アパタイト、炭酸アパタイトが挙げられる。リン酸マグネシウム塩としては、例えば、リン酸一マグネシウム、リン酸二マグネシウム、リン酸三マグネシウム、ピロリン酸マグネシウム、メタリン酸マグネシウムが挙げられる。リン酸アンモニウム塩としては、例えば、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウムが挙げられる。

リン酸塩は一般的には液体培地中において、強塩基性条件ではリン酸イオン（ＰＯ_４ ^３−）として、弱塩基性条件ではリン酸水素イオン（ＨＰＯ_４ ^２−）として、弱酸性条件ではリン酸二水素イオン（Ｈ_２ＰＯ_４ ⁻）として存在し、そして、強酸性条件では遊離リン酸（Ｈ_３ＰＯ_４）として存在する。リン酸塩はまた、重合化したリン酸イオンとして存在し得る。例えば、二リン酸又はピロリン酸（Ｐ_２Ｏ_７ ^４−）、三リン酸（Ｐ_３Ｏ_１０ ^５−）等が挙げられる。培地中のリンがリン酸イオンであることが好ましい。

有機リン化合物としては、リン酸が結合された（リン酸基を有する）生体分子が挙げられる。例えば、糖リン酸、及びヌクレオチドリン酸等が挙げられる。具体的に、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ^５ＵＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸等のヌクレオシド三リン酸が挙げられる。他に、ＡＤＰ等のヌクレオシド二リン酸、ＡＭＰ等のヌクレオシド一リン酸も挙げられる。例えば、ＡＴＰがＡＤＰ、あるいはＡＤＰがＡＭＰになる際にリン酸イオンが形成され放出される。他のヌクレオシド三リン酸やヌクレオシド二リン酸でも同様である。リン酸が結合された生体分子としてはまた、リン酸基を介したフォスフォジエステル結合がヌクレオチド分子同士を連結しているＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸も挙げられる。リン酸とグリセロールから誘導されたリン酸エステルで、グリセロリン脂質の構成要素の一つであるグリセロール３−リン酸も挙げられる。

有機リン化合物源としては、ペプトン類、エキス類、細胞残渣、浸出液等が挙げられるが、エキス類が好ましく用いられる。

本実施形態の培地において、リンを含むリン源は１種類であってもよく、２種類以上のリン源を任意の比率で混合してもよい。培地中のリン濃度（Ｐ濃度）は、リン酸イオン換算濃度で８.８〜２６６.０ｍＭであってよく、好ましくは８.８〜１３２.７ｍＭ、若しくは８.８〜７９.８ｍＭ程度、より好ましくは８.８〜４３.９ｍＭ程度、さらに好ましくは１０〜４０ｍＭ、１０〜３５ｍＭ、１２〜３０ｍＭ、若しくは１５〜２５ｍＭ程度である。培養開始時のリンの好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のリンの消費に応じて、適宜にリン源を添加してもよい。ここで、リン酸イオン換算濃度とは、単位液体培地（中に存在するリン原子を「リン酸イオン（ＰＯ_４ ^３−）」に換算したモル濃度である。リン酸イオン濃度の測定は、Ｃｅｄｅｘ Ｂｉｏ ＨＴ(Ｒｏｃｈｅ社、製品番号６３２−２５８４１)で、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｉｏ（Ｒｏｃｈｅ社、製品番号６３６−３１４７１）を用いて測定することができる。

ビブリオ属細菌の培養用培地としては、ビブリオが生育できる培地であり、かつ、Ｐ濃度が上記範囲内であれば、組成に関して特に制限されないが、例えば、ビブリオが資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類（ミネラル）等の一般的な細菌を培養するための培地成分を含有する、天然培地又は合成培地であってよい。

炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、ソルビトール等のアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。

炭素源としては、１種類であってもよく、２種類以上の炭素源を任意の比率で混合してもよい。培地における炭素源の濃度は、０.１ｗ/ｖ％〜５０ｗ/ｖ％程度、好ましくは０.５ｗ/ｖ％〜４０ｗ/ｖ％程度、より好ましくは１ｗ/ｖ％〜３０ｗ/ｖ％程度、特に好ましくは５ｗ/ｖ％〜２０ｗ/ｖ％程度であってよい。本実施形態において、炭素源としてグリセロール又はグルコースを用いることが好ましく、グリセロール又はグルコースと他の炭素源とを任意の比率で混合してもよい。炭素源中のグリセロール又はグルコースの比率は、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、特に好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。培養開始時の炭素源の好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中の炭素源の消費に応じて、炭素源を適宜に添加してもよい。

窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機窒素塩、アミノ酸、ペプトン、エキス類、コーンスターチ製造工業における副産物であるコーンスティープリカー（ＣＳＬ）等の有機窒素源が挙げられる。ペプトン類としては、カゼインペプトン、獣肉ペプトン、心筋ペプトン、ゼラチンペプトン、又は大豆ペプトン等が挙げられる。エキス類としては、肉エキス、酵母エキス、心臓浸出液（ハートインフュージョン）等が挙げられる。アミノ酸又はペプチドを含む窒素源としては、より低分子のペプチド及びアミノ酸の含有量が高いほうが好ましい。コーンスティープリカーは、窒素源である一方、リンも含むためリン源でもある。窒素源は、高濃度で使用すると、コストの上昇になり、また廃液処理の負担が上がる。

無機塩類（ミネラル）としては、リン（Ｐ）の他に、イオウ（Ｓ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、鉄（Ｆｅ）、ナトリウム（Ｎａ）等が挙げられる。

培地には、ビタミン類、成長因子等の微量成分も含んでよい。ビタミン類としては、ビオチン、塩化コリン、シアノコバラミン、葉酸、イノシトール、ニコチン酸、４−アミノ安息香酸、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアンミン、チムジン等が挙げられる。ビタミン類の源としては、麦芽エキス、ポテトエキス、トマトジュース等の各種エキスが挙げられ、成長因子の源としては、例えば酵母エキスが挙げられる。

用いられる培地としては、肉汁培地、肉汁ゼラチン培地、硝酸塩培地、牛乳培地、コーンミール培地、ＭＲ−ＶＰ培地、トマトジュース培地、ＴＳＩ培地、ＳＩＭ培地、グルコース−ブイヨン培地、ＹＭ培地、Ｌｅｎｎｏｘ培地（Ｌ培地）、ＬＢ培地等が挙げられる。これらの培地のＰ濃度を、各種リン源を用いてリン酸イオン換算濃度で８.８〜２６６ｍＭに調整すればよい。

無機物質を主成分とする合成培地の場合は、リンのリン酸イオン換算濃度は８.８〜７９.８ｍＭ程度が好ましく、８.８〜７０ｍＭ、８.８〜６０ｍＭ、８.８〜５０ｍＭ、若しくは８.８〜４０ｍＭ程度がより好ましく、８.８〜３０ｍＭ、若しくは８.８〜２０ｍＭ程度がさらに好ましい。合成培地は、例えば、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、アンモニウム等の陽イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、塩酸イオン等の陰イオンを含んでよく、必要に応じてグルコース等の糖類、さらに、ビタミン類を含んでもよい。具体的には、１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．７ｍＭ ＣａＣｌ_２、９μＭ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４ｍＭ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１０ｍＭ グルコースを含む培地、６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、６ｇ／Ｌ グルコース、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び０．０４％ Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌを含む培地、或いは、１６ｇ／Ｌ Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ、２４６．４８ｍｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、及び２ｇ／Ｌ グルコースを含む培地、或いは７ｇ／Ｌ Ｋ_２ＨＰＯ_４、３ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／Ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２ｇ／Ｌ グルコース、及び３０μｇ／ｍＬチアミンを含む培地が挙げられる。

培地のｐＨはビブリオ属細菌の種類によって変えることが可能であり、通常、５．０〜９．０とすることが好ましい。また、必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモータとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換されたビブリオ属細菌を培養する場合は、必要に応じてインデューサを培地に添加してもよい。

＜ビブリオ属細菌＞
本発明の一実施形態におけるビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）細菌は、γ−プロピオバクテリアのＶｉｂｒｉｏｎａｎｃｅａｅ科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛１本を持って運動し、淡水や海水に見られる細菌である。本発明で用いるビブリオ属細菌は、非病原性のものが望ましく、病原性が知られていないビブリオ細菌は、Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ （ＯＨＳ）発行のＢｉｏｓａｆｅｔｙ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＭＢＬ） ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）に挙げられており、以下のようなビブリオ属細菌が利用できる。
Ｖｉｂｒｉｏ ａｂａｌｏｎｉｃｕｓ ＡＴＣＣ２７３９０
Ｖｉｂｒｉｏ ａｄａｐｔａｔｕｓ ＡＴＣＣ１９２６３
Ｖｉｂｒｉｏ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ７００７９７
Ｖｉｂｒｉｏ ａｅｓｔｕａｒｉａｎｕｓ ＡＴＣＣ３５０４８
Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１４５８２
Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｏｓｕｓ ＡＴＣＣ１４３９０
Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ ＡＴＣＣ４３３０５
Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｌｖｉｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−６０６
Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ ＡＴＣＣ２５９２０
Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｒｃｈａｒｉａｅ ＡＴＣＣ３５０８４
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４５０
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｏｓｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ４３１４７
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｙｃｌｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＡＴＣＣ７００９８２
Ｖｉｂｒｉｏ ｃｙｃｌｏｓｉｔｅｓ ＡＴＣＣ１４６３５
Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ ＡＴＣＣ３３４６６
Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ＡＴＣＣ２５９１８
Ｖｉｂｒｉｏ ｇａｚｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ２９９８８
Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ ＡＴＣＣ７００６８０
Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ＡＴＣＣ１４１２６
Ｖｉｂｒｉｏ ｈｉｓｐａｎｉｃａ ＡＴＣＣ５１５８９
Ｖｉｂｒｉｏ ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ ＡＴＣＣ７０００２３
Ｖｉｂｒｉｏ ｉｌｉｏｐｉｓｃａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ５１７６０
Ｖｉｂｒｉｏ ｌｅｎｔｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−５３９
Ｖｉｂｒｉｏ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ＡＴＣＣ１７０５８
Ｖｉｂｒｉｏ ｌｏｇｅｉ ＡＴＣＣ１５３８２
Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎａｇｉｌｉｓ ＡＴＣＣ１４３９８
Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｏｆｕｌｖｕｓ ＡＴＣＣ１４３９５
Ｖｉｂｒｉｏ ｍａｒｉｎｏｖｕｌｇａｒｉｓ ＡＴＣＣ１４３９４
Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ ＡＴＣＣ４３３４１
Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ ＡＴＣＣ７７０８
Ｖｉｂｒｉｏ ｍｙｔｉｌｉ ＡＴＣＣ５１２８８
Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ ＡＴＣＣ１４０４８
Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ ＡＴＣＣ５１１８３
Ｖｉｂｒｉｏ ｎｅｒｅｉｓ ＡＴＣＣ２５９１７
Ｖｉｂｒｉｏ ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ ＡＴＣＣ２７０４３
Ｖｉｂｒｉｏ ｏｒｄａｌｉｉ ＡＴＣＣ３３５０９
Ｖｉｂｒｉｏ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＡＴＣＣ３３９３３
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ ＡＴＣＣ７００７８３
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｌａｇｉｕｓ ＡＴＣＣ３３５０４
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ ＡＴＣＣ５１８４１
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｏｎｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１４３９１
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ５３５５９
Ｖｉｂｒｉｏ ｐｓｙｃｈｒｏｅｒｙｔｈｒｕｓ ＡＴＣＣ２７３６４
Ｖｉｂｒｉｏ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ ＡＴＣＣ４３８３９
Ｖｉｂｒｉｏ ｓｈｉｌｏｉｉ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−９１
Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ ＡＴＣＣ３３１２５
Ｖｉｂｒｉｏ ｔｙｒｏｓｉｎａｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１９３７８
Ｖｉｂｒｉｏ ｖｉｓｃｏｓｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１０５
Ｖｉｂｒｉｏ ｗｏｄａｎｉｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１０４
Ｂｅｎｅｃｋｅａ ｐｅｌａｇｉａ ＡＴＣＣ２５９１６
Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ ＡＴＣＣ１９２６４

また、Ｂｅｎｅｃｋｅａ ｐｅｌａｇｉａ、Ｌｉｓｔｏｎｅｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍはビブリオ属細菌と近縁であり、ビブリオ属細菌に分類されるものもある（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００４） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，２３，４０３−４３１及びＭａｃｉａｎ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３，３７３−３７５．）。したがって、このような細菌も本発明におけるビブリオ属細菌として、本発明の培地を用いて培養することができる。

ビブリオ属細菌としては、ビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）を用いることが好ましい。ビブリオ・ナトリージェンスは、γ−プロピオバクテリアのＶｉｂｒｉｏｎａｎｃｅａｅ科に属する海洋性の通性嫌気性細菌であり、１９５８年にウロン酸酸化細菌として分離された（Ｐａｙｎｅ，Ｗ．Ｊ．（１９５８） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，７６，３０１）。当初は同じγ−プロピオバクテリアのシュードモナス（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ）に属するとされていたが、ベネケア（Ｂｅｎｅｃｋｅａ）属に再分類された後、他のベネケア属と同様にビブリオ属に編入された。ＡＴＣＣではＢｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ １に分類されており、ＤＳＭＺ（ｔｈｅ Ｇｅｒｍａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ）でも、Ｒｉｓｋ Ｇｒｏｕｐ １（Ｇｅｒｍａｎ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ））に分類されており、病原性は知られていない。ビブリオ・ナトリージェンスとしては、ビブリオ・ナトリージェンスＮＢＲＣ１５６３６株（ＡＴＣＣ １４０４８株）が挙げられる。

本実施形態におけるビブリオ属細菌は野生型であってもよく形質転換体であってもよい。形質転換体は、一般的に遺伝子工学的手法によって得ることができ、例えば目的成分をコードする核酸を有するベクターをビブリオ属細菌株に導入することによって得ることができる。また、各種育種技術により得られた変異株であってもよい。さらに、遺伝子工学的手法により得られた、遺伝子の挿入株や破壊株であってもよい。

＜培養方法＞
ビブリオ属細菌の培養方法は、上記培地を用いてビブリオ属細菌を培養することを含む。培養温度は、例えば、１５〜４０℃であってよく、特に好ましくは３０〜４２℃で通気培養を行うことが好ましい。培地のｐＨは５．０〜９．０に保持することが好ましい。培養液のｐＨは、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて調整することができる。酸素は、振とう、通気及び撹拌等の方法によって供給され、溶存酸素濃度を１〜５０％に調節するのが好ましい。酸素濃度の調節は、振とう速度、通気量又は攪拌数等の設定によって行う。圧力制御が可能な容器であれば、加圧で溶存酸素濃度を調節するもできる。

＜微生物製剤の製造方法＞
本発明の一実施形態の微生物製剤の製造方法は、上記培地を用いてビブリオ属細菌を培養することを含む。所望の成分が産生される条件でビブリオ属細菌培養し、所望の成分を産生させ、該成分を回収し、必要に応じて精製することで微生物製剤を製造できる。

ビブリオ属細菌が産生する成分は、野生型のビブリオ属細菌が産生する成分であってもよく、遺伝子工学によって得られたビブリオ属細菌によって産生される成分であってもよい。

遺伝子工学によって得られたビブリオ属細菌としては、例えば所望の成分を産生する形質転換体が挙げられる。形質転換体が産生する成分としては、例えば構造タンパク質、例えばフィブロインが挙げられ、これらをコードする核酸によってビブリオ属細菌を形質転換することのよって、形質転換体が得られる。形質転換体と宿主としては、特に「ビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）が好ましくは用いられる。

以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。

実施例で用いたビブリオ属細菌は、ビブリオ・ナトリージェンス（Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）ＮＢＲＣ１５６３６であり、これを培養するための培地の組成は表１〜６にします。比較例で用いた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を培養するための培地の組成は表７に示す。ここで用いた無機化合物は全て和光純薬工業株式会社より購入し、酵母エキス（Yeast extract）及びトリプトン（Trypton）はBD Biosciences社より購入した。

＜実施例１＞
Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓを表１に示すシード培地ＬＢｖ２で一晩ダブルアクションラボシェイカーＳＳＲ−２（アズワン社、製品番号１−２２６−０１）を用いて、室温、２００ｒｐｍで振とう培養した。一晩培養した培養液の５μＬをそれぞれ５ｍＬの表２に示すＶｎ培地１〜３に植菌した。小型振盪培養装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、製品番号ＴＶＳ０６２ＣＡ）を用いて、３７℃、６０ｒｐｍで振とう培養し、６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ_６６０）を５分間隔で測定した。

結果を図１に示す。Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖が、Ｐ濃度がＶｎ培地１より低いＶｎ培地２及びＶｎ培地３では、より速くなり、最終ＯＤ_６６０はＰ濃度が一番低いＶｎ培地３（Ｐ濃度：４３.９ｍＭ）で最大となった。

＜実施例２＞
より低いＰ濃度を検討するため、実施例１と同様に、Ｖｎ培地３と、Ｐ濃度がより低いＶｎ培地４〜５（表３）との比較を行った。その結果を図２に示す。Ｐ濃度がより低いＶｎ培地４及び５を用いた培養では、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの増殖速度及び最終ＯＤ_６６０は、Ｖｎ培地３を用いた場合に比べ、著しく増加した。

＜実施例３＞
Ｖｎ培地の作製にＫＨ_２ＰＯ_４を使用しているために、Ｐ濃度を下げる際に、カリウム濃度も減少する。そこで、得られた効果がＰ濃度の低下に起因するのか、あるいは、カリウム濃度の低下に起因するのか、あるいは両濃度の低下に起因するのかを確認した。

培地作製の際に、ＫＨ_２ＰＯ_４の代わりに、ＫＣｌとＮａＨ_２ＰＯ_４を用いることで、カリウムイオン濃度とＰ濃度を独立に調整し、Ｖｎ培地６〜１０（表４）を作製した。これらの培地を使用して、実施例１と同様の方法で培養し、濁度を測定した。

結果を図３に示す。カリウムイオン濃度のみを下げたＶｎ培地９及び１０で、Ｖｎ培地６と比べて、到達ＯＤ_６６０及び比増殖速度に顕著な差は見られなかった。これに対し、Ｐ濃度のみを下げたＶｎ培地７及び８では、Ｖｎ培地６と比べて、最終ＯＤ_６６０及び増殖速度の顕著な増加が見られた。この結果からＰ濃度がＶ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの最終ＯＤ_６６０及び増殖速度の増加に重要であると考えられる。

＜実施例４＞
次に、ビブリオ属細菌の培養に広く使用され、リン（Ｐ）を含まない培地であるＶｎ培地１１（特許文献２）にＰを添加し、Ｖｎ培地１２及び１３（表５）を作製し、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの生育に与える影響を調べた（図４）。

結果を図４に示す。Ｐが含まれるＶｎ培地１２及び１３での増殖速度は、Ｐが含まれないＶｎ培地１１に比べ、増加した。最終ＯＤ_６６０については、１７.８ｍＭのＶｎ培地１３で著しい増加が見られた。

＜実施例５＞
続いて、合成培地であるＶｎ培地１４〜１６（表６）におけるＰ濃度による影響を調べた。結果を図５に示す。Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓの最終ＯＤ_６６０及び増殖速度は、Ｐ濃度の低下により、著しく増加した。

＜比較例１＞
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてもＰ濃度による増殖への影響を調べた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）をＬＢ培地で３７℃、２００ｒｐｍで一晩振とう培養した。一晩培養した培養液の５μＬを５ｍＬのＥｃ培地１〜３（表７）に植菌した。小型振盪培養装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、製品番号ＴＶＳ０６２ＣＡ）を用いて、３７℃、６０ｒｐｍで振とう培養し、６６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ_６６０）を５分間隔で測定した。

結果を図６に示す。Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓとは異なり、Ｅ．ｃｏｌｉでは１７７ｍＭの濃度で、最終ＯＤ及び増殖速度が共に最大であり、Ｐ濃度の低下に伴い、減少する傾向を示した。

Claims (10)

1. リン酸イオン換算濃度が８．８〜２６６ｍＭであるリン（Ｐ）を含むことを特徴とする、ビブリオ属細菌を培養するための培地。
2. 前記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）である、請求項１に記載の培地。
3. リン酸イオン換算濃度が８．８〜７９.８ｍＭであるリン（Ｐ）を含む、請求項１又は２記載の培地。
4. 前記リンがリン酸イオンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の培地。
5. 前記リンがアルカリ金属リン酸塩に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の培地。
6. 前記培地が無機物質を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の培地。
7. 前記培地が少なくとも一種類のビタミン類を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の培地。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地を用いて、ビブリオ属細菌を培養することを含む、ビブリオ属細菌の培養方法。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載の培地を用いて、ビブリオ属細菌を培養することを含む、微生物製剤の製造方法。
10. 前記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）である、請求項９に記載の微生物製剤の製造方法。
    

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