CA2973912A1 - Combinaison de chaperonnes bacteriennes affectant positivement la physiologie d'une cellule eucaryote native ou portant une ingenierie - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'expression d'une combinaison spécifique de trois chaperonnes bactériennes dans une cellule eucaryote, ce qui améliore significativement ses propriétés de croissance et de résistance à des contraintes physico chimiques, en particulier lorsque cette cellule comporte une ingénierie supplémentaire mettant en uvre un ou plusieurs gènes non-natifs. Une combinaison de chaperonnes préférée comprend les chaperonnes GroES et GroEL d' E. coli et la chaperonne RbcX de Synechococcus elongatus.

Description

COMBINAISON DE CHAPERONNES BACTERIENNES AFFECTANT POSITIVEMENT LA PHYSIOLOGIE
D'UNE CELLULE EUCARYOTE NATIVE OU PORTANT UNE INGENIERIE
La présente invention concerne le domaine de l'ingénierie cellulaire, en particulier des cellules eucaryotes. Plus particulièrement, l'invention concerne des cellules eucaryotes présentant des propriétés de croissance et/ou métaboliques améliorées, ainsi que leurs utilisations pour la production de composés d'intérêt. L'invention concerne en particulier des cellules eucaryotes exprimant une combinaison spécifique de chaperonnes. L'invention trouve des applications notamment dans le domaine de la production de protéines recombinantes.
Arrière-plan technologique Il existe actuellement de nombreux systèmes d'expression de protéines d'intérêt utilisés dans des domaines aussi variés que les biotechnologies, l'agroalimentaire, l'industrie du médicament ou la recherche diagnostic, fondamentale et/ou appliquée. Parmi ces systèmes d'expression, les cellules eucaryotes et en particulier les levures jouent un rôle important en raison notamment de leur capacité de glycosylation et de leur facilité de culture en conditions industrielles. Ces cellules présentent cependant des limites, dues notamment à des contraintes de toxicité liées par exemple à l'accumulation de produits d'intérêt (par exemple une grande concentration d'éthanol ou autre alcool) ou encore à une toxicité directe ou indirecte des protéines exprimées ou à la charge énergétique que requiert la présence des plasmides d'expression.
Résumé de l'invention La présente invention fournit des cellules eucaryotes ayant des performances améliorées, permettant le développement de systèmes d'expression optimisés.
Dans le cadre d'un projet visant à introduire chez la levure un cycle de Calvin synthétique, les inventeurs ont observé de manière surprenante que la coexpression, chez la levure, d'un ensemble de trois chaperonnes bactériennes(RbcX, GroES et GroEL) conférait aux cellules eucaryotes des propriétés métaboliques remarquables, notamment en terme d'expression et de repliement fonctionnel de protéines hétérologues ou endogènes. Poursuivant leurs

2 investigations, les inventeurs ont également mis en évidence que cette combinaison de chaperonnes permettait en outre d'accélérer la croissance des levures et de lever les effets toxiques d'autres ingénieries, par exemple lorsque la kinase PRK est co-exprimée dans la cellule. Les inventeurs ont par ailleurs vérifié et obtenu les mêmes effets sur les performances sur différentes cellules eucaryotes, confirmant l'intérêt et le grand potentiel de ces résultats inattendus.
Un objet de la présente invention concerne donc une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle exprime les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL.
Dans un mode particulier, la présente invention porte sur une cellule eucaryote transformée, 1 0 caractérisée en ce qu'elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne RbcX
impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
L'invention vise également une cellule eucaryote contenant:
(i) une séquence codant pour une chaperonne RbcX sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une séquence codant pour une chaperonne GroES sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ; et (iii) une séquence codant pour une chaperonne GroEL sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.

3 Selon un mode particulier, les cellules eucaryotes de l'invention ne contiennent pas de séquence codant pour la sous-unité RbcL et/ou RbcS d'une enzyme RuBisCO de forme I
d' origine bactérienne.
L'invention propose notamment une levure transformée comme indiqué ci-dessus.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression d'une chaperonne RbcX et des chaperonnes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote, et notamment pour augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule eucaryote et/ou augmenter la résistance de ladite cellule eucaryote à un stress environnemental et/ou augmenter la résistance de ladite cellule à
la toxicité d'un composé synthétisé par la cellule eucaryote et/ou pour la production d'une protéine recombinante.
L'invention a aussi pour objet un procédé biotechnologique pour produire au moins un composé
sélectionné parmi les molécules chimiques et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule eucaryote selon l'invention dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule eucaryote, de ce composé, et une étape de récupération dudit composé.
L'invention propose plus particulièrement un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et optionnellement (iii) la récupération ou purification de ladite protéine.
Bref description de la figure Figure 1: Cinétiques de production d'éthanol des souches lb, 18b, 102, 15, 14b. La barre d'erreur représente un écart-type de 3 cultures indépendantes.
Description détaillée En travaillant sur l'expression de certaines protéines chaperonnes bactériennes dans une cellule eucaryote, les inventeurs ont découvert que de manière tout à fait étonnante des chaperonnes bactériennes peuvent être exprimées dans le cyto sol d'une cellule eucaryote et conserver leur

4 fonction chaperonne dans ladite cellule eucaryotes. La fonction chaperonne bactérienne s'ajoute à la fonction chaperonne cytosolique déjà présente dans la cellule eucaryote. Les inventeurs ont en outre découvert que l'expression d'un triplet de chaperonnes particulier, à
savoir les chaperonnes bactériennes GroEL et GroES et la chaperonne RbcX, confère à la cellule eucaryote transformée qui les exprime des propriétés particulièrement intéressantes en termes de croissance, d'expression et de repliement fonctionnel de protéines.
Les effets observés requièrent obligatoirement la présence simultanée des trois chaperonnes citées, provenant préférentiellement d'au moins deux microorganismes différents. S'il était connu que la coexpression de chaperonnes est de nature à améliorer dans un système bactérien le repliement de protéines hétérologues et donc potentiellement les performances d'un bioprocédé en dépendant, il n'était pas prévisible qu'une combinaison spécifique inter-organismes de trois protéines chaperonnes bactériennes, puisse se révéler particulièrement efficace en étant exprimée en contexte eucaryote. Les mécanismes moléculaires conduisant aux effets de l'invention sont actuellement inconnus même si ils sont probablement, au moins pour partie, liés au repliement des protéines ou au contrôle de leur devenir intracellulaire. Un rôle généraliste surprenant est joué par la protéine de la famille RbcX (décrite dans l'art antérieur comme spécialisée pour l'association fonctionnelle du complexe RuBisCO des organismes photosynthétiques), en présence des chaperonnes GroES et GroEL qui jouent des rôles complémentaires. Cette caractéristique de l'invention laisse penser que l'effet observé ne peut être totalement attribué à un rôle de repliement facilité et pourrait impliquer d'autres mécanismes comme une modulation de la durée de vie de protéines spécifiques, l'assemblage de complexes ou la modification de leurs propriétés, voire des effets spécifiques de nature à
définir.
Dans ce contexte, l'invention propose donc de transformer des cellules eucaryotes de manière à ce qu'elles expriment un triplet de chaperonnes particulier, à savoir les chaperonnes bactériennes GroEL et GroES et la chaperonne RbcX. De telles cellules transformées peuvent trouver de nombreuses applications, notamment dans le cadre de la production de protéines recombinantes.
L'invention a donc pour objet une cellule eucaryote, caractérisée en ce qu'elle exprime les chaperonnes RbcX, GroES et GroEL.

5 Les chaperonnes GroEL et GroES appartiennent à la famille des protéines de choc thermique (HSP). Ces chaperonnes sont présentes dans de nombreuses bactéries. Dans le contexte de l'invention, ces chaperonnes sont désignées comme chaperonnes généralistes en ce sens qu'elles sont connues pour co-agir afin de permettre un repliement efficace d'un très grand nombre de protéines (M. mayhew et al. 1996, Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex Nature 1996 Feb 1 ;379(6564) :420-6). Selon l'invention, les chaperonnes GroEL et GroES peuvent provenir de n'importe quelle bactérie les exprimant, et notamment à titre d'exemple, de E. coli (Gene ID: 948655 et 948665), S.
elongatus (Gene ID: 3199735, 3199535 et 3198035), S. pneumonia (GenBank accession number:
AF117741), S. pyogenes (GenBank accession number: SPGROELGN), S. aureus (GenBank accession number: STAHSP) ou P. aeruginosa (GenBank accession number: ATCC9027). L'homme du métier est parfaitement en mesure d'identifier dans une bactérie les séquences nucléiques susceptibles de codées pour l'une ou l'autre de ces chaperonnes. A titre informatif, on notera que la similarité de séquence des chaperonnes (% d'acides aminés identiques dans l'alignement) est de 61 % entre GroEL1 de S. elongatus et GroEL de E. coli; de 56 % entre GroEL2 de S.
elongatus et GroEL de E. coli ; de 63 % entre GroEL1 et GroEL2 de S.
elongatus.
Les cellules selon l'invention expriment en outre la chaperonne RbcX connue chez les cyanobactéries et les plantes pour participer au bon assemblage des sous-unités RbcL et RbcS
de la Rubisco. Dans le contexte de l'invention, cette chaperonne est désignée comme 2 0 chaperonne spécifique en ce sens que cette protéine est connue pour jouer un rôle dans l'association fonctionnelle de complexes protéiques, comme c'est notamment le cas avec la Rubisco (S. Saschenbrecker et al. 2007, Structure and function of RbcX, an assembly chaperone for hexadecameric Rubisco , Cell. 2007 Jun 15; 129(6) :1189-200).
Selon l'invention, la chaperonne RbcX peut provenir de n'importe quelle cyanobactérie l'exprimant, et notamment à titre d'exemple, de S. elongatus (SEQ ID N 3), Synechocystis sp. (Kaneko et al., "Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp.
strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein- coding regions." DNA Res. 3 (3), 109-136 (1996)), Anabaena sp. (Li et al. J. Bacteriol.
(1997), 179(11), 3793-3796), Microcystis sp., Tychonema sp., Planktothrix sp.
or Nostoc sp.
(Rudi et al., J. Bacteiiol. (1998), 180(13), 3453-3461).
Dans le contexte de l'invention, une activité chaperonne s'entend d'une action sur le repliement de protéines et/ou sur l'association fonctionnelle de complexes protéiques.

6 Dans un mode particulier de l'invention, les chaperonnes utilisées proviennent préférentiellement de deux organismes différents. Selon l'invention, les chaperonnes peuvent provenir d'une ou plusieurs bactéries différentes. De préférence, les trois chaperonnes proviennent d'au moins deux espèces bactériennes Gram négatives éloignées, dont l'une au moins est une cyanobactérie.
Selon une autre mise en oeuvre particulière de la présente invention, au moins une des chaperonnes généralistes GroES et GroEL ne provient ni d'une cyanobactérie ni d'une autre bactérie exprimant un complexe RuBisCO. Selon l'invention, les chaperonnes GroES et GroEL
peuvent provenir d'une même bactérie ou de deux bactéries différentes. Dans un exemple de réalisation particulier, les chaperonnes GroES et GroEL proviennent de E. cou.
Dans un exemple de réalisation particulier, les chaperonnes GroES et GroEL
proviennent de E.
Coli et la chaperonne RbcX provient de Synechococcus elongatus.
Dans un autre exemple de réalisation, les trois chaperonnes GroES, GroEL et RbcX proviennent de Synechococcus elongatus. Dans un tel cas, la cellule transformée peut exprimer l'une ou l'autre ou les deux isoformes (GroEL1 et GroEL2) de la chaperonne GroEL, préférentiellement les deux isoformes.
Dans le contexte de l'invention, on considère qu'une protéine provient d'un organisme donné dès lors qu'elle présente une identité de séquence en acides aminés supérieure à 95% et la même fonction que la protéine considérée dudit organisme.
Dans le présent texte, on désigne par "GroES" et "GroEL" toute protéine présentant une activité
de chaperonne et ayant entre 65 et 100 % d'identité en acides aminés avec les GroES et GroEL
de E. cou i K 12, respectivement. Alternativement, "GroES" et "GroEL"
désignent des chaperonnes généralistes présentant un pourcentage d'identité inférieur, et notamment entre 55 et 65%, et plus particulièrement entre 56 et 63%, telles que les chaperonnes généralistes de S.
elongatus. L'activité chaperonne d'un variant des chaperonnes généralistes GroES et GroEL
d'E. cou i pourra être vérifiée par exemple en substituant dans les différents exemples décrits ci-dessous, la cassette d'expression codant pour GroES ou GroEL natif de E. cou i par des variants de chaperonnes à évaluer.

7 La chaperonne RbcX est très éloignée de GroEL et GroES et sa séquence ne peut être alignée avec les séquences de ces deux chaperonnes.
Dans le présent texte, on désigne par "RbcX" toute protéine, notamment de cyanobactérie, présentant une activité de chaperonne et ayant plus de 50% d'identité de séquence en acides aminés avec la chaperonne RbcX codée par la séquence SEQ ID No : 3 et conservant l'activité
de chaperonne spécifique de cette protéine. L'activité chaperonne spécifique peut être vérifiée dans une levure exprimant les sous unités RbcL et RbcS de la RuBisCO de S.
elongatus, en remplaçant la cassette d'expression incluant la séquence SEQ ID N 3 par toute autre séquence à évaluer, et en mesurant par un test in vitro sur des extraits cellulaires l'activité RuBisCO ainsi obtenue.
De préférence, la présente invention est mise en oeuvre avec une chaperonne RbcX dont l'identité de séquence en acides aminés avec la chaperonne RbcX codée par la SEQ ID No : 3 est supérieure à 80%, préférentiellement supérieure à 90 %, plus préférentiellement supérieure à 95%, encore plus préférentiellement supérieure à 99%.
L'invention peut être mise en oeuvre avec tout type de cellule eucaryote, provenant d'un organisme unicellulaire ou pluricellulaire. Notamment, la combinaison de chaperonnes selon l'invention peut être exprimée dans une cellule de levure, de champignon, de plante, d'animal tel qu'un mammifère, etc.
Notamment, la présente invention se rapporte à une levure transformée exprimant une chaperonne spécifique RbcX, une chaperonne bactérienne généraliste GroES, et une chaperonne bactérienne généraliste GroEL.
Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à une levure transformée, caractérisée en ce qu'elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX
impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
et

8 (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
L'invention peut être mise en oeuvre avec toute levure d'intérêt.
Avantageusement, la levure est choisie parmi Saccharomyces, Yarrowia et Pichia. Par exemple, la levure transformée selon l'invention est une cellule de Saccharomyces cerevisiae. Dans un autre exemple, la levure transformée selon l'invention est une cellule de Yarrowia lipolytica, ou une cellule de Pichia pastoris.
L'utilisation de Pichia pastoris est particulièrement intéressante pour la production de protéines recombinantes. En effet, Pichia présente un système d'expression de protéines eucaryotes très performant tant pour pour la sécrétion et que pour l'expression intracellulaire. Il est particulièrement adapté pour une production à grande échelle de protéines eucaryotes recombinantes. Notamment, Pichia peut être utilisée pour la production de protéines excrétées à haut rendement , afin de réduire les coûts et les délais de production comparativement à ceux associés aux systèmes d'expression des cellules de mammifères.
Yarrowia lipolytica est également adaptée à une utilisation pour la production de protéines recombinantes. En effet, Yarrowia présente (i) une croissance à haute densité, (ii) un taux élevé
de sécrétion, (iii) une absence de la protéase alcaline AEP et (iv) une capacité à produire de l'invertase de S. cerevisiae qui permet l'utilisation du saccharose comme source de carbone (Nicaudet al., 1989). Cette dernière propriété est particulièrement intéressante dans le cas de production industrielle, car cette souche peut croître efficacement sur des substrats bon marché
tels que les mélasses.
L'invention se rapporte également à une cellule eucaryote issue d'un organisme pluricellulaire, telle qu'une cellule animale et notamment une cellule de mammifère, transformée exprimant une chaperonne spécifique RbcX, une chaperonne bactérienne généraliste GroES, et une chaperonne bactérienne généraliste GroEL.
Dans un exemple de réalisation, une telle cellule eucaryote est transformée pour contenir :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX
impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;

9 (ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
et (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
L'invention a notamment trait à une cellule CHO transformée exprimant le triplet de chaperonnes selon l'invention.
Selon l'invention, les gènes codant pour les chaperonnes GroEL, GroES et RbcX
sont introduits dans les cellules eucaryotes sous une forme permettant leur expression dans lesdites cellules.
Ainsi, les séquences codant pour les chaperonnes sont associées à des séquences promotrices permettant leur transcription. Dans un mode de réalisation, une même séquence promotrice est associée aux séquences codant pour les trois chaperonnes. Dans un autre mode de réalisation, la chaperonne RbcX est associée à un promoteur particulier différent du ou des promoteurs associés aux chaperonnes GroEL et GroES. Dans un autre mode de réalisation, chaque chaperonne est associée à un promoteur particulier différent.
Des promoteurs utilisables dans le cadre de la présente invention incluent des promoteurs constitutifs, à savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des états cellulaires et des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs inductibles qui sont activés ou réprimés par des stimuli physiques ou chimiques exogènes, et qui induisent donc un niveau d'expression variable en fonction de la présence ou de l'absence de ces stimuli.
Pour les cassettes d'expression dans les levures, des exemples de promoteurs constitutifs sont ceux des gènes TEF1,TDH3,PGI1,PGK,ADH1. Des exemples de promoteurs inductibles sont les promoteurs tet0-2, GAL10, GAL10-CYCL PH05. De préférence, les promoteurs utilisés seront différents d'une cassette à l'autre. Les cassettes d'expression de l'invention comprennent en outre les séquences usuelles telles que des terminateurs transcriptionnels, et le cas échéant d'autres éléments de régulation de la transcription. Les cassettes d'expression conformes à
l'invention peuvent être insérées dans l'ADN chromosomique de la cellule-hôte, et/ou portées par un ou plusieurs réplicon(s) extra-chromosomiques. La stoechiométrie relative de ces protéines est susceptible de jouer un rôle important dans la mise en oeuvre optimale de la présente invention. Les systèmes de coexpression décrits dans la partie expérimentale ci-après sont particulièrement pertinents à cet égard. L'invention n'est toutefois pas limitée à

l'utilisation de ces systèmes, et elle peut être mise en oeuvre avec n'importe quelle variante d'expression des éléments mentionnés ayant des effets au moins équivalents, tels qu'ils peuvent être mesurés, par exemple, en mesurant la croissance d'une cellule transformée dans un milieu standard pour ladite cellule.
Selon un mode de réalisation avantageux, les trois cassettes d'expression forment un bloc continu d'information génétique. Il peut également être avantageux que les cassettes d'expression des trois chaperonnes soient portées par un élément génétique épisomique unique.
Un aspect particulièrement intéressant de la présente invention est donc un "plug-in génétique"
unique (séquence continue d'ADN) porté par un élément épisomique à origine de réplication 1 0 centromérique. La transformation par cet élément est suffisante pour introduire les propriétés d'intérêt chez des levures sauvages ou portant une ingénierie quelconque.
Selon l'invention, les gènes codant pour chacune des chaperonnes peuvent être introduits en un ou plusieurs exemplaires dans la cellule. Notamment, il est possible d'introduire une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour GroES, une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour GroEL, et une, deux, trois ou plus cassettes contenant une séquence codant pour RbcX. De même, une cassette peut contenir plusieurs exemplaires d'une séquence codant pour GroES, GroEL ou RbcX. Dans le cas où
plusieurs exemplaires de gènes codant pour une chaperonne sont introduits dans la cellule, on utilise préférentiellement la même séquence à chaque fois, c'est-à-dire provenant d'une même 2 0 bactérie. Il est autrement possible d'utiliser des séquences provenant de bactéries différentes.
Comme mentionné plus haut, les cellules selon la présente invention présentes des propriétés améliorées (vitesse de croissance, résistance, capacité de production, etc.).
Ces cellules sont donc particulièrement utiles pour la production de protéines ou autres composés, ou pour l'amélioration de procédés de fermentation.
Production de protéines Aussi, l'invention porte également sur une cellule eucaryote transformée pour exprimer une combinaison de chaperonnes telle que décrite ci-dessus et qui comporte en outre au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, et/ou qui a subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.

Selon une mise en oeuvre préférée de l'invention, la cellule eucaryote transformée est une levure. Selon une autre mise en oeuvre préférée de l'invention, la cellule eucaryote transformée est une cellule CHO.
L'invention a donc également pour objet une levure ou une cellule CHO
transformée pour exprimer une combinaison de chaperonnes telle que décrite ci-dessus, et contenant :
(iv) une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes ;
et/ou (v) ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.
Selon l'invention, il est possible d'utiliser une telle cellule transformée pour produire une ou plusieurs protéines d'intérêt.
Avantageusement, la protéine d'intérêt n'est pas la Rubisco. De même, préférentiellement, la protéine d'intérêt est une protéine autre que la PKR. Aussi, si la cellule eucaryote transformée exprime la Rubisco et/ou la PKR, elle exprime avantageusement au moins une autre protéine hétérologue.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule transformée exprimant le triplet de chaperonnes GroES, GroEL et RbcX et en outre modifiée de manière à exprimer et excréter une protéine recombinante.
La présente invention concerne également un procédé biotechnologique pour produire au moins un composé sélectionné parmi les molécules chimiques, les enzymes, les hormones, les anticorps et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule transformée telle que décrite ci-dessus, dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule, de ce composé, et de manière optionnelle une étape de récupération et/ou purification dudit composé.
L'invention concerne également un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant le triplet de chaperonnes RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et de manière optionnelle (iii) la récupération et/ou purification de ladite protéine. Avantageusement, ladite protéine est une enzyme ou une hormone.
Dans un mode de réalisation particulier, la cellule selon l'invention est transformée de manière à produire au moins une enzyme hétérologue. Par exemple, la cellule est transformée pour produire une enzyme choisie parmi les endotoxines, telle que l'endotoxine de Bacillus thuringiensis, les lipases, les subtilisines, les cellulases et les luciférases.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la cellule selon l'invention est transformée de manière à produire au moins une molécule d'intérêt médical. Par exemple, la cellule est transformée pour produire une hormone, un facteur de croissance, un anticorps, etc.
Préférentiellement, la molécule d'intérêt médical est choisie parmi l'érythropoïétine, les alpha-interférons de type I et/ou II, les facteurs de stimulation des colonies de granulocytes, l'insuline, les hormones de croissance, les activateurs tissulaire du plasminogène.
Avantageusement, la cellule transformée selon l'invention présente une production améliorée de la ou des protéines d'intérêt, comparativement à une cellule recombinante n'exprimant pas la combinaison de chaperonne de l'invention. Dans le contexte de l'invention, une production améliorée s'entend en termes de quantité et/ou de qualité. Notamment, la cellule transformée selon l'invention peut produire des protéines d'intérêt plus actives et/ou plus stables, et donc moins susceptibles d'être dégradées, ce qui permet une plus grande accumulation desdites protéines, comparativement aux protéines hétérologues produites par une cellule recombinante n'exprimant pas la combinaison de chaperonne de l'invention. Ainsi, l'augmentation du niveau d'expression d'une protéine recombinante par une cellule eucaryote transformée selon l'invention s'explique notamment par une plus grande stabilité et donc une plus forte accumulation desdites protéines dans la cellule et/ou le milieu de culture. En outre, l'expression de la combinaison de chaperonnes par la cellule transformée peut de manière avantageuse augmenter la résistance de la cellule recombinante aux protéines recombinantes qu'elle exprime, participant ainsi également à l'augmentation du rendement de production.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression, dans une cellule eucaryote, de la chaperonne spécifique RbcX et des chaperonnes généralistes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie et/ou les performances (notamment la vitesse de croissance) de ladite cellule eucaryote.
Selon une mise en oeuvre préférée de cet aspect de l'invention, la cellule eucaryote dont on cherche à améliorer la physiologie est une levure. Selon une autre mise en oeuvre préférée, ladite cellule eucaryote n'a pas été transformée pour exprimer une séquence codant pour la sous-unité
RbcL d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, et/ou une séquence codant pour la sous-unité RbcS de ladite enzyme RuBisCO.
Comme évoqué plus haut, une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression des chaperonnes généralistes GroES et GroEL et de la chaperonne spécifique RbcX est particulièrement utile pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène ou comprenant au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, par exemple sous forme d'un élément génétique épisomique.
En particulier, l'expression concomitante, dans une cellule, des chaperonnes généralistes GroES et GroEL et de la chaperonne spécifique RbcX permet d'augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule et/ou d'augmenter la résistance de ladite cellule à un stress environnemental, notamment à un stress dû à la toxicité d'un élément présent dans le milieu de culture de la cellule. Une autre application avantageuse est d'augmenter la résistance de la cellule à la toxicité d'un composé synthétisé par elle-même, et donc la production d'un composé
d'intérêt.
De très nombreuses applications de l'invention sont envisageables, notamment toutes les applications liées à l'amélioration du repliement ou de la stabilité
(résistance aux agents chimiques ou thermiques, durée de vie intrinsèque) de protéines homologues ou hétérologues à
la cellule eucaryote transformée. Il peut s'agir des protéines en elles-mêmes, soit d'intérêt en catalyse enzymatique, soit du fait de leurs propriétés intrinsèques (anticorps, protéines thérapeutiques, protéines structurales aux seins de complexes, etc.); Les applications liées à
l'amélioration des performances d'une chaîne métabolique synthétique ou semi-synthétique (impliquant des protéines de la cellule eucaryote transformée) ; dans ce cas, l'avantage est principalement une amélioration du résultat de leurs actions au niveau de la production d'un produit d'intérêt (molécule chimique). Cet effet peut résulter de l'amélioration du repliement ou de la stabilité mais aussi d'autres phénomènes par exemple transport subcellulaire, formation facilitée ou modifiée de complexes, modulation de mécanismes de couplage, etc.
; Les applications résultant d'effets globaux positifs sur un organisme en terme de croissance, de viabilité, d'adaptabilité, de résistance ou de récupération au stress, de formation de produits d'intérêt sans que le mécanisme soit connu ou explicitable.
A titre d'exemples d'applications industrielles de l'invention, on peut citer, sans que cela soit limitatif :
Effet sur le repliement / stabilité des protéines La production de certaines protéines recombinantes d'intérêt considérées comme difficiles, voire impossibles à produire sous forme soluble et fonctionnelle peut être améliorée par la mise en oeuvre de l'invention. Cela s'explique notamment par une correction des défauts de repliement desdites protéines dans la cellule eucaryote transformée selon l'invention. Cela peut être particulièrement utile dans les domaines de la santé, de l'énergie, de la chimie, de l' agroalimentaire, etc.
Protection contre la toxicité induite par les produits d'une ingénierie d'intérêt ou des intermédiaires de cette ingénierie Il peut s'agir de la bio-production de molécules toxiques pour la cellule hôte ou dont le procédé
de production implique des intermédiaires toxiques, par exemple des médicaments (l'hydrocortisone, l'acide artémisinique ou bien encore la trictosinide, certains flavonoïdes pour prendre des procédés développés) ou des molécules réactives comme des cétones insaturée, des aldéhydes (par exemple la vanilline), etc. D'autres exemples correspondent à
des procédés produisant des molécules devenant toxiques à haute concentration, par exemple l'éthanol ou 2 0 d'autres alcools. La production d'éthanol par exemple est limitée par la tolérance des souches de levure à des concentrations élevées d'alcool. D'autres exemples concernent la production de molécules chimiques industrielles très variées, de précurseurs de produits courants ou d'intermédiaires chimiques et bien sûr les biocarburants. Il peut également s'agir de protéines recombinantes dont la production par une cellule recombinante tend à
déséquilibrer le métabolisme, induisant une mort cellulaire. L'utilisation d'une cellule eucaryote exprimant la combinaison de chaperonnes selon l'invention permet avantageusement d'augmenter la résistance de la cellule transformée à la toxicité induite par les protéines recombinantes qu'elle exprime.

Tolérance thermique L'amélioration de la tolérance thermique d'enzymes spécifiques ou d'organismes telles que les levures est un facteur important pour la productivité biotechnologique de nombreuses molécules peu solubles par exemple.
Augmentation de la biomasse d'un microorganisme produite à partir d'une quantité fixée de source de carbone Il s'agit là d'effets qui ne sont pas compris au niveau moléculaire mais qui sont observés dans les premières expériences relatées ci-dessous.
Comme mentionné plus haut, la présente invention porte également sur une molécule d'acide nucléique comprenant :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour la chaperonne RbcX
impliquée dans le repliement d'une enzyme RuBisCO de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
et (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Un exemple de tel "plug-in génétique" est une séquence continue d'ADN
comprenant les trois cassettes mentionnées plus haut (dans un ordre quelconque), portée par un élément épisomique à origine de réplication centromérique.
La partie expérimentale ci-dessous illustre l'invention sans toutefois la limiter, en présentant :
- Les constructions réalisées et les méthodes mises en oeuvre (Exemple 1) ;
- Une première série de tests comparant l'effet de différentes combinaisons de chaperonnes sur la reconstruction de l'activité d'une RuBisCO de type I
constituée de l'assemblage de 16 chaines peptidiques appartenant à deux types différents.
L'expression de différentes associations de chaperonnes a été combinée à l'expression des polypeptides RbcL
et RbcS d'une "RuBisCO de type I". Cela a permis d'analyser le rôle de la combinaison des chaperonnes sur l'activité RuBisCO mesurée in vitro sur des extraits cellulaires de levure (Exemple 2) ;
- Une seconde série de tests impliquant la coexpression des systèmes de chaperonnes dans une levure exprimant de manière conditionnelle une phophoribulokinase (PRK) de S. elongatus.
En absence de l'invention, l'induction de l'expression de la PRK induit sur la levure un effet toxique majeur allant d'une croissance très ralentie à la létalité totale (>99,99 %) selon les souches de S. cerevisiae et les conditions de culture (milieu, niveau d'oxygène, pH).
L'exemplification illustre que l'invention "guérit" cet état morbide sans pour cela interférer avec l'activité de l'enzyme PRK qui reste totalement active (Exemple 3) ;
- Une troisième série de tests démontrant que l'invention rétablit un niveau de croissance sauvage dans une souche portant des autotrophies complémentées par des plasmides même neutres (ne conduisant pas en eux même à l'expression d'autres fonctions que leur propre réplication). Cette situation est typique des ingénieries métaboliques impliquant des éléments génétiques épisomiques. Dans l'exemple, l'invention corrige totalement l'impact négatif sur la croissance lié à la présence de structures génétiques épisomiques (Exemple 4) ; et - Une autre série de tests illustrant que les cellules de l'invention sont particulièrement utiles pour la production de composés et notamment de protéines recombinantes (Exemple 5).
EXEMPLES :
Dans les exemples ci-dessous, et sauf mention contraire, les mêmes acronymes sont utilisés d'un tableau à l'autre et d'une expérimentation à l'autre pour désigner les mêmes éléments.
Exemple 1 : Matériels et méthodes - Construction du "plug-in CHAPERONNES" et des vecteurs - Constructions des différentes souches ¨ Méthodes de culture et de mesure 1.1. Construction du "plug-in CHAPERONNES" et des vecteurs pour S. cerevisiae Certaines constructions décrites ci-dessous permettent l'expression des deux sous-unités RbcS
et RbcL de la RuBisCO (pFPP45) et celle de la phosphoribulokinase PRK (pFPP20) de Synechoccocus elongatus pCC6301. D'autres constructions décrites ci-dessous ont été réalisées afin de permettre d'élaborer, à partir d'un seul et même vecteur d'expression, des combinaisons variables d'expression de la chaperonnes spécifique RbcX de Synechoccocus elongatus et des chaperonnes généralistes de E. cou GroES (Gene ID: 948655), GroEL (Gene ID:
948665) ou de leurs homologues GroES (Gene ID: 3199735), GroEL1 (Gene ID: 3199535) et GroEL2 (Gene ID: 3198035) de Synechoccocus elongatus.
Des gènes synthétiques codant pour les sous-unités RbcS (Gene ID: 3200023) et RbcL (Gene ID : ID: 3200134) et pour la chaperonne spécifique RbcX (Gene ID: 3199060) de la RuBisCO
de Synechoccocus elongatus pCC6301, et optimisés pour l'expression dans la levure, ont été
préparés et clonés dans le plasmide pBSII (Genecust). Des variants optimisés pour l'expression dans la levure, dans lesquels une étiquette HA a été ajoutée à l'extrémité 3' de la séquence codante, ont également été construits. Les séquences de ces gènes synthétiques (sans l'étiquette HA) sont respectivement indiquées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO:3.
De même, des gènes synthétiques codant pour la phosphoribulokinase PRK (SEQ ID
NO: 4) (pFPP20), ainsi que pour les chaperonnes généralistes GroES (SEQ ID NO: 5), GroEL1 (SEQ ID NO: 6) et GroEL2 (SEQ ID NO: 7) de Synechoccocus elongatus pCC6301, et optimisés pour l'expression dans la levure, ont été construits et clonés.
Les séquences codant pour les chaperonnes GroES et GroEL de E. cou ont été
amplifiées à
partir de cultures d'E. cou et clonées dans le plasmide pSC-B-amp/kan (Stratagène).
Les séquences récupérées à partir des vecteurs de clonage ont été introduites dans des vecteurs d'expression de levure. Ces vecteurs hôtes sont listés dans le Tableau I ci-dessous.

Tableau I: Liste des vecteurs utilisés Noms Origine réplication Marqueur de Cassette de transcription Réplicon E. cou levure sélection (promoteur-terminateur) pFPP5 2p URA3 pGAL10-CYC1-tPGK Yes (AmpR) pFPP10 2p URA3 pTDH3- -tADH Yes (AmpR) pFPP11 2p URA3 pTDH3- -tCYC1 Yes (AmpR) pFPP12 2p URA3 pTG11- -tCYC1 Yes (AmpR) pFPP13 ARS-CEN6 LEU2 pTEF1-tPGK Yes (AmpR) Note : pGAL10-CYC1 : promoteur synthétique composé de l'UAS du gène GAL10 et de l'initiation de transcription du gène CYC1 (POMPON et al, Methods Enzymol, 272, 51-64, 1996).
Les cassettes d'expression ainsi obtenues sont listées dans le Tableau II ci-dessous.
Tableau II: cassettes d'expression Noms Promoteur Phase ouverte de lecture Étiquette Terminateur CAS6 TDH3p RbcL sans ADH1 CAS7 Tet07p PRK sans CYC1t CAS16 TEF1 RbcS Sans PGK
CAS19 TEF1p RbcX Sans PGK
CAS21 PG11p GroES E. cou Sans CYC1 CA522 TDH3 GroEL E. Coli Sans ADH
CA523 PG11p GroES S. elongatus sans CYC1t CA525 TDH3p Gr0EL2 S. elongatus sans ADH1t CA528 PG11p polylinker sans CYC1t CA533 TEF1p polylinker Sans PGKt Dans certains vecteurs, 2 ou 3 cassettes ont été insérées. Pour cela, les plasmides ont été
amplifiés dans la bactérie Escherichia cou DH5a et préparés par maxiprep, puis digérés par des 1 0 enzymes de restriction adaptées. Enfin, les fragments sont intégrés aux vecteurs hôtes par ligation à la ligase T4 (FERMENTAS) ou par recombinaison homologue directement chez la levure. La liste des vecteurs construits est indiquée dans le Tableau III ci-dessous.
Tableau III : vecteurs d'expression Noms Type Origine Cassette 1 Cassette2 Cassette 3 marqueurs Vecteur hôte pFPP13 ARS415-CEN6 CAS33 sans sans LEU2 pFL36 pFPP20 ARS416-CEN4 CAS7 sans sans TRP pCM185 pFPP45 2 p CAS6 CAS16 sans URA3 pFPP5/pFPP10 pFFP53 ARS415-CEN6 CAS19 CAS28 sans LEU2 pFL36 pFPP56 ARS415-CEN6 CAS19 CAS21 CAS22* LEU2 pFPP13 pFB05 ARS415-CEN6 CAS19 CAS25* CAS21 LEU2 pFFP56 pFB07 ARS415-CEN6 CAS23 CAS22* CAS19 LEU2 pFFP56 pFB08 ARS415-CEN6 CAS23 CAS25* CAS19 LEU2 pFFP56 pFB09 ARS415-CEN6 CAS21 CAS22* sans LEU2 pFFP56 1.2. Construction de différentes souches de S. cerevisiae Les différents plasmides ci-dessus ont été construits de manière à permettre à
volonté
l'expression de composantes individuelles ou d'une association de ces composantes au sein de souches de levure. Différents vecteurs ou combinaisons de vecteurs ont donc été utilisés pour transformer plusieurs souches de levure S. cerevisiae (W303.1B, FY1679 et CEN.PK 1605).
CEN.PK 1605 est la version prototrophe de la souche 1605. C'est donc un contrôle positif de "comportement physiologique". Chaque numéro, compilé dans la première colonne du tableau IV ci-dessous, correspond à l'association de vecteurs décrite sur la ligne correspondante du même tableau. Ainsi pour chacune des souches utilisée, le chiffre référence associé apporte l'information de l'ingénierie reconstruite. Seules les souches CEN.PK 1605 ont été
exemplifiées (Tableau IV) par soucis de clarté, mais la nomenclature est la même pour les deux autres souches.

Tableau IV. Combinaison de plasmides et souches (références au Tableau III.) N Protéines exprimées Souche Vecteur Vecteur Vecteur Rbc Rbc Rbc PRK GroE GroE
combinais 1 2 3 n parente S L X syn S L
l CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP1 b CEN.PK pCM18 pFPP5 E.
E.
2 pFPP45 X X X
1605 5 6 cou i coui CEN.PK pFPP5 E. E.
3 pFPP45 pFPP20 X X X syn 1605 6 cou i coui CEN.PK pFPP5 4 pFPP45 pFPP20 X X X syn CEN.PK pCM18 pFPP5 pFPP45 X X X

CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP5 CEN.PK PYEDP pCM18 pFPP5 E.
E.
13b X
1605 51 5 6 cou i coui CEN.PK PYEDP pFPP5 14b pFPP20 X Syn CEN.PK PYEDP pFPP5 E.
E.
pFPP20 X syn 1605 51 6 cou i coui CEN.PK pCM18 pFPP1 16b pFPP45 X X

CEN.PK pFPP1 17b pFPP45 pFPP20 X X syn CEN.PK PYEDP pFPP1 18b pFPP20 syn CEN.PK L2 101 pFPP45 pFPP20 pFB08 X
X X Syn syn syn CEN.PK PYEDP
E. E.
102 pFPP20 pFB09 Syn cou i coui CEN.PK E.
E.
102b pFPP45 pFPP20 pFB09 X X syn cou i coui CEN.PK PYEDP pCM18 E. E.
103 pFB09 cou i coui (Syn : Synechoccocus elongatus ; L2 syn :GroEL2 Synechoccocus elongatus , Li syn :GroEL1 Synechoccocus elongatus) Notes concernant certains tableaux :
1. pCM185 : plasmide commercial (ATCC 87659) 2. pFL36 : Plasmide commercial (ATCC 77202) 3. PYeDP51 : Plasmide vide , décrit dans l'article suivant : Urban P, Mignotte C, Kazmaier M, Delorme F, Pompon D. Cloning, yeast expression, and characterization of the coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450 reductases with P450 CYP73A5. J Biol Chem. 1997 Aug 1; 272(31):19176-86.
4. GroES E. cou i Gene ID: 6061370 ; GroEL E. cou i Gene ID: 6061450 5. Souche S. Cerevisiae CEN.PK 113-7D : Mat a prototrophe 6. Souche S. Cerevisiae CEN.PK i605: Mat a HI531eu2-3.112trp1-289 ura3-52 MAL.28c. Souche issue de CEN.PK 113-7D
7. Les autres abréviations se rapportent aux gènes de S. cerevisiae décrits dans les banques de données 8. Gènes synthétiques : les gènes de Synechoccocus elongatus codant pour les sous-unités de la RuBisCO, la chaperonne spécifique de l'assemblage de la RuBisCO (RbcX), la PRK ainsi que les chaperonnes généralistes GroES, GroEL1 et GroEL2 ont été synthétisées après recodage propriétaire pour la levure mettant en oeuvre un biais de codons inhomogènes et clonés dans pCC6301 (commercial). Les séquences codantes de ces protéines (après recodage) sont présentées en annexe (SEQ ID No : 1 : séquence codante de RbcS ; SEQ ID No :
2: séquence codante de RbcL ; SEQ ID No: 3: séquence codante de RbcX ; SEQ ID No: 4:
séquence codante de PRK ; SEQ ID No: 5: séquence codante de GroES; SEQ ID No: 6:
séquence codante de GroEL1 ; SEQ ID No : 7: séquence codante de GroEL2).

9. Les séquences codantes des chaperonnes de E. colt GroES et GroEL ont été
amplifiées à partir de la bactérie, clonées dans pSC-B-amp/kan (Statagène) et montées sans recodage dans les vecteurs d'expression (voir plus haut).

10. Les séquences recodées des ADNc codant pour les chaperonines de Synechoccocus elongatus ont été insérées par recombinaison homologue dans le vecteur pUC57 préalablement linéarisé en cotransformant les deux molécules dans la levure. De la même manière les ORFs ont été amplifiées par PCR à partir des constructions précédentes, générant des régions flanquantes homologues aux promoteurs et terminateurs portés par le vecteur pFPP56. Cela a permis ainsi un clonage par recombinaison homologue en co-transformant ce produit PCR dans une souche de levure avec le vecteur pFPP56 préalablement linéarisé, générant les différents vecteurs d'expression décrits Tableau III selon les cassettes décrites Tableau II.
1.3. Construction de différentes souches de Saccharomyces cerevisiae intégrant des chaperonnes d'origines différentes Des chaperonnes issues de différentes bactéries ont été évaluées. Ainsi, des combinaisons incluant des protéines issues de la même espèce (S. elongatus) ont également été testées, en combinant RbcX de S. elongatus à GroES et GroEL1 et/ou GroEL2 de S. elongatus.
Tableau V : Cassettes d'expression Noms Promoteur Phase ouverte de lecture Etiquette Terminateur CAS19 TEF1p RbcX S. elongatus optimisée Sans PGKt CAS21 PGI1p GroES E. coli Sans CYC1t CA522 TDH3p GroEL E. Coli Sans ADH1t CA523 PGI1p GroES S. elongatus optimisée sans CYC1t CA524 TEF2p Gr0EL1 S. elongatus optimisée sans TEF1t CA525 TDH3p Gr0EL2 S. elongatus optimisée sans ADH1t Tableau VI: Vecteurs d'expression Type Cassette Marqueurs Vecteur Noms Cassette 1 Cassette2 Cassette 3 Origine 4 d'auxotrophie Hôte pFFP56 CAS19 CAS21 CAS22* LEU2 pFL36 pFB08 CAS23 CAS25* CAS19 LEU2 pFFP56 pCB02 CAS23 CAS25* CAS19 LEU2 pFB08 Tableau VII: Combinaison de plasmides et souches combinais Souche Vecteur Vecteur Vecteur Protéines exprimées n parente 1 2 3 RbcX GroES GroEL
CEN.PK V51TE pCM18 lb pFL36 CEN.PK V51TE pCM18 pFPP5 13b syn E. cou i E.
coui CEN.PK pCM18 116 V51TE pFB08 Syn syn L2 syn CEN.PK V51TE pCM18 L2 syn 111 pCB02 Syn syn 1605 F 5 L1 syn (Syn : Synechoccocus elongatus ; L2 syn :GroEL2, Li syn :GroEL1 Synechoccocus elongatus) 1.4.Constructions de souches de Pichia pastoris Afin de maintenir une expression fonctionnelle des gènes contenus dans le plug-in les promoteurs et terminateurs ont été remplacés par des promoteurs et terminateurs fonctionnel chez Pichia pasteuris GS115 (Thermofischer scientific C181-00) Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes RbcX, GroES et GroEL, issus des CAS19, CAS20 et CAS21 (TableauII) a été
remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau VIII ci-dessous).

Tableau VIII : cassettes d'expression Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur CAS50 PEX8 RbcX TEF1 CAS51 A0X1 GroES PGK
CAS52 FLD1 GroEL ADH1 La région incluant les trois cassettes d'expression ci-dessous (Tableau IX) a été amplifiée par PCR et clonée NotI dans le plasmide commercial pPIC3.5 de chez Thermofischer K1710-01.
Tableau IX : vecteurs d'expression Noms Type origine Cassette1 Cassette2 Cassette3 Marqueur Vecteur hote pCB05 ARS415-CEN6 CAS50 CAS51 CAS52 LEU2 pFL36 pCB06 lntegratif CAS50 CAS51 CAS52 HIS4 pPIC3.5 Ces plasmides ont été préalablement linéarisé et transformés individuellement dans une souche Pichia pasteuris GS115 (thermofischer C181-00) auxotrophe pour l'histidine selon le protocole Easy select Pichia expression kit de Thermofischer et sélectionnée sur milieu minimal et glucose à 30 C.
Tableau X : Plasmides et Souches Noms Souches parentes Vecteur 1 Protéines exprimées RbcX GroES GroEL
Pichia pasteuris pIC3.5 -PGC115_01 G5115 Pichia pasteuris pCB06 S. elongatus E.Coli E.Coli PGC115_02 G5115 1.5. Construction de souches de Yarrowia lipolytica La souche sauvage W29 (ATCC 20460, MatA) isolée d'eaux usées a été utilisée.

Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes RbcX, GroES et GroEL, issus des CAS19, CAS20 et CAS21 (Tableau II) a été
remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau XI ci-dessous).
Tableau XI: cassettes d'expression Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur CAS55 TEF RbcX TEF1 CAS56 EXP GroES PGK
CAS57 GDP GroEL ADH1 La région incluant les trois cassettes d'expression ci-dessus (TableauXI) a été amplifiée par PCR et clonée dans le plasmide commercial pYLEX1.
Tableau XII: vecteur d'expression Noms Type origine Cassette1 Cassette2 Cassette3 Marqueur Vecteur hote pCB07 Intégratif CAS19 CAS20 CAS21 LEU2 pYLEX1 Ces plasmides ont été linéarisés et transformés individuellement dans une souche Yarrowia lipolytica auxotrophe pour la leucine selon le protocole YLOS transformation kit de Yeastearn Biotech et sélectionnée sur milieu minimal et glucose à 28 C. (YLEX Expression Kit de Yeastearn Biotech (Cat. #: FYY201-1KT)).
Tableau XIII : Plasmides et Souches Noms Souches Vecteur 1 Protéines exprimées parentes RbcX GroES GroEL
PO1f_01 Yarrowia -lipolytica YLEX1 PO1f_02 Yarrowia S. elongatus E.Coli E.Coli lipolytica CB07 Yarrowia lipolytica POlf (ATCC MYA2613Tm) Genotype: MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2 L'évaluation de l'impact des chaperonnes a été réalisée sur une culture des souches POlf_01 et PO lf 02 en milieu synthétique sans leucine à 28 C pendant 72H.

1.6. Construction de cellules CHO
Pour s'assurer une manipulation aisée, polyvalente et un transfert performant du plug-in Chaperonnes sur l'ensemble des cellules d'eucaryotes supérieurs un système de transduction lentiviral de quatrième génération a été choisi. Ces particules lentivirales permettent de transférer indifféremment le plug-in dans des cellules primaires, immortalisées ou transformées issues de différentes espèces d'eucaryotes supérieurs comme des cellules humaines ou murines par exemple.
Sur le plasmide pFPP56 (Tableau III), chaque promoteur contrôlant l'expression des gènes GroES et GroEL issus des CAS20 et CAS21 (Tableau II) a été remplacé par un promoteur compatible selon la littérature (tableau XIV).
Tableau XIV: cassettes d'expression Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur CAS54 CMV RbcX hBeta globine CAS55 hEF-1a GroES hPKG1 CAS56 hUBC GroEL hGAPDH
La région incluant la phase ouverte de lecture de RbcX et les deux cassettes d'expression CA555 et CA556 ci-dessous ont été amplifiées par PCR et clonées XhoI-KpnI dans le plasmide commercial pLVX-Puro de chez Clontech (Catalog No. 632164).
Tableau XV : vecteur d'expression Noms Type origine Cassette1 Cassette2 Cassette3 Marqueur Vecteur hote pCB10 Intégratif CAS54 CAS55 CAS56 Puro pLVX-Puro Les plasmides pLVX-Puro ou pCB10 ont été transformés à l'aide du Lenti-X
packaging system (Clontech) dans des cellules Lenti-X 293T (Clontech) selon le protocole du kit. Le surnagent contenant les particules virales a été filtré et ajouté dilué au 1/5e ou 1/2 sur des cellules CHO
en culture dans des boites de pétri de 10cm pour un volume final de milieu de 5mL.
Après 24H de transduction, les cellules sont lavées au PBS et du milieu de culture frais supplémenté avec 2 g/mL de puromycine est rajouté pour la sélection sur 48H00 à 37 C.

La lignée cellulaire ainsi établie est maintenue sous une concentration de 0.5 g/mL de puromycine dans le milieu de culture.
Tableau XVI :plasmide et souches Protéines exprimées Noms Souches parentes Vecteur 1 RbcX GroES
GroEL
CHO-01 CHO pLVX-Puro -CHO-02 CHO pCB10 S. elongatus E.Coli E.Coli 1.7. Méthodes Méthode de culture] : Croissance sur glucose Les cellules transformées sont cultivées à 30 C à l'air ambiant sur milieu YNB
(yeast without nitrogen base) supplémenté en sulfate d'ammonium 6,7 g.L-1, glucose 20 g.L-1, agar 20 g.L-1 pour les géloses complémenté avec un milieu commercial CSM (MP Biomedicals) adapté aux marqueurs de sélection des plasmides utilisés pour la transformation (-ura, -leu, -trp) et en présence de doxycycline 2 /ml. Les cultures sont arrêtées par refroidissement à 4 C une génération avant la fin de la phase exponentielle. La culture est centrifugée, puis des sphéroplastes sont préparés par digestion enzymatique des parois cellulaires avec un mélange zymolyase-cytohélicase en milieu sorbitol hypertonique (1,2M sorbitol). Les sphéroplases sont lavés en milieu hypertonique sorbitol en présence de concentrations saturantes de PMSF et d'EDTA (inhibiteurs des protéases), puis cassés par pipetage répétés et sonication légère en milieu isotonique (0,6M) sorbitol. Après centrifugation à basse vitesse (1500 rpm) pour éliminer les gros débris puis à moyenne vitesse (4000rpm) pour récupérer les débris de tailles 2 0 intermédiaires et les mitochondries, le surnageant est récupéré et la concentration en protéines est quantifiée par la méthode de Bradford.
Test d'activité RuBisCO in vitro In vitro, 15 g d échantillon protéique, issu de cette lyse cellulaire, est ajouté à la molécule synthétique RuBP (2mM final) dans un tampon approprié (50mM Tris/HC1 pH7.4, 10mM
MgC12+, 60mM bicarbonate de sodium), pour un volume réactionnel de 2001iL, permettant au complexe RuBisCO, exprimé dans le lysat de levure, de catalyser la formation de molécules d'acide phosphoglycérique. A des temps variables, les réactions sont stoppées par ajout de HC1 (12,1M) et les produits de la réaction sont analysés par HPLC/MS afin d'évaluer l'activité
carboxylase de l'échantillon protéique en dosant l'acide phosphoglycérique produit en fonction du temps.
Cultures en milieu contrôlé
Les précultures ont été réalisées sur milieu chimiquement défini. Après décongélation, 1 mL
d'un tube du stock (- 80 C) a été prélevé pour ensemencer un flacon pénicilline (100 mL) contenant 10 mL de milieu de culture, incubé 18 heures à 30 C et 120 rpm .
Les précultures ont été réalisées en anaérobiose (flacons préalablement flushés à l'azote) et en présence de doxycycline afin d'éviter les problèmes de toxicité observés en présence du gène PRK Les précultures ont ensuite été lavées trois fois (centrifugation, resuspension, vortex 15 s) à l'eau physiologique (NaC1, 9 g L-1), puis le culot cellulaire a été resuspendu dans du milieu de culture sans doxycycline .
Ces cellules issues des précultures ont ensuite été inoculées afin d'atteindre une densité optique initiale de 0,05 (soit 0,1 g L-1). Le volume de départ des cultures était de 50 mL en aérobiose (fioles d'Erlenmeyer bafflées de 250 mL) ou de 35 mL en anaérobiose (flacons pénicilline de 100 mL).
Les cultures ont été arrêtées après consommation totale du glucose ou arrêt de la production d'éthanol. Chaque culture a été tripliquée.
Analyses : Caractérisation des métabolites extracellulaires Les concentrations du glucose, de l'acide formique et des principaux métabolites (éthanol, glycérol, acides acétique, succinique et pyruvique) ont été mesurées par chromatographie liquide à haute performance (C.L.H.P.). L'appareil utilisé était un chromatographe (Waters, Alliance 2690) équipé d'une colonne Aminex HPX 87-H (300 mm x 7,8 mm). La détection des molécules a été assurée par un détecteur à indice de réfraction (réfractomètre Waters 2414).
L'éluant était de l'H2SO4 à 8 mM à un débit de 0,5 mL mn-1, et la température de la colonne fixée à 50 C. En anaérobiose, cette analyse a été réalisée sur un seul flacon de chaque souche.
Dans ce cas, le calcul de l'écart-type a été réalisé sur la perte de masse, puis appliqué aux métabolites.

Exemple 2: Effet de la combinaison de chaperonnes sur la reconstruction de l'activité
carboxylase de la RuBisCO de type I chez la levure.
Le cycle de Calvin permet chez les Plantes et les cyanobactéries de fabriquer du glucose à partir du dioxyde de carbone. L'étape critique est la fixation du CO2 sur le ribulose-1,5-biphosphate (RuBP), molécule possédant 5 carbones. Cette étape nécessite une enzyme appelée la RuBisCO
(pour Ribulose-1,5-Biphosphate Carboxylase/Oxygénase). Cette enzyme permet la formation d'une molécule instable à 6 carbones qui donne rapidement deux molécules de 3-phosphoglycérate à 3 carbones. Il existe plusieurs formes de RuBisCO. La forme Test constituée de deux types de sous-unités : des grandes sous-unités (RbcL) et des petites sous-unités (RbcS), dont l'assemblage correct nécessite en outre l'intervention d'au moins une chaperonne spécifique : RbcX. Le RuBP, substrat de la RuBisCO, est formé par réaction du ribulose 5-phosphate avec l' ATP ; cette réaction est catalysée par une phosphoribulokinase (PRK).
Dans cet exemple, un cycle de Calvin artificiel est reconstitué par la co-transformation de la souche de levure CEN.PK 1605 par les combinaisons de vecteurs n 3 et 4 du tableau IV ci-dessus, qui permettent l'expression simultanée des sous unités RbcS et RbcL de la RuBisCO, de la chaperonne spécifique RbcX et de l'enzyme PRK de Synechoccocus elongatus, avec (combinaison 3 et 101) ou sans (combinaison 4) les chaperonnes généralistes GroEL et GroES
de E. cou i ou de synechoccocus selon le n de la combinaison.
Ainsi, des essais d'activité RuBisCO sur trois expériences indépendantes A, B
et C sont réalisés 2 0 à partir d'extraits protéiques issus de culture de levures sur glucose (protocole détaillé ci-dessus, point 1.3) ; leur rendement est évalué en mesurant la production d'acide phosphoglycérique en fonction du temps. Les résultats sont présentés dans le tableau XVII ci-dessous.
Tableau XVII : Tests d'activité in vitro de la RuBisCO réalisés à partir d'extraits de souches CEN-PK cultivées sur glucose et contenant l'ingénierie indiquée dans la première colonne. Les tests sont effectués durant 80 min d'incubation avec 0.01-0.02 mg de protéine d'extrait soluble de levure dans un volume réactionnel de 200 microL contenant 2 mM de ribulose diphosphate à température ambiante. Les activités sont données en nmoles de 3-phosphoglycérate formé/min/mg de protéines totales dans l'extrait.

Souches A B C
CEN.PK n 3 RbcS/RbcL/RbcX/PRK/(GroES/GroEL) E.coli 20 13 20 CEN.PK n 4 RbcS/RbcL/RbcX 0 ND ND
CEN.PK
RbcS/RbcL/RbcX/PRKAGroES/GroEL2) S.elongatus ND ND 1,5 n 101 L'expérience A démontre que la présence de la chaperonne RbcX seule, pourtant spécifique du complexe RuBisCO, n'est pas suffisante pour permettre l'expression d'un complexe enzymatique actif. Seule la combinaison des deux chaperonnes généralistes GroES et GroEL
de E. cou i associées dans une stoechiométrie adaptée à la présence de RbcX, permet de détecter la production d'acide phosphoglycérique croissante dans le temps.
De plus, l'expérience C montre que l'activité RuBisCO chute dramatiquement de plus de 90%
quand les sous-unités RbcL/RbcS de Synechoccocus elongatus sont associées aux chaperonnes homologues RbcX, GroES GroEL2 issues du même organisme. Cela illustre de manière frappante l'intérêt d'une association de chaperonines hétérologues.
Cet exemple permet de déterminer clairement que l'association de chaperonnes généralistes bactériennes hétérologues à la chaperonne spécialiste bactérienne RbcX est nécessaire pour optimiser l'activité d'un complexe RuBisCO synthétique chez la levure.
Exemple 3: Effet de protection de la combinaison de chaperonnes contre la toxicité de protéines recombinantes Effet sur la levée de toxicité liée à l'expression de la ribulokinase in vivo, indépendamment de la RuBisCO
Les méthodes et analyses mises en oeuvre sont décrites à l'exemple 1 ci-dessus.
L'expression de la seule ribulokinase chez la levure (souche 18b) entraîne une longue phase de latence (de plus de 50 heures) et une chute drastique de son taux de croissance maximale (de 70% en aérobiose et de 82% en anaérobiose) par rapport à la souche sauvage (WT) (Tableau XVIII).
Tableau XVIII : Génotype, taux de croissance maximal et retard de croissance des souches WT, lb, 18b, 102, 15, 14b.
Civii Chaperonne5 _________________Umu max Retard croissance 111 h-1 h WT
0,2 lb PI PV PV 0.19 2 10b R PV 0.08 100 ca ce 102 P. 0.16 12 14b P 0.10 65 P. ,2c..) MIT 0.28 w lb M. PV PV 0.18 (t) ca 18b PV 0.05 50 LU 1.02 P.: 0.11 12 cc cc 14b I 0,13 50 15 P' 0,23 plasmide vide Cette toxicité, induite par la PRK, peut être partiellement levée par la co-expression dans la souche 102 des chaperonnes GroES/GroEL d'E. cou (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 26% en anaérobiose et de 42% en aérobiose) ou de la chaperonne RbcX de 1 0 Synechococcus elongatus dans la souche 14b (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 34% anaérobiose et de 10% en aérobiose).
La co-expression dans la souche 15 des chaperonnes GroES/GroEL d'E. cou et RbcX de Synechococcus elongatus permet de restaurer la quasi-totalité de la croissance (levée de la toxicité sur le taux de croissance de 78% en anaérobiose et de 63% en aérobiose). Cette co-15 expression permet également d'éliminer totalement la longue phase de latence.

La toxicité liée à l'expression de la ribulokinase (PRK) affecte la fermentation alcoolique caractérisée par une chute de la productivité en éthanol (souche 18b) (Figure 1) directement liée à la présence de phase de latence et à la chute du taux de croissance.
L'expression de l'ingénierie CHAPERONNES (GroES+ GroEL de E.coli + RbcX de Synechococcus elongatus) permet non seulement de lever totalement la toxicité de la ribulokinase (PRK) et plus particulièrement à l'accumulation du produit de la réaction catalysée par la PRK, mais aussi par conséquent d'augmenter la productivité en éthanol (souche 15), alors que le couple de chaperonines généralistes GroES/GroEL n'a qu'un effet partiel (souche 102) et l'expression de RbcX seule n'en a aucun (souche 14b).
Exemple 4: Exemplification de l'effet généraliste sur la croissance d'une cellule transformée 4.1. Effet généraliste sur la croissance de Saccharomyces cerevisiae en fermentation Les méthodes et analyses mises en oeuvre sont décrites à l'exemple 1 ci-dessus. Les résultats sont présentés dans le Tableau XIX ci-dessous.
Tableau XIX : Génotype, taux de croissance maximal et retard de croissance des souches WT, lb, 103, 13b.
Chaperonnes 11111111111111111eta rd croissance 111111.1111 h WTO 0.27 0 lb PV 0.19 ce 103 = 0.15 11 13b = 0.26 w WT
0.28 lb PV 0.18 ce w 103 = 0.10 13b = = 0.24 PV = plasmide vide De manière intéressante, l'expression de l'ingénierie CHAPERONNES offre un avantage prolifératif de 30% à la souche 13b (RbcX+(Gros/GroEL) E. cou) en comparaison de la souche contrôle contenant 3 plasmides vides (souche lb), ou encore la souche 103 n'exprimant que les chaperonnes généralistes de E. colt GroES/GroEL.
De plus, le taux de croissance de la souche 13b est égal à 96 et 86% du taux de croissance de la souche sauvage (WT) CEN.PK 113-7D non transformée et donc non stressée, en aérobiose et anaérobiose respectivement (Tableau XVIII).
4.2. Effet généraliste sur la croissance de Pichia pastoris en fermentation L'évaluation de l'impact des chaperonnes a été réalisé sur une culture des souches PPGC115_01 et PPGC115_02 milieu minimal glycérolée à 30 C pendant 14H et une induction avec 1% méthanol pendant 48H à 100H selon le protocole décrit dans F. Wang et al. 2015 (PLoS One. 2015 Mar 17;10(3):e0120458. "High-level expression of endo-I3-N-acetylglucosaminidase H from Streptomyces plicatus in Pichia pastoris and its application for the deglycosylation of glycoproteins.").
Les deux souches ont été ensemencées à la même concentration cellulaire évaluée sur une fermentation de 100H, le mu maximal de la souche calculé sur la phase exponentielle de la courbe de croissance présente pour la souche PPGC115_02 un avantage prolifératif de l'ordre de 30% par rapport à celui de la souche contrôle PPGC115_01.
4.3. Effet généraliste sur la croissance de Yarrowia lipolytica en fermentation Les souches PO lf_01 et PO 1f_02 ont été évaluées selon le protocole décrit dans JM Nicaud et al. 2002 (Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica.
FEMS Yeast Res.
2002 Aug;2(3):371-9). Le phénotype montre une croissance accrue pour la souche exprimant la combinaison de chaperonnes. L'avantage prolifératif est évalué à plus de 35%.
4.4. Effet généraliste sur la croissance de cellules CHO
Les lignées CH0-01 et CH0-02 sont ensemencées à la même densité (soit 2.106 cellules par boite de 10 cm et la croissance est évaluée sur 4 jours. Les cellules sont décollées et individualisées par traitement à la trypsine et comptées tous les jours à
l'aide d'un compteur automatique. La vitesse de croissance des cellules de la lignée CH0-02 est plus élevée que celle de la lignée contrôle CH0-01 de l'ordre de 25%. La combinaison de chaperonnes a un effet sur le temps de doublement des cellules.
Ces études démontrent que cette ingénierie CHAPERONNES permet (i) de restaurer une croissance normale de cellules eucaryotes, contenant une autre ingénierie ou non, mais soumises à des stress physicochimiques et (ii) d'offrir un avantage prolifératif par rapport à des souches/cellules utilisées dans les mêmes conditions.
Exemple 5 : Exemplification de l'effet sur la production de protéines recombinantes 5.1. Production de l'hormone de croissance humaine chez Saccharomyces cerevisiae Le gène de l'hormone de croissance humaine (GenBank: K02382.1 ) a été
synthétisé et cloné
en aval du promoteur constitutif TEF1 selon la cassette ci-dessous.
Tableau XX : Cassette d'expression Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur CAS54 TEF 1 p hGH PGK
Tableau XXI : Vecteurs d'expression Noms Type origine C as s ettel Cas sette2 Cas sette3 Marqueur Vecteur hote pCB09 2 CAS54 URA3 PYeDP51 pFPP56 AR5415- CAS19 CAS21 CA522 LEU2 pFL36 Ces plasmides ont été transformés conjointement dans la souche CEN.PK 1605 selon le protocole de transformation précédemment décrit. Les souches ont été
sélectionnées sur milieu 2 0 synthétique (-leu-ura).

Tableau XXII : Souches Protéines exprimées Noms Souche parente Vecteur 1 Vecteur 2 RbcX GroES GroEL hGH
200 CEN.PK1605 PYeDP51 pFPP56 S. E.Coli E.Coli elongatus 230 CEN.PK1605 pCB09 pFPP56 S. E.Coli E.Coli hGH
elongatus 231 CEN.PK1605 pCB09 pFL36 hGH
Les souches 200, 230 et 231 ont été cultivées dans un milieu synthétique (-leu-ura) jusqu'à une DØ600nm de 0,7. Les cellules ont été récoltées et lavées une fois avec 1 ml de tampon de lyse froid (PBS 1X pH 7,4, PMSF 1 mM), puis remises en suspension dans 0,3 ml du tampon Laemli et incubées 5 min à 98 C. Une dilution serielle (1:10) est réalisée et le même volume de chaque échantillon est déposé sur un gel SDS page gradient 4%-20%, transféré sur une membrane de nitrocellulose. L'expression de hGH est évaluée avec l'anticorps [GH-1]
(ab9821) de chez Abcam et standardisée par rapport à l'expression du gène ubiquitaire GAPDH
(ab9485) de chez 1 0 Abcam. Par ailleurs, la quantification de l'expression de hGH est réalisée par dosage Elisa avec et selon le protocole du kit Growth Hormone ELISA Kit, Human Numéro de catalogue: EHGH1 de chez thermoscientific La quantité de protéine hGH produite évaluée dans la souche 230 est 40% plus élevée que celle obtenue dans la souche 211.
5.2.
Evaluation de l'activité de la luciférase endogène chez Saccharomyces cerevisiae Le gène de la luciférase firefly a été amplifié à partir du vecteur pGL4 (Promega) et cloné en aval du promoteur constitutif TEF1 selon la cassette ci-dessous.
2 0 Tableau XXIII : cassette d'expression Noms Promoteurs Phase ouverte de lecture Terminateur CA553 TEF 1 p fLuc PGK

Tableau XXIV : vecteurs d'expression Noms Type origine C as s ettel Cas sette2 Cas sette3 Marqueur Vecteur hote pCB08 2 CAS53 URA3 PYeDP51 pFPP56 ARS415- CAS19 CAS21 CAS22 LEU2 pFL36 Ces plasmides ont été transformés conjointement dans la souche CEN.PK 1605 selon le protocole de transformation précédemment décrit. Les souches ont été
sélectionnées sur milieu synthétique (-leu-ura).
Tableau XXV : plasmides et souches Vecteur Protéines exprimées Noms Souche parente Vecteur 1 2 RbcX GroES GroEL fLUC
200 CEN.PK1605 PYeDP51 pFPP56 S. E.Coli E.Coli elongatus 210 CEN.PK1605 pCB08 pFPP56 S. E.Coli E.Coli fLuc elongatus 211 CEN.PK1605 pCB08 pFL36 fLuc Les souches 200, 210 et 211 ont été cultivées dans un milieu synthétique (-leu-ura) jusqu'à une 1 0 DØ600nm de 0,7. Les cellules ont été récoltées et lavées une fois avec 1 ml de tampon de lyse froid (PBS 1X pH 7,4, PMSF 1 mM), puis remises en suspension dans 0,3 ml du même tampon.
Les cellules en suspension ont été lysées avec des billes de verre (fast prep).
La concentration des lysats bruts a été déterminée par la méthode de Bradford (BioRad) et diluée à 0.5 mg/mL, et les activités Luciférase ont été déterminées en utilisant 5 uL de lysat /
échantillon en utilisant le Système Luciferase Assay (Promega) et la luminescence évaluée sur un luminomètre.
L'activité est standardisée par rapport à la quantité de protéine totale.
L'activité luciférase évaluée dans la souche 210 est 60% plus élevée que celle évaluée dans la souche 211 5.3. Evaluation de l'activité d'une cellulase recombinante chez Saccharomyces cerevisiae L'ingénierie Chaperonnes est associée à une ingénierie permettant d'exprimer une cellulase, cellobiohydrolase 1 (CBH1) de Talaromyces emersonii (GenBank accession no.
AAL89553) sous promoteur TEF2. L'analyse de l'activité cellulase a été conduite comme décrit dans Y. Ito et al. 2015 (Combinatorial Screening for Transgenic Yeasts with High Cellulase Activities in Combination with a Tunable Expression System. PLoS One. 2015 Dec 21;10(12)).
L'activité enregistrée pour la souche co-exprimant l'ingénierie Cellulase en présence de Chaperonnes présent un rendement d'activité 37% plus élevé que la souche exprimant uniquement l'ingénierie Cellulase seule.
5.4. Amélioration de la production de protéines L'utilisation des chaperonnes pour améliorer la production de protéines décrit précédemment pour Saccharomyces peut aisément être mise en oeuvre dans toute cellule eucaryote d'intérêt et notamment chez Pichia et Yarrowia, de manière à en optimiser le rendement et/ou l'activité de protéines endogènes ou hétérogènes. L'homme du métier peut notamment se référer aux publications ci-dessous pour faire produire par une levure exprimant la combinaison de chaperonnes selon l'invention diverses protéines d'intérêt pour l'industrie agroalimentaire, le domaine pharmaceutique, l'hydrolyse de la biomasse, l'énergie, etc. :
D Spohner SC, Müller H, Quitmann H, Czermak P. Expression of enzymes for the usage in food and feed industry with Pichia pastoris. J Biotechnol. 2015 May 20;202:118-34.
D Kim H, Yoo SJ, Kang HA. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins. FEMS Yeast Res. 2014 Aug 12.
D Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Jun;98(12):5301-17. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5. Epub 2014 Apr 18. Review.
D Weinacker D, Rabert C, Zepeda AB, Figueroa CA, Pessoa A, Farfas JG.
Applications of recombinant Pichia pastoris in the healthcare industry. Braz J Microbiol.
2014 Mar 10;44(4):1043-8 Rabert C, Weinacker D, Pessoa A Jr, Farfas JG. Recombinants proteins for industrial uses: utilization of Pichia pastoris expression system. Braz J Microbiol. 2013 Oct 30;44(2):351-6.

D Spadiut 0, Capone S, Krainer F, Glieder A, Herwig C. Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments. Trends Biotechnol. 2014 Jan;32(1):54-60.
D Espejo-Mojica AJ, Alméciga-Dfaz CJ, Rodrfguez A, Mosquera A, Dfaz D, Beltrà.n L, Dfaz S, Pimentel N, Moreno J, Sà.nchez J, Sà.nchez OF, C6rdoba H, Poutou-Pifiales RA, Barrera LA. Human recombinant lysosomal enzymes produced in microorganisms.
Mol Genet Metab. 2015 Sep-Oct;116(1-2):13-23.
D Gündüz Ergün B, Çalik P. Lignocellulose degrading extremozymes produced by Pichia pastoris: current status and future prospects. Bioprocess Biosyst Eng. 2015 Oct 23.
D Ledesma-Amaro R, Dulermo T, Nicaud JM. Engineering Yarrowia lipolytica to produce biodiesel from raw starch. Biotechnol Biofuels. 2015 Sep 15;8:148.
D Kalyani D, Tiwari MK, Li J, Kim SC, Kalia VC, Kang YC, Lee JK. A highly efficient recombinant laccase from the yeast Yarrowia lipolytica and its application in the hydrolysis of biomass. PLoS One. 2015 Mar 17;10(3):e0120156.
D Zinjarde SS. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem.
2014;152:1-10.
D Hughes SR, L6pez-Ntifiez JC, Jones MA, Moser BR, Cox EJ, Lindquist M, Galindo-Leva LA, Riario-Herrera NM, Rodriguez-Valencia N, Gast F, Cedefio DL, Tasaki K, Brown RC, Darzins A, Brunner L. Sustainable conversion of coffee and other crop wastes to biofuels and bioproducts using coupled biochemical and thermochemical processes in a multi-stage biorefinery concept. Appl Microbiol Biotechnol.

Oct;98(20):8413-31.
D Groenewald M, Boekhout T, Neuvéglise C, Gaillardin C, van Dijck PW, Wyss M.
Yarrowia lipolytica: safety assessment of an oleaginous yeast with a great industrial potential. Crit Rev Microbiol. 2014 Aug;40(3):187-206.
D Celik E, Calik P. Production of recombinant proteins by yeast cells.
Biotechnol Adv.
2012 Sep-Oct;30(5):1108-18.
D Sabirova JS, Haddouche R, Van Bogaert I, Mulaa F, Verstraete W, Timmis K, Schmidt-Dannert C, Nicaud J, Soetaert W. The 'LipoYeasts' project: using the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica in combination with specific bacterial genes for the bioconversion of lipids, fats and oils into high-value products. Microb Biotechnol.
2011 Jan;4(1):47-54.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1) Cellule eucaryote transformée, caractérisée en ce qu' elle contient :
(i) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne RbcX
impliquée dans le repliement d'une enzyme Rubisco de forme I d'origine bactérienne, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
(ii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroES, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié ;
et (iii) une cassette d'expression contenant une séquence codant pour une chaperonne bactérienne généraliste GroEL, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.

2) Cellule eucaryote selon la revendication 1, caractérisée en ce que la chaperonne RbcX est une chaperonne de cyanobactérie.

3) Cellule eucaryote selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'au moins une des chaperonnes généralistes GroES et GroEL ne provient ni d'une cyanobactérie ni d'une autre bactérie exprimant un complexe RuBisCO.

4) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les trois cassettes d'expression forment un bloc continu d'information génétique.

5) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les cassettes d'expression des trois chaperonnes sont portées par un élément génétique épisomique unique.

6) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu' elle comporte en outre au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, ou en ce qu'elle a subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.

7) Cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu' elle ne contient pas de séquence codant pour une sous-unité RbcL ou RbcS d'une enzyme RuBisCO
de forme I d'origine bactérienne.

8) Cellule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure, préférentiellement choisie parmi Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris.

9) Utilisation d'une combinaison de cassettes d'expression permettant l'expression d'une chaperonne RbcX et des chaperonnes GroES et GroEL, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote.

10) Utilisation selon la revendication 9, pour améliorer la physiologie d'une souche de levure.

11) Utilisation selon la revendication 9 ou 10, pour améliorer la physiologie d'une cellule eucaryote comprenant au moins une cassette d'expression pour une protéine hétérologue autre que lesdites chaperonnes, ou ayant subi une ingénierie de séquence modifiant le niveau d'expression et/ou la séquence d'une protéine endogène.

12) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 11, pour augmenter la vitesse de croissance de ladite cellule eucaryote.

13) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 12, pour augmenter la résistance de ladite cellule eucaryote à un stress environnemental.

14) Utilisation selon la revendication 13, dans laquelle le stress environnemental est dû à la toxicité d'un élément présent dans le milieu de culture de la cellule eucaryote.

15) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 14, pour augmenter la résistance de ladite cellule à la toxicité d'un composé synthétisé par la cellule eucaryote.

16) Utilisation d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour la production d'une protéine recombinante.

17) Procédé biotechnologique pour produire au moins un composé sélectionné
parmi les molécules chimiques et les protéines, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en culture d'une cellule eucaryote selon l'une quelconque des revendications 1 à
8 dans des conditions permettant la synthèse, par ladite cellule eucaryote, de ce composé, et de manière optionnelle une étape de récupération dudit composé.

18) Procédé de production d'une protéine recombinante comprenant (i) l'insertion d'une séquence codant ladite protéine dans une cellule eucaryote exprimant RbcX, GroES et GroEL, (ii) la culture de ladite cellule dans des conditions permettant l'expression de ladite séquence et de manière optionnelle (iii) la récupération ou purification de ladite protéine.

19) Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que ladite protéine est une enzyme.

20) Procédé selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que ladite protéine est une hormone.