SI22256A

SI22256A - MUTIRANI SKRAJĹ ANI GEN mt-pfkA ZA SINTEZO AKTIVNEGA KRAJĹ EGA FRAGMENTA 6-FOSFOFRUKTO-1-KINAZE

Info

Publication number: SI22256A
Application number: SI200600107A
Authority: SI
Inventors: Matic LEGIŠA; Mojca BENČINA; Gregor TEVŽ; Maja Capuder; Tina Mlakar; Darija Oven
Original assignee: Kemijski inštitut
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2007-10-31
Also published as: EP2010651A2; US20090098605A1; US7807404B2; WO2007123498A3; BRPI0710863A2; EP2010651B1; WO2007123498A2; WO2007123498A8

Abstract

Izum se nanaša na mutirani skrajšani mt-pfkA gen za krajši fragment 6-fosfofrukto-1-kinaze (PFK1), ki za polno aktivnost ne potrebuje fosforilacije encima, ki ga kodira, ki ni pomembno inhibiran scitronsko kislino in/ali soljo te kisline ter molekulami ATP. Aktivni 49-52 kDa fragmenta, ki je produkt mt-pfkA gena ima ohranjene pozitivne regulatorne lastnosti, tako da se aktivira ob prisotnostispecifičnih aktivatorjev, ni pa več občutljiv na inhibicijo s citronsko kislino in ATP kot pomembnima substancama, ki pri višjih organizmih delujeta kot inhibitorja povratne zveze. Izum se nanaša tudi na postopek, ki vključuje vnos mt-pfkA gengena, ki kodira spremenjeni krajši fragment, v celice, z namenom, da pride do povečanega pretoka metabolizma preko glikolize ter povečano sintezo primarnih in sekundarnih metabolitov. Izum se nanaša tudi na uporabo spremenjenega krajšega fragmenta v biotehnoloških postopkih pridobivanja primarnih in sekundarnih metabolitov.

Description

Predmet izuma je mutirani skrajšani gen mi-pfkA, ki kodira sintezo aktivnega krajšega fragmenta 6-fosfofrukto-l-kinaze (PFK1), ki za indukcijo aktivnosti ne potrebuje posttranslacijske modifikacije, ter uporaba mutiranega krajšega gena in njegovega proteinskega produkta za povečanje hitrosti sinteze celične biomase, ekstracelulamih encimov ter primarnih in sekundarnih metabolitov.

Izum spada na področje mikrobne biotehnologije in biokemije.

Pri biotehnoloških procesih ima odločilni vpliv za končno ceno produkta hitrost sinteze produkta. Pri izboljšavah biotehnoloških procesov vedno stremijo k izboljšavi, tako mikroorganizma, kot pogojev gojenja, kjer bi se v čim krajšem času predelalo čim več substrata v končni produkt.

Pri industrijskih mikroorganizmih, ki so sposobni izločati določene biotehnološke produkte s povečano produktivnostjo in visokimi dobitki, so izrednega pomena anaplerotske reakcije, ki vodijo do povečane koncentracije intermediatov cikla trikarboksilnih kislin v celicah. Citronski cikel ali cikel trikarboksilnih kislin predstavlja osrednje mesto metabolizma, kamor se steka večina produktov oksidacije ogljikovih hidratov, maščobnih kislin in amino kislin, iz njega pa izvira tudi cela vrsta prekurzorjev za različne biosintetske poti. Cikel tako predstavlja kritično povezavo med katabolnimi in anabolnimi procesi v celici. Z dvigom nivoja intermediatov cikla trikarboksilnih kislin, s pospeševanjem t.i. anaplerotskih reakcij, se poveča sinteza ključnih celičnih gradbenih elementov, kot so na primer lipidi, amino kisline in porforini, s tem pa posredno hitrost rasti celic ter sinteza primarnih in sekundarnih metabolitov, ki imajo pogosto biotehnološko vrednost.

Več specifičnih metabolnih reakcij prištevamo k anaplerotskim reakcijam, vendar pa je neomejen pretok metabolitov preko glikolitične poti razgradnje glukoze najbolj pomemben. Pri tem igra pomembno vlogo encim 6-fosfofrukto-l-kinaza (PFK1), ki predstavlja ključno regulatomo točko. Pri evkariontskih organizmih je encim preko inhibicije povratne zveze reguliran s citratom in ATP, kar pomeni, da njegova aktivnost pade, ko se v celici prekomerno dvigne nivo citronske kisline kot intermediata cikla trikarboksilnih kislin in ATP, kot končnim produktom oksidativne fosforilacije (Voet in Voet, 1995). Tako dejansko negativna regulacija

-2encimske aktivnosti zmanjšuje učinkovitost anaplerotskih reakcij in s tem posredno hitrost sinteze končnih produktov. Izredno povečanje hitrosti tvorjenja bioproduktov bi dosegli, če bi imeli nemoten pretok preko glikolize, to pa bi bilo mogoče, če bi bil na voljo aktiven encim 6fosfofrukto-l-kinaza, ki bi ohranil pozitivne lastnosti regulacije, izgubil pa bi negativno regulacijo.

V preteklosti je bilo opisanih vi č primerov, ko so poskušali pospešiti metabolni pretok preko glikolize, s ciljem da bi povečali dobitke ali hitrost sinteze končnih produktov, vendar so se takšni projekti slabo končali. Da bi dvignili metabolni pretok preko glikolize so iz glive Aspergillus niger sistematično izolirali tri gene, ki kodirajo regulatome encime te poti, med drugim tudi gen za 6-fosfofrukto-l-kinazo (PFK1). Gene so vrnili v celice istega seva v povečanem številu kopij, s ciljem, da bi dobili večjo koncentracijo omenjenih encimov in posredno hitrejšo pretvorbo metabolitov preko glikolize, vendar natančna analiza transformant ni potrdila pričakovanih rezultatov. Pričakovana pospešitev metabolnega pretoka pridobljena z gensko manipulacijo je bila izničena s spremenjenimi regulatomimi mehanizmi (Ruijter et al., 1996). Pri istem mikroorganizmu so enak efekt želeli doseči z naključnimi mutacijami, kjer so želeli spremeniti PFK1 tako, da ne bi bila več občutljiva na inhibicijo s citratom. Uspeli so izolirati mutanto, ki je dejansko imela nekoliko zmanjšano občutljivost na citat, vendar pa je encim pri nekoliko povečani koncentraciji inhibitorja (lOmM) deloval le z 20% maksimalne aktivnosti. Delno povečana odpornost na inhibitomo delovanje citrata tudi ni bistveno pripomogla h končnemu cilju, to je dvigu hitrosti sinteze končnega produkta (Schreferl et al.,

1986) . Encim z nekoliko znižano občutljivostjo na inhibicijo s citratom so uspeli dokazati s proteolitičnim odcepom 8 aminokislinskih ostankov na C terminalnem delu PFK1 izolirane iz zajčje mišice. Modificiran encim je popolnoma izgubil aktivnost šele ob prisotnosti 10 mM citrata, medtem ko je bil izhodni encim neaktiven že pri 2,5 mM inhibitorja (Valaitis et al.,

1987) .

V primerjavi s PFK1 opisanimi pri drugih organizmih ima nativni encim pri glivi Aspergillus niger nekoliko večjo rezistenco na inhibicijo s citratom, kljub temu pa 10 mM koncentracija citrata skoraj popolnoma zavre njegovo delovanje. Poleg tega na encim inhibitomo delujejo koncentracije ATP večje od 1 mM. Encim PFK1 so pri glivi Aspergillus niger že večkrat poskusili natančno opisati (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Schreferel et al. 1986; Arst et al., 1987/, izolirali pa so tudi gen, ki kodira omenjeni encim in določili njegovo nukleotidno zaporedje. Analiza gena je pokazala, da gre za 85 kDa velik

-3protein (EMBL accession number pfkA Z79690), medtem ko je študij kinetike na delno prečiščenem encimu, ki pa mu niso določili molske mase (!), pokazal, da encim aktivirajo AMP, fruktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni, medtem ko ga citrat in ATP inhibirata (Habison et al., 1983; Mesojednik in Legiša, 2005). Ugotovljeno je bilo, da prisotnost amonijevih ionov inhibicijo encimske aktivnosti s citratom ie nekoliko omili, ne pa prepreči (Habison et al., 1983, Arst et al., 1987). V literaturi smo opisali primer, ko smo pri glivi Aspergillus niger odkrili nekoliko krajši protein, z molsko maso 48 kDa, ki pa prvotno ni bil aktiven in se je ponovno aktiviral šele po fosforilaciji proteinske molekule (Legiša in Benčina 1994a). C.P. Kubicek, ki je vodil raziskave meijenja encimske kinetike pri istem encimu (Habison et al., 1979; Habison et al., 1983; Scheferel et al. 1986; Arst et al., 1987), je kategorično zavrnil, da bi v njegovem laboratoriju našli protein z 48 kDa, ki bi kazal znake aktivnosti PFK1 (Legiša in Benčina, 1994b). V dveh diplomskih delih (Smerkolj, 2000) je bil opisan tudi postopek za izolacijo 48 kDa fragmenta PFK1 in proces po katerem 48 kDa fragment v celicah glive A. niger verjetno nastane s posttranslacijsko modifikacijo (Mesojednik, 2003). Nedavno smo ugotovili, da gre v primeru izolata iz glive Aspergillus niger za protein katerega podenota ima molsko težo 49 kDa in ne 48 kDa, bolj natačno pa smo opisali tudi posttranslacijsko modifikacijo in osnovno encimsko kinetiko (Mesojednik in Legiša, 2005). Z in vitro eksperimentom smo dokazali, da fragment takoj po proteolitični razgradnji ni aktiven in se ponovno aktivira šele po fosforilaciji proteinske molekule s cAMP-odvisno proteinsko kinazo. Študij kinetike krajšega fragmenta PFK1 izoliranega iz celic glive Aspergillus niger je pokazal, da je encim rezistenten na inhibicijo s citratom (Mlakar, diplomsko delo), negativno delovanje molekul ATP pa uspešno prepreči prisotnost fruktoze-2,6-difosfata (Mesojednok in Legiša, 2005).

V literaturi ni zaslediti opisa, da bi se PFK1 katerega koli eukarionstkega organizma lahko in vivo posttranslacijsko modificirala ter tako ohranila pozitivno in izgubila negativno regulacijo. Izgleda, da je krajši fragment PFK1 pri glivi Aspergillus niger, glede na svoje kinetičnie lastnosti najbolj učinkovita do sedaj opisana oblika PFK1 encima.

Da bi se izognili zapleteni posttranslacijski modifikaciji, smo poskušali krajši fragment PFK1 pripraviti iz skrajšanega genapjkA. Po preizkusu serije različno dolgih genov, skrajšanih na 3' koncu kodirajoče verige, smo po transformaciji skrajšanega t-pfkA gena v celice glive A. niger in po inducirani fosforilaciji, uspeli v homogenatu detektirati aktivnost PFK1, ki je karakteristična za PFK1 fragment (M. Capuder, 2004). V celicah smo fosforilacijo izzvali z dodatkom Na-azida, ki je znan inhibitor toka elektronov preko citohromske verige. Rezultat te

-4inhibicije je prekinjena sinteza molekul ATP, kar ima za posledico zmanjšano aktivnost transmembranskih protonskih črpalk (H⁺ATPaz), zastajanje protonov v celicah pa povzroči padec intracelulame pH vrednosti. Znano je, da glive na kopičenje protonov v celicah pogosto odgovorijo s sintezo signalne molekule cAMP, kar inducira fosforilacijo PFK1 fragmenta s cAMP-odvisno proteinsko kinazo, to pa končno povzroči aktivacijo encima.

Čeprav krajši fragment PFK1 lahko celice in vivo sintetizirajo iz skrajšanega gena, pa encim prvotno ni aktiven. Aktivira se šele po fosforilaciji proteinske molekule, ki jo katalizira predhodno aktivirana cAMP-odvisna proteinska kinaza, kar je pogojeno z dvigom koncentracije cAMP v celicah. Za dvig nivoja cikličnega AMP, kot sekundarnega prenašalva signalov, so potrebne določene stresne spremembe v okolju/gojišču, ali pa moramo dvig cAMP inducirati umetno, z dodatkom specifičnih molekrl v gojišče, ki aktivirajo adenilat ciklazo. Kot nam je znano pride do spontanega padca intracelulame pH vrednosti le pri enem od sevov glive Aspergittus niger (A60), kjer se krajši fragment lahko tudi spontano aktivira. Pri drugem sevu (Al 58) iste vrste pa kljub enakim pogojem rasti do indukcije ne pride, saj so tu prisotne močnejše H^4--ATPaze, ki preprečijo padec pH vrednosti v celicah, s tem pa tudi sintezo signalne molekule cAMP (Jerneje in Legiša, 2004). Pri nekaterih drugih mikroorganizmih poznamo mehanizme, ki sprožijo spontano sintezo cAMP ter aktivacijo proteinskih kinaz, ki bi lahko aktivirale krajši fragment PFK1, vendar pa takšni pogoji velikokrat niso združljivi z optimalnimi pogoji za sintezo biotehnoloških produktov in zato v praksi neuporabni.

Potrebi po fosforilaciji proteinske molekule za aktivacijo encima bi se lahko ognili z vnosom specifičnih mutacij.

V literaturi je zaslediti nekaj člankov, ki opisujejo spremenjene kinetične lastnosti PFK1 encima po induciranih spremembah v zaporedju nukeotidnih baz - mutacijah. Vendar pa so avtoiji uporabljali tehniko ciljanih mutacij prvenstveno pri študiju določevanja alosteričnih mest predvsem pri vezavi različnih efektoijev. Najlepši prikaz takšnega študija je zaobjet v članku Li et al., 1999, kjer opisujejo določitev vezalnih mest za citrat kot inhibitor zajčje fosfofrukto-l-kinaze in pregledni članek Kemp in Gunasekera, 2002, ki govori o evoluciji alosteričnih Ugandskih mestih na sesalčjih fosfoffukto-l-kinazah. Z mutacijami so tudi preučevali delovanje prokarijontskih PFK1 encimov, in sicer pri bakteriji E. coli (Wang in Kemp, 2001). Vendar pa z mutacijami do sedaj še niso poizkušali spreminjati fosforilacijskih mest na proteinu PFK1, kar bi pripeljalo do rezistence encima na kovalentno regulacijo s kinazami. Regulacijo encimske molekule s fosforilacijo in vpliv mutacij v fosforilacijski regiji

-5na spremembo regulatomih lastnosti pa so bolj temeljito študirali pri PFK1 sorodnem encimu, to je 6-fosfofrukto-2-kinaza/fruktoza-2,6-bifosfataza (Kurland et al., 1992; Kurland in Pilkis, 1995), vendar pa je ta encim le posredno udeležen pri glikolizi.

Tudi ob pregledu patentnih prijav in podeljenih patentnih zahtevkov ni bilo zaslediti dokumentov, ki bi se nanašali na PFK1 encim s spremenjenimi kinetičnimi lastnostmi in, ki bi mu neposredno aktivnost takoj po sintezi encimske molekule omogočale šele mutacije v fosforilacijski regiji.

Glede na znano stanje tehnike, predstavljen problem sinteze aktivnega fragmenta PFK1, ki ima boljše encimske karakteristike, ni zadovoljivo rešen. Naloga in cilj izuma je rešiti predstavljen problem s postopkom, ki zaobide potrebo po fosforilaciji proteinske molekule za njeno aktivacijo in omogoča in vivo sintezo aktivnega proteina neposredno iz modificiranega m\-pfkA gena.

Da bi dosegli čim hitrejšo sintezo končnih biotehnoloških produktov, bi v produkcijskih mikrobnih celicah morali imeti popolnoma deregulirano glikolizo, kar bi lahko dosegli s prisotnostjo modificirane 6-fosfoffukto-l-kinaze (PFK1), ki bi bila neobčutljiva na inhibicijo s citratom in molekulami ATP, po drugi strani pa bi obdržala pozitivne lastnosti regulacije encima, tako da bi prisotnost določenih efektorjev povečala njeno aktivnost. Aktivni krajši fragment PFK1 lahko pripravimo iz mutiranega skrajšanega gena mt-pfkA.

Po izumu je naloga rešena z neodvisnimi patentnimi zahtevki.

Izum se nanaša na mutiran gen, ki kodira aktiven krajši fragment encima 6fosfofrukto-l-kinaze, pri katerem za aktivacijo ni potrebna fosforilacija proteinske molekule, katerega molska masa ene podenote je večja od 30 in manjša od 55 kDa, za katerega je značilno, da encimska aktivnost krajšega fragmenta ni pomembno inhibirana s citronsko kislino in solmi citronske kisline ter molekulam ATP. Izum se sklicuje na mutiran gen, ki kodira krajši fragment, za katerega je značilno, daje takoj po sintezi aktiven, da njegova encimska aktivnost ni pomembno inhibirana v območju nad 0 mM do 15 mM citronske kisline in solmi citronske kisline ter koncentracijami ATP do 1,5 mM ob prisotnosti fruktoze-2,6-difosfata. Izum se nanaša na modificirani gen, ki kodira nastanek aktivnega krajšega fragmenta PFK1, ki se v prisotnosti citronske kisline in/ali njenih soli ter molekulami ATP še vedno aktivira z nekaterimi celični metaboliti, kot so fruktoza-2,6-bifosfat, amonijevi ioni in AMP. Omenjeni

-6krajši fragment predstavlja proteinski preostanek, ki ne vsebuje N- in/ali C terminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Predstavljen izum je zasnovan na odkritju, da mutirani gen, ki kodira aktiven krajši fragment 6-fosfofrukto-l-kinaze in le ta ni bistveno inhibiran s citronsko kislino in/ali solmi citronske kisline ter molekulami ATP, z vnosom v celico poveča hitrost sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov.

Na podlagi teh odkritij je izum tudi postopek, ki vključuje uporabo mutiranega gena za krajši PFK1 fragment, oziroma vnos homolognega ali heterolognega rekombinantnega gena v celico in s tem povečanje hitrosti sinteze primarnih in sekundarnih metabolitov zaradi povečanja hitrosti glikolize, ki ni podvržena inhibiciji s citronsko kislino in/ali solmi le te ter molekulami ATP.

OPIS SLIK

Slika 1: PFK1 specifične aktivnosti v homogenatih izmeijene pri izhodnem sevu glive Aspergilus niger (A645, ki izhaja iz seva Al58) in dveh transformantah (Tl2 in Tl4) z integriranim t-pfkA genom pred in po indukciji fosforilacije z dodatkom azida.

Slika 2: PFK1 specifične aktivnosti v homogenatih izmeijene pri izhodnem sevu glive Aspergilus niger (A645, ki izhaja iz seva A158), T12 transformanti z integriranim skrajšanim tpfkA. genom in transformanti An-TEGI-23 z integriranim mutiranim skrajšanim vcA-pfkk genom. Gojišču ni bil dodan azid.

Slika 3: Izločanje citronske kisline v gojišče pri sevih glive Aspergilus niger transformiranih s skrajšanim t-pfkk genom. Slika 3a transformanti pripravljeni iz A645 kot izhodnim sevom, ki izvira iz Al 58 in (slika 3b) transformanti pripravljeni na sevu A60 kot starševskem sevu.

Slika 4: Izločanje citronske kisline v gojišče pri transformantah glive Aspergilus niger z integriranim mutiranim skrajšanim mt-pjkA genom. Kot izhodni sev je bil vzet avksotrofni sev (A645), ki izvira iz seva A158.

Skila 5: Izločanje α-amilaz pri izhodnem sevu glive A. niger (Al 58) in transformanti

An-TEGI-23 na gojišču, ki vsebuje škrob (amilozo) kot edini vir ogljika. Po treh dneh rasti smo preostali škrob obarvali z jodovico. Okoli kolonije transformante An-TEGI 23 se vidi

-Ίneobarvan del gojišča, kjer so encimi (a-amilaze) škrob razgradili. Pri izhodnem sevu ni razbarvane cone okoli kolonije.

Slika 6: Alfa-amilolitične aktivnosti pri izhodnem sevu glive A. niger (Al 58) in transformanti An-TEGI-23 izmerjene v filtratu gojišča, ki vsebuje škrob kot edini vir ogljika.

Slika 7: Izločanje itakonske kisline v gojišče pri transformantah glive Aspergillus terreus z integriranim mutiranim skrajšanim vcA-pjkk genom (AT-TEGI1), integriranim skrajšanim genom ί-pfkk (AT-44) in izhodnim sevom Al 56.

DEFINICIJE

Okrajšava PFK1 se nanaša na encim 6-fosfofrukto-l-kinazo (EC 2.7.1.11)

Izraz krajši fragment se nanaša na protein, katerega število aminokislinskih ostankov je manjše, kot pri proteinu iz katerega izhaja.

Izraz krajši fragment PFK1 se nanaša na PFK1 protein, ki nosi zapis za 6fosfofrukto-l-kinazo, katerega število aminokislinskih ostankov je manjše, kot pri izvornem encimu 6-fosfoffukto-l-kinazi, ki se nahaja v živi celici, ki ni genetsko spremenjena.

OkrajšavapfkA se nanaša na gen, ki kodira encim 6-fosfofrukto-l-kinazo.

Okrajšava t-pfkk se nanaša na skrajšani gen pfkA, katerega število deoksinukleotidov je manjše, kot pri izvornem pfkk genu in, ki kodira nastanek krajšega fragmenta PFK1, katerega število aminokislinskih ostankov je manjše, kot pri PFK1 proteinu iz katerega izhaja.

Izraz mutacija se nanaša na dedno spremembo v zaporedju nukletitov v določenem genu.

Izraz mutiran pfkA gen se nanaša na spremembo enega ali več nukletoditov, kjerkoli v pfkk genu, ki omogoči spremembo v zaporedju amino kislinskih ostankov kjerkoli v sintetiziranem PFK1 proteinu.

Izraz mutiran mt-pj%A gen se nanaša na spremembo enega ali več nukleotidov kjerkoli v skrajšanem t-pfkk genu, ki kodira nastanek spremenjenega krajšega fragmenta PFK1, ki ima spremenjenega enega ali več aminokislinskih ostankov kjerkoli v proteinu.

-8Izraz 6-fosfofrukto-l-kinaza se nanaša na encim, ki ob prisotnosti adenozin trifosfata in magnezijevih ionov ireverzibilno pretvarja fruktozo-6-fosfat v fruktozo-1,6-difosfat in je encim v procesu glikolize.

Izraz inhibicija s citronsko kislino se nanaša na negativni vpliv citronske kisline in soli citronske kisline kot so citrati na encimsko aktivnost 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Izraz inhibicija z ATP se nanaša na negativni vpliv molekul ATP, na encimsko aktivnost 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Izraz aktivacija se nanaša na povečanje aktivnosti encima nad osnovno vrednost ob prisotnosti aktivacijskih komponent: kot so celični metaboliti, na primer ffuktoza-2,6-bifosfat in amonijevi ioni in AMP.

Izraz N- in/ali C terminalni del proteina se sklicuje na del proteina od amino (NH2-) končnega ostanka, oziroma začetka proteina proti notranjosti proteina in od notranjosti proteina do karboksilnega (-COOH) končnega ostanka, oziroma zaključka proteina.

Izraz posttranslacijska modifikacija se nanaša na spremembo osnovne aminokislinske sekvence proteina s skrajšanjem proteina s proteazami oziroma z adicijo spojin na aminokislinsko sekvenco, kot je na primer dodatek fosfata s fosforilacijo s proteinsko kinazo. Posttranslacijake modifikacije so opisane v strokovni literaturi.

Izraz metaboliti se nanaša na produkte celičnega metabolizma.

Izraz »anaplerotske reakcije« senanaša na procese, ki vodijo do povečanja koncentracije intermediatov cikla trikarboksilnih kislin.

Izraz izvorni ali nativni encim oziroma gen se nanaša na encim 6-fosfofrukto-lkinazo in gen encima, kije prvotno prisoten v celicah divjega tipa, kije sev prisoten v naravi.

Izraz rekombinantni izvor se nanaša na gen oziroma protein, ki je prilagojen in pridobljen laboratorijsko s tehnikami poznanimi strokovnjakom s področja.

Izraz sintetičnega izvora se nanaša na sintetično pridobljen gen oziroma protein, kije pridobljen laboratorijsko s tehnikami poznanimi strokovnjakom s področja. Sintetični protein lahko predstavlja kombinacijo živalskega in mikrobnega proteina.

Izraz cepitev izvornega gena na 5' in/ali 3' delu se nanaša na odstranitev dela gena od

5' proti notranjosti in/ali odstranitev gena od notranjosti do 3' dela gena. Odstranitev dela gena je opravljena na način poznan strokovnjakom s področja in je lahko opravljen z endonukleazno specifično cepitvijo, nespecifično cepitvijo ali s pomnoževanjem gena s polimerazno verižno

-9reakcijo z uporabo oligonukleotidnih začetnikov, ki so komplementarni genu na mestih, katerih namnožen produkt kodira krajši fragment.

Izraz mutiran homologen rekombinantni gen se nanaša na mutiran gen, ki nosi zapis za mutiran krajši fragment, pripravljen z rekombinantnimi tehnikami in je vnešen v isto vrsto celic, kot izhaja izvorni gen.

Izraz mutiran heterogen rekombinantni gen se nanaša na mutiran gen, ki nosi zapis za mutiran krajši fragment, pripravljen z rekombinantnimi tehnikami in je vnešen v drugo vrsto celic, kot izhaja izvorni gen.

Izum se nanaša na gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment 6fosfofrukto-l-kinaze, ki za pridobitev biološke aktivnosti ne potrebuje fosforilacije proteina in v prisotnosti citronske kisline in/ali soli citronske kisline do koncentracije 15 mM in molekulami ATP do koncentracije 1,5 mM ne izgubi več kot 30 % encimske aktivnosti in ohrani sposobnost aktivacije s ffuktoza-2,6-bifosfatom, amonijevimi ioni in AMP in kateri nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega gen je prisoten v genomu organizmov mikrobnega, živalskega in rastlinskega izvora, prednostno gliv, oziroma filamentoznih gliv in kvasovk prednostno izbranih iz rodov Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Neurospora, prednostno glive Aspergillus niger. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, ki ima molsko maso proteina, ki ga kodira, večjo kot 30 kDa in manjšo od 55 kDa in protein krajšega fragmenta ne vsebuje N- in/ali C- terminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-l-kinaze.

Izum se nanaša na gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment 6fosfofrukto-l-kinaze, ki za pridobitev biološke aktivnosti ne potrebuje fosforilacije proteina in v prisotnosti citronske kisline in/ali soli citronske kisline do koncentracije 15 mM ter molekul ATP do koncentracije 1,5 mM ne izgubi več kot 30 % encimske aktivnosti in ohrani sposobnost aktivacije s fruktoza-2,6-bifosfatom, amonijevimi ioni in AMP in kateri nosi zapis za protein s sekvenco SEQ ID NO:1 ali SEQ ID NO:2, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od proteina kratkega fragmenta PFK ki izvira iz nativnega proteina s sekvenco SEQ ID NO:3, katerega gen s sekvenco SEQ ID NO:4 je prisoten v genomu glive Aspergillus niger in ima molsko maso proteinske podenote, ki ga kodira, večjo kot 30 kDa in manjšo od 55 kDa in protein krajšega fragmenta ne vsebuje N- in/ali C- terminalnega dela izvornega encima 6-fosfofrukto-l-kinaze.

-10Izum se nanaša na ekspresij ski vektor, ki nosi zgoraj imenovani gen, kateri je operativno povezan s kontrolnimi sekvencami, promotorji ali drugimi sekvencami DNA, ki omogočajo ekspresijo proteina, ki je kodiran z imenovanim genom in ekspresij ski vektor omogoča izražanje imenovanega gena v evkariontski gostitelj ski celici ali prokariontski gostitelj ski celici, prednostno živalskih tkivnih kulturah, rastlinskih tkivnih kulturah, filamentoznih glivah, kvasovkah in bakterijah, prednostno v filamentoznih glivah, prednostno iz rodu Aspergillus, Trichoderma, Penicillium in kvasovkah, prednostno iz rodu Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, prednostno v bakterijah iz rodu Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Zymomonas, prednostno v filamentoznih glivah iz rodu Aspergillus, prednostno Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae.

Izum se nanaša na organizme, ki vsebujejo imenovani gen in/ali imenovani ekspresij ski vektor in je imenovani gen in/ali ekspresij ski vektor, ki ustreza imenovanemu organizmu, vstavljen v imenovani organizem z ustrezno tehniko poznano strokovnjakom s področja, na način, ki zagotavlja izražanje imenovanega gena in so organizmi mikrobnega izvora, prednostno filamentozne glive, prednostno iz rodu Aspergillus, Trichoderma, Penicillium in kvasovke prednostno iz rodu Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces oziroma filamentozne glive iz rodu Aspergillus, prednostno Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, bakterije, prednostno iz rodu Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Zymomonas in rastlinskega in živalskega izvora, prednostno tkivne kulture rastlinskega ali živalskega izvora.

Izum se nanaša na uporabo imenovanega gena in/ali ekspresij skega vektorja in/ali imenovanega organizma za dvig metabolnega pretoka preko glikolize in okrepitev anapleroze med procesom pridobivanja bioproduktov, prednostno celične biomase; homolognih in heterolognih proteinov; primarnih metabolitov, kot so etanol, acetat, laktat, organske kisline, amino kisline, polioli; sekundarnih metabolitov, kot so antibiotiki, ergot alkaloidi, statini, vitamini, imunomodulatorji, citostatiki, insekticidi, herbicidi.

Izum se nanaša na postopek priprave bioproduktov, ki vključuje uporabo zgoraj opisanega gena, ki je vgrajen v zgoraj opisan ekspresijski vektor in vstavljen v zgoraj opisan organizem in je imenovan organizem gojen na način, da pride do sinteze bioprodukta.

-11Primeri v nadaljevanju so zgolj informativne narave in služijo pojasnjevanju izuma. V postopkih se lahko uporablja tudi druge ustrezne materiale in metode, ki so poznani strokovnjakom s področja.

1. PRIPRAVA IN PREIZKUS MUTIRANEGA SKRAJŠANEGA GENA mt-p#A

1.1.1. Gojenje glive Aspergillus niger

Spore glive A. niger sev A60 (MZKI), ki so se razvile na poševnem pivinem agarju po 7 dnevni inkubaciji pri 30°C, smo suspendirali v 25 ml sterilne raztopine Tvveena 80 (0,1%). Končna koncentracija spor je bila približno 10⁷ spor na ml.

Za hitro nagojitev biomase smo spore pocepili v kompleksno gojišče, ki je v enem litru vsebovalo: 2 g glukoze, 0,5 g kvasnega ekstrakta, 0,2 g kazeinskega hidrolizata, 6g NaNO_3; 1,5 g KH₂PO₄ 0,5 g MgSO₄ χ 7H₂O, 0,5 g KCI, 10 ml raztopine soli kovin v sledovih (Vishniac in Santer, 1957), pH vrednost 6,0.

Micelij za določevanje encimske kinetike smo izhodni sev in transformante gojili na gojišču, ki je v 1 litru vsebovalo: 20g glukoze, 5g NH₄(SO₄)₂, 5g KH₂PO₄, lg MgSO₄.7H₂O, 0,5g NaCI, 10 mg MnCl₂, 10 mg peptona, pH=6,0.

Vsa gojišča (lOOml) v 500 ml Erlenmeyericah z utori smo pocepili s 5 ml vcepka in inkubirali na stresalniku pri 100 obr./min. in 30°C.

1.1.2. Priprava pyrG' avksotrofnih mutant

Enojne avksotrofne mutante glive Aspergillus niger primerne za homologno transformacijo smo pripravili iz Al 58 seva mikrobiološke zbirke MZKI. Mutante smo pripravili z utišanjem pyrG gena ob uporabi enojne zamenjalne metode, kot je bila predhodno opisana (Rothstein, 1983). Plazmid pGWII, ki smo ga uporabili za utišanje pyrG gena smo pripravili iz plazmida pGW635 (Goosen et al., 198'⁷), ta pa vsebuje integriran pyrG gen glive A. niger v pBluescript KS+ plazmidu (Stratagene, La Jolla, CA). Iz 3,9 kbp dolgega KnpVXbal izreza pGW635 smo odstranili 0,8 kbp dolg fragment Bgfll/ΒαηϊΆΪ, medtem ko smo preostala sosednja območja (KprillBglU - 1,3 kbp in Bam\AXIXba\ - 1,8 kbp) zlepili in vgradili v pBS vektor. Po transformaciji pGWII plazmida v protoplaste, smo le-te regenerirali na minimalnem

-12gojišču ob dodatku 5mM uridina in lmg/ml 5-fluoro-orotske kisline. Regenerirane kolonije smo testirali na avksotroftiost. Avksotrofni mutant pyrG' pripravljen iz A158 seva je dobil oznako A645.

1.1.3. Priprava pMO J004 plazmida

Ekspresijski vektor pMOJ004 .zvira iz pBluescript II KS+ plazmida (Stratagene, La Jolla, CA), ki ima integrirano promrtorsko regijo gena, ki kodira gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (gpdA) in terminatorsko regijo gena, ki kodira glutamin amido transferazo (trpC) glive A. nidulans. Promotor gpdA (Z32524) smo pomnožili s PCR metodo ob uporabi pAN7-l vektoija (Z32698) kot osnove in gpi/A-specifičnih oligonukletidnih začetnikov: 5’GAGCTCGTGACCGGTGACTCTTTC-3’ in 5’TCTAGATGCATATGGGTGATGTCTGCTCAAGC-3’, ki sta istočasno omogočala vgraditev iSXd in Xbal-Ndel restikcijskih mest na 5' koncu. Podobno smo s PCR metodo namnožili tudi trpC terminatorsko regijo (Χ02390) ob uporabi sledečih oligonukleotidnih začetnikov: 5'CCATGGGTCTAGACGGATCCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTC-3’ in 5’GAATTCAAGCTTCCGCGGCCGGGTATTGGGTG-3’, ki sta omogočala vgraditev Xbal BamHl in Xho\ restrikcij skih mest na 5 koncu. PCR produkte smo razrezali s Sstl in Xbal encimi pri pripravi gpdA promotoija in z Xbal in Xhol za trpC terminator. Ob uporabi QIAquick GEL Extraction Kita (Quiage.n) smo po iz agaroznega gela izolirali 0,9 in 0,5 kbp dolge fragmente. Končno smo PCR pn dukte ob uporabi T4 DNA polimeraze (New England Biolabs, Promega) ligirali v razklenjen pBlueScript II KS+ plazmid (Stratagene) in dobili pMOJ004 ekspresijski vektor.

1.1.4. Priprava skrajšanega 1-pjkA gena

Ndel/Apal-ATT-BamUl fragment pfkA gena glive AspergiUus niger (EMBL dostopna št. pfkA Z79690), smo pomnožili s PCR reakcijo ob uporabi sledečih oligonukleotidnih začetnikov: 5'-CCG CGG ATG CAT ATG GCT CCC CCC CAA GC-3' in 5’-TGG ATC CTT ACC CGG GAT CAT AGT GCC GGC A.CA GAC C-3'. Nastali fragment smo subklonirali v plazmid pBluescript II KS+ (pBS, Stratagene, La Jolla, CA), ki je bil razrezan z EcoRV restrikcijskim encimom. Po pomnoževanju pBS-t-#/£A plazmida v E.coli DH5a sevu in izolaciji plazmida z GeneElute Plasmid Mini Prep kitom (Sigma), smo na pozitivno orientiranem plazmidu določili sekvenc > t-pfkA gena (MWG-Biotech, Eberberg, Nemčija), da

-13smo preverili pravilnost pomnoževanja s PCR reakcijo. WeI/BawHI razrez pBS-t-p/fcA smo ustavili v plazmid pET3a za ekspresijo v bakterijskih sistemih in pMOJ004 za ekspresijo v filamentoznih glivah.

Skrajšani gen t-p/kA je sintetiziral protein z 452 amino kislinskimi ostanki in molsko maso približno 49,8 kDa. Protein ima identično amino kislinsko zaporedje na N- terminalnem koncu kot izvorni protein, vendar pa sta amino kislinska ostanka na 451 in 452 mestu umetno dodana zaradi priprave primernega restrikcij skega mesta. Po preverjanju sekvence smo skrajšani t-pfkN gen inserirali v avksotrofni sev (pyrG') glive Aspergillus niger.

1.2.1. Priprava ciljanih mutacij v t-pfkA genu

Na osnovi trodimenzionalne analize zvitja PFK1 proteina in obdelave aminokislinske sekvence z NetPhos 2,0 računalniškim programom, ki pove verjetnost fosforilacije ser/tre ostankov, smo prišli do sklepa, daje za fosforilacijo in aktivacijo krajšega fragmenta PFK1 zelo veijetno odgovorna fosforilacija treoninskega ostanka na 89 mestu od N- terminalnega dela. Z mutacijami smo v t-pfkA genu zamenjali zaporedje nukleotidov tako, da smo v proteinu dobili aminokislinske ostanke, ki so karakteristični za analogno zaporedje v pfkA genu bakterije E.coli. Pri izvedbi ciljanih mutacij smo si pomagali s QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis kitom (Stratagene, La Jolla, CA) ob uporabi sledečih oligonukleotidnih začetnikov: zamenjava T89E, 5' -CCG CC CGC TGC ATG GAG TTC CGT GAG CGC CC-3' in 5’-GG GCG CTC ACG GAA CTC CAT GCA GCG GGC GG-3’; zamenjava G95I, 5'-C CGC TGC ATG GAG TTC CGT GAG CGC CCC ATC CGT CTG CGG G-3' in 5'-C CCG CAG ACG GAT GGG GCG CTC ACG GAA CTC CAT GCA GCG G-3*. Po pomnoževanju pET3a plazmida, ki je nosil mutirani t-pjkA gen, smo določili sekvenco mutiranega \-pjkk gena (MWG-Biotech, Eberberg, Nemčija), da smo preverili pravilnost vnosa ciljanih mutacij s PCR reakcijo. Mutiram i-pfkN gen smo označili z oznako vnt-pfkA.

Na skrajšanem genu 1-pfkA smo s QuikChange II Site directed mutagenesis kitom zamenjali nukleotide v dveh kodonih, ki omogočata insercijo dveh nadomestnih amino kislinskih ostankov, in sicer tako, daje na mestu 89 treonin (T) zamenjan z glutaminsko kislino (E) ter pa na mestu 95 glicin (G) zamenjan z izoleucinom (I). Po preverjanju sekvence mutiranega gena smo konstrukt vgradili v celice glive A. niger.

-141.2.2. Vnos dodatnih mutacij v gen mt-pfkA. Priprava gena Mt-p/£A

Pred vnosom mutiranga t-pfkA gena smo zamenjali še več dodatnih nukleotidov, tako da smo dobili gen, ki kodira spremenjen krajši PFK1 protein glive A. niger, in sicer tako, daje sekvenca 14 amino kislinskih ostankov okoli tarčnega mesta za cAMP-odvisno proteinsko kinazo enaka kot pri bakteriji E. coli. Pri tem smo morali zamenjati nukleotide še za sintezo petih dodatnih aminikislinskih ostankov, kot so podani v tabeli 1.

A.K. ostanek v PFK1 proteinu glive A. niger	Mesto od N- terminalnega dela	Spremenjeni a.k. ostanek v proteinu sintetiziranemu iz Mt-ρ/λΑ gena
Cistein	87	fenilalanin
Metionin	88	prolin
Glutaminska k.	92	Aspartatna k.
Arginin	93	glutaminska k.
Prolin	94	asparagin

Tabela 1: Dodatne zamenjave gensko spremenjenem fragmentu PFK1, kijih omogoča ekspresija gena Mt-/?y%A.

Dodatne mutacije v mt-pfkA genu smo izvedli s PCR metodo dveh prekrivajočih se fragmentov dolžin 297 in 1128 baz, ki tvorita 23 komplementarinih baznih parov. Za pomnožitev obeh fragmentov je matično DNA predstavlja! plazmid pMOJ004-mt-p/£A. Zaradi namena klonirati Mt-pfkA gen v pALTER-Exl plazmid, smo morali ob pomnožitvi večjega fragmenta restrikcij sko mesto /tazzzHI na 3' koncu mt-pfkA gena zamenjati z restrikscijskim mestom Xbal. Za konstrukcijo celotnega Mt-p/kA gena smo nato uporabili PCR ligacijo obeh fragmentov. Uporabljeni oligonukleotidni začetniki so prikazani v tabeli 2.

	Pomnožitev in mutageneza 297 baz dolgega fragmenta
	5 ’ -CC ATCGC ACGC ATATGGCTCC-3 ’
	5 ’ - ATGTTCTCGTC ACGGAACTCGGGG AAGCGGGCGGAACCGATC AAG-3 ’
	Pomnožitev in mutageneza 1128 baz dolgega fragmenta
	5’-CCCGAGTTCCGTGACGAGAACATCCGTCTGCGGGCTGCC-3’
	5’-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCCtGCtATCATAG-3’
	PCR ligacija obeh fragmentov
	5 ’ -CC ATCGC ACGCAT ATGGCTCC-3 ’
	5’-TAGGCGTTTATCGCTGCTTCTAGAGGATCCTTACCCGCtGATCATAG-3’

Tabela 2: Oligonukleotidni začetniki uporabljeni pri pripravi gena Mt-p/fcA.

Gen Mt-#/£A smo ligirali v pALTER-Exl vektor (Promega) pod kontrolo tac promotoija.

Po pomnoževanju pALTER-Exl plazmida, ki je nosil mutirani Mt-/?/fcA gen, smo določili sekvenco Mt-/?/£A gena (MWG-Biotech, Eberberg, Nemčija), da smo preverili pravilnost vnosa ciljanih mutacij s PCR reakcijo.

1.3.1.Transformacija celic glive A. niger s pMOJ004-t-/?J%A in pMOJ004-mt-/?/5fcA plazmidom

Micelij glive A. niger smo dobili s 16-18 urnim gojenjem glive v tekočem kompleksnem gojišču. Protoplaste in kasnejšo transformacijo smo pripravili, kot je bilo opisano predhodno (Kusters-van Someren et al., 1991), s to razliko, da smo namesto litičnega encima Novozyme 234 uporabljali encim Caylase-4 (Cayla, Toulouse, F). Kot selekcijski marker smo uporabljalipyrA gen na pGW635 plazmidu. Za kotransformacijo A645 avksotrofhega seva smo tako uporabljali 1 pg pGW635 DNA in 15 pg pMOJ004-t-/?/£A ali pMOJ004-mt-/y%A, ki je nosil skrajšani gen ali mutirani skrajšani gen za sintezo spremenjenega krajšega fragmenta PFK1. Transformante smo izolirali po ponovni reinokulaciji na trdnem minimalnem gojišču brez prisotnosti uridina.

-161.3.1.1. Analiza po Southem-u

Kromosomalno DNA (3pg) transformant smo razgradili s 30U restikcijskega encima in v končnem volumnu 200μ1 inkubirali preko noči. DNA molekule smo ločili na 0,5% agaroznem gelu (lxTris-acetat-EDTA pufer in etidijev bromid (2pg/ml)) in prenesli na najlonsko membrano (Hybond™-N⁺, Amersham). Eno vijačno DNA smo pričvrstili na membrano z UV svetlobo (Biometra Ti3, Biometra, Goetingen, DE). DNA sondo smo pripravili iz Ndel/Bamlil izreza pMOJ004-p/kA plazmida in jo markirali z BioPrime DNA označevalnim kitom (Life technologies). Kemoluminiscenco smo inducirali s CDP-Star kitom (Roche Applied Science), nato pa membrane izpostavili X-Omat AR filmu (Kodak).

Izolirali smo 17 transformant, ki nosijo integriran skrajšani gen za sintezo kratkega fragmenta PFK1. Analiza po Southemu je pokazala, da pri enajstih transformantah lahko zaznamo različno količino integriranih plazmidov. Ocena števila vgrajenih kopij pri enajstih mutantah je prikazana v tabeli 3.

Delovno ime seva	Izhodni sev (Uridinski avksotrof)	Plazmidi za transformacijo	Število kopij
ANPM 3	Al 58 (A645)	pGW635, pMOJ004-t-p#A	10
ANPM 4	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-p/fcA	9
ANPM5	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-p#A	6
ANPM 9	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-p/fcA	12
ANPM 14	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-p#A	1
ANPM 16	Al58 (A645)	pGW635, pMOJ004- t-p#A	1
ANPM 29	A158 (A645)	pGW635, pMOJ004- t-p/fcA	3
ANPM 30	Al 58 (A645)	pGW635, pMOJ004- i-pfkA	5
ANPM 31	Al 58 (A645)	pGW635, pMOJ004- t-p/kA	12
ANPM 32	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-pfkA	10
ANPM 34	A158(A645)	pGW635, pMOJ004- t-p/kA	10

Tabela 3; Število ocenjenih kopij skrajšanega t-p/kA gena v celokupni DNA izolirani iz transformant, kot je bilo ugotovljeno z metodo po Southemu.

Po kotransformaciji skrajšanega mutiranega gena mt-p/fcA v celice avksotrofnega seva glive

Aspergillus niger smo z analizo po Soutrhemu določili različno število integriranih kopij gena.

Ocena števila vgrajenih kopij je prikazat a v tabeli 4.

-18Delovno ime seva

Izhodni sev (Uridinski Plazmidi za transformacijo avksotrof)

Ocenjeno število kopij

An-TEGIl

An-TEGI4

An-TEGI5

An-TEGI6

An-TEGI12

An-TEGI22

An-TEGI23

A158 (A645)

A158(A645)

Al58 (A645)

Al58 (A645) pGW635, pMOJ004-mt-/?/&A pGW635, pMOJ004-mt-/?XfcA pGW635, pMOJ004-mt-pyfcA pGW635, pMO J004-mt-pykA pGW635, pMOJ004-mt-p/kA pGW635, pMO J004-mt-/?/fcA pGW635, pMOJ004-mt-/?/fcA

Tabela 4: Število ocenjenih kopij mutiranega skrajšanega mt-pjkA gena v celokupni DNA izolirani iz transformant glive A. niger, kot je bilo ugotovljeno iz hibridizacije po Southemu.

1.3.2. Transformacija celic glive Aspergillus terreus s pMOJ004-mt-/?/kA plazmidom

Micelij glive A. terreus smo dobili s 16-18 urnim gojenjem glive v tekočem kompleksnem gojišču. Protoplaste in kasnejšo transformacijo smo pripravili, kot je bilo opisano predhodno (Kusters-van Someren et al., 1991), s to razliko, da smo namesto litičnega encima Novozyme 234 uporabljali encim Caylase-4 (Cayla, Toulouse, F). Transformante glive A. terreus, ki nosijo mt-/y%A gen smo pripravili s ko-transformacijo ob uporabi pMOJ004-mt-p/tA plazmida in pUT720 vektorja, ki nosi zapis za phleomycinsko rezistenco.

-191.3.2.1. Analiza po Southem-u

Izolirali smo pet sevov pri katerih smo s PCR metodo dokazali integriran mt-p/£A gen, kasnejša analiza po Southemu pa je pokazala različno število kopij integriranega plazmidov, kot je razvidno iz tabele 5.

Delovna oznaka seva	Izhodni sev	Plazmidi za transformacijo	Ocenjeno število kopij plazmida v transformantah
At-TEGIl	A156	pUN720(selekcijski marker), pMOJ004-PFK10EI phleomycin	6
At-TEGI2	A156	pUN720(selekcijski marker), pMOJ004-PFK 10EI phleomycin	10
At-TEGI3	A156	pUN720(selekcijski marker), pMOJ004-PFK10EI phleomycin	10
At-TEGI4	A156	pUN720(selekcijski marker), pMOJ004-PFK10EI phleomycin	3
At-TEGI5	A156	pUN720(selekcijski marker), pMOJ004-PFK10EI phleomycin	3

Tabela 5: Število ocenjenih kopij mutiranega skrajšanega mt-p/fcA gena v celokupni DNA izolirani iz transformant glive A. terreus, kot je bilo ugotovljeno iz hibridizacije po Southemu.

1.3.3. Transformacija celic bakterije E. coli sev DF 1020 s pALTER-Exl plazmidom, ki nosi Mt-p/fcA gen

Plazmid pALTER-Exlz Mt-p/fcA genom smo transformirali v E. coli DF 1020 sev, ki ima utišana bakterijskapfkA inpfkR gena. Uspešnost transformacije smo ocenili s sposobnostjo rasti bakterije na selektivnem gojišču. Plazmid pALTER-Exl vsebuje namreč gen za ekspresijo tetraciklinske rezistence v bakterijskih celicah.

-201.4.1. Aktivnost krajšega PFK1 fragmenta sintetiziranega iz t-pfkA gena

Transformante, ki so imele vgrajen ϊ-pfkA gen smo 14 ur submerzno gojili na minimalnem gojišču, kot je opisano v poglavju “gojenje glive Aspergillus niger”. Po tem času smo v gojišče dodali natrijev azid (do končne koncentracije lmM) in kulturo inkubirali dodatnih 15 minut. Azid, kot inhibitor verige elektronskega transporta preko citohromov povzroči v celicah kopičenje protonov, to pa rahel padec intacelulame pH vrednosti, katero mikroorganizem zazna kot stress in naj o odgovori s sintezo signalne molecule c AMP. Ta molekula aktivira c AMP odvisno proteinsko kinazo, ki fosforilira krajši fragment PFK1 sintetiziran iz t-pfkA gena. V homogenatih pripravljenih iz celic, ki imajo prisoten sintetiziran neaktiven krajši fragment PFK1 po inducirani fosforilaciji zaznamo spremenjeno kinetiko PFK1, karakteristično za krajši fragment, medtem ko v homogenatu iz netransformiranih celic, kljub inducirani fosforilaciji, naj ne bi zaznali spremenjene kinetike.

1.4.2. Aktivnost krajšega PFK1 fragmenta sintetiziranega iz mt-p/kA gena

Transformante, ki so imele vgrajen mutiran mt-p/kA gen, ki omogoča sintezo spremenjenega krajšega fragmenta PFK1, smo 14 ur gojili na minimalnem gojišču, kot je opisano v poglavju “gojenje glive Aspergillus niger”. V tem primeru v gojišče nismo dodali natrijevega azida preden smo v homogenatu merili encimsko kinetiko. Dokaz prisotnosti aktivnega krajšega fragmenta PFK1 je bila kinetika karakteristična za krajši fragment PFK1, brez umetno inducirane proteinske fosforilacije.

1.5.1. Encimski testi

1.5.1.1. Priprava homogenata

Po končani fermentaciji smo micelij zbrali s filtriranjem ter ga dobro sprali z ohlajenim 50 mM fosfatnim pufrom, kije vseboval 0,5 mM ditioeritritola in lmM EDTA.

Približno 50 g mokre teže, grobo zmletega, zamrznjenega micelij a, smo dodatno dezintegrirali z 1 minutnim drobljenjem v celičnem homogenizatoiju (Braun, Melsungen), ob občasnem ohlajevanju s suhim ledom. Po odtajanju smo vsebino strtih celic ekstrahirali s 5 ml ohlajenega 50mM fosfatnega pufra, pH=7,8, ob dodatku 0,5 mM ditioeritritola in 10 μΐ

-21mešanice proteaznih inhibitorjev (Sigma). Homogenat smo pri 4°C 15 minut centrifugirali pri 15.000 obr./min. Koncentracija proteinov v supernatantu je znašala več kot 5 mg/ml.

1.5.1.2. Merjenje encimske kine tike

Encimsko kinetiko smo merili spektrofotometrično po delno modificiranem postopku, kot je bil opisan predhodno (Legiša in Mattey, 1988). Reakcijska mešanica je v končnem volumnu 1 ml vsebovala 50 mM Tris-HCl pufer, pH = 7,8. Poleg pufra je sistem za merjenje encimske kinetike vseboval še: 0,5 mM ditioeritritola, 200 mM KC1, 5 mM MgCl₂, 0,2 mM NADH, različne koncentracije ffuktoze-6-fosfata, 20 μΐ encimskega preparata, 2,4 enote trioze3-fosfat izomeraze in glicerol-3-fosfat dehidrogenaze (Sigma), 4,5 enot aldolaze (Sigma) in 1 mM ATP.

Ker so amonijevi ioni močni aktivatorji PFK1, smo pomožne encime (aldolazo, izomerazo in glicerol-3-fosfat dehidrogenazo) predhodno preko noči dializirali v 50 mM TrisHCl pufru, pH 7,8, ki je vseboval 0,5 inM ditiotreitola in 30% glicerola. Tako pripravljeni encimi so v hladnem ostali stabilni nekaj tednov.

Pri določevanju kinetike fragmenta, smo vse meritve izvedli ob prisotnosti albumina v pufru, in sicer v koncentraciji 5mg/ml. Albumin smo pufru dodali tik pred meritvijo.

S ciljem, da bi ločili med aktivnostjo nativnega proteina in krajšega fragmenta PFK1, smo vse meritve encimske kinetike najprej izvedli samo ob dodatku fruktoze 6-fosfata, nato dodanemu 0,1 mM ATP, nadaljnemu dodatku ATP do končne koncentracije lmM in končno dodanim 4 μΜ ffuktoze-2,6-bisfosfata.

1.5.2.Dokaz o sintezi krajšega fragmenta PFK1 neposredno iz skrajšanega t-pfkk gena.

Ker skrajšani gen t-pfkA ne more kodirati sinteze aktivnega krajšega fragmenta, saj proteinska molekula potrebuje fosforilacijo za pridobitev aktivnosti, smo morali fosforilacijo v celicah umetno inducirati. To smo dosegli z dodatkom natrijevega azida v gojišče. Azid, kot inhibitor verige elektronskega transporta preko citohromov povzroči v celicah kopičenje protonov, to pa rahel padec intacelulame pH vrednosti, katero mikroorganizem zazna kot stress in nanjo odgovori s sintezo signalne molecule cAMP. Ta molekula aktivira cAMP odvisno

-22proteinsko kinazo, ki fosforilira krajši fragment PFK1 sintetiziran iz 1-pfkA gena. V homogenatih pripravljenih iz celic, ki imajo prisoten sintetiziran neaktiven krajši fragment PFK1 po inducirani fosforilaciji zaznamo spremenjeno kinetiko PFK1 (Slika 1), karakteristično za krajši fragment, medtem ko v homogenatu pripravljenem iz enako starih netransformiranih celic, kljub inducirani fosforilaciji, ni bilo zaznati spremenjene kinetike. Na enak način smo preizkusili tudi serijo drugih genov, ki so kodirali encime skrajšane na C-terminalnem delu, in sicer z molsko maso od 40 do 52 kDa. Po številu aminokislinskih ostankov so se med seboj razlikovali po 8 enot, vendar pa noben od ostalih genov po transformaciji in inducirani fosforilaciji ni omogočil sinteze aktivnega PFK1 encima s spremenjeno kinetiko.

1.5.3. Dokaz o sintezi aktivnega krajšega fragmenta PFK1 iz mutiranega skrajšanega gena mt-/?#A

Kot dokaz aktivnosti mutiranega krajšega fragmenta PFK1 smo izvedli enak poskus kot pri testiranju nemutiranega krajšega fragmenta, le s to razliko, da pred pripravo homogenata v celicah nismo inducirali fosforilacije z dodatkom azida v gojišče, ampak smo enako stare celice starševskega seva, transformant z inseriranim nemutiranim genom 4-pfkA in transformant z vgrajenim mutiranim genom rrA-pfkA takoj po odstranitvi iz gojišča zamrznili pod tekočim dušikom, desintegrirali in pripravili celični homogenat. Samo v ekstraktu celic transformiranih z mt-p/fcA genom smo uspeli zaznati kinetiko PFK1 karakteristično za spremenjeni krajši fragment PFK1, ki ne potrebuje fosforilacije za indukcijo (Slika 2).

1.5.4. Določanje α-amilolotične aktivnosti v filtratu

Aktivnost α-amilaz smo določali v filtratu gojišča, kot je opisano pod primerom 2.2., in sicer ob uporabi kita za določevanje α-alilaz po Ceralpha metodi (Megazyme, Bray, Irska).

2. PRIMERI

2.1. Test transformantov glive Aspergillus niger na povečano produkcijo citronske kisline

Pri tesu na izločanje citronske kisline smo vse seve glive Aspergillus niger gojili na gojišču, ki je v enem litru vsebovalo: 150 g saharoze, 2,5 g amon sulfata, 0,5g kalijevega

-23dihidrogen fosfata, 250 mg magnezijevega sulfata, 6,5 mg železovega sulfata, 1,3 mg cinkovega sulfata in začetno pH vrednost 2,5.

Vsebnost citronske kisline smo v filtratu gojišča določili po postopku, kot je bil predhodno opisan (Legiša in Jerneje, 2002). Rezultati so povprečje petih paralelk pocepljenih z istim sevom/transformantom.

Vse transformante z vgrajenim nemutiranim t-pfkA genom so v primeijavi s starševskim sevom Al 58 citronsko kislino izločali počasneje in tudi dobitki ob koncu fermentacije so bili nižji (Slika 3a). Sev Al58 glive Aspergillus n^:ger\Q namreč poznan po tem, da ima močno aktivne H⁺ATPaze (Jerneje in Legiša, 2004), ki so sposobne vzdrževati konstantno pH vrednost v celicah (Hesse et al., 2002). Odsotnost padca intracelulame pH vrednosti pri tem sevu ne sproži sinteze cAMP in seveda tudi ne more priti niti do aktivacije cAMP odvisne proteinske kinaze in fosforilacije krajšega fragmenta PFK1, ki je potrebna za njegovo aktivacijo. V nasprotju z Al 58 sevom smo pri transformantah, ki so imele vgrajen ϊ-pfkk gen in so bile pripravljene na drugem sevu glive Aspergillus niger (A60) dobili povečano produkcijo citronske kisline v primerjavi z izhodnim sevom (Slika 3b). Sev A60 je znan po tem, da ima slabše, manj aktivne H⁺ATPaze (Jerneje in Legiša, 2004), kar pripelje do spontanega padca intracelulame pH vrednosti med rastjo v gojišču, ki omogoča kopičenje citronske kisline, indukcije sinteze cAMP in fosforilacije krajšega fragmenta PFK1.

Večina transformantov z vgrajenim mutiranim skrajšanim mt-pfkA genom pa je v primeijavi z izhodnim sevom Al 58 bolje izločala citronsko kislino. Nekateri sevi so dosegali do 50% večjo produktivnost kot starševski sev (Slika 41 in tudi dobitki so bili ob koncu fermentacije bistveno večji. Nekateri sevi z vgrajenim mt-#/%A genom so sicer slabše producirali citronsko kislino. Vendar pa moramo vedeti, da se ob transformaciji plazmidi, ki nosijo mt-pfkA gen vgradijo v kromosom, pri tem pa lahko povzročijo mutacijo. Pri nekaterih transformantah seje zelo verjetno ena od kopij plazmida vgradila na mesto, ki povzroča negativno mutacijo v smislu produckije citronske kisline.

2.2. Test transformantov glive Aspergillus niger na povečano produkcijo a-amilaz

Za test smo uporabili trdno gojišče sledeče sestave: škrob 20g, NaNCb 6,0 g, KH2PO4 1,5 g,

MgSO₄.7H₂O 0,5 g, KC1 0,5 g, EDTA 0,1 g, ZnSO₄44mg, MnCl₂.4H₂O 10 mg, CoC1₂.6 H₂O

3,2 mg, CuSO₄.5 H2O 3,2 mg, (ΝΗ^ΜογίΖ^Α H2O 2,2 mg, CaCl2-2H2O 14,7 mg,

FeSO₄.7H2O 10 mg, dest. H2O do 1000 ml, agar 1,5% (m/v). Agar smo nalili v petrijeve plošče

-24in po strditvi pocepili s 5 μΐ suspenzije spor glive Aspergillus niger (sev Al58) ter transformante An-TEGI23. Po tridnevni inkubaciji na 30°C, smo plošče prelili z jodovico (J₂0,4M/KJ 0,4M) in okoli kolonij izmerili premer zbistritvenih con (Slika 5). Transformante, ki vsebjejo integriran mt-pfkA gen rastejo hitreje, saj je premer kolonije dosegel 26 mm, medtem ko je pri izhodnem sevu kolonija zrasla le do 22 mm. Po obarvanju z jodovico, se ob koloniji s transformanto opazi zbistritveno cono (razgrajeno amilozo), medtem ko pri koloniji izhodnega seva škrob ni razgrajen okoli kolonije, ampak samo v agaiju pod micelijem.

Alfa amilolitično aktivnost smo določevali tudi pri izhodnem sevu glive A. niger (A 15 8) in transformanti z vgrajenim mt-pfkA genom (An-TEGI-23) med submerzno rastjo v gojišču, kot je opisano zgoraj, vendar brez dodatka agarja. Aktivnost v filtratu fermentacijske brozge smo določevali po metodi Ceralpha. Rezultati, ki so povprečje treh paralelk so prikazani v Sliki 6.

2.3. Test transformantov glive Aspergillus terreus na povečano produkcijo itakonske kisline

Pri tesu na izločanje itakonske kisline smo seve glive Aspergillus terreus gojili v produkcijskem gojišču, kot je bilo predhodno opisano (Riscaldati, et al., 2000), in ki je v enem litru vsebovalo: 150 g glukoze, 2,36 g amon sulfata, 0,1 lg kalijevega dihidrogen fosfata, 208 mg magnezijevega sulfata, 130 mg kalcijevega klorida, 74 mg natrijevega klorida ter 0,2 mg CuSC>4.5H₂O, 5,5 mg FeSO4.7H₂O, 0,7 mg MnCl₂.4H₂O, 1,3 mg ZnSC>4.7H2O in začetno pH vrednost 3,4.

Vsebnost itakonske kisline smo v filtratu gojišča določali z ionsko kromatografijo ob uporabi CIM diskov (BIA, Ljubljana, SI) in itakonata/Sigma) kot standarda. Rezultati so povprečje petih paralelk pocepljenih z istim sevom/transformantom. Slika 6 prikazuje vrednosti izločenega itakonata pri izhodnem sevu Al56 in transformanti At-TEGI-1. Pri transformanti, ki vsebuje večje število integriranih genov mt-pfkA, so dobitki itakonske kisline d.o 40% večji.

2.4. Test transformantov bakterije E. coli seva (DF 1020) na rast na specifičnih substratih Izhodne seve in dvojne transformante bekterije E. coli smo gojili na minimalnem gojišču ob dodatku sledečih ogljiko-hidratnih komponent, kot edinih virov ogljika: glukoze, fruktoze, manoze, manitola. V minimalno agamo gojišče smo dodali tudi IPTG, ki omogoča konstitutivno ekspresijo Mt-p/fcA gena. Na sposobnost rasti smo poleg sevov E. Coli DF 1020, ki nosijo

-25'Mt-pfkA gen smo testirali še sledeče E. coli seve: BL21 sev, DF 1020 sev, DF 1020 sev z integriranim nativnim pfkA. genom glive Aspergillus niger, ter DF 1020 sev z integriranim tpfkA genom. Po nekajdnevni inkubaciji pri 35°C smo opazovali rast posameznih kolonij na gojiščih. Rast posameznih kolonij je ocenjena v tabeli 6.

Edini vir ogljika	E. coli BL21	E. coli DF1020	E. coli DF1020 + n- n-pfkA	E. coli DF 1020 + Mt-p/AA
Glukoza	++	+	++	++
Fruktoza	++	+++	+++	+++
Manoza	-H-	-	++	+++
Manitol		-	++	+++

Tabela 6: Rast transformant bakterije E. coli na minimalnih gojiščih z različnimi viri ogljika. Večje število plusov označuje močnejšo rast. Minus pomeni, da sev ni sposoben rasti.

-26SEKVENCE

SEQ ID NO 1

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVYEGYEGLV

NGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMEFRERPIRLRAAKNMVLRGIDALVVC

GGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDMSGTDA

TIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGFVIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVPE

MPPKDGWEDDMCAIITKNRKERGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNLD

TRVTVLGHTQRGGAACAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMPL

MDAVQHTKTVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMRI

GIIHVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDPG#

SEQ ID NO 2

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVYEGYEGLV

NGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMEFRERPGRLRAAKNMVLRGIDALVV

CGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDMSGTD

ATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGFVIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVP

EMPPKDGWEDDMCAIITKNRKERGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNL

DTRVTVLGHTQRGGAACAYDRWLSTLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMP

LMDAVQHTKTVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMR

IGIIHVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDPG#

SEQ ID NO 3

MAPPQAPVQPPKRRRIGVLTSGGDAPGMNGVVRAVVRMAIHSDCEAFAVYEGYEGLV

NGGDMIRQLHWEDVRGWLSRGGTLIGSARCMTFRERPGRLRAAKNMVLRGIDALVV

CGGDGSLTGADVFRSEWPGLLKELVETGELTEEQVKPYQILNIVGLVGSIDNDMSGTD

ATIGCYSSLTRICDAVDDVFDTAFSHQRGFVIEVMGRHCGWLALMSAISTGADWLFVP

EMPPKDGWEDDMCAIITKNRKERGKRRTIVIVAEGAQDRHLNKISSSKIKDILTERLNL

DTRVTVLGHTQRGGAACAYDRWLi>TLQGVEAVRAVLDMKPEAPSPVITIRENKILRMP

LMDAVQHTKTVTKHIQNKEFAEAMALRDSEFKEYHFSYINTSTPDHPKLLLPENKRMR

IGIIHVGAPAGGMNQATRAAVAYCLTRGHTPLAIHNGFPGLCRHYDDTPICSVREVAW

QESDAWVNEGGSDIGINRGLPGDDLATTAKSFKKFGFDALFVVGGFEAFTAVSQLRQ

AREKYPEFKIPMTVLPATISNNVPGTEYSLGSDTCLNTLIDFCDAIRQSASSSRRRVFVIE

-27TQGGKSGYIATTAGLSVGAVAVYIPEEGIDIKMLARDIDFLRDNFARDKGANRAGKIIL

RNECASSTYTTQVVADMIKEEAKGRFESRAAVPGHFQQGGKPSPMDRIRALRMATKC

MLHLESYAGKSADEIAADELSASVIGIKGSQVLFSPMGGETGLEATETDWARRRPKTEF

WLELQDTVNILSGRASVNNATWSCYENAPG#

SEQ ID NO 4

ATGGCTCCCCCCCAAGCTCCCGTGCAACCGCCCAAGAGACGCCGCATCGGTGTCTT

GACCTCTGGTGGCGATGCTCCCGGTATGAACGGTGTCGTCCGGGCCGTCGTCCGGA

TGGCTATCCACTCCGACTGTGAGGCTTTCGCCGTCTACGAAGGTTACGAGGGTCTC

GTCAATGGCGGCGACATGATCCGTCAGCTTCACTGGGAGGATGTTCGCGGCTGGTT

GTCCCGTGGTGGTACCTTGATCGGTTCCGCCCGCTGCATGACCTTCCGTGAGCGCCC

CGGTCGTCTGCGGGCTGCCAAGAACATGGTCCTCCGTGGCATTGACGCCCTTGTCG

TCTGTGGTGGTGATGGCAGTTTGACTGGTGCCGACGTTTTTCGTTCCGAGTGGCCCG

GTCTGTTGAAGGAATTGGTCGAGACGGGCGAGTTGACCGAAGAGCAGGTCAAGCC

ATACCAGATTCTGAACATCGTCGGTTTGGTGGGTTCGATCGATAACGACATGTCCG

GCACCGACGCCACCATCGGTTGCTACTCCTCCCTCACTCGCATCTGTGACGCCGTCG

ACGACGTCTTCGATACTGCCTTTTCCCACCAGCGTGGATTCGTCATTGAGGTCATGG

GTCGTCACTGCGGTTGGCTGGCCTTGATGTCTGCTATCAGTACCGGTGCCGACTGGC

TGTTCGTGCCCGAGATGCCGCCCAAGGACGGATGGGAGGATGACATGTGCGCTATC

ATTACCAAGGTGGGTTGATCGGAACTTGGTGGAGAGAACTCAGAGGCATCACTAA

CTCCCCGCAGAACAGAAAGGAGCGTGGAAAGCGTAGGACGATCGTCATCGTGGCC

GAGGGTGCCCAGGATCGCCATCTCAACAAGATCTCGAGTTCGAAGATCAAGGATAT

TTTGACGGAGCGGTTGAACCTGGATACCCGTGTGACTGTGTTGGGTCACACTCAGA

GAGGTGGAGCCGCCTGTGCGTACGACCGCTGGCTGTCCACACTGCAGGGTGTCGAG

GCTGTCCGCGCGGTGCTGGACATGAAGCCCGAAGCCCCGTCCCCGGTCATCACCAT

CCGTGAGAACAAGATCTTGCGCATGCCGTTGATGGACGCCGTGCAGCACACCAAG

ACTGTCACCAAGCACATTCAGAACAAGGAGTTCGCCGAAGCCATGGCCCTCCGCGA

CTCGGAATTCAAAGAGTACCACTTTTCCTACATCAACACTTCCACGCCCGACCACC

CGAAGCTGCTCCTCCCAGAGAACAAGGTTTGTCGCCACAGTAGCTGCTTCGGTGCT

GAGCTAACAAAAGGCAGAGAATGCGCATCGGTATTATTCACGTTGGCGCCCCCGCT

GGTGGTATGAACCAGGCTACCCGCGCGGCCGTTGCCTACTGCCTGACTCGTGGCCA

CACCCCCCTGGCCATTCACAACGGTTTCCCCGGTCTGTGCCGGCACTATGATGACA

CCCCGATCTGCTCTGTGCGCGAGGTGGCATGGCAGGAATCGGACGCCTGGGTCAAC

-28GAGGGTGGTTCGGATATCGGTACCAACCGTGGTCTGCCCGGCGATGACCTCGCGAC

CACGGCGAAGAGCTTCAAGAAGTTCGGATTCGATGCGTTGTTCGTCGTGGGTGGAT

TTGAGGCGTTCACCGCCGTCAGCCAGCTTCGCCAGGCGCGCGAGAAGTACCCCGAA

TTCAAGATTCCCATGACCGTGCTGCCGGCGACCATTTCCAACAACGTGCCGGGCAC

AGAATACTCTCTGGGTAGCGACACCTGCCTTAACACCTTGATCGACTTCTGCGACG

CCATCCGCCAGTCGGCCTCGTCCTCTCGTCGCCGTGTGTTCGTCATCGAGACGCAGG

GTGGCAAGTCGGGTTACATCGCC/ CGACGGCTGGTCTGTCGGTGGGCGCGGTAGCC

GTGTACATTCCCGAGGAGGGCATCGACATTAAGATGCTGGCCCGCGACATTGACTT

CCTGCGTGACAACTTTGCGCGCGACAAGGGAGCGAACCGCGCCGGTAAGATCATC

CTGCGTAACGAGTGCGCGTCCAGCACGTACACGACACAGGTGGTGGCCGACATGA

TCAAGGAGGAAGCCAAGGGACGTTTCGAGAGTCGTGCGGCGGTGCCGGGACACTT

CCAGCAGGGTGGCAAGCCGTCGCCGATGGACCGTATCCGGGCGTTGCGGATGGCC

ACCAAGTGTATGCTGCACCTGGAGAGCTATGCGGGCAAGTCGGCGGATGAGATTG

CGGCCGATGAGCTGTCTGCGTCGGTCATTGGTATCAAGGGCTCGCAGGTGTTGTTC

TCGCCGATGGGTGGAGAGACCGGCCTGGAGGCGACCGAGACGGACTGGGCGCGCC

GTCGACCCAAGACGGAGTTCTGGCTGGAGCTGCAGGACACGGTGAACATTCTGTCG

GGACGGGCGAGCGTGAACAACGCGACGTGGAGTTGCTATGAGAATGCTCCCGGGT

AA

-29LITERATURA

Arts, E. in ostali. Gen. Microbiol., 133 (1987), s. 1195-1199.

Capuder M. Diplomska naloga. Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerzitetni študijski program biokemija, (2004), 77.

Habison, A. in ostali. M. FEMS Microbiol. Lett. 5 (1979): 39-42.

Habison, A. in ostali. Biochem. J. 209 (1983): 669-676.

Hansen, T. in ostali. Arch. Microbiol. 177 (2002): 401-409.

Hesse S.J.A. in ostali. Eur. J. Biochem. 269 (2002): 3485-3494.

Huse. K. In ostali. FEBS Letts. 234 (1988): 185-188.

Jerneje, K./Legiša M. J. Biotechnol. 112 (2004): 289-297.

Kemp, R. G./ Gunasekera, D. Biochem. 41 (2002): 9426-9430.

Kurland, I.J. in ostali J. Biol. Chem. 267 (1992) 7: 4416-4423.

Kusters-van Someren, M. A., J. A. in ostali. Curr Genet 20 (1991), 293-9.

Kurland, I.J./Pilkis, S. Protein Science 4 (1995): 1023-1037.

Legiša, M./ Mattey M. Enzyme Microbiol. Technol. 10 (1988): 33-36.

Legiša, M./ Benčina, M. FEMS Microbiol. Lett. 188 (1994a): 327-334.

Legiša, M./ Benčina, M. FEMS Microbiol. Lett. 121 (1994b): 129.

Legiša, M./Kidrič, J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 (1989): 453-457.

Laemmli. U.K. Nature 277 (1970): 680-685.

Li, Y. in ostali. Biochem. 38 (1999): 16407-16412.

Mesojednik, S. Diplomska naloga. Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo, (2003), 46.

Mesojednik, S./ Legiša, M. Appl. Environment. Microbiol. 71, 3, 1425-1432.

Mlakar, T. Diplomska naloga, Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Oddelek za biokemijo, (2003), 56.

-30Poorman, R.A. in ostali. Nature 309 (1984): 467-469.

Riscaldati, E. in ostali (2000 J. Biotechnol. 83 (3), 219-230.

Ruijter, G.J.G. in ostali. Biochim. Biophys.Acta 1334 (1997): 317-326.

Schreferl, G. in ostali. J. Bacteriol. 165, 3 (1986), s. 1019-102.

Smerkolj, S. Diplomska naloga. Ljubljana. Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Enota medoddelčnega študija mikrobiologije, (2000), 32.

Valaitis, A.P. in ostali. J. Biol. Chem. 262, 11 (1987): 5044-5048.

Visniac, W. / Souter, M. The Thiobacilli. Bacterial Rev., 21 (1957), 185-213.

Voet, D./ Voet, J. G. Biochemistry. Second edition. New York. Wiley & Sons inc., 1995,1361 Wang, X./Kemp, R.G. Biochemistry, 40 (2001): 3938-3942.

Claims

PATENTNI ZAHTEVKI

1. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment 6-fosfofrukto-l-kinaze, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule in v prisotnosti citronske kisline in/ali soli citronske kisline do koncentracije 15 mM ter molekul ATP do koncentracije 1,5 mM ne izgubi več kot 30 % encimske aktivnosti in ohrani sposobnost aktivacije s fruktoza-2,6-bifosfatom, amonijevimi ioni in AMP in kateri nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega gen je prisoten v genomu organizmov mikrobnega, živalskega in rastlinskega izvora.
2. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, ki je aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po zahtevku 1 označen s tem, daje molska masa proteina, ki ga kodira, večja kot 30 kDa in manjša od 55 kDa.
3. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po zahtevku 1 označen s tem, da protein krajšega fragmenta ne vsebuje N- in/ali Cterminalnega dela izvorne 6-fosfofrukto-1 -kinaze.
4. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, ki je aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po katerem koli zahtevku od 1 do 3 označen s tem, da nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega gen je prisoten v genomu organizmov mikrobnega, živalskega in rastlinskega izvora.
5. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po zahtevku 4 označen s tem, da nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega nativni gen je prisoten v genomu organizmov mikrobnega izvora, prednostno gliv in kvasovk.
6. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, ki je aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po zahtevku 4 označen s tem, da nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega nativni gen je prisoten v genomu gliv, prednostno filamentoznih gliv in kvasovk.

-327. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po zahtevku 4 označen s tem, da nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega nativni gen je prisoten v genomu organizmov filamentoznih gliv, kvasovk, prednostno iz rodov Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Neurospora.
8. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po katerem koli zahtevku od 1 do 3 označen s tem, da nosi zapis za protein, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1, katerega nativni gen je prisoten v genomu filamentoznih gliv, prednostno glive Aspergillus niger.
9. Gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1, kije aktiven takoj po nastanku, zato za svojo aktivacijo ne potrebuje fosforilacije proteinske molekule, po katerem koli zahtevku od 1 do 3 ali 8 označen s tem, da nosi zapis za protein s sekvenco SEQ ID NO:1 ali SEQ ID NO:2, ki se vsaj za eno aminokislino razlikuje od aminokislinskega zaporedja proteina kratkega fragmenta PFK1 ki izvira iz nativnega proteina s sekvenco SEQ ID NO:3, katerega gen s sekvenco SEQ ID NO:4 je prisoten v genomu glive Aspergillus niger.
10. Ekspresijski vektor, ki nosi gen po katerem koli zahtevku od 1 do 9, ki je operativno povezan s kontrolnimi sekvencami, promotorji ali drugimi sekvencami DNA, ki omogočajo ekspresijo gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9.
11. Ekspresijski vektor po zahtevku 10 označen s tem, da omogoča izražanje gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9 v evkariontskih gostitelj skih celicah ali prokariontskih gostitelj skih celicah.
12. Ekspresijski vektor po katerem koli zahtevku od 10 do 11 označen s tem, da omogoča izražanje gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9 v evkariontskih gostitelj skih celicah, prednostno filamentoznih glivah in kvasovkah.
13. Ekspresijski vektor po katerem koli zahtevku od 10 do 12 označen s tem, da omogoča izražanje gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9 v filamentoznih glivah, prednostno iz rodu Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, kvasovkah, prednostno iz rodu Pichia,

Saccharomyces, Schizosaccharomyces in bakterijah iz rodu Acetobacter, Escherichia,

Bacillus, Streptomyces, Zymomonas.

-3314. Ekspresijski vektor po katerem koli zahtevku od 10 do 13 označen s tem, da omogoča izražanje gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9 v filamentoznih glivah iz rodu Aspergillus, prednostno Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae.
15. Organizmi, ki vsebujejo gen, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1 po katerem koli zahtevku od 1 do 9 in/ali ekspresijski vektor po katerem koli zahtevku od 10 do 14 in je imenovani gen in/ali ekspresijski vektor, ki ustreza imenovanemu organizmu, vstavljen v imenovani organizem z ustrezno tehniko poznano strokovnjakom s področja, na način, ki zagotavlja izražanje gena po katerem koli zahtevku od 1 do 9.
16. Organizmi po zahtevku 15 označeni s tem, da so mikrobnega, rastlinskega ali živalskega izvora.
17. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 16 označeni s tem, da so mikrobnega izvora.
18. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 16 označeni s tem, da so tkivne kulture rastlinskega izvora.
19. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 16 označeni s tem, da so tkivne kulture živalskega izvora.
20. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 17 označeni s tem, da so filamentozne glive, kvasovke in bakterije.
21. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 17 označeni s tem, da so filamentozne glive, prednostno iz rodu Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, kvasovke prednostno iz rodu Pichia, Saccharomyces, Schizosac haromyces in bakterije, prednostno iz rodu Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Zymomonas.
22. Organizmi po katerem koli zahtevku od 15 do 17 označeni s tem, da so filamentozne glive iz rodu Aspergillus, prednostno Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae.
23. Uporaba gena, ki nosi zapis za kratek, gensko spremenjeni fragment PFK1 po katerem koli zahtevku od 1 do 9 in/ali ekspresij skega vektorja po katerem koli zahtevku od 10 do 14 in/ali organizma po katerem koli zahtevku od 15 do 22 za dvig metabolnega pretoka preko glikolize in okrepitev anapleroze med procesom pridobivanja bioproduktov.
24. Uporaba po zahtevku 23 označena s tem, da so bioprodukti prednostno celična biomasa;

homologni in heterologni proteini; primarni metaboliti, kot so etanol, acetat, laktat,

-34organske kisline, amino kisline, polioli; sekundami metaboliti, kot so antibiotiki, ergot alkaloidi, statini, vitamini, imunomodulatorji, citostatiki, insekticidi, herbicidi.
25. Postopek priprave bioproduktov, ki vključuje uporabo gena po zahtevku od 1 do 9, kije vgrajen v ekspresijski vektor po zahtevku od 10 do 14 in vstavljen v organizem po zahtevku od 15-22 in je imenovani organizem gojen na način, da omogoča sintezo bioproduktov.