KR20160002692A - 증가된 생산 수율을 갖는 방법에 사용하기 위한 재조합 미생물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 리불로스-1,5-바이포스페이트 카르복실라제 옥시게나제 (루비스코) 및 포스포리불로키나제 (PRK)를 암호화하는 하나 이상의 재조합, 특히 이종, 핵산 서열을 기능적으로 발현하는 재조합 효모 세포, 특히 형질전환 효모 세포에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 재조합 화학영양합성 미생물, 특히 진핵 미생물에서 전자 수용체로서 이산화탄소의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 목적하는 발효 산물을 생산하는 능력을 갖는 재조합 미생물, 미생물에서 이종 펩티드의 기능적 발현, 및 상기 미생물이 사용되는 발효 산물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 효모이다. 본 발명은 추가로 미생물에서 CO2의 용도에 관한 것이다.
미생물 발효 공정은 재생가능한 탄수화물 공급원료로부터 광범위하고 신속하게 팽창하는 범위의 화학적 화합물의 산업적 생산에 적용된다.
특히 혐기적 발효 공정에서, 보조인자 커플 NADH/NAD+의 산화환원 균형은 생산 수율에 중요한 제약을 초래할 수 있다. 이러한 난제는 - 예를 들어 - 생합성 반응에서 형성된 NADH를 재산화시킬 필요의 직접적인 결과로서, 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)에 의한 연료 에탄올의 산업적 생산에서 주된 부산물로서 글리세롤의 형성을 예로 들 수 있다.
사카로마이세스 세레비지에에 의한 에탄올 생산은 현재, 부피 기준으로, 산업적 생물공학에서 단일의 가장 큰 발효 공정이지만, 기타 알코올, 카르복실산, 이소프레노이드, 아미노산 등을 비롯한 다양한 다른 화합물이 산업적 생물공학적 공정에서 현재 생산되고 있다.
유전적 변형에 의해 산업적 생물공학에 사용되는 생물의 발효적 특성을 개선하기 위해 다양한 접근법이 제안되어져 왔다.
국제공개공보 WO 2008/028019는 적어도 하나의 이종 유전자 서열을 갖는 미생물을 사용하여 발효 산물을 형성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 적어도 하나의 탄수화물을 3-포스포글리세레이트로 전환하는 단계 및 이산화탄소를 고정하는 단계를 포함하고, 상기 단계 중 적어도 하나는 적어도 하나의 외인성 효소에 의해 촉매된다. 또한, 상기 공보는 적어도 하나의 당류의 발효를 통해 발효 산물을 형성하는 미생물에 관한 것으로, 상기 미생물은 포스포펜토스 에피머라제, 포스포리불로키나제, 및 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효소를 암호화하는 적어도 하나의 이종 유전자 서열을 포함한다.
예시로서, 이종 PRK 및 이종 루비스코 (Rubisco) 유전자가 도입된 효모가 언급된다. 실시양태에서, 효모는 에탄올 생산을 위해 사용된다. 그 결과 (도 24)는 형질전환 대조군 및 변형된 균주에 대한 농도를 나타낸다. 변형된 효모 및 그의 상응하는 대조군 사이에는 눈에 띌만한 차이가 없다. 생산 수율, 당 전환, 효모 성장, 에탄올의 증발 속도에 대한 정보는 확인되지 않는다. 따라서, 상기 결과가 에탄올 수율의 개선과 관련하여 확정적이지 않은 것은 명백하다.
또한 국제공개공보 WO 2008/028019는 글리세롤 부산물 형성의 문제에 대해 아무런 언급이 없다.
다른 화합물에도 해당되지만, 에탄올의 효모-기반 생산의 화학량론에 관한 주된 난제는, 특히 혐기적 및 산소-제한된 조건하에서 또는 다르게는 호흡이 제한되거나 부재인 조건하에서 일반적으로 상당한 양의 NADH-의존성 부산물 (특히, 글리세롤)이 부산물로서 형성된다는 것이다. 전형적인 산업적 에탄올 공정에서, 당 공급원료의 최대 약 4 wt%가 글리세롤로 전환되는 것으로 추정되고 있다 (Nissen et al. Yeast 16 (2000) 463-474). 혐기적 성장에 이상적인 조건하에서, 글리세롤로의 전환은 심지어 최대 약 10%로 더 높을 수 있다.
혐기적 조건하에서 글리세롤 생산은 주로 산화환원 대사와 연결된다. S. 세레비지에의 혐기적 성장 동안에, 당 이화 (dissimilation)가 알코올 발효를 통해 일어난다. 이 공정에서, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 해당 작용에서 형성된 NADH는, NAD+-의존성 알코올 디히드로게나제에 의한 피루베이트의 에탄올로의 탈카르복실화 작용에 의해 형성된, 아세트알데히드를 전환시킴으로써 재산화된다. 이 산화환원-중성 이화 경로의 고정된 화학량론은, NAD+의 NADH로의 순 환원이 대사의 어느 과정에서 야기되는 경우 문제를 초래한다. 혐기적 조건하에서, S. 세레비지에서의 NADH 재산화는 당의 글리세롤로의 환원에 온전히 의존한다. 글리세롤 형성은, NAD+-의존성 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제에 의해 촉매되는 반응인, 해당 중간물 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)의 글리세롤 3-포스페이트 (글리세롤-3P)로의 환원에 의해 개시된다. 이어서, 이 반응에서 형성된 글리세롤 3-포스페이트는 글리세롤-3-포스파타제에 의해 가수분해되어 글리세롤과 무기 포스페이트를 생성한다. 결과적으로, 글리세롤은 S. 세레비지에에 의한 에탄올의 혐기적 생산 동안에 주된 부산물이고, 이는 당의 에탄올로의 전반적인 전환을 감소시키기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 에탄올 생산 플랜트의 유출물 내 글리세롤의 존재는 폐수 처리를 위한 비용을 부과할 수 있다.
국제공개공보 WO 2011/010923에서, 탄수화물 함유 공급원료 - 특히, 리그노셀룰로스 바이오매스로부터 유래한 탄수화물 공급원료 - 로부터 에탄올의 생산을 위한 공정에서 NADH-관련 부산물 (글리세롤) 형성, 글리세롤 부-생산 문제는 NAD+-의존성 아세틸화 아세트알데히드 디히드로게나제 (EC 1.2.1.10) 활성을 암호화하는 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 포함하는 재조합 효모 세포를 제공함으로써 해결되는데, 상기 세포는 NADH-의존성 글리세롤 합성에 요구되는 효소 활성이 결여된 것이거나, 그의 상응하는 야생형 효모 세포에 비해 NADH-의존성 글리세롤 합성과 관련된 감소된 효소 활성을 갖는 것 중 하나이다. 글리세롤 생산을 본질적으로 제거하는데 효과적인 세포가 기술된다. 또한, 상기 세포는 NADH를 재산화시키기 위해 아세테이트를 사용하고, 그로 인해 아세테이트-함유 공급원료가 사용되는 경우 에탄올 수율이 증가될 수 있다.
국제공개공보 WO 2011/010923에 기술된 공정이 유리하다고 하더라도, 특히 NADH-의존성 부산물 합성을 제거하거나 적어도 감소시키기 위해 아세테이트 또는 기타 유기 전자 수용체 분자를 필요로 하지 않으면서, 에탄올과 같은 유용한 유기 화합물의 생산을 허용하는 대안이 계속 요구되고 있다. 이는 NADH-의존성 부산물 합성이 감소되고, 또한 아세테이트의 부재하에서 증가된 생산 수율을 가능케 하는 미생물을 제공하는 것이 특히 바람직할 수 있다.
본 발명자들은 기질로 이산화탄소를 사용하는, 종속영양, 화학영양합성 미생물 세포, 특히 효모 세포에서 재조합 효소를 기능적으로 발현시킴으로써 NADH-의존성 부산물 합성을 감소 또는 심지어 제거할 수 있음을 인식하였다.
따라서, 본 발명은 재조합 화학종속영양 미생물, 특히 진핵 미생물에서 전자 수용체로서 이산화탄소의 사용에 관한 것이다. 본원에서 화학영양합성, (화학)종속영양 및 독립영양과 기타 분류의 미생물은 재조합 이전의 미생물에 관한 것으로, 이들 생물은 본원에서 또한 숙주로 언급된다. 예를 들어, 본원에 기술된 재조합을 적용하는 것은 재조합된 생물이 이산화탄소를 이화할 수 있고, 그로써 (부분적으로) (화학)독립영양이 되게 하기 때문에, 본원에 기술된 바와 같은 재조합을 통해, 독립영양이 아닌 본래 (화학)종속영양생물인, 숙주 미생물은 재조합 이후에 독립영양이 될 수 있다.
유리하게, 본 발명자들은 산물 수율을 개선시키고/거나 부산물 형성을 감소시키는데 사용될 수 있는 종속영양 산업 미생물의 대사 공학에서 보조기질로서 이산화탄소를 도입하는 방식을 발견하였다.
특히, 본 발명자들은 진핵 미생물, 특히 효모 세포에서 2종의 특정 그룹으로부터 적어도 2개의 재조합 효소를 기능적으로 발현시킴으로써 NADH-의존성 부산물 합성을 감소시키거나 심지어 제거할 수 있으며, 상기 효소의 하나는 이산화탄소가 사용되는 반응을 촉매하고 다른 효소는 보조인자로서 ATP를 사용한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 또한 재조합, 특히 형질전환, 진핵 미생물, 특히 효모 세포에 관한 것이고, 상기 미생물은 리불로스-1,5-바이포스페이트 카르복실라제 옥시게나제 (루비스코) 및 포스포리불로키나제 (PRK)를 암호화하는 하나 이상의 재조합, 특히 이종, 핵산 서열을 기능적으로 발현한다.
본 발명에 따른 미생물은 루비스코 및 PRK의 존재하에서 NADH-의존성 부산물 형성 (글리세롤)이 상당히 감소하거나 본질적으로 완전히 제거되고 목적하는 산물의 생산이 증가될 수 있다는 점에서 유리한 것으로 밝혀졌다. 이산화탄소가 NADH에 대한 전자 수용체로 작용하고, 그로 인해 더 적은 NADH가 부산물 (예컨대, 글리세롤)로의 반응에 이용가능한 것으로 생각된다.
본 발명은 또한 유기 화합물, 특히 알코올, 유기산 또는 아미노산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 탄소원, 특히 탄수화물 또는 기타 유기 탄소원을 미생물을 이용하여 전환시키고, 그로써 유기 화합물을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 미생물은 본 발명에 따른 미생물이거나 재조합 화학영양합성 또는 화학종속영양 미생물에서 이산화탄소가 전자 수용체로 사용되는 미생물이다.
본 발명은 또한 효모 세포에서 이종 폴리펩티드의 기능적 발현을 위한 벡터에 관한 것으로, 여기서 상기 벡터는 루비스코 및 PRK를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고, 상기 루비스코는 탄소 고정 활성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "하나" ("a" 또는 "an")는 달리 특정되지 않는 한 "적어도 하나"로 정의된다.
단수로 명사 (예컨대, 화합물, 첨가제 등)가 언급될 때, 복수가 포함되는 것을 의미한다. 따라서, 특정 모이어티, 예컨대 "화합물"이 언급될 때, 이는 달리 언급이 없는 한, 상기 모이어티의 "적어도 하나", 예컨대 "적어도 하나의 화합물"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 '또는'은 '및/또는'인 것으로 이해된다.
그의 몇몇 이성체가 존재하는 (예컨대, D 및 L 거울상이성체) 화합물이 언급될 때, 원칙적으로 상기 화합물은 본 발명의 특정 방법에 사용될 수 있는 해당 화합물의 모든 거울상이성체, 부분입체이성체 및 시스/트랜스 이성체를 포함하고; 특히 이러한 화합물이 언급될 때, 이는 천연 이성체(들)를 포함한다.
명확하고 간결한 설명을 목적으로 같거나 별개의 실시양태의 일부로서 특징이 본원에 기술되지만, 그러나 발명의 범주가 기술된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 실시양태를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이 구절에 비추어 출원된 제1항의 변이체가 출원된 명세서에 기술된 다른 특징과, 특히 일반적으로 발명의 가장 바람직한 실시양태와 관련된 청구항인, 종속항에 기술된 특징과 조합될 수 있음은 통상의 기술자에게 자명하다.
용어 '발효', '발효적' 등은 고전적 의미, 즉 공정이 혐기적 조건하에서 수행되거나 수행되었다는 것을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다. 혐기적 조건은 임의의 산소가 없거나 본질적으로 산소가 효모 세포, 특히 효모 세포에 의해 소모되지 않는 상태로 정의되고, 일반적으로 5 mmol/l.h 미만의 산소 소비, 특히 2.5 mmol/l.h 미만의 산소 소비, 또는 1 mmol/l.h 미만의 산소 소비에 상응한다. 더욱 바람직하게, 0 mmol/L/h가 소비된다 (즉, 산소 소비가 검출가능하지 않음). 이는 일반적으로 배양 브로쓰에서 5% 미만의 공기 포화의 용존 산소 농도, 특히 1% 미만의 공기 포화의 용존 산소 농도, 또는 0.2% 미만의 공기 포화의 용존 산소 농도에 상응한다.
용어 "효모" 또는 "효모 세포"는 대부분이 아스코마이코타 (Ascomycota) 및 바시도마이코타 (Basidiomycota) 문에 속하는 계통발생적으로 다양한 그룹의 단일-세포 진균을 지칭한다. 출아 효모 ("진성 효모")는 가장 잘 알려진 종으로 사카로마이세스 세레비지에가 포함되는, 사카로마이세탈레스 (Saccharomycetales) 목으로 분류된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "재조합 (세포)" 또는 "재조합 미생물"은 재조합 DNA 기술(들) 및/또는 기타 돌연변이 기술(들)을 이용한 하나 이상의 유전적 변형의 결과인 핵산을 함유하는 균주 (세포)를 지칭한다. 특히, 재조합 세포는 상응하는 야생형 세포에는 존재하지 않는 핵산을 포함할 수 있는데, 상기 핵산은 재조합 DNA 기술을 이용하여 그 균주 (세포) 내로 도입되었거나, 상기 야생형에 존재하지 않는 핵산은 상기 야생형에 존재하는 핵산 서열 (예컨대, 야생형 폴리펩티드를 암호화하는 유전자)에서 하나 이상의 돌연변이 - 예를 들어 재조합 DNA 기술 또는 UV 조사와 같은 기타 돌연변이화 기술-의 결과이고, 또는 유전자의 핵산 서열은 또 다른 세포 구획으로 (이를 암호화하는) 폴리펩티드 산물을 표적하도록 변형되었다. 또한, 용어 "재조합 (세포)"은 특히 DNA 서열이 재조합 DNA 기술을 이용하여 제거되었던 균주 (세포)와 관련된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "형질전환 (효모) 세포"는, 그 균주 (세포)에는 자연적으로 발생하지 않으며, 그 균주 (세포)에 재조합 DNA 기술을 이용하여 도입된 핵산을 함유하는 균주 (세포), 즉 재조합 세포를 지칭한다.
단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 용어 "변이된"은 야생형 또는 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드 서열에서 적어도 하나의 아미노산이 이들 아미노산을 암호화하는 핵산의 돌연변이화를 통해 다른 아미노산으로 대체되고, 삽입되거나 그 서열로부터 제거되었던 것을 의미한다. 돌연변이화는 당해 기술분야에 잘 알려진 방법으로, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989)]에 기술된 바와 같은 PCR을 이용한 부위-지정 돌연변이화 또는 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이화가 포함된다. 유전자와 관련하여 본원에 사용된 바와 같이 용어 "변이된"은 그 유전자의 핵산 서열 또는 그의 조절 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드가 돌연변이화에 의해 다른 뉴클레오티드로 대체되거나 또는 그 서열로부터 제거되어 질적 또는 양적으로 변형된 기능을 갖는 단백질 서열의 전사 또는 그 유전자의 넉-아웃을 초래하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유전자"는 핵산 중합효소, 진핵생물에서, RNA 중합효소 II에 대한 주형을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 유전자는 mRNAs로 전사되고 이후에 이는 단백질로 번역된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "핵산"은 단일 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나로, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체, 즉 폴리뉴클레오티드에 대한 언급을 포함하고, 달리 제한되지 않는 한, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 (예컨대, 펩티드 핵산)와 유사한 방식으로 단일-가닥 핵산에 혼성화하는 점에서 천연 뉴클레오티드의 본질적인 특성을 갖는 공지의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 고유의 또는 이종의 구조 또는 조절 유전자의 전장 또는 하부서열일 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 상기 용어는 특정된 서열뿐만 아니라 이의 상보적인 서열에 대한 언급을 포함한다. 따라서, 안정성 또는 기타 이유로 변형된 골격을 갖는 DNAs 또는 RNAs는 상기 용어가 본원에 의도되는 경우 "폴리뉴클레오티드"이다. 또한, 단지 2개의 예를 들면, 이노신과 같은 비정상 염기 또는 트리틸화 (tritylated) 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNAs 또는 RNAs는, 상기 용어가 본원에 사용되는 경우 폴리뉴클레오티드이다. 매우 다양한 변형이 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 수많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA에 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 본원에 사용되는 한 용어 폴리뉴클레오티드는 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 이들 중에서 무엇보다도, 단순하고 복잡한 세포를 포함하는, 바이러스 및 세포 특유의 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 상기 용어들은 자연적으로 발생하는 아미노산 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연적으로 발생하는 아미노산의 인위적 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 자연적으로 발생하는 아미노산의 이러한 유사체의 본질적인 특성은, 단백질 내로 도입될 때, 단백질이 전적으로 자연적으로 발생하는 아미노산으로 이루어지지만 동일한 단백질에 대해 촉발되는 항체에 대해 특이적으로 반응성이라는 것이다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 글리코실화, 지질 부착, 황산화 (sulphation), 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 수산화 및 ADP-리보실화를 비롯한 변형을 또한 포함한다.
효소가 효소 분류 (EC)와 관련하여 언급될 때, 효소 분류는 효소가 생화학 및 분자생물학 국제연합의 명명법 위원회 (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, NC-IUBMB)에 의해 제공된 효소 명명법을 기준으로 분류되거나 분류될 수 있는 분류이고, 이 명명법은 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/에서 확인할 수 있다. (아직) 특정 분류로 분류되지는 않았지만 이와 같이 분류될 수 있는 기타 적합한 효소가 포함되는 것으로 의도된다.
만약 본원에서 단백질 또는 핵산 서열, 예컨대 유전자가 등재 번호를 참조로 언급되는 경우, 이 번호는 특히, 달리 특정되지 않는 한, www.ncbi.nlm.nih.gov / (13 July 2009에 이용가능한 바와 같음)를 통해 확인될 수 있는 바와 같은 서열을 갖는 단백질 또는 핵산 서열 (유전자)를 지칭하는 것으로 사용된다.
유전자 코드를 참조하여, 본원에서 폴리펩티드를 또한 암호화하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 용어 "보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 아미노산 서열의 동일하거나 보존적으로 변형된 변이체를 암호화하는 그러한 핵산을 지칭한다. 용어 "유전자 코드의 축퇴성"은 수많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 암호화하는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 암호화되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 상응하는 코돈의 어느 하나로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이체는 "침묵 변이체"이고 보존적으로 변형된 변이이 일종을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 서열 (예컨대, 서열번호: X)을 갖는 폴리펩티드의 용어 "기능적 동족체" (또는 줄여서 "동족체")는 하나 이상의 아미노산이 치환되고, 결손되고, 부가되고/되거나 삽입되는 조건 부로 상기 특정 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭하고, 이 폴리펩티드는 기질 전환에 대해 (정성적으로) 동일한 효소적 기능성을 갖는다. 이 기능성은 효모에서 동족체의 발현을 위한 발현 벡터를 포함하는 재조합 효모 세포를 포함하는 어세이 시스템의 사용에 의해 검사될 수 있는데, 상기 발현 벡터는 효모에서 기능성인 프로모터에 작동적으로 연결된 이종 핵산 서열을 포함하고, 상기 이종 핵산 서열은 효모 세포에서 아세틸-코엔자임 A를 아세트알데히드로 전환하기 위한 그의 효소적 활성이 검사되는 동족 폴리펩티드를 암호화하며, 상기 전환이 상기 세포에서 일어나는지 여부를 평가한다. 후보 동족체는 인실리코 (in silico) 유사성 분석을 이용하여 동정될 수 있다. 이러한 분석의 구체적인 예시가 WO2009/013159의 실시예 2에 기술된다. 통상의 기술자는 어떻게 적합한 후보 동종체를 찾아낼 수 있는지를 이로부터 유도할 수 있고, 선택적으로 코돈 (쌍) 최적화 시, 상기에 기술된 바와 같은 적합한 어세이를 이용하여 이러한 후보 동족체의 요구된 기능성을 검사할 수 있을 것이다. 적합한 동족체는 특정 폴리펩티드와 50% 초과, 바람직하게는 60% 이상, 특히 적어도 70%, 더욱 특히 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 유사한 아미노산 서열을 갖고 요구된 효소 기능성을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 핵산 서열과 관련하여, 용어 기능성 동족체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 또 하나의 핵산 서열과는 다르고 동일한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것을 의미한다.
서열 동일성은, 서열들을 비교하여 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 아미노산 (폴리펩티드 또는 단백질) 서열 또는 2개 이상의 핵산 (폴리뉴클레오티드) 서열 사이의 관계로서 본원에 정의된다. 일반적으로, 서열 동일성 또는 유사성은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 비교된다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한, 경우에 따라서는, 이러한 서열의 가닥들 (strings) 사이의 일치에 의해 결정되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 특정 수준의 유사성을 나타낼 때 동종인 것으로 일컬어진다. 동종인 2개의 서열은 공통의 진화 근원을 나타낸다. 2개의 동종 서열이 밀접하게 관련되어 있거나 더 멀리 관련되어 있는지 여부가, 각각 높거나 낮은, "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 유사성"으로 나타낸다. 논쟁의 여지가 있지만, "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 유사성", "상동성의 수준" 또는 "퍼센트 상동성"은 종종 상호 교환적으로 사용된다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 몇몇 상이한 컴퓨터 프로그램이 2개의 서열을 정렬시키고 두 서열 사이의 상동성을 결정하는데 이용가능하다는 사실을 인식할 것이다 (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley). 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 2개 서열의 정렬을 위한 니들만 및 원치 알고리즘 (Needleman and Wunsch algorithm)을 이용하여 결정될 수 있다 (Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). 이 알고리즘은 아미노산 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열을 정렬시킨다. 니들만-원치 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE에서 시행되어 왔다. 본 발명의 목적을 위하여, EMBOSS 패키지로부터의 NEEDLE 프로그램을 사용하였다 (버전 2.8.0 이상, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우, EBLOSUM62가 대입 매트릭스 (substitution matrix)를 위해 사용된다. 뉴클레오티드 서열의 경우, EDNAFULL이 사용된다. 기타 매트릭스가 특정될 수 있다. 아미노산 서열의 정렬을 위해 사용된 임의의 매개변수는 10의 갭-오픈 페널티 (gap-open penalty) 및 0.5의 갭 신장 페널티 (gap extension penalty)이다. 통상의 기술자는 상이한 알고리즘을 사용하는 경우 모든 이러한 상이한 매개변수가 약간 다른 결과를 생성할 것이지만 두 서열의 전반적인 퍼센트 동일성은 유의미하게 변경되지 않을 것임을 인식할 것이다.
포괄적
상동성
정의
상동성 또는 동일성은 임의의 갭 또는 신장을 포함하는 전체 정렬된 영역에 걸쳐서 2개의 완전한 서열 사이에서 동일한 일치의 비율이다. 2개의 정렬된 서열 사이의 상동성 또는 동일성은 다음과 같이 계산된다: 두 서열 모두에서 동일한 아미노산을 나타내는 정렬 내 상응하는 위치의 개수를 갭을 포함하는 정렬의 전체 길이로 나눔. 본원에서와 같이 정의된 동일성은 NEEDLE로부터 입수할 수 있고 "동일성 (IDENTITY)"으로서 컴퓨터의 출력에 표시된다.
가장 긴 동일성 정의
2개의 정렬된 서열 사이의 상동성 또는 동일성은 다음과 같이 계산된다: 두 서열 모두에서 동일한 아미노산을 나타내는 정렬 내 상응하는 위치의 개수를 정렬 내 갭의 총 개수를 제한 후 정렬의 전체 길이로 나눔. 본원에서와 같이 정의된 동일성은 NOBRIEF 옵션을 이용하여 NEEDLE로부터 입수할 수 있고 "가장 긴-동일성 (longest-identity)"으로 프로그램의 출력에 표시된다.
본원에 기술된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변이체는 또한 본원에 특별하게 기술된 (예컨대, 서열목록에서) 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 비해 하나 또는 수개의 치환, 삽입 및/또는 결손을 갖는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로서 정의될 수 있다.
선택적으로, 아미노산 유사성의 정도를 측정함에 있어서, 통상의 기술자는 또한 통상의 기술자에게 자명할 것인 바와 같이, 소위 "보존적" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 쓰레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 일군의 아미노산은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 및 아스파라긴-글루타민이다. 본원에 기술된 아미노산 서열의 치환 가능한 변이체는 기술된 서열 내 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 위치에 다른 잔기가 삽입되어진 것들이다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 보존적이다. 각각의 자연적으로 발생하는 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala에서 ser; Arg에서 lys; Asn에서 gln 또는 his; Asp에서 glu; Cys에서 ser 또는 ala; Gln에서 asn; Glu에서 asp; Gly에서 pro; His에서 asn 또는 gln; Ile에서 leu 또는 val; Leu에서 ile 또는 val; Lys에서 arg; gln에서 glu; Met에서 leu 또는 ile; Phe에서 met, leu 또는 tyr; Ser에서 thr; Thr에서 ser; Trp에서 tyr; Tyr에서 trp 또는 phe; 및, Val에서 ile 또는 leu.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 또한 온건한, 또는 바람직하게는 엄격한 혼성화 조건하에서 각각 본원에 기술된 특정 뉴클레오티드 서열의 일부와 혼성화하는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. 엄격한 혼성화 조건은 적어도 약 25개, 바람직하게는 약 50개 뉴클레오티드, 75개 또는 100개 및 가장 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드의 핵산 서열이 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6× SSC 또는 상응하는 이온 강도를 갖는 임의의 기타 용액 중에서 약 65℃의 온도에서 혼성화를 가능케 하고, 약 0.1 M 염 이하를 포함하는 용액, 바람직하게는 0.2× SSC 또는 상응하는 이온 강도를 갖는 임의의 기타 용액 중에서 65℃에서 세척되는 조건으로 본원에서 정의된다. 바람직하게는, 혼성화는 밤새, 즉 적어도 10시간 동안 수행되고, 바람직하게 세척은 적어도 2회의 세척 용액의 교환과 함께 적어도 1시간 동안 수행된다. 이러한 조건은 일반적으로 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 혼성화를 가능케 할 것이다.
온건한 조건은 본원에서 적어도 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드의 핵산 서열이 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6× SSC 또는 상응하는 이온 강도를 갖는 임의의 기타 용액 중에서 45℃의 온도에서 혼성화를 가능케 하고, 약 1 M 염을 포함하는 용액, 바람직하게는 6× SSC 또는 상응하는 이온 강도를 갖는 임의의 기타 용액 중에서 실온에서 세척되는 조건으로 정의된다. 바람직하게는, 혼성화는 밤새, 즉 적어도 10시간 동안 수행되고, 바람직하게 세척은 적어도 2회의 세척 용액의 교환과 함께 적어도 1시간 동안 수행된다. 이러한 조건은 일반적으로 최대 50%의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 혼성화를 가능케 할 것이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 50%와 90% 사이에서 동일성이 달라지는 서열을 특이적으로 동정하기 위하여 이러한 혼성화 조건을 변경할 수 있을 것이다.
"발현"은 구조 RNA (rRNA, tRNA) 또는 전령 RNA (mRNA)로의 유전자의 전사 및 단백질로의 후속 번역을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 또는 단백질과 관련하여 "이종"은 외래 종으로부터 유래하거나, 만약 동일한 종이라면, 의도적인 인간 간섭에 의해 조성물 내 그의 천연형 및/또는 게놈 유전자좌로부터 실질적으로 변형된 형태인 핵산 또는 단백질이다. 예를 들어, 이종 구조 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 그 구조 유전자가 유래된 것과 다른 종 유래이거나, 만약 동일한 종이라면, 하나 또는 둘 모두는 이들의 원형 형태로부터 실질적으로 변형된다. 이종 단백질은 외래 종으로부터 유래할 수 있고, 만약 동일한 종이라면, 의도적인 인간 간섭에 의해 그의 원형 형태로부터 실질적으로 변형된다.
용어 "이종 발현"은 숙주 세포에서 이종 핵산의 발현을 지칭한다. 효모와 같은 진핵 숙주 세포 시스템에서 이종 단백질의 발현은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 특이적 활성을 갖는 효소를 암호화하는 유전자의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 이러한 진핵 시스템에서 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질전환된/형질감염된 효모 세포가 효소의 발현을 위한 발현 시스템으로 이용될 수 있다. 효모에서 이종 단백질의 발현은 잘 알려져 있다. 문헌 [Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]은 효모에서 단백질을 발현시키는데 이용가능한 다양한 방법을 기술하고 있는 잘 알려진 논문이다. 2종의 광범위하게 사용되는 효모는 사카로마이세스 세레비지에 및 피치아 파스토리스이다. 사카로마이세스 및 피치아에서의 발현을 위한 벡터, 균주 및 프로토콜은 당해 기술분야에 알려져 있고 상업적인 공급자 (예컨대, 인비트로젠)로부터 이용가능하다. 적합한 벡터는 일반적으로 필요에 따라 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 알코올 옥시다제를 비롯한, 프로모터, 및 복제 기원, 종결 서열 등과 같은 발현 조절 서열을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터"는 (구조) 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 (구조) 유전자의 전사 개시 부위에 근접한, 유전자의 5'-영역에 위치한다. 프로모터 서열은 구성적, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 만약 프로모터가 유도성 프로모터라면, 전사 속도는 유도제에 반응하여 증가한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "벡터"는 상염색체 발현 벡터 및 염색체 내로의 통합을 위해 사용되는 통합 벡터에 대한 언급을 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 그의 전사를 위해 제공하는 부가적인 핵산 분절(즉, 작동 가능하게 연결된)의 조절하에서 관심 폴리펩티드를 암호화하는 분절을 포함하는, 선형 또는 원형의 DNA 분자를 지칭한다. 이러한 부가적인 분절은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래하거나, 이들 모두의 요소를 포함할 수 있다. 특히 발현 벡터는 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된: (a) 효모-인식 전사 및 번역 개시 영역, (b) 관심 폴리펩티드에 대한 코딩 서열, 및 (c) 효모-인식 전사 및 번역 종결 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다. "플라스미드"는 미생물의 게놈 내로 통합되지 않으며 통상 자연계에서 원형인 자율적으로 복제하는 염색체외성 DNA를 지칭한다.
"통합 벡터"는 미생물의 게놈 내로 통합될 수 있고 관심 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 안정적인 유전을 제공하는, 선형 또는 원형의 DNA 분자를 지칭한다. 통합 벡터는 일반적으로 그의 전사를 위해 제공하는 부가적인 핵산 분절(즉, 작동 가능하게 연결된)의 조절하에서 관심 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 하나 이상의 분절을 포함한다. 이러한 부가적인 분절은 프로모터 및 종결 서열과, 일반적으로 상동 재조합의 공정에 의해 표적 세포의 게놈 내로 관심 유전자의 통합을 유도하는 하나 이상의 분절을 포함할 수 있다. 전형적으로, 통합 벡터는 표적 세포 내로 전달될 수 있지만, 그 생물 내에서 비기능적인 복제단위 (replicon)를 갖는 것일 것이다. 관심 유전자를 포함하는 분절의 통합은 적절한 마커가 상기 분절 내 포함된다면 선택될 수 있다.
"숙주 세포"은 벡터를 함유하고 그 벡터의 복제 및/또는 발현을 지지하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 대장균 (E. coli)과 같은 원핵 세포, 또는 효모, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 악티노마이세탈레스 (Actinomycetales) 목의 진핵 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "형질전환" 및 "형질전환하는"은, 예를 들어 직접 흡수, 형질도입, f-교배 (f-mating) 또는 전기천공과 같이, 삽입을 위해 사용된 방법과는 무관하게, 숙주 세포 내로 외인성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합된 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지될 수 있고, 또는 대안적으로, 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다.
미생물은 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 베티커스 (Saccharomyces beticus), 사카로마이세스 페르멘타티 (Saccharomyces fermentati), 사카로마이세스 파라독서스 (Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 우바룸 (Saccharomyces uvarum) 및 사카로마이세스 베이아누스 (Saccharomyces bayanus)와 같은 사카로마이세라세아에 (Saccharomyceraceae); 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 쉬조사카로마이세스 자포니카스 (Schizosaccharomyces japonicas), 쉬조사카로마이세스 옥토스포루스 (Schizosaccharomyces octosporus) 및 쉬조사카로마이세스 크리오필루스 (Schizosaccharomyces cryophilus)와 같은 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces); 토룰라스포라 델부르에키 (Torulaspora delbrueckii)와 같은 토룰라스포라 (Torulaspora); 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)와 같은 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces); 피치아 스티피티스 (Pichia stipitis), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 피치아 안구스타 (Pichia angusta)와 같은 피치아 (Pichia); 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailii)와 같은 자이고사카로마이세스 ( Zygosaccharomyces); 브레타노마이세스 인테르메디우스 (Brettanomyces intermedius), 브레타노마이세스 브뤼셀렌시스 (Brettanomyces bruxellensis), 브레타노마이세스 아노말러스 (Brettanomyces anomalus), 브레타노마이세스 커스터시아누스 (Brettanomyces custersianus), 브레타노마이세스 나아르데넨시스 (Brettanomyces naardenensis), 브레타노마이세스 나누스 (Brettanomyces nanus), 데케라 브뤼셀렌시스 (Dekkera bruxellensis) 및 데케라 아노말라 (Dekkera anomala)와 같은 브레타노마이세스 (Brettanomyces); 메츠크니코위아 (Metschnikowia), 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis)와 같은 이사첸키아 (Issatchenkia), 클로에케라 아피쿨라타 (Kloeckera apiculata)와 같은 클로에케라 (Kloeckera); 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans)와 같은 아우레오바시디움 (Aureobasidium)의 군으로부터 선택된다.
매우 바람직한 실시양태에서, 미생물은 사카로마이세라세아에로부터 선택되는 효모 세포이다. 특히, 사카로마이세스 세레비지에 세포를 이용하여 우수한 결과가 달성되었다. 루비스코 및 PRK 부재의 유사한 세포에 비해 NADH-의존성 부산물 형성 (글리세롤)이 약 90% 감소하고 목적 산물 (에탄올)의 수율이 약 10% 증가한, 알코올 (에탄올)을 제조하는 방법에서 본 발명에 따른 이러한 세포를 사용하는 것이 가능한 것으로 확인되었다.
루비스코는 원칙적으로 진핵 및 원핵 루비스코로부터 선택될 수 있다.
루비스코는 바람직하게는 비-광합성 생물 유래이다. 특히, 루비스코는 화학무기독립영양 (chemolithoautotrophic) 미생물 유래일 수 있다.
세균 루비스코를 이용하여 우수한 결과를 달성하였다. 바람직하게는, 상기 세균 루비스코는 티오바실러스 (Thiobacillus), 특히 화학무기독립영양균인 티오바실러스 데니트리피칸스 (Thiobacillus denitrificans)로부터 유래한다.
루비스코는 단일-소단위 루비스코 또는 하나 이상의 소단위를 갖는 루비스코일 수 있다. 특히, 단일-소단위 루비스코를 이용하여 우수한 결과가 달성되었다.
특히 II-형 루비스코, 더욱 특히 CbbM을 이용하여 우수한 결과가 달성되었다.
서열번호: 2는 본 발명에 따라 특히 바람직한 루비스코의 서열을 나타낸다. 이는 티오바실러스 데니트리피칸스의 cbbM 유전자에 의해 암호화된다. 이 루비스코에 대한 바람직한 대안은 이 루비스코의 기능적 동족체로서, 특히 이러한 기능적 동족체는 서열번호: 2와 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 적합한 천연 루비스코 폴리펩티드가 표 1에 나타낸다.
표 1:
루비스코
폴리펩티드
본 발명에 따라서, 루비스코는 적어도 관심 화합물을 제조하기 위한 산업적 공정에 사용하는 동안 미생물에서 기능적으로 발현된다.
본원에서 효소 활성이 본 발명의 형질전환된 (재조합) 숙주 세포에서 활성 형태로 충분한 수준으로 발현되는 가능성을 증가시키기 위하여, 본 발명의 루비스코 효소 및 기타 효소 (하기 참조) 뿐만 아니라, 이들 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 당해의 숙주 세포의 것들에 이들의 코돈 용법을 최적화하는데 적합하다. 숙주 세포의 코돈 용법에 대한 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 적응성은 코돈 적응 지수 (codon adaptation index, CAI)로 표현될 수 있다. 코돈 적응 지수는 특정 숙주 세포 또는 생물에서 높게 발현된 유전자의 코돈 용법에 대한 유전자의 코돈 용법의 상대적 적응성의 측정으로서 본원에 정의된다. 각 코돈의 상대적 적응성 (w)은 동일한 아미노산에 대해 가장 빈번한 코돈에 대한, 각 코돈의 용법의 비율이다. CAI 지수는 이들 상대적 적응성 값의 기하학적 수단으로서 정의된다. 비-동의어 코돈 및 종결 코돈 (유전자 코드에 의존적임)은 배제된다. CAI 값은 0 내지 1의 범위이고, 더 높은 값은 가장 빈번한 코돈의 더 높은 비율을 나타낸다 (문헌 [Sharp and Li , 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; 및 Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8): 2242-51] 참조). 적응된 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 CAI를 갖는다. 예컨대 S. 세레비지에 세포와 같은 당해 진균 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었던 서열이 가장 바람직하다.
바람직하게는, 기능적으로 발현된 루비스코는 적어도 1 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1의 세포 추출물에 의한 리불로스-1,5-비스포스페이트-의존성 14C-중탄산염 도입의 속도로 정의되는 활성, 특히 적어도 2 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1의 활성, 더욱 특히 적어도 4 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1의 활성을 갖는다. 상기 활성의 상한치는 중요하지 않다. 실제로, 상기 활성은 약 200 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1 이하, 특히 25 nmol.min-1.(mg 단백질)-1, 더욱 특히 15 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1 이하, 예컨대 약 10 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1 이하일 수 있다. 본원에서 루비스코의 활성에 대해 언급될 때, 특히 30℃에서의 활성을 의미한다. 이 루비스코 활성을 측정하기 위한 어세이를 위한 조건은 하기 실시예 (실시예 4)에서 확인되는 바와 같다.
본 발명에 따른 기능적으로 발현된 포스포리불로키나제 (PRK, (EC 2.7.1.19))는 하기 화학적 반응을 촉매할 수 있다:
따라서, 이 효소의 2가지 기질은 ATP와 D-리불로스 5-포스페이트인 반면, 이의 2가지 산물은 ADP와 D-리불로스 1,5-비스포스페이트이다.
PRK는 트랜스퍼라제 패밀리, 구체적으로 수용체로서 알코올 그룹을 갖는 인-함유 그룹을 전달하는 것들 (포스포트랜스퍼라제)에 속한다. 이 효소 분류의 계통명은 ATP:D-리불로스-5-포스페이트 1-포스포트랜스퍼라제이다. 통상적으로 사용되는 다른 명칭에는 포스포펜토키나제, 리불로스-5-포스페이트 키나제, 포스포펜토키나제, 포스포리불로키나제 (인산화), 5-포스포리불로스 키나제, 리불로스 포스페이트 키나제, PKK, PRuK, 및 PRK가 포함된다. 이 효소는 탄소 고정에 참여한다.
PRK는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래할 수 있다. 진핵생물로부터 유래하는 PRK를 사용하여 우수한 결과를 달성하였다. 바람직하게는, 진핵 PRK는 석죽목 (Caryophyllales), 특히 비듬과 (Amaranthaceae)로부터 선택되는 식물, 특히 시금치 (Spinacia)로부터 유래한다.
시금치 유래의 PRK에 대한 바람직한 대안으로서, 시금치 유래의 PRK의 기능적 동족체, 특히 서열번호: 4와 적어도 70%, 75%, 80%. 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 기능적 동족체가 존재할 수 있다.
적합한 천연 PRK 폴리펩티드가 표 2에 나타낸다.
표 2: 발현에 적합한 천연 PRK 폴리펩티드
유리한 실시양태에서, 재조합 미생물은 하나 이상의 이종 원핵 또는 진핵 분자 샤페론을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는데, 이는 - 발현될 때 - 상기 미생물에서 효소, 특히 루비스코 및 PRK의 적어도 하나와 기능적으로 상호작용할 수 있다.
샤페로닌은 다른 단백질의 정확한 중첩에 유리한 조건을 제공하여, 응집을 방지하는 단백질이다. 새롭게 만들어진 단백질은 일반적으로 선형 가닥의 아미노산으로부터 3차원 형태로 중첩되어야 한다. 샤페로닌은 분자 샤페론이라는 단백질 중첩을 보조하는 큰 분류의 분자에 속한다. 단백질을 중첩시키기 위한 에너지는 아데노신 트리포스페이트 (ATP)에 의해 공급된다. 본원에 유용한 샤페론에 대한 리뷰 문헌은 Yebenes (2001)에 의해 작성된 것이다 ["Chaperonins: two rings for folding"; Hugo Yebenes et al. Trends in Biochemical Sciences, August 2011, Vol. 36, No. 8].
바람직한 실시양태에서, 샤페론 또는 샤페론들은 세균, 바람직하게는 에스케리치아 (Escherichia), 특히 대장균 유래이다. 대장균 유래 GroEL 및 GroEs는 특히 본 발명에 따른 미생물에서 암호화될 수 있다. 기타 바람직한 샤페론은 사카로마이세스 유래 샤페론이고, 특히 사카로마이세스 세레비지에 Hsp10 및 Hsp60이다. 만약 샤페론이 미토콘드리아와 같은 소기관에서 자연적으로 발현된다면 (예를 들면 사카로마이세스 세레비지에의 Hsp60 및 Hsp10), 세포질로의 재배치가, 예컨대 샤페로닌의 고유 신호 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
진핵생물에서 단백질 Hsp60 및 Hsp10은 각각 GroEL 및 GroES와 구조적 및 기능적으로 거의 동일하다. 따라서, 임의의 진핵 세포 유래의 Hsp60 및 Hsp10이 루비스코에 대한 샤페론으로 제공될 수 있음이 고려된다. 문헌 [Zeilstra-Ryalls J, Fayet O, Georgopoulos C (1991). "The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins". Annu Rev Microbiol. 45: 301-25. doi:10.1146/annurev.mi.45.100191.001505. PMID 1683763, 및d Horwich AL, Fenton WA, Chapman E, Farr GW (2007). "Two Families of Chaperonin: Physiology and Mechanism". Annu Rev Cell Dev Biol. 23: 115-45. doi:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123555. PMID 17489689] 참조.
이종 샤페론 GroEL 및 GroES 둘 모두를 포함하는 재조합 효모 세포를 이용하여 특히 우수한 결과를 달성하였다.
GroEL의 바람직한 대안으로서 GroEL의 기능적 동족체, 특히 서열번호: 10과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 기능적 동족체가 존재할 수 있다.
서열번호: 10에 동종인 적합한 천연 샤페론 폴리펩티드가 표 3에 제시된다.
표 3: 발현에 적합한 서열번호: 10 폴리펩티드에 동종인 천연 샤페론
GroES의 바람직한 대안으로서 GroES의 기능적 동족체, 특히 서열번호: 12와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 기능적 동족체가 존재할 수 있다.
서열번호: 12에 동종인 적합한 천연 샤페론 폴리펩티드가 표 4에 제시된다.
표 4: 발현에 적합한 서열번호: 12 폴리펩티드에 동종인 천연 샤페론
일 실시양태에서, 표 3으로부터의 10 kDa 샤페론은 숙주에서의 발현을 위해 동일한 생물 속 또는 종의 표 4로부터의 매칭 60 kDa 샤페론과 조합된다.
예를 들어: 매칭 >gi|189190432|ref|XP_001931555.1| 열 충격 단백질 60, 미토콘드리아 전구체 [피레노포라 트리티치-레펜티스 (Pyrenophora tritici-repentis) Pt-1C-BFP]와 함께 발현된 >gi|189189366|ref|XP_001931022.1|:71-168 10 kDa 샤페로닌 [피레노포라 트리티치-레펜티스].
동일한 생물원으로 유사하게 만들어진 표 3 및 4로부터의 모든 조합이 또한 발현을 위해 통상의 기술자에게 이용가능하다.
또한, 통상의 기술자는 하나의 생물 유래의 표 3으로부터 샤페론을 다른 생물 유래의 표 4로부터의 샤페론과 조합할 수 있고, 또는 GroES를 표 3으로부터의 샤페론과 조합할 수 있으며, 또는 GroEL을 표 4로부터의 샤페론과 조합할 수 있다.
상기로부터 수반되는 바와 같이, 본 발명은 또한 미생물을 이용하여 탄소원을 전환함으로써 유기 화합물을 형성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 호기적, 산소-제한적 또는 혐기적 조건하에서 수행될 수 있다.
본 발명은 특히 NADH 의존적 부산물, 구체적으로 글리세롤의 형성을, 상응하는 참조 균주에서의 상기 생산에 비해 최대 100%, 최대 99%, 또는 최대 90% 감소시키는 것을 가능케 한다. NADH 의존적 부산물 형성은 상응하는 참조 균주에 비해 바람직하게는 10% 초과, 특히 적어도 20%, 더욱 특히 적어도 50% 감소한다. NADH 의존적 부산물 생산은 바람직하게는 10 내지 100%, 특히 20 내지 95%, 더욱 특히 50 내지 90% 감소한다.
루비스코, 또는 CO2 (및 또 다른 기질)로부터 유기 화합물의 형성을 촉매할 수 있는 또 다른 효소 또는 전자 수용체로서 CO2의 기능을 촉매하는 또 다른 효소가 사용되는 바람직한 방법에서, 반응 배지 내 이산화탄소 농도는 반응 조건하에서 CO2 포화 농도의 적어도 5%, 특히 상기 CO2 포화 농도의 적어도 10%, 더욱 특히 상기 CO2 포화 농도의 적어도 20%이다. 이는 생산 수율 측면에서 특히 유리하다. 반응 배지는 CO2 농도로 과포화되거나, CO2 농도로 포화될 수 있고 또는 포화 농도 미만의 농도를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, CO2 농도는 포화 농도의 75 % 이하, 특히 상기 포화 농도의 50% 이하이고, 더욱 특히 CO2 포화 농도의 25% 이하이다.
특정 실시양태에서, 이산화탄소 또는 그의 일부는 미생물에 의해 인시츄 (in situ)로 형성된다. 필요에 따라, 본 방법은, 일반적으로 CO2 또는 CO2 함유 가스 혼합물, 예를 들어 CO2/질소 혼합물을 이용한 폭기에 의해, 반응 시스템에 외부 CO2를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 특히 외부 CO2의 첨가는, 만약 CO2 가 인시츄로 전혀 또는 충분하게 형성되지 않는 경우, 목적하는 농도 범위 내로 CO2를 (증가 또는) 유지하기 위해 사용된다.
유체 내 CO2 농도의 측정은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 일상적인 기술 이내이다. 실제로, 통상의 기술자는 일상적으로 효모의 배양액 위의 가스상에서 CO2 농도를 측정할 수 있다 (만약 배지가 가스로 정화되는 경우에는, 실제로 오프-가스). 이는 RosemountNGA200000 가스 분석기 (Rosemount Analytical, Orrvile, USA)와 같은 상업적 가스 분석기를 사용하여 일상적으로 측정될 수 있다. 이어서 액체상 중의 농도 (포화 농도 대비)가 가스에서 측정된 값으로부터, 본 방법에서 기존 조건 하의 CO2 포화 농도 및 헨리 상수 (Henri coefficients)로부터 계산될 수 있다. 이들 매개변수는 편람으로부터 이용가능하거나 일상적으로 결정될 수 있다.
탄소원으로서, 원칙적으로는 미생물이 기질로 사용할 수 있는 임의의 탄소원이 사용될 수 있다. 특히 탄수화물 및 지질 (지방산 포함)의 군으로부터 선택된, 유기 탄소원이 사용될 수 있다. 적합한 탄수화물에는 단당류, 이당류, 및 가수분해 다당류 (예컨대, 가수분해 전분, 리그노셀로로스 가수분해물)가 포함된다. 카르복실산이 존재할 수 있다고 하더라도, 탄소원으로서 아세트산과 같은 카르복실산을 포함할 필요는 없다.
글리세롤 3-포스페이트 포스포히드롤라제의 억제에 의한 세포의 게놈 내 간섭을 요구하고/하거나 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 암호화하지 않으면서, 개선된 에탄올 수율 및 감소된 글리세롤 생산이 예컨대, 야생형 효모에 비해 실현가능하다는 것은, 특히 본 발명의 이점이다.
여전히 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 효모 세포는 글리세롤 3-포스페이트 포스포히드롤라제를 암호화하고/하거나 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제 유전자를 암호화하는 하나 이상의 내인성 뉴클레오티드 서열의 결손 또는 파괴를 포함할 수 있다.
본원에서 세포 내 NADH-의존성 글리세롤 합성에 요구되는 효소 활성은 감소 또는 제거된다. 이 효소 활성의 감소 또는 제거는, 상기 효소가 야생형에서보다 상당히 더 적게 발현되거나 또는 상기 유전자가 감소된 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하도록, NAD-의존성 글리세롤 3-포스페이트 디히드로게나제 활성 (GPD)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 또는 글리세롤 포스페이트 포스파타제 활성 (GPP)을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 변형함으로써 달성될 수 있다.
이러한 변형은 일반적으로 알려진 생물공학 기술을 이용하여 사용될 수 있고, 특히 GPD 및/또는 GPP를 암호화하는 구조 유전자의 프로모터 영역 또는 코딩 영역의 하나 이상의 넉-아웃 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이를 포함할 수 있다. 대안적으로, 글리세롤 생산에 결함이 있는 효모 균주는 GPD 및/또는 GPP의 감소된 또는 부재의 활성을 갖는 균주의 선택에 이어 무작위 돌연변이화에 의해 수득될 수 있다. S. 세레비지에 GPD1, GPD2, GPP1 및 GPP2 유전자는 WO 2011/010923에 나타나 있고, 그 출원에 서열번호: 24 내지 27로 기재되어 있다. 이 출원의 내용, 특히 GPD 및/또는 GPP와 관련된 내용은 참조로서 포함된다.
하기의 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명은 알코올, 명백히 에탄올의 생산을 위한 공정에서 특히 유리한 것으로 확인된다. 그러나, 자연적으로 이를 허용하지 않는 미생물에서 CO2가 전자 수용체로 사용될 수 있다는 통찰이 유기 분자, 특히 상대적으로 낮은 분자량을 갖는 유기 분자, 특히 1000 g/mol 미만의 분자량을 갖는 유기 분자의 기타 생물공학적 공정에 산업적 이점을 갖는 것으로 고려된다. 하기 항목이 본 발명에 따라 전자 수용체로서 이산화탄소의 용도에 관한 바람직한 실시양태로서 본원에 언급된다.
1. 비-광합성 진핵 미생물인 재조합 화학영양합성 미생물에서 전자 수용체로서 이산화탄소의 용도.
2. 혐기적 조건하에서 유기 화합물을 생산하는 재조합 화학영양합성 미생물에서 전자 수용체로서 이산화탄소의 용도.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 이산화탄소가 전자 공여체로서 NADH를 이용한 공정에서 전자 수용체로서 작용하는 것인 용도.
5. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 미생물이 ATP 및/또는 NADH의 과잉 생산을 이용한 공정에서 유기 화합물을 생산하는 것인 용도.
6. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 미생물이 (자연적으로) 독립영양 생물 유래의 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것인 용도.
7. 항목 6에 있어서, 미생물이 상기 폴리펩티드에 대한 제1 원핵 샤페론을 암호화하는 이종 핵산 서열 및 바람직하게는 상기 폴리펩티드에 대한 - 제1과는 다른 - 제2 원핵 샤페론을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 용도.
8. 항목 7에 있어서, 샤페론이 GroEL 및 GroES인 것인 용도.
9. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 미생물이 알코올 (예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 페놀, 폴리페놀), 리보솜 펩티드, 항생제 (예컨대, 페니실린), 바이오-디젤, 알킨, 알켄, 이소프레노이드, 에스테르, 카르복실산 (예컨대, 석신산, 시트르산, 아디프산, 락트산), 아미노산, 폴리케타이드, 지질, 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 화합물을 생산하는 것인 용도.
10. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 미생물이 탄산무수화효소, 카르복실라제, 옥시게나제, 히드로게나제, 디히드로게나제, 이소머라제, 알돌라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 포스파타제, 에피머라제, 키나제, 카르복시키나제, 산화화원효소, 아코티나제, 푸마라제, 리덕타제, 락토나제, 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복실라제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제, 삼탄당인산 이소머라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제, 포스포펜토스 이소머라제, 포스포펜토스 에피머라제, 포스포리불로키나제 (PRK), 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리불로스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 옥시게나제, 락테이트 디히드로게나제, 말레이트 신타제, 이소시트레이트 리아제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 포스포글루코이소머라제, 글루코스-6-포스파타제, 헥소키나제, 글루코키나제, 포스포프럭토키나제, 피루베이트 키나제, 석시네이트 디히드로게나제, 시트레이트 신타제, 이소시트레이트 디히드로게나제, α-케토글루타레이트 디히드로게나제, 석시닐-CoA 신세타제, 말레이트 디히드로게나제, 뉴클레오시드-다이포스페이트 키나제, 자일로스 리덕타제, 자일리톨 디히드로게나제, 자일로스 이소머라제, 이소프레노이드 신타제, 및 자일로네이트 디히드로타제로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 기능적으로 발현하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것인 용도.
11. 항목 10에 있어서, 미생물이 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 옥시게나제 (루비스코)를 기능적으로 발현하는 이종 핵산 서열 및/또는 포스포리불로키나제 (PRK)를 기능적으로 발현하는 이종 핵산 서열을 포함하는 것인 용도.
12. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 미생물이 사카로마이세라세아에 (Saccharomyceraceae), 페니실리움 (Penicillium), 야로위와 (Yarrowia) 및 아스페러질러스 (Aspergillus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
13. 전술한 항목 중 어느 하나에 있어서, 이산화탄소가 또 다른 알코올 또는 카르복실산과 같은 또 다른 유기 화합물을 제조하는 공정에서 글리세롤과 같은 NAD+-의존성 부산물 또는 NADH-의존성 부산물의 생산을 감소시키기 위해 전자 수용체로 사용되는 것인 용도.
14. 미생물이 화학영양합성 (비-광합성) 조건하에서 전자 수용체로서 이산화탄소를 사용하는 것을 허용하는 효소 시스템을 갖는 재조합 미생물, 특히 진핵 미생물이고, 상기 미생물이 바람직하게는 전술한 항목에서 정의된 바와 같은 것인 재조합 미생물.
15. 항목 14에 있어서, 미생물이 ATP 및/또는 NADH의 과잉 생산을 이용한 공정에서 유기 화합물을 생산하기 위한 효소 시스템을 갖는 것인 재조합 미생물.
목적한 유기 화합물의 생산은 목적한 유기 화합물의 생산에 있어 그의 유용성에 대해 공지된 생물에서 일어날 수 있는데, 단 상기 생물은 그 생물에서 전자 수용체로 이산화탄소의 사용을 가능케 하도록 유전적으로 변형되었던 것이다.
본 발명이 산업적으로 관련된 다양한 유기 화합물의 생산에 관심을 갖는 것이라고 하더라도, 본 발명에 따른 방법 또는 용도는 알코올, 특히 에탄올, n-부탄올 및 2,3-부타네디올의 군으로부터 선택된 알코올의 생산에 또는 유기산/카르복실레이트, 특히 L-락테이트, 3-히드록시프로피오네이트, D-말레이트, L-말레이트, 석시네이트, 시트레이트, 피루베이트 및 이코네이트의 군으로부터 선택된 카르복실레이트의 생산에 특히 유리한 것으로 생각된다.
에탄올의 생산과 관련하여, 상세한 설명은 상기 본원에서 PRK 및 루비스코를 포함하는 효모 세포를 기술하면서, 그리고 실시예에서 확인된다. 에탄올 또는 또 다른 알코올은 바람직하게는 발효적 공정에서 생산된다.
여러 유기산 (카르복실레이트), 예컨대 시트르산의 생산을 위해, 호기적 공정이 유용하다. 시트르산 생산을 위해 예를 들어 아스페르질러스 니거 (Aspergillus niger), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 또는 또 다른 공지의 시트레이트 생산 생물이 사용될 수 있다.
바람직하게는 혐기적으로 생산되는 유기산의 예시는 젖산이다. 락테이트 생산을 위해 조작되었던 다양한 젖산 생산 세균 균주 및 효모 균주가 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있다.
실시예
실시예
1. 발현 벡터의 제작
스피나시아 올레라세아 (Spinacia oleracea) (시금치) 유래의 포스포리불로키나제 (PRK) cDNA (EMBL 수탁번호: X07654.1)를 퓨전 핫-스타트 (Phusion Hot-start) 중합효소 (Finnzymes, Landsmeer, the Netherlands) 및 올리고뉴클레오티드 XbaI_prk-FW2와 RV1_XhoI_prk를 사용하여 PCR 증폭하고 (표 5), pCR®-Blunt II-TOPO® (Life Technologies Europe BV, Bleiswijk, the Netherlands)에 라이게이션하였다.
표 5: 올리고뉴클레오티드
XbaI 및 XhoI에 의한 절단 (restriction) 후, PRK-함유 단편을 pTEF424 내로 라이게이션하였다. TEF1p를 그 후에 XbaI 및 SacI 절단/라이게이션에 의해 플라스미드 pSH47 유래 GAL1p로 대체하였다 (표 6 참조).
표 6: 플라스미드
KpnI 및 SacI 부위로 플랭킹된 (flanked) 티오바실러스 데니트리피칸스 (T. denitrificans) 유래 루비스코 II형 유전자 cbbM을 GeneArt (Life Technologies Europe BV)에서 코돈 최적화 합성하였고, 이를 pPCR-Script. 내로 라이게이션한 후, 상기 플라스미드를 BamHI 및 SacI으로 분해하였다. cbbM-함유 단편을 BamHI 및 SacI 절단된 벡터 pGPD_426 내로 라이게이션하여 플라스미드 pBTWW002를 생성하였다. cbbM 발현 카세트를 KpnI 및 SacI을 사용하여 pRS416 내로 전달하여, pUDC098을 생성하였디.
T. 데니트리피칸스 cbbQ2 및 cbbO2 유래의 특이적 루비스코 II형 샤페론, 및 대장균 유래 샤페론 groEL 및 groES의 발현 카세트를 코돈 최적화하였다. 발현 카세트는 코돈 최적화된 유전자에 플랭킨된 효모 구성적 프로모터 및 종결자를 포함하고 있다. 상기 카세트는 사카로마이세스 게놈 결손 프로젝트에서 사용된 바-코드 서열과 EcoRV 부위 (GeneArt)를 무작위로 조합하여 수득된 독특한 60 bp 영역이 플랭킹되어 있다. 상기 발현 카세트를 SfiI 클로닝 부위를 이용하여 플라스미드 pMK-RQ (GeneArt)에 삽입하여 pUB230 (PGI1p-cbbQ2-TEF2t), pUD231 (PGK1p-cbbO2-ADH1t), pUD232(TEF1p-groEL-ACT1t), 및 pUDE233 (TPI1p-groES-PGI1t)를 생성하였다 (표 6). 재조합 클로닝을 위한 60-bp 영역을 도입하기 위하여 상기 발현 카세트 TDH3p-cbbM-CYC1t를 퓨전 핫-스타트 중합효소 (Phusion Hot-Start Polymerase, Finnzymes) 및 프라이머 HR-cbbM-FW-65 및 HR-cbbM-RV-65를 사용하여 플라스미드 pBTWW002로부터 PCR 증폭하였다.
실시예
2. 균주 제작, 분리 및 유지
사용된 모든 사카로마이세스 세레비지에 균주 (표 7)는 CEN.PK 패밀리에 속한다. 이들이 말기 대수증식기에 도달할 때까지 요구되는 경우 150 mg L-1 우라실이 보충된 2% w/v 글루코스 합성 배지에서 모든 균주를 성장시켰고, 그 후에 멸균 글리세롤을 최대 ca. 30% v/v으로 첨가하였으며, 1 ml의 분액을 -80℃에서 보관하였다.
표 7:
사케로마이세스
세레비지에
균주
루비스코 II형 ccbM 및 4종의 샤페론 cbbQ2, cbbO2, groEL 및 groES를 동시-발현하는 균주 IMC014를 생체내 형질전환 관련 재조합을 이용해 구축하였다. 200 fmol의 각 발현 카세트를 50 ㎕의 최종 부피로 100 fmol의 KpnI/SacI 선형화된 pRS416 골격으로 채운 (pooled) 후 리튬 아세테이트 프로토콜 (Gietz, et al., Yeast Transform by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method in Yeast Protocol, Humana press, 2006)을 이용하여 CEN.PK 113-5D로 형질전환하였다. 세포를 합성 배지 상에서 선택하였다. pUDC075의 단편의 정확한 조립을 상동 재조합에 사용된 영역에 걸쳐서 증폭을 가능케 하는 프라이머 (표 5)를 사용하여 형질전환체 콜로니에 대해 다중 PCR에 의해, 그리고 대장균 DH5α 내 단리된 플라스미드의 재-형질전환 후 제한효소 분석에 의해 수행하였다. PUDC075를 넥스트-제너레이션 시퀀싱 (Next-Generation Sequencing, Illumina, San Diego, California, U.S.A.) (100 br reads paired-end, 50 Mb)으로 서열 분석하였고 벨벳 (Velvet) (Zerbino, et al., Velvet: Algorithms for De Novo Short Read Assembly Using De Bruijn Graphs, Genome Research, 2008)을 이용해 조립하였다. 조립된 서열은 임의의 조립된 발현 카세트 내에 돌연변이를 포함하지 않았다. 각각 ccbM/ccbQ2/ccbO2 및 ccbM/groEL/groES를 발현하는 균주 IMC034 및 IMC035를 하기 변형을 갖는 동일한 생체 내 조립 방법을 이용하여 구축하였다. 플라스미드 pUDC099 및 pUDC100을 구축하기 위하여, 120 bp cbbO2-pRS416 링커 및 cbbM-GroEL 링커를 각각 조립을 종료하기 위해 사용하였고 (표 5), 100 fmol의 각각의 상보적인 120 bp 올리고뉴클레오티드를 형질전환에 첨가하였다. cbbM 유전자만을 발현하는 균주 IMC033은 CEN.PK113-5D를 pUDC098로 형질전환시켜 구축하였다.
PRK, ccbM, ccbQ2, ccbO2, GroEL, GroES를 동시-발현하는 균주 IMU033을 구축하기 위하여, 중간 균주 IMI229를 PRK, 4종의 샤페론 및 KlLEU2 (Guldener, et al., A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockouts in budding yeast, Nucleic Acids Research, 2002)를 CEN.PK102-3A에서 생체 내 상동 통합에 의해 CAN1 유전자좌에 통합함으로써 구축하였다. 발현 카세트를 퓨전 핫-스팟 중합효소 (Finnzymes, Thermo Fisher Scientific Inc. Massachusetts, U.S.A.), 상응하는 올리고뉴클레오티드 및 DNA 주형을 사용하여 PCR 증폭하였다 (표 5). 마지막으로, 균주 IMI229를 루비스코 II형 ccbM 및 2종의 대장균 샤페론 groEL 및 groES를 보유하는 pUDC100으로 형질전환하였다
균주 IMI232는 CEN.PK102-3A를 KlLEU2 카세트로 형질전환하여 구축하였다. IMI232를 마지막으로 플라스미드 p426GPD로 형질전환하여 원영양체 (prototrophy)를 회복시켜 참조 균주 IMU032를 구축하였다.
실시예
3.
키모스탯
(
chemostat
) 및 일괄 실험의 실험적
셋업
혐기적 키모스탯 배양은 본질적으로 문헌 (Basso, et al., Engineering topology and kinetics of sucrose metabolism in Saccharomyces cerevisiae for improved ethanol yield, Metabolic Engineering 13: 694-703, 2011)에 기술된 바와 같이, 그러나 탄소원으로 12.5 g l-1 글루코스 및 12.5 g l-1 갈락토스와, 지시되는 경우 스파징 (sparging) 가스로 10% CO2/90% N2 대체 순수 질소의 혼합물을 사용하여 수행하였다. 잔여 글루코스 및 갈락토스 농도를 글루코스 (Boehringer, Mannheim, Germany) 및 D-갈락토스 (Megazyme, Bray, Ireland)를 위한 상업적 효소 어세이를 이용하여 급속 냉각 (Mashego, et al., Critical evaluation of sampling techniques for residual glucose determination in carbon-limited chemostat culture of Saccharomyces cerevisiae, Biotechnology and Bioengineering 83: 395-399, 2003) 후 측정하였다. 혐기적 생물반응기 일괄 배양은 본질적으로 문헌 (Guadalupe Medina, et al., Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Applied and Environmental Microbiology 76: 190-195, 2010)에 기술된 바와 같이, 그러나 20 g L-1 갈락토스 및 10% CO2 및 90% N2로 이루어진 스파징 가스를 사용하여 수행하였다. 일괄 및 키모스탯 배양에서 바이오매스 및 대사산물 농도를 문헌 [Guadalupe Medina, et al., Elimination of glycerol production in anaerobic cultures of a Saccharomyces cerevisiae strain engineered to use acetic acid as an electron acceptor. Appl. Environ. Microbiol. 76, 190-195, 2010)에 기술된 바와 같이 측정하였다. 에탄올 유출 및 수율의 계산 시, 에탄올 증발을 생물반응기 셋업 내 및 이 연구에 사용된 조건하에서 0.008 h-1의 1차 증발 속도를 기준으로 교정하였다.
실시예
4.
포스포리불로키나제
(
PRK
) 및
루비스코에
대한 효소
어세이
포스포리불로키나제 (PRK) 활성의 분석을 위한 세포 추출물을 이전에 기술된 바와 같이 준비하였다 (Abbott, et al., Catalase Overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae , Applied and Environmental Microbiology 75: 2320-2325, 2009). PRK 활성을 공역 분광광도 어세이 (coupled spectrophotometric assay) (MacElroy, et al., Properties of phosphoribulokinase from Thiobacillus neapolitanus, Journal of Bacteriology 112: 532-538, 1972)에 의해 30℃에서 측정하였다. 반응 속도는 첨가된 세포 추출물의 양에 비례하였다. 단백질 농도를 표준품으로서 소 혈청 알부민을 사용하는 로우리 방법 (Lowry, et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent, The Journal of Biological Chemistry 193: 265-275, 1951)에 의해 측정하였다.
루비스코 활성을 위한 세포 추출물을, Tris-HCl (1 mM, pH 8.2) 함유 20 mM MgCl2·6H2O, 5 mM의 DTT, 5 mM NaHCO3를 초음파처리 용액으로 사용하였고 Tris-HCl (100 mM, pH 8.2), 20 mM MgCl2·6H2O 및 5 mM의 DTT를 동결 완충액으로 사용하는 2가지 변형을 가하여, 문헌 [Abbott, D. A. et al. Catalase overexpression reduces lactic acid-induced oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 75: 2320-2325, 2009]에 기술된 바와 같이 준비하였다. 루비스코 활성을 문헌 (Beudeker, et al., Relations between d-ribulose-1,5-biphosphate carboxylase, carboxysomes and CO2 fixing capacity in the obligate chemolithotroph Thiobacillus neapolitanus grown under different limitations in the chemostat, Archives of Microbiology 124: 185-189, 1980)에 기술된 바와 같이 14CO2-고정 (PerkinElmer, Groningen, The Netherlands)을 측정하고, 울티마 골드 섬광 칵테일 (Ultima Gold™ scintillation cocktail) (PerkinElmer, Groningen, The Netherlands)을 사용하여 TRI-CARB® 2700TR 시리즈 액체 섬광 계수기 (Series liquid scintillation counter) (PerkinElmer, Groningen, The Netherlands)에서 방사능 계수를 측정함으로써 결정하였다. 단백질 농도를 50 mM Tris-HCl (pH 8.2)에 용해된 소 혈청 알부민의 표준 용액을 사용하여 로우리 방법 (Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., & Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951)에 의해 결정하였다.
실시예
5. 세포 추출물에서
루비스코의
활성 및
PRK의
활성
S. 세레비지에에서 루비스코의 이종 샤페론의 가능한 요건을 연구하기 위하여, T. 데니트리피칸스 유래 II-형 루비스코-암호화 cbbM 유전자를 코돈-최적화시키고 단독 및 코돈-최적화된 대장균 groEL/groES 및/또는 T. 데니트리피칸스 cbbO2/cbbQ2 유전자용 발현 카세트와 조합하여 동원체 (centromeric) 벡터로부터 발현시켰다. 효모 세포 추출물에 의한 리불로스-1,5-바이포스페이트-의존성 CO2 고정 연구는 S. 세레비지에에서 T. 데니트리피칸스 루비스코의 기능적 발현이 대장균 GroEL/GroES의 동시-발현 시 관찰되었음을 입증하였다. 루비스코 활성은 <0.2 nmol.min-1.(mg 단백질)-1로부터 6 nmol.min- 1.(mg 단백질)-1 초과로 증가하였다. 이들 실험 결과를 도 1에 가시화하였는데, 이는 단독 (IMC033) 또는 대장균 샤페론 GroEL/GroES (IMC035), T. 데니트리피칸스 샤페론 CbbO2/CbbQ2 [20] (IMC034) 또는 모든 4종의 샤페론 (IMC014)과 조합하여 T. 데니트리피칸스 유래 루비스코 II형 CbbM을 발현하는 S. 세레비지에의 세포 추출물에서 특이적 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 (루비스코) 활성을 나타낸다. 이종 발현된 유전자를 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화하였고 단일 동원체 벡터로부터 발현시켰다. 바이오매스 시료를 질소로 스파징되고 탄소원으로 20 g l-1 글루코스를 함유하는 합성 배지 (pH 5.0, 30℃) 상의 혐기적 일괄 배양으로부터 취하였다. 야생형 참조 균주 및 cbbM and cbbM-cbbQ2-cbbO2를 발현하는 S. 세레비지에 균주에서, 세포 추출물 내 14CO2-고정으로 측정된, 루비스코 활성은 효소 어세이의 검출 한계 (0.2 nmol CO2 min-1 mg 단백질-1) 미만이었다.
CbbO2/cbbQ2의 동시-발현은 루비스코 활성의 유의미한 추가적인 증가를 초래하지 않았다. S . 세레비지에에서 루비스코 발현에 대한 GroEL/GroES의 양성 효과는 특히 원핵 효소가 진핵생물의 세포질 내에서 기능적으로 발현될 필요가 있을 때, 대사 공학을 위한 이 접근법의 잠재적 가치를 증명한다.
스피나치 올레라세아 (Spinach oleracea) PRK 유전자를 갈락토스-유도성 GAL1 프로모터의 조절하에서, CAN1 유전자좌에서 S. 세레비지에 게놈 내로 대장균 groEL/groES 및 T. 데니트리피칸스 cbbO2/cbbQ2와 함께 통합하였다. 이는 S. 세레비지에 균주 IMU033의 세포 추출물에서 높은 PRK 활성을 유도하였고, 이는 부가적으로 T. 데니트리피칸스 루비스코를 위한 동원체 발현 카세트를 부가적으로 운반하였다. 이렇게 조작된 효모 균주를 루비스코 및 PRK 발현의 생리학적 영향을 정성적으로 분석하기 위해 사용하였다.
표 8
표 8은 포스포리불로키나제 (PRK) 및 루비스코를 발현하는 S. 세레비지에 균주의 당에 대한 증가된 에탄올 수율을 나타낸다. 탄소원으로 12.5 g l-1 글루코스 및 12.5 g l-1 갈락토스가 보충된 합성 배지 (pH 5) 상에서 0.05 h-1의 희석률로 성장한, 혐기적 키모스탯 배양에서 PRK 및 루비스코를 발현하는 S. 세레비지에 IMU033 및 동종 (isogenic) 참조 균주 IMU032의 생리학적 분석을 수행하였다. CO2 농도의 영향을 평가하기 위하여, 키모스탯 배양을 순수 질소 가스 또는 10% CO2 및 90% 질소의 블랜드 중 하나를 스파징하면서 수행하였다. 결과를 별개의 중복 키모스탯 실험으로부터 얻은 데이터의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 동일한 아래첨자 (a,a, b,b, 등)로 표시된 데이터 쌍은 표준 t-검정에서 통계적으로 다른 것으로 간주된다 (p <0.02).
PRK의 동시-발현 없이 루비스코와 4종의 샤페론의 발현 (균주 IMC014)은 CO2가 보충된 탄소-제한 키모스탯 배양에서 참조 균주 IMU032 (0.12 mol mol- 1)에 비해 감소된 글리세롤 수율 (0.13 mol mol- 1)을 나타내지 않았는데, 이는 포스포리불로키나제 (PRK) 유전자의 발현이 글리세롤 생산을 감소시키기 위해 S. 세레비지에의 기능적 경로에 요구됨을 나타내는 것이다. S. 세레비지에의 갈락토스-성장 혐기적 일괄 배양에서 성장, 기질 소모 및 산물 형성에 대한 PRK와 루비스코 발현의 생리학적 영향을 또한 조사하였고 이를 동종 참조 균주와 비교하였다. 성장 조건: T = 30℃, pH 5.0, 입구 가스로 10% CO2. 2회의 별개의 중복 실험을 수행하였고, 그의 성장 역학 매개변수는 5% 미만의 차이를 보였다. PRK와 루비스코를 기능적으로 발현하는 효모 세포에서 이들 효소가 결여된 효모 세포에 비해 갈락토스에 대한 에탄올 수율은 8% 이상이었고 글리세롤 생산은 60% 감소하였다. 이 차이는 통계적으로 유의미하였다 (p값 < 0.02). 조작된 균주 IMU033의 세포 추출물에서 포스포리불로키나제 및 루비스코의 활성 (표 7)은 전자 수용체로서 CO2의 사용을 가능케 한다. 참조 균주 IMU032 대비 균주 IMU033의 에탄올 수율 및 글리세롤 수율 (표 8)은 증가된 에탄올 생산을 갖는 혐기적 발효가 가능함을 보여준다.
서열
서열번호 1:
루비스코 cbbM 유전자 (합성; 티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbM 유전자를 토대로 함 - pBTWW002, 코돈 최적화됨. 출처: Hernandez et al 1996, GenBank ID: L37437.2)
GATAGAAAGGGACGAATGTCAAGGTCCAGTTTATTTTCAAAAATGGTACGGTATGAAACCAACTACTCCAATTATCTCCGGAGGAATGAATGCTTTGAGATTGCCTGGTTTTTTCGAAAATTTGGGTCATGGTAACGTTATTAATACTGCAGGTGGTGGTTCTTACGGTCATATTGATTCTCCTGCTGCTGGTGCTATTTCTTTGAGACAATCTTACGAATGTTGGAAACAAGGTGCAGATCCAATTGAATTTGCTAAGGAACATAAGGAATTTGCAAGAGCTTTTGAATCTTTTCCAAAAGATGCTGATAAGTTATTTCCAGGATGGAGAGAAAAATTGGGAGTTCATTCTTAA
서열번호 2:
티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbM 유전자의 변역된 단백질 서열
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서열번호 3:
스피나세아 올레아세아 유래 prk 유전자 - pBTWW001, 절단 및 라이게이션을 이용하여 구축된 플라스미드. 출처: Milanez and Mural 1988, GenBank ID: M21338.1
GTCTACAGCAACTGCAACAGCTGCTAAAGCCTAG
서열번호 4:
스피나세아 올레아세아 유래 prk 유전자의 번역된 단백질 서열
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서열번호 5:
cbbQ2 유전자 (합성, 티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbQ2 유전자를 토대로 함 - 코돈 최적화됨, Beller et al 2006으로부터 입수한 본래 서열, GenBank 유전자 ID: 3672366, 단백질 ID: AAZ98590.1
ATGACTACTAACAAGGAACAATACAAGGTTCACCAAGAACCATACTACCAAGCTCAAGGTAGAGAAGTTCAATTGTACGAAGCTGCTTACAGAAACAGATTGCCAGTTATGGTTAAGGGTCCAACTGGTTGTGGTAAGTCTAGATTCGTTGAATACATGGCTTGGAAGTTGAACAAGCCATTGATCACTGTTGCTTGTAACGAAGACATGACTGCTTCTGACTTGGTTGGTAGATACTTGTTGGAAGCTAACGGTACTAGATGGTTGGACGGTCCATTGACTACTGCTGCTAGAATCGGTGCTATCTGTTACTTGGACGAAGTTGTTGAAGCTAGACAAGACACTACTGTTGTTATCCACCCATTGACTGACCACAGAAGAACTTTGCCATTGGACAAGAAGGGTGAATTGATCGAAGCTCACCCAGACTTCCAATTGGTTATCTCTTACAACCCAGGTTACCAATCTTTGATGAAGGACTTGAAGCAATCTACTAAGCAAAGATTCGCTGCTTTCGACTTCGACTACCCAGACGCTGCTTTGGAAACTACTATCTTGGCTAGAGAAACTGGTTTGGACGAAACTACTGCTGGTAGATTGGTTAAGATCGGTGGTGTTGCTAGAAACTTGAAGGGTCACGGTTTGGACGAAGGTATCTCTACTAGATTGTTGGTTTACGCTGCTACTTTGATGAAGGACGGTGTTGACGCTGGTGACGCTTGTAGAATGGCTTTGGTTAGACCAATCACTGACGACGCTGACATCAGAGAAACTTTGGACCACGCTATCGACGCTACTTTCGCTTAA
서열번호 6:
티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbQ2 유전자의 번역된 단백질 서열
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서열번호 7:
cbbO2 유전자 (합성, 티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbO2 유전자를 토대로 함 - 코돈 최적화됨, Beller et al 2006으로부터 입수한 본래 서열, GenBank 유전자 ID: 3672365, 단백질 ID: YP_316394.1
GTAGACCATCTGACGTTGACGCTGCTGACGAAAGATTGTTGGTTGAAGACGCTAGACAAGCTGTTAAGGAATTGGACAGACAAGGTATCTTCGCTTACTGTATCTCTTTGGACGCTCAATTGAAGGCTGGTGCTGACGACTACGTTGCTGAAATCTTCGGTAGACAATACACTGTTATCGACAGAGTTGAAAGATTGCCAGAAAGATTGCCAGAATTGTTCATGGCTTTGACTAAGTAA
서열번호: 8
티오바실러스 데니트리피칸스 유래 cbbO2 유전자의 번역된 단백질 서열
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서열번호: 9
GroEL 유전자 (합성, 대장균 유래 GroEL을 토대로 함 - 코돈 최적화됨, Durfee et al 2008로부터 입수한 본래 서열, 유전자 ID: 6061450, 단백질 ID: YP_001732912.1
CCAAGGTAGAGTTGCTCAAATCAGACAACAAATCGAAGAAGCTACTTCTGACTACGACAGAGAAAAGTTGCAAGAAAGAGTTGCTAAGTTGGCTGGTGGTGTTGCTGTTATCAAGGTTGGTGCTGCTACTGAAGTTGAAATGAAGGAAAAGAAGGCTAGAGTTGAAGACGCTTTGCACGCTACTAGAGCTGCTGTTGAAGAAGGTGTTGTTGCTGGTGGTGGTGTTGCTTTGATCAGAGTTGCTTCTAAGTTGGCTGACTTGAGAGGTCAAAACGAAGACCAAAACGTTGGTATCAAGGTTGCTTTGAGAGCTATGGAAGCTCCATTGAGACAAATCGTTTTGAACTGTGGTGAAGAACCATCTGTTGTTGCTAACACTGTTAAGGGTGGTGACGGTAACTACGGTTACAACGCTGCTACTGAAGAATACGGTAACATGATCGACATGGGTATCTTGGACCCAACTAAGGTTACTAGATCTGCTTTGCAATACGCTGCTTCTGTTGCTGGTTTGATGATCACTACTGAATGTATGGTTACTGACTTGCCAAAGAACGACGCTGCTGACTTGGGTGCTGCTGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGGGTGGTATGATGTAA
서열번호: 10
대장균 유래 GroEL 유전자의 번역된 단백질 서열
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서열번호: 11
GroES 유전자 (합성, 대장균 유래 GroES를 토대로 함 - 코돈 최적화됨, Durfee et al 2008로부터 입수한 본래 서열, 유전자 ID: 6061370, 단백질 ID: YP_001732911.1
ATGAACATCAGACCATTGCACGACAGAGTTATCGTTAAGAGAAAGGAAGTTGAAACTAAGTCTGCTGGTGGTATCGTTTTGACTGGTTCTGCTGCTGCTAAGTCTACTAGAGGTGAAGTTTTGGCTGTTGGTAACGGTAGAATCTTGGAAAACGGTGAAGTTAAGCCATTGGACGTTAAGGTTGGTGACATCGTTATCTTCAACGACGGTTACGGTGTTAAGTCTGAAAAGATCGACAACGAAGAAGTTTTGATCATGTCTGAATCTGACATCTTGGCTATCGTTGAAGCTTAA
서열번호: 12
대장균 유래 GroES 유전자의 번역된 단백질 서열
MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
<110> Technische Universiteit Delft
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Product Yield
<130> HIP0149-NL
<150> EP 13156448.6
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<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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Thiobacillus denitrificans - pBTWW002, codon optimized Source:
Hernandez et al 1996, GenBank ID: L37437.2)
<400> 1
atggatcaat ctgcaagata tgctgacttg tctttaaagg aagaagattt gattaaaggt 60
ggtagacata ttttggttgc ttacaaaatg aaaccaaaat ctggttatgg ttatttggaa 120
gctgctgctc attttgctgc tgaatcttct acaggtacaa atgttgaagt ttctactaca 180
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gcaaaaatga tagattttta cgttccagaa agatgtattc aaatgtttga tggtccagct 420
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gctggtacta ttattaagcc aaaattgggt ttaagaccag aaccatttgc taaagctgct 540
tatcaatttt ggttgggtgg agattttatc aagaatgacg aaccacaagg taatcaagtt 600
ttttgtccat tgaaaaaagt tttgccattg gtttacgatg ctatgaaaag agcacaagat 660
gatactggtc aagcaaaatt gttttctatg aatattactg cagacgatca ttatgaaatg 720
tgtgcaagag ctgattatgc tttggaagtt ttcggtccag atgcagataa attggctttt 780
ttggtagatg gttacgttgg aggtccagga atggttacta ctgctagaag gcaatatcct 840
ggtcaatatt tgcattatca tagagcaggt cacggtgctg ttacttctcc atctgctaaa 900
agaggttata ctgcttttgt tttggctaaa atgtctagat tgcaaggcgc ttcaggtatt 960
catgttggta ctatgggtta tggaaaaatg gaaggagaag gcgacgataa gattattgct 1020
tatatgatag aaagggacga atgtcaaggt ccagtttatt ttcaaaaatg gtacggtatg 1080
aaaccaacta ctccaattat ctccggagga atgaatgctt tgagattgcc tggttttttc 1140
gaaaatttgg gtcatggtaa cgttattaat actgcaggtg gtggttctta cggtcatatt 1200
gattctcctg ctgctggtgc tatttctttg agacaatctt acgaatgttg gaaacaaggt 1260
gcagatccaa ttgaatttgc taaggaacat aaggaatttg caagagcttt tgaatctttt 1320
ccaaaagatg ctgataagtt atttccagga tggagagaaa aattgggagt tcattcttaa 1380
1380
<210> 2
<211> 459
<212> PRT
<213> Thiobacillus denitrificans
<400> 2
Met Asp Gln Ser Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Ser Leu Lys Glu Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Lys Gly Gly Arg His Ile Leu Val Ala Tyr Lys Met Lys Pro
20 25 30
Lys Ser Gly Tyr Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Ala His Phe Ala Ala Glu
35 40 45
Ser Ser Thr Gly Thr Asn Val Glu Val Ser Thr Thr Asp Asp Phe Thr
50 55 60
Lys Gly Val Asp Ala Leu Val Tyr Tyr Ile Asp Glu Ala Ser Glu Asp
65 70 75 80
Met Arg Ile Ala Tyr Pro Leu Glu Leu Phe Asp Arg Asn Val Thr Asp
85 90 95
Gly Arg Phe Met Leu Val Ser Phe Leu Thr Leu Ala Ile Gly Asn Asn
100 105 110
Gln Gly Met Gly Asp Ile Glu His Ala Lys Met Ile Asp Phe Tyr Val
115 120 125
Pro Glu Arg Cys Ile Gln Met Phe Asp Gly Pro Ala Thr Asp Ile Ser
130 135 140
Asn Leu Trp Arg Ile Leu Gly Arg Pro Val Val Asn Gly Gly Tyr Ile
145 150 155 160
Ala Gly Thr Ile Ile Lys Pro Lys Leu Gly Leu Arg Pro Glu Pro Phe
165 170 175
Ala Lys Ala Ala Tyr Gln Phe Trp Leu Gly Gly Asp Phe Ile Lys Asn
180 185 190
Asp Glu Pro Gln Gly Asn Gln Val Phe Cys Pro Leu Lys Lys Val Leu
195 200 205
Pro Leu Val Tyr Asp Ala Met Lys Arg Ala Gln Asp Asp Thr Gly Gln
210 215 220
Ala Lys Leu Phe Ser Met Asn Ile Thr Ala Asp Asp His Tyr Glu Met
225 230 235 240
Cys Ala Arg Ala Asp Tyr Ala Leu Glu Val Phe Gly Pro Asp Ala Asp
245 250 255
Lys Leu Ala Phe Leu Val Asp Gly Tyr Val Gly Gly Pro Gly Met Val
260 265 270
Thr Thr Ala Arg Arg Gln Tyr Pro Gly Gln Tyr Leu His Tyr His Arg
275 280 285
Ala Gly His Gly Ala Val Thr Ser Pro Ser Ala Lys Arg Gly Tyr Thr
290 295 300
Ala Phe Val Leu Ala Lys Met Ser Arg Leu Gln Gly Ala Ser Gly Ile
305 310 315 320
His Val Gly Thr Met Gly Tyr Gly Lys Met Glu Gly Glu Gly Asp Asp
325 330 335
Lys Ile Ile Ala Tyr Met Ile Glu Arg Asp Glu Cys Gln Gly Pro Val
340 345 350
Tyr Phe Gln Lys Trp Tyr Gly Met Lys Pro Thr Thr Pro Ile Ile Ser
355 360 365
Gly Gly Met Asn Ala Leu Arg Leu Pro Gly Phe Phe Glu Asn Leu Gly
370 375 380
His Gly Asn Val Ile Asn Thr Ala Gly Gly Gly Ser Tyr Gly His Ile
385 390 395 400
Asp Ser Pro Ala Ala Gly Ala Ile Ser Leu Arg Gln Ser Tyr Glu Cys
405 410 415
Trp Lys Gln Gly Ala Asp Pro Ile Glu Phe Ala Lys Glu His Lys Glu
420 425 430
Phe Ala Arg Ala Phe Glu Ser Phe Pro Lys Asp Ala Asp Lys Leu Phe
435 440 445
Pro Gly Trp Arg Glu Lys Leu Gly Val His Ser
450 455
<210> 3
<211> 1059
<212> DNA
<213> Spinacea oleracea
<400> 3
atgtcacaac aacaaacaat tgtgattggt ttagcagcag attcaggttg tggtaagagt 60
acattcatga ggaggttaac aagtgttttc ggtggcgcgg ccgagccacc aaagggtggt 120
aacccagatt caaacacatt gattagtgac actactactg ttatctgttt ggatgatttt 180
cattcccttg atagaaatgg caggaaagtg gaaaaagtta ctgctttaga cccaaaagct 240
aatgattttg atcttatgta tgaacaagtt aaggctttga aagaaggtaa agctgttgat 300
aaacctattt ataatcatgt ttctggtttg ttggaccctc ctgagcttat tcaacctcct 360
aagatcttgg tcattgaagg gttacacccc atgtatgacg cacgtgtgag ggaattgcta 420
gacttcagca tctacttgga cattagcaat gaagttaaat ttgcctggaa aattcagaga 480
gacatgaaag aaagaggaca cagtcttgaa agcatcaaag ccagtattga atccagaaag 540
ccagattttg atgcttacat tgacccacaa aagcagcatg ctgatgtagt gattgaagta 600
ttgccaactg aactcattcc tgatgatgat gaaggcaaag tgttgagagt aaggatgatt 660
cagaaagaag gagtcaagtt tttcaaccca gtttacttgt ttgatgaagg atctaccatt 720
tcatggattc catgtggtag aaaattaaca tgttcttacc ctggtatcaa attttcctat 780
ggcccagaca ccttctatgg caacgaggtg acagtagtag agatggatgg gatgtttgac 840
agattagacg aactaatcta cgtcgaaagc catttgagca atctatcaac caagttttat 900
ggtgaagtca ctcaacaaat gttgaagcac caaaatttcc caggaagcaa caatggaact 960
ggtttcttcc aaaccataat tggattgaag atcagagact tgttcgagca gctcgttgct 1020
agcaggtcta cagcaactgc aacagctgct aaagcctag 1059
<210> 4
<211> 352
<212> PRT
<213> Spinacea oleracea
<400> 4
Met Ser Gln Gln Gln Thr Ile Val Ile Gly Leu Ala Ala Asp Ser Gly
1 5 10 15
Cys Gly Lys Ser Thr Phe Met Arg Arg Leu Thr Ser Val Phe Gly Gly
20 25 30
Ala Ala Glu Pro Pro Lys Gly Gly Asn Pro Asp Ser Asn Thr Leu Ile
35 40 45
Ser Asp Thr Thr Thr Val Ile Cys Leu Asp Asp Phe His Ser Leu Asp
50 55 60
Arg Asn Gly Arg Lys Val Glu Lys Val Thr Ala Leu Asp Pro Lys Ala
65 70 75 80
Asn Asp Phe Asp Leu Met Tyr Glu Gln Val Lys Ala Leu Lys Glu Gly
85 90 95
Lys Ala Val Asp Lys Pro Ile Tyr Asn His Val Ser Gly Leu Leu Asp
100 105 110
Pro Pro Glu Leu Ile Gln Pro Pro Lys Ile Leu Val Ile Glu Gly Leu
115 120 125
His Pro Met Tyr Asp Ala Arg Val Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ile
130 135 140
Tyr Leu Asp Ile Ser Asn Glu Val Lys Phe Ala Trp Lys Ile Gln Arg
145 150 155 160
Asp Met Lys Glu Arg Gly His Ser Leu Glu Ser Ile Lys Ala Ser Ile
165 170 175
Glu Ser Arg Lys Pro Asp Phe Asp Ala Tyr Ile Asp Pro Gln Lys Gln
180 185 190
His Ala Asp Val Val Ile Glu Val Leu Pro Thr Glu Leu Ile Pro Asp
195 200 205
Asp Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Val Arg Met Ile Gln Lys Glu Gly
210 215 220
Val Lys Phe Phe Asn Pro Val Tyr Leu Phe Asp Glu Gly Ser Thr Ile
225 230 235 240
Ser Trp Ile Pro Cys Gly Arg Lys Leu Thr Cys Ser Tyr Pro Gly Ile
245 250 255
Lys Phe Ser Tyr Gly Pro Asp Thr Phe Tyr Gly Asn Glu Val Thr Val
260 265 270
Val Glu Met Asp Gly Met Phe Asp Arg Leu Asp Glu Leu Ile Tyr Val
275 280 285
Glu Ser His Leu Ser Asn Leu Ser Thr Lys Phe Tyr Gly Glu Val Thr
290 295 300
Gln Gln Met Leu Lys His Gln Asn Phe Pro Gly Ser Asn Asn Gly Thr
305 310 315 320
Gly Phe Phe Gln Thr Ile Ile Gly Leu Lys Ile Arg Asp Leu Phe Glu
325 330 335
Gln Leu Val Ala Ser Arg Ser Thr Ala Thr Ala Thr Ala Ala Lys Ala
340 345 350
<210> 5
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cbbQ2 gene (synthetic, based on cbbQ2 gene from Thiobacillus
denitrificans -codon optimized, original sequence obtained from
Beller et al 2006, GenBank Gene ID: 3672366, Protein ID:
AAZ98590.1)
<400> 5
atgactacta acaaggaaca atacaaggtt caccaagaac catactacca agctcaaggt 60
agagaagttc aattgtacga agctgcttac agaaacagat tgccagttat ggttaagggt 120
ccaactggtt gtggtaagtc tagattcgtt gaatacatgg cttggaagtt gaacaagcca 180
ttgatcactg ttgcttgtaa cgaagacatg actgcttctg acttggttgg tagatacttg 240
ttggaagcta acggtactag atggttggac ggtccattga ctactgctgc tagaatcggt 300
gctatctgtt acttggacga agttgttgaa gctagacaag acactactgt tgttatccac 360
ccattgactg accacagaag aactttgcca ttggacaaga agggtgaatt gatcgaagct 420
cacccagact tccaattggt tatctcttac aacccaggtt accaatcttt gatgaaggac 480
ttgaagcaat ctactaagca aagattcgct gctttcgact tcgactaccc agacgctgct 540
ttggaaacta ctatcttggc tagagaaact ggtttggacg aaactactgc tggtagattg 600
gttaagatcg gtggtgttgc tagaaacttg aagggtcacg gtttggacga aggtatctct 660
actagattgt tggtttacgc tgctactttg atgaaggacg gtgttgacgc tggtgacgct 720
tgtagaatgg ctttggttag accaatcact gacgacgctg acatcagaga aactttggac 780
cacgctatcg acgctacttt cgcttaa 807
<210> 6
<211> 268
<212> PRT
<213> Thiobacillus denitrificans
<400> 6
Met Thr Thr Asn Lys Glu Gln Tyr Lys Val His Gln Glu Pro Tyr Tyr
1 5 10 15
Gln Ala Gln Gly Arg Glu Val Gln Leu Tyr Glu Ala Ala Tyr Arg Asn
20 25 30
Arg Leu Pro Val Met Val Lys Gly Pro Thr Gly Cys Gly Lys Ser Arg
35 40 45
Phe Val Glu Tyr Met Ala Trp Lys Leu Asn Lys Pro Leu Ile Thr Val
50 55 60
Ala Cys Asn Glu Asp Met Thr Ala Ser Asp Leu Val Gly Arg Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Glu Ala Asn Gly Thr Arg Trp Leu Asp Gly Pro Leu Thr Thr Ala
85 90 95
Ala Arg Ile Gly Ala Ile Cys Tyr Leu Asp Glu Val Val Glu Ala Arg
100 105 110
Gln Asp Thr Thr Val Val Ile His Pro Leu Thr Asp His Arg Arg Thr
115 120 125
Leu Pro Leu Asp Lys Lys Gly Glu Leu Ile Glu Ala His Pro Asp Phe
130 135 140
Gln Leu Val Ile Ser Tyr Asn Pro Gly Tyr Gln Ser Leu Met Lys Asp
145 150 155 160
Leu Lys Gln Ser Thr Lys Gln Arg Phe Ala Ala Phe Asp Phe Asp Tyr
165 170 175
Pro Asp Ala Ala Leu Glu Thr Thr Ile Leu Ala Arg Glu Thr Gly Leu
180 185 190
Asp Glu Thr Thr Ala Gly Arg Leu Val Lys Ile Gly Gly Val Ala Arg
195 200 205
Asn Leu Lys Gly His Gly Leu Asp Glu Gly Ile Ser Thr Arg Leu Leu
210 215 220
Val Tyr Ala Ala Thr Leu Met Lys Asp Gly Val Asp Ala Gly Asp Ala
225 230 235 240
Cys Arg Met Ala Leu Val Arg Pro Ile Thr Asp Asp Ala Asp Ile Arg
245 250 255
Glu Thr Leu Asp His Ala Ile Asp Ala Thr Phe Ala
260 265
<210> 7
<211> 2289
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cbbO2 gene (Synthetic, based on cbbO2 gene from Thiobacillus
denitrificans -codon optimized, original sequence obtained from
Beller et al 2006, GenBank Gene ID: 3672365, Protein ID:
YP_316394.1)
<400> 7
atggctgctt actggaaggc tttggacact agattcgctc aagttgaaga agttttcgac 60
gactgtatgg ctgaagcttt gactgttttg tctgctgaag gtgttgctgc ttacttggaa 120
gctggtagag ttatcggtaa gttgggtaga ggtgttgaac caatgttggc tttcttggaa 180
gaatggccat ctactgctca agctgttggt gaagctgctt tgccaatggt tatggctttg 240
atccaaagaa tgcaaaagtc tccaaacggt aaggctatcg ctccattctt gcaaactttg 300
gctccagttg ctagaagatt gcaatctgct gaacaattgc aacactacgt tgacgttact 360
ttggacttca tgactagaac tactggttct atccacggtc accacactac tttcccatct 420
ccaggtttgc cagaattctt cgctcaagct ccaaacttgt tgaaccaatt gactttggct 480
ggtttgagaa actgggttga atacggtatc agaaactacg gtactcaccc agaaagacaa 540
caagactact tctctttgca atctgctgac gctagagctg ttttgcaaag agaaagacac 600
ggtactttgt tggttgacgt tgaaagaaag ttggacttgt acttgagagg tttgtggcaa 660
gaccacgacc acttggttcc atactctact gctttcgacg aaatcagaaa gccagttcca 720
tactacgaca agttgggtat gagattgcca gacgtttacg acgacttggt tttgccatgt 780
ccagctggta gaggtggtgc tggtggtgaa gacgttttgg tttctggttt ggacagatac 840
agagctactt tggctcacat ggttggtcac agaagatggt ctgaagctca aatcgctgac 900
aactggtctc cattccaaag aatggctgtt gaattcttcg aagactgtag agttgaaact 960
ttgttgatga gagaataccc aggtttggct agaatcttca gagctttgca cccaaagcca 1020
gttgaagctg cttgtgacgg tgaaactact tcttgtttga gacacagatt ggctatgttg 1080
tctagagctt tcatcgaccc agaccacggt tacgctgctc cagttttgaa cgacttcgtt 1140
gctagattcc acgctagatt ggctgacggt acttcttcta cttctgaaat ggctgacttg 1200
gctttgtctt acgttgctaa gactagaaga ccatctgacc aattcgctaa ggttcacttc 1260
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ggtgacgaag aagaagcttt cgacgctaag agaaagatcg aaccaggtga agaaatccaa 1380
ggtttgccac caagacacta cccagaatgg gactacactt ctcaaactta cagaccagac 1440
tgggtttctg tttacgaagg tttgcacaga tctggtaacg ctggtgacat cgacagattg 1500
ttggctaagc acgctgcttt ggctaagaga ttgaagaaga tgttggactt gttgaagcca 1560
caagacaagg ttagagttag ataccaagaa gaaggttctg aattggactt ggacgttgct 1620
atcagatctt tgatcgactt caagggtggt gctactccag acccaagaat caacatgtct 1680
cacagatctg acggtagaga catcgctgtt atgttgttgt tggacttgtc tgaatctttg 1740
aacgaaaagg ctgctggtgc tggtcaaact atcttggaat tgtctcaaga agctgtttct 1800
ttgttggctt ggtctatcga aaagttgggt gacccattcg ctatcgctgg tttccactct 1860
aacactagac acgacgttag atacttccac atcaagggtt actctgaaag atggaacgac 1920
gacgttaagg ctagattggc tgctatggaa gctggttact ctactagaat gggtgctgct 1980
atgagacacg ctgctcacta cttgtctgct agaccagctg acaagaagtt gatgttgatc 2040
ttgactgacg gtagaccatc tgacgttgac gctgctgacg aaagattgtt ggttgaagac 2100
gctagacaag ctgttaagga attggacaga caaggtatct tcgcttactg tatctctttg 2160
gacgctcaat tgaaggctgg tgctgacgac tacgttgctg aaatcttcgg tagacaatac 2220
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actaagtaa 2289
<210> 8
<211> 762
<212> PRT
<213> Thiobacillus denitrificans
<400> 8
Met Ala Ala Tyr Trp Lys Ala Leu Asp Thr Arg Phe Ala Gln Val Glu
1 5 10 15
Glu Val Phe Asp Asp Cys Met Ala Glu Ala Leu Thr Val Leu Ser Ala
20 25 30
Glu Gly Val Ala Ala Tyr Leu Glu Ala Gly Arg Val Ile Gly Lys Leu
35 40 45
Gly Arg Gly Val Glu Pro Met Leu Ala Phe Leu Glu Glu Trp Pro Ser
50 55 60
Thr Ala Gln Ala Val Gly Glu Ala Ala Leu Pro Met Val Met Ala Leu
65 70 75 80
Ile Gln Arg Met Gln Lys Ser Pro Asn Gly Lys Ala Ile Ala Pro Phe
85 90 95
Leu Gln Thr Leu Ala Pro Val Ala Arg Arg Leu Gln Ser Ala Glu Gln
100 105 110
Leu Gln His Tyr Val Asp Val Thr Leu Asp Phe Met Thr Arg Thr Thr
115 120 125
Gly Ser Ile His Gly His His Thr Thr Phe Pro Ser Pro Gly Leu Pro
130 135 140
Glu Phe Phe Ala Gln Ala Pro Asn Leu Leu Asn Gln Leu Thr Leu Ala
145 150 155 160
Gly Leu Arg Asn Trp Val Glu Tyr Gly Ile Arg Asn Tyr Gly Thr His
165 170 175
Pro Glu Arg Gln Gln Asp Tyr Phe Ser Leu Gln Ser Ala Asp Ala Arg
180 185 190
Ala Val Leu Gln Arg Glu Arg His Gly Thr Leu Leu Val Asp Val Glu
195 200 205
Arg Lys Leu Asp Leu Tyr Leu Arg Gly Leu Trp Gln Asp His Asp His
210 215 220
Leu Val Pro Tyr Ser Thr Ala Phe Asp Glu Ile Arg Lys Pro Val Pro
225 230 235 240
Tyr Tyr Asp Lys Leu Gly Met Arg Leu Pro Asp Val Tyr Asp Asp Leu
245 250 255
Val Leu Pro Cys Pro Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gly Gly Glu Asp Val
260 265 270
Leu Val Ser Gly Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Thr Leu Ala His Met Val
275 280 285
Gly His Arg Arg Trp Ser Glu Ala Gln Ile Ala Asp Asn Trp Ser Pro
290 295 300
Phe Gln Arg Met Ala Val Glu Phe Phe Glu Asp Cys Arg Val Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Met Arg Glu Tyr Pro Gly Leu Ala Arg Ile Phe Arg Ala Leu
325 330 335
His Pro Lys Pro Val Glu Ala Ala Cys Asp Gly Glu Thr Thr Ser Cys
340 345 350
Leu Arg His Arg Leu Ala Met Leu Ser Arg Ala Phe Ile Asp Pro Asp
355 360 365
His Gly Tyr Ala Ala Pro Val Leu Asn Asp Phe Val Ala Arg Phe His
370 375 380
Ala Arg Leu Ala Asp Gly Thr Ser Ser Thr Ser Glu Met Ala Asp Leu
385 390 395 400
Ala Leu Ser Tyr Val Ala Lys Thr Arg Arg Pro Ser Asp Gln Phe Ala
405 410 415
Lys Val His Phe Asp Asp Thr Val Val Asp Tyr Arg Asp Asp Asn Arg
420 425 430
Gln Leu Trp Lys Phe Ile Glu Glu Gly Asp Glu Glu Glu Ala Phe Asp
435 440 445
Ala Lys Arg Lys Ile Glu Pro Gly Glu Glu Ile Gln Gly Leu Pro Pro
450 455 460
Arg His Tyr Pro Glu Trp Asp Tyr Thr Ser Gln Thr Tyr Arg Pro Asp
465 470 475 480
Trp Val Ser Val Tyr Glu Gly Leu His Arg Ser Gly Asn Ala Gly Asp
485 490 495
Ile Asp Arg Leu Leu Ala Lys His Ala Ala Leu Ala Lys Arg Leu Lys
500 505 510
Lys Met Leu Asp Leu Leu Lys Pro Gln Asp Lys Val Arg Val Arg Tyr
515 520 525
Gln Glu Glu Gly Ser Glu Leu Asp Leu Asp Val Ala Ile Arg Ser Leu
530 535 540
Ile Asp Phe Lys Gly Gly Ala Thr Pro Asp Pro Arg Ile Asn Met Ser
545 550 555 560
His Arg Ser Asp Gly Arg Asp Ile Ala Val Met Leu Leu Leu Asp Leu
565 570 575
Ser Glu Ser Leu Asn Glu Lys Ala Ala Gly Ala Gly Gln Thr Ile Leu
580 585 590
Glu Leu Ser Gln Glu Ala Val Ser Leu Leu Ala Trp Ser Ile Glu Lys
595 600 605
Leu Gly Asp Pro Phe Ala Ile Ala Gly Phe His Ser Asn Thr Arg His
610 615 620
Asp Val Arg Tyr Phe His Ile Lys Gly Tyr Ser Glu Arg Trp Asn Asp
625 630 635 640
Asp Val Lys Ala Arg Leu Ala Ala Met Glu Ala Gly Tyr Ser Thr Arg
645 650 655
Met Gly Ala Ala Met Arg His Ala Ala His Tyr Leu Ser Ala Arg Pro
660 665 670
Ala Asp Lys Lys Leu Met Leu Ile Leu Thr Asp Gly Arg Pro Ser Asp
675 680 685
Val Asp Ala Ala Asp Glu Arg Leu Leu Val Glu Asp Ala Arg Gln Ala
690 695 700
Val Lys Glu Leu Asp Arg Gln Gly Ile Phe Ala Tyr Cys Ile Ser Leu
705 710 715 720
Asp Ala Gln Leu Lys Ala Gly Ala Asp Asp Tyr Val Ala Glu Ile Phe
725 730 735
Gly Arg Gln Tyr Thr Val Ile Asp Arg Val Glu Arg Leu Pro Glu Arg
740 745 750
Leu Pro Glu Leu Phe Met Ala Leu Thr Lys
755 760
<210> 9
<211> 1647
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GroEL gene (synthetic, based on GroEL from E. coli - codon
optimized, original sequence obtained from Durfee et al 2008,
Gene ID: 6061450, Protein ID: YP_001732912.1)
<400> 9
atggctgcta aggacgttaa gttcggtaac gacgctagag ttaagatgtt gagaggtgtt 60
aacgttttgg ctgacgctgt taaggttact ttgggtccaa agggtagaaa cgttgttttg 120
gacaagtctt tcggtgctcc aactatcact aaggacggtg tttctgttgc tagagaaatc 180
gaattggaag acaagttcga aaacatgggt gctcaaatgg ttaaggaagt tgcttctaag 240
gctaacgacg ctgctggtga cggtactact actgctactg ttttggctca agctatcatc 300
actgaaggtt tgaaggctgt tgctgctggt atgaacccaa tggacttgaa gagaggtatc 360
gacaaggctg ttactgctgc tgttgaagaa ttgaaggctt tgtctgttcc atgttctgac 420
tctaaggcta tcgctcaagt tggtactatc tctgctaact ctgacgaaac tgttggtaag 480
ttgatcgctg aagctatgga caaggttggt aaggaaggtg ttatcactgt tgaagacggt 540
actggtttgc aagacgaatt ggacgttgtt gaaggtatgc aattcgacag aggttacttg 600
tctccatact tcatcaacaa gccagaaact ggtgctgttg aattggaatc tccattcatc 660
ttgttggctg acaagaagat ctctaacatc agagaaatgt tgccagtttt ggaagctgtt 720
gctaaggctg gtaagccatt gttgatcatc gctgaagacg ttgaaggtga agctttggct 780
actttggttg ttaacactat gagaggtatc gttaaggttg ctgctgttaa ggctccaggt 840
ttcggtgaca gaagaaaggc tatgttgcaa gacatcgcta ctttgactgg tggtactgtt 900
atctctgaag aaatcggtat ggaattggaa aaggctactt tggaagactt gggtcaagct 960
aagagagttg ttatcaacaa ggacactact actatcatcg acggtgttgg tgaagaagct 1020
gctatccaag gtagagttgc tcaaatcaga caacaaatcg aagaagctac ttctgactac 1080
gacagagaaa agttgcaaga aagagttgct aagttggctg gtggtgttgc tgttatcaag 1140
gttggtgctg ctactgaagt tgaaatgaag gaaaagaagg ctagagttga agacgctttg 1200
cacgctacta gagctgctgt tgaagaaggt gttgttgctg gtggtggtgt tgctttgatc 1260
agagttgctt ctaagttggc tgacttgaga ggtcaaaacg aagaccaaaa cgttggtatc 1320
aaggttgctt tgagagctat ggaagctcca ttgagacaaa tcgttttgaa ctgtggtgaa 1380
gaaccatctg ttgttgctaa cactgttaag ggtggtgacg gtaactacgg ttacaacgct 1440
gctactgaag aatacggtaa catgatcgac atgggtatct tggacccaac taaggttact 1500
agatctgctt tgcaatacgc tgcttctgtt gctggtttga tgatcactac tgaatgtatg 1560
gttactgact tgccaaagaa cgacgctgct gacttgggtg ctgctggtgg tatgggtggt 1620
atgggtggta tgggtggtat gatgtaa 1647
<210> 10
<211> 548
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 10
Met Ala Ala Lys Asp Val Lys Phe Gly Asn Asp Ala Arg Val Lys Met
1 5 10 15
Leu Arg Gly Val Asn Val Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly
20 25 30
Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Asp Lys Ser Phe Gly Ala Pro Thr
35 40 45
Ile Thr Lys Asp Gly Val Ser Val Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp
50 55 60
Lys Phe Glu Asn Met Gly Ala Gln Met Val Lys Glu Val Ala Ser Lys
65 70 75 80
Ala Asn Asp Ala Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala
85 90 95
Gln Ala Ile Ile Thr Glu Gly Leu Lys Ala Val Ala Ala Gly Met Asn
100 105 110
Pro Met Asp Leu Lys Arg Gly Ile Asp Lys Ala Val Thr Ala Ala Val
115 120 125
Glu Glu Leu Lys Ala Leu Ser Val Pro Cys Ser Asp Ser Lys Ala Ile
130 135 140
Ala Gln Val Gly Thr Ile Ser Ala Asn Ser Asp Glu Thr Val Gly Lys
145 150 155 160
Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Lys Glu Gly Val Ile Thr
165 170 175
Val Glu Asp Gly Thr Gly Leu Gln Asp Glu Leu Asp Val Val Glu Gly
180 185 190
Met Gln Phe Asp Arg Gly Tyr Leu Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Lys Pro
195 200 205
Glu Thr Gly Ala Val Glu Leu Glu Ser Pro Phe Ile Leu Leu Ala Asp
210 215 220
Lys Lys Ile Ser Asn Ile Arg Glu Met Leu Pro Val Leu Glu Ala Val
225 230 235 240
Ala Lys Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly
245 250 255
Glu Ala Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Thr Met Arg Gly Ile Val Lys
260 265 270
Val Ala Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met
275 280 285
Leu Gln Asp Ile Ala Thr Leu Thr Gly Gly Thr Val Ile Ser Glu Glu
290 295 300
Ile Gly Met Glu Leu Glu Lys Ala Thr Leu Glu Asp Leu Gly Gln Ala
305 310 315 320
Lys Arg Val Val Ile Asn Lys Asp Thr Thr Thr Ile Ile Asp Gly Val
325 330 335
Gly Glu Glu Ala Ala Ile Gln Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Gln Gln
340 345 350
Ile Glu Glu Ala Thr Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg
355 360 365
Val Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala
370 375 380
Thr Glu Val Glu Met Lys Glu Lys Lys Ala Arg Val Glu Asp Ala Leu
385 390 395 400
His Ala Thr Arg Ala Ala Val Glu Glu Gly Val Val Ala Gly Gly Gly
405 410 415
Val Ala Leu Ile Arg Val Ala Ser Lys Leu Ala Asp Leu Arg Gly Gln
420 425 430
Asn Glu Asp Gln Asn Val Gly Ile Lys Val Ala Leu Arg Ala Met Glu
435 440 445
Ala Pro Leu Arg Gln Ile Val Leu Asn Cys Gly Glu Glu Pro Ser Val
450 455 460
Val Ala Asn Thr Val Lys Gly Gly Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Asn Ala
465 470 475 480
Ala Thr Glu Glu Tyr Gly Asn Met Ile Asp Met Gly Ile Leu Asp Pro
485 490 495
Thr Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Tyr Ala Ala Ser Val Ala Gly
500 505 510
Leu Met Ile Thr Thr Glu Cys Met Val Thr Asp Leu Pro Lys Asn Asp
515 520 525
Ala Ala Asp Leu Gly Ala Ala Gly Gly Met Gly Gly Met Gly Gly Met
530 535 540
Gly Gly Met Met
545
<210> 11
<211> 294
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GroES gene (synthetic, based on GroES E. coli - codon optimized,
original sequence obtained from Durfee et al 2008, Gene ID:
6061370, Protein ID: YP_001732911.1)
<400> 11
atgaacatca gaccattgca cgacagagtt atcgttaaga gaaaggaagt tgaaactaag 60
tctgctggtg gtatcgtttt gactggttct gctgctgcta agtctactag aggtgaagtt 120
ttggctgttg gtaacggtag aatcttggaa aacggtgaag ttaagccatt ggacgttaag 180
gttggtgaca tcgttatctt caacgacggt tacggtgtta agtctgaaaa gatcgacaac 240
gaagaagttt tgatcatgtc tgaatctgac atcttggcta tcgttgaagc ttaa 294
<210> 12
<211> 97
<212> PRT
<213> E. coli
<400> 12
Met Asn Ile Arg Pro Leu His Asp Arg Val Ile Val Lys Arg Lys Glu
1 5 10 15
Val Glu Thr Lys Ser Ala Gly Gly Ile Val Leu Thr Gly Ser Ala Ala
20 25 30
Ala Lys Ser Thr Arg Gly Glu Val Leu Ala Val Gly Asn Gly Arg Ile
35 40 45
Leu Glu Asn Gly Glu Val Lys Pro Leu Asp Val Lys Val Gly Asp Ile
50 55 60
Val Ile Phe Asn Asp Gly Tyr Gly Val Lys Ser Glu Lys Ile Asp Asn
65 70 75 80
Glu Glu Val Leu Ile Met Ser Glu Ser Asp Ile Leu Ala Ile Val Glu
85 90 95
Ala
Claims (19)
- 리불로스-1,5-바이포스페이트 카르복실라제 옥시게나제 (루비스코, Rubisco) 및 포스포리불로키나제 (PRK)를 암호화하는 하나 이상의 재조합, 특히 이종, 핵산 서열을 기능적으로 발현하는, 특히 형질전환 (transgenic) 효모 세포인, 재조합 효모 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 효모 세포가 하나 이상의 원핵 분자 샤페론을 추가로 포함하고, 상기 사페론이 바람직하게는 세균, 더욱 바람직하게는 에스케리치아 콜라이 (E. coli)로부터 유래하는 것인, 재조합 효모 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 샤페론이 GroEL, GroES, GroEL의 기능적 동족체 및 GroES의 기능적 동족체의 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 효모 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루비스코가 단일 소단위 루비스코인 것인, 재조합 효모 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루비스코가 원핵 II형 루비스코인 것인, 재조합 효모 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 베티커스 (Saccharomyces beticus), 사카로마이세스 페르멘타티 (Saccharomyces fermentati), 사카로마이세스 파라독서스 (Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 우바룸 (Saccharomyces uvarum) 및 사카로마이세스 베이아누스 (Saccharomyces bayanus)와 같은 사카로마이세라세아에 (Saccharomyceraceae); 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 쉬조사카로마이세스 자포니카스 (Schizosaccharomyces japonicas), 쉬조사카로마이세스 옥토스포루스 (Schizosaccharomyces octosporus) 및 쉬조사카로마이세스 크리오필루스 (Schizosaccharomyces cryophilus)와 같은 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces); 토룰라스포라 델부르에키 (Torulaspora delbrueckii)와 같은 토룰라스포라 (Torulaspora); 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus)와 같은 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces); 피치아 스티피티스 (Pichia stipitis), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 피치아 안구스타 (Pichia angusta)와 같은 피치아 (Pichia); 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailii)와 같은 자이고사카로마이세스 ( Zygosaccharomyces); 브레타노마이세스 인테르메디우스 (Brettanomyces intermedius), 브레타노마이세스 브뤼셀렌시스 (Brettanomyces bruxellensis), 브레타노마이세스 아노말러스 (Brettanomyces anomalus), 브레타노마이세스 커스터시아누스 (Brettanomyces custersianus), 브레타노마이세스 나아르데넨시스 (Brettanomyces naardenensis), 브레타노마이세스 나누스 (Brettanomyces nanus), 데케라 브뤼셀렌시스 (Dekkera bruxellensis) 및 데케라 아노말라 (Dekkera anomala)와 같은 브레타노마이세스 (Brettanomyces); 메츠크니코위아 (Metschnikowia), 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis)와 같은 이사첸키아 (Issatchenkia), 클로에케라 아피쿨라타 (Kloeckera apiculata)와 같은 클로에케라 (Kloeckera); 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans)와 같은 아우레오바시디움 (Aureobasidium)의 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 세포인 것인, 재조합 효모 세포.
- 제6항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세라세아에의 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 효모 세포.
- 제7항에 있어서, 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지에, 사카로마이세스 파스토리아누스, 사카로마이세스 베티커스, 사카로마이세스 페르멘타티, 사카로마이세스 파라독서스, 사카로마이세스 우바룸 및 사카로마이세스 베이아누스의 군으로부터 선택되는 것인, 재조합 효모 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, PRK가 진핵생물로부터 유래하는 PRK인 것인, 효모 세포.
- 제9항에 있어서, PRK가 석죽목 (Caryophyllales), 특히 비듬과 (Amaranthaceae)로부터 선택되는 식물, 특히 시금치 (Spinacia)로부터 유래하는 것인, 효모 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 루비스코가, 세포 추출물에 의한 리불로스-1,5-비스포스페이트-의존성 14C-중탄산염 도입 속도로 정의되는, 적어도 1 nmol.min- 1.(mg 단백질) (30℃에서, 실시예 4에 언급된 방법에 의해 측정될 수 있는 바와 같음)의 활성을 갖는 것인, 효모 세포.
- 효모 세포에서 이종 폴리펩티드의 기능적 발현을 위한 하나 이상의 벡터로서, 상기 벡터 또는 벡터들이 루비스코 및 PRK를 암호화하는 하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하고, 상기 루비스코가 탄소 고정(carbon fixation) 활성을 나타내는 것인, 벡터.
- 알코올, 유기산 또는 아미노산을 제조하는 방법으로서, 탄소원, 특히 탄수화물을 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 효모 세포와 함께 발효시켜, 알코올, 유기산 또는 아미노산을 형성하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 효모 세포가 반응 배지 중에 존재하는 것인, 방법.
- 제13항에 있어서, 반응 배지가 이산화탄소를 포함하고, 여기서 상기 반응 배지 내 이산화탄소 농도가 이산화탄소 포화 농도의 적어도 5%, 특히 적어도 10%, 더욱 특히 적어도 20%인 것인, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 에탄올이 형성되는 것인, 방법.
- 재조합 화학영양합성 (chemotrophic) 미생물, 특히 화학영양합성 진핵 미생물에서 전자 수용체로서 이산화탄소의 용도.
- 제16항에 있어서, 상기 미생물이
- (자연적으로) 독립영양 (autotrophic) 생물로부터의 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 서열로, 상기 폴리펩티드는 탄산무수화효소, 카르복실라제, 옥시게나제, 히드로게나제, 디히드로게나제, 이소머라제, 알돌라제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 포스파타제, 에피머라제, 키나제, 카르복시키나제, 산화화원효소, 아코니타제, 푸마라제, 리덕타제, 락토나제 (lactonases), 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복실라제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제, 삼탄당인산 이소머라제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 세도헵툴로스-1,7-비스포스파타제, 포스포펜토스 이소머라제, 포스포펜토스 에피머라제, 포스포리불로키나제 (PRK), 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 6-포스포글루코노락토나제, 6-포스포글루코네이트 디히드로게나제, 리불로스 5-포스페이트 이소머라제, 리불로스 5-포스페이트 3-에피머라제, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 옥시게나제, 락테이트 디히드로게나제, 말레이트 신타제, 이소시트레이트 리아제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 프럭토스-1,6-비스포스파타제, 포스포글루코이소머라제, 글루코스-6-포스파타제, 헥소키나제, 글루코키나제, 포스포프럭토키나제, 피루베이트 키나제, 석시네이트 디히드로게나제, 시트레이트 신타제, 이소시트레이트 디히드로게나제, α-케토글루타레이트 디히드로게나제, 석시닐-CoA 신세타제, 말레이트 디히드로게나제, 뉴클레오시드-다이포스페이트 키나제, 자일로스 리덕타제, 자일리톨 디히드로게나제, 자일로스 이소머라제, 이소프레노이드 신타제, 및 자일로네이트 디히드로타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 이종 핵산 서열; 및
- 상기 폴리펩티드를 위한 제1 원핵 샤페론을 암호화하는 이종 핵산 서열과 바람직하게는 상기 폴리펩티드를 위한 - 제1과는 다른 - 제2 원핵 샤페론을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 용도. - 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 미생물이 혐기적 조건하에서 유기 화합물을 생산하고/하거나 상기 이산화탄소가 전자 공여체로서 NADH를 이용한 공정에서 전자 수용체로서 작용하는 것인, 용도.
- 미생물이 화학영양합성 (비-광합성) 조건하에서 전자 수용체로서 이산화탄소를 사용하도록 허용하는 하나 이상의 재조합 효소를 포함하는 효소적 시스템을 갖는 재조합 미생물, 특히 진핵 미생물, 특히 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 재조합 미생물.
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