CN110563825B

CN110563825B - 细菌内co2固定类细胞器的合成及应用

Info

Publication number: CN110563825B
Application number: CN201910655267.7A
Authority: CN
Inventors: 门冬; 张先恩; 张玉威; 周娟
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110563825A

Abstract

本发明提供一种类细胞器，所述类细胞器包括壳体蛋白csoS1，csoS2，csoS4A/B，核酮糖‑1,5‑二磷酸羧化酶(RuBisCO)和碳酸酐酶(csoSCA)。本发明提供的类细胞器至少具有如下优势之一：本发明提供的类细胞器能够在原核表达系统中高效的表达、自组装，其可高效固定、转化外源CO₂，且其遗传特性稳定，为实现无机碳向有机碳的转化提供了技术支撑，也为节能减排，降低温室效应现象提供了新的出路。

Description

细菌内CO2固定类细胞器的合成及应用

技术领域

本发明涉及类细胞器的异源表达系统的合成，具体涉及细菌内CO₂固定类细胞器的合成及应用。

背景技术

化石燃料如石油、煤炭是人类所不可或缺的能源。它支撑了工业革命以来人类文明的进步和经济社会发展。然而，化石能源的不可再生性和人类对其的巨大消耗，也为我们带来了一些挑战性的问题：诸如温室效应气体的排放，使大气中二氧化碳(CO₂)的浓度骤然增加，导致全球气候变暖，破坏了全球的生态平衡。虽然目前已经开发了多种新能源来替代化石燃料，诸如太阳能、风能、水能、生物质能、地热能、海洋能等，但是从世界范围看，今后相当长时期内，煤炭、石油等化石能源仍将是能源供应的主体。因此，如何高效率的实现空气中温室效应气体二氧化碳(CO₂)的固定及可再生新能源的产业化生产受到了越来越多人的关注。

通常二氧化碳(CO₂)的固定通常有三个策略：首先是自然界光能自养绿色植物、显微藻类及某些化能自养细菌通过将空气中的二氧化碳(CO₂)引入更复杂的反应体系—通常称为卡尔文循环(Calvin-Benson-Bassham)中进行，通过一系列催化多种磷酸类化合物的酶促反应，将三分子的二氧化碳(CO₂)引入，转化产生3-磷酸甘油酸(3-PGA)这种有机物。这类生物通常是生长周期很长，环境适应性差，二氧化碳固定的效率也很低，不适用于工业化处理。其次是生物工程改造，既是对原有光合固碳代谢途径的改造或者是开创新的二氧化碳固定途径。主要方法是人们通过对某些具有显著光合作用效率的显微藻类中参与光合固碳的主要代谢途径进行遗传修饰改造，获得了一系列能够有效提高光合固碳效率，并偶联乙醇等化学品生产的代谢菌株。例如，Ulf Duhring、Dan Kramer课题组(Patent US 2014/0011264 A1)通过对光能自养型产乙醇细菌中乙醇代谢途径中的关键酶或修饰酶的辅因子进行定向进化、筛选，可以有效的实现利用空气中的二氧化碳固定转化并产生乙醇；同样地，Brian D.Green、Nikos Basil Reppas课题组(Patent US 8216816 B2)也做了十分类似的工作；除此之外，有些课题组独辟蹊径，通过高度精准的理性化设计及功能模块的顺序组合，开创了一种新型的光合固碳模式。其中最具代表性的是2016年Tobias J.Erb课题组(Science 354.6314(2016):900-9040)设计了一种利用来源三种不同生命领域的九个高活性的功能酶顺序组合形成的，涉及到多达17个酶促反应的体外二氧化碳级联固定转化的的多酶复合体系CETCH，该多酶复合物首次实现了在自然环境里将空气中的无机碳转化为有机碳。

除此之外，化学家们也开发了一系列利用水电解产氢并偶联二氧化碳还原成甲醇的反应系统，也都可以有效的实现环境中二氧化碳的固定。诸如Meyer Steinberg(PatentUS005767165A)&Kato Saburo(Patent EP0890388A2)各自开发了一种通过将空气中的二氧化碳加压进入一种酸性水溶液中，水解成碳酸盐，利用催化剂电解水产生氢气并还原碳酸盐，生成甲醇的反应体系。两种反应系统经证实都可以有效的实现空气中二氧化碳的固定，并偶联甲醇的和合成。但是化学固定法要求CO₂的纯度较高，而工业CO₂排放纯度较低，富集成本高。加上化学手段固定、转化CO₂通常是需要高温、高压、高耗能、特殊催化剂催化、选择性及转化率也不高。因此，如何利用这个巨大的可再生碳源来解决全球资源危机并实现减排，仍然面临巨大的挑战。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种类细胞器，该类细胞器成分简单，能够在原核表达系统中高效完整的可溶表达并自组装而成，且其能够高效的固定外源二氧化碳。

本发明提供一种类细胞器，所述类细胞器包括壳体蛋白csoS1，csoS2，csoS4A/B，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)和碳酸酐酶(csoSCA)。该类细胞器的组分简单，相关组分在原核表达系统中能够高效完整地可溶表达并自组装形成类细胞器。

在本发明的一个具体实施方式中，所述类细胞器由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)、碳酸酐酶(csoSCA)、壳体蛋白csoS1、csoS4A/B和壳体蛋白csoS2组成。

在本发明的一个具体实施方式中，所述类细胞器还包括维持所述壳体稳定结构的csoS1D蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述类细胞器由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)、碳酸酐酶(csoSCA)、壳体蛋白csoS1、csoS4A/B、壳体蛋白csoS2和维持稳定结构的csoS1D蛋白组成。

在本发明的一个具体实施方式中，所述类细胞器包括有效参与固定、转化外源CO₂的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶RuBisCO、碳酸酐酶csoSCA等组成的多酶反应体系。

在本发明的一个具体实施方式中，所述类细胞器的组分，例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)、碳酸酐酶(csoSCA)、壳体蛋白csoS1、csoS4A/B、壳体蛋白csoS2、维持稳定结构的csoS1D蛋白等均来源于模式菌株海洋原绿球藻(Prochlorococcus MED4)。

本发明另一方面还提供了一种表达载体，其能够表达上述类细胞器。

示例性地，表达载体为pTrcHis C、pBV221、pTrcHis A、pET-28a(+)、pET-28b(+)、pET100/D-TOPO、pETDuet-1、pET-37b(+)、pQE-70、、pCold III、pBad/Myc-His C、pBad/HisB、pTrcHis2C、pRSET-CFP、pRSET-BFP、pGFPuv、pBluescript II SK(+)、pKD46、pTYB1、PinPoint Xa-2、pTWIN1、pET-5a(+)、pKD4、pRSET C、pBad33等。

本发明另一方面还提供了一种表达系统，其包括上述表达载体和/或其能够表达上述类细胞器。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表达系统为原核表达系统，优选地，所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表达系统包括原核表达载体pETDuet-1。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表达系统还包括分子伴侣。

示例性地，所述分子伴侣包括GroEL/S、RbcX和Raf1中的一种或多种。优选地，所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX。

本发明另一方面提供了分子伴侣在促进类细胞器表达和/或组装中的应用。

示例性地，所述分子伴侣在促进类细胞器在原核表达系统中的表达和/或组装中的应用。

示例性地，所述分子伴侣选自GroEL/S、RbcX、Raf1、Hsp70、Hsp60、Hsp68、DnaK/DnaJ、Bip、Hsc1、Hsc2、Hsc4或Hsc70、核质素、T受体结合蛋白(TRAP)、大肠杆菌的SecB和触发因子及PapD、噬菌体编码的支架蛋白。优选地，所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX。

本发明另一方面提供了上述类细胞器的制备方法，其包括如下步骤：

通过基因重组，将所述类细胞器所包含的基因导入到表达载体和/或表达系统中进行表达。

示例性地，所述表达载体为原核表达载体，所述表达系统为原核表达系统。

在本发明的一个具体实施方式中，所述原核表达系统为大肠杆菌表达系统。

在本发明的一个具体实施方式中，上述类细胞器的制备方法还包括分子伴侣在表达系统中的表达。

在本发明的一个具体实施方式中，通过将表达分子伴侣的相关基因导入到表达载体和/或表达系统中进行表达。

示例性地，所述分子伴侣包括GroEL/S、RbcX、Raf1、Hsp70、Hsp60、Hsp68、DnaK/DnaJ、Bip、Hsc1、Hsc 2、Hsc4或Hsc70、核质素、T受体结合蛋白(TRAP)、大肠杆菌的SecB和触发因子及PapD、噬菌体编码的支架蛋白等中的一种或多种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX。

在本发明的一个具体实施方式中，上述类细胞器的制备方法具体包括如下步骤：

(1)通过基因重组，将类细胞器壳体组分相关基因导入到第一原核表达载体pETDuet-1中进行表达；以及任选地，

(2)通过基因重组，将分子伴侣相关基因导入到第二原核表达载体pETDuet-1中进行表达。

示例性地，所述类细胞器相关基因包括壳体蛋白csoS1、csoS2，csoS4A/B，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)和碳酸酐酶(csoSCA)，以及任选地，维持稳定结构的csoS1D蛋白。

示例性地，所述分子伴侣选自GroEL/S、RbcX、Raf1、DnaK、DnaJ、GrpE、Tig、HtpG、sti1、p50、Aha1等。优选地，所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX。

本发明还提供上述类细胞器，和/或上述表达载体，和/或上述表达系统在CO₂固定中的应用。

本发明提供的类细胞器至少具有如下优势之一：本发明提供的类细胞器能够在原核表达系统中高效、大规模的表达并自组装。利用其，可实现在大肠杆菌工程菌株内高效率的固定、转化温室效应气体二氧化碳。

附图说明

图1所示为本发明实施例提供的构建类细胞器基因簇分布示意图。

其中，csoS1D表示壳体面蛋白的二聚体，可三聚化，参与维持羧化体的稳定结构(Proceedings of the National Academy of Sciences 109.2(2012):478-483.)；csoS1表示壳体面蛋白，可六聚化，形成羧化体的组成单元；cbbl表示核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的大亚基；cbbs表示核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基，完整功能化的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶由八个大亚基cbbl，八个小亚基cbbs折叠组装形成；csoS2表示羧化体组装所需的壳体相关蛋白，其在羧化体组装过程中起重要作用，经研究发现，csoS2在宿主菌体内可编码两种分子量的蛋白质，分别是全长且磷酸化修饰后的csoS2A及羧基端部分缺少的csoS2B，这两种蛋白都能在羧化体组装过程中起到协助作用；csoSCA表示碳酸酐酶，包裹在羧化体的空腔内，参与HCO₃ ^-与CO₂之间的相互转化；csoS4A/B表示壳体顶点蛋白，可五聚化，形成羧化体正二十面体的顶点。

图2所示为本发明实施例提供的类细胞器的表达质粒的结构示意图。

图3A所示为本发明实施例提供的表达的类细胞器相关组分的SDS-PAGE的实验结果图。

图3B所示为本发明实施例提供的表达类细胞器组分的Western blotting的实验结果图。

其中，M表示标准品；-IPTG表示不添加诱导剂IPTG；+IPTG表示添加诱导剂IPTG；Purified CB表示本实验纯化获得异源合成的类羧化体；csoS1D表示壳体面蛋白的二聚体；cbbL表示核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的大亚基；cbbs表示核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶的小亚基，完整功能化的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶由八个大亚基cbbl，八个小亚基cbbs折叠组装形成；csoS1表示壳体面蛋白，可六聚化，形成羧化体的组成单元；csoS3即为csoSCA，碳酸酐酶，包裹在羧化体的空腔内，参与将HCO₃ ^-与CO₂之间的相互转化；csoS4A表示壳体顶点蛋白，可五聚化，形成羧化体正二十面体的顶点，csoS4B也是壳体顶点蛋白，作用与csoS4A相同，且其氨基酸序列与csoS4A高度相似；csoS2表示羧化体组装所需的壳体相关蛋白，其在羧化体组装过程中起重要作用，经研究发现，csoS2在宿主菌体内可编码两种分子量的蛋白质，分别是全长且磷酸化修饰后的csoS2A及C端部分缺少的csoS2B，这两种蛋白都能在羧化体组装过程中起到协助作用。

图4所示为本发明实施例提供的类细胞器在大肠杆菌体内外的超薄切片实验结果图。

其中，图4A为类细胞器在0mM IPTG作用下的实验结果；图4B为类细胞器在10μMIPTG诱导作用下的实验结果；图4C为类细胞器在50μM IPTG诱导作用下的实验结果；图4D为类细胞器在100μM IPTG诱导作用下的实验结果；图4E为类细胞器在500μM IPTG诱导作用下的实验结果；图4F为类细胞器在1mM IPTG诱导作用下的实验结果(bar：500nm)。

图5A所示为本发明实施例提供的从野生型海洋原绿球藻中分离纯化获得α-羧化体经蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析纯化后的透射电子显微镜实验结果图(bar:200nm).

图5B所示为本发明实施例提供的大肠杆菌体内利用分子伴侣辅助合成的类细胞器的透射电子显微镜实验结果图(bar：500nm)。其中，图5B中的左下图为图中箭头所指的类细胞器放大后的结果图(bar:100nm)。

图5C所示为本发明实施例提供的大肠杆菌体内合成的类细胞器的透射电子显微镜实验结果图(无分子伴侣辅佐)(bar:100nm)。

图6所示为本发明实施例提供的验证合成功能性类细胞器具有二氧化碳固定功能的原理图。

其中，Arabinose：阿拉伯糖；R5P：5-磷酸核酮糖；PRK：磷酸核酮糖激酶；RuBP：1、5-二磷酸核酮糖；ProCB：α-羧化体；3-PGA：3-磷酸甘油酸；Glycolysis：糖酵解途径；glucose6-phosphate：果糖-6-磷酸；Toxic：毒性物质；Detoxification：解毒。

图7所示为本发明实施例提供的验证合成的类细胞器具有固定CO₂功能的实验结果图。

其中，WT表示野生型菌株；ProCB表示表达功能性类细胞器菌株；PRK表示表达磷酸核酮糖激酶菌株；ProCB/PRK表示共表达类细胞器及磷酸核酮糖激酶菌株。

图8A所示为本发明实施例提供的纯化获得类细胞器腔内包装的RuBisCO酶活力测定的实验原理图。

图8B所示为本发明实施例提供的没有分子伴侣协作下纯化获得类细胞器腔内包装的RuBisCO酶活力测定的实验结果图。

图8C所示为本发明实施例提供的在分子伴侣协助下纯化获得类细胞器腔内包装的RuBisCO酶活力结果图。

图8D所示为本发明实施例提供的分子伴侣对类细胞器腔内包装的RuBisCO酶动力学参数比较结果图。

其中，WT表示文献报道从海洋原绿球藻分离的羧化体，ProCB表示本实验室在大肠杆菌体内表达并分离纯化获得的类羧化体结构的类细胞器，ProCB-Cha表示本实验室在大肠杆菌体内、在含有分子伴侣辅助作用下表达并分离纯化获得的形成类羧化体结构的类细胞器。

图9A所示为本发明实施例提供的利用类细胞器转化二氧化碳后用于乙醇代谢产生的示意图。

图9B所示为本发明实施例提供的利用类细胞器转化二氧化碳后用于乙醇代谢产生的实验结果图。

图10A所示为本发明实施例提供的利用类细胞器转化二氧化碳后用于异丁醛代谢产生的示意图。

图10B所示为本发明实施例提供的利用类细胞器转化二氧化碳后用于异丁醛代谢产生的实验结果图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

具体而言，本文所使用的，“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括在内的或开放性的，并且不排除另外的未陈述的元件或方法步骤。术语“包含”在本文中的任何表述，特别是在描述本发明的方法、用途或产品时，应理解为包括基本上由所述组分或元件或步骤组成和由所述组分或元件或步骤组成的那些产品、方法和用途。本文示例性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开的任何一种或多种元件、一种或多种限制的情况下进行实践。

本文所述的“类细胞器”表示具有一定形态结构，散布在细菌细胞质内，并行使某一种或者某一类特定生理功能的微结构或者微器官。

本文所述的“类羧化体”表示大肠杆菌体内合成，有多种小蛋白分子自发自组装形成的100nm左右尺寸的纳米空壳，在其腔内包装固定、转化外源CO₂的级联酶促体系的纳米反应容器，并行使与来源海洋原绿球藻体内参与CO₂固定、转化的类细胞器-羧化体类似的功能。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

本文中的WT表示从海洋原绿球藻分离的羧化体，具体参考文献(Roberts,EvanW.,et al."Isolation and characterization of the Prochlorococcus carboxysomereveal the presence of the novel shell protein CsoS1D."Journal ofbacteriology 194.4(2012):787-795.)

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例1类细胞器合成

本实施例中提供的类细胞器合成所需基因包括壳体蛋白csoS1、csoS2、csoS4A/B、csoS1D蛋白、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)及参与CO₂及HCO₃ ^-之间相互转化的碳酸酐酶csoSCA基因，该基因来源于模式菌株海洋原绿球藻(Prochlorococcus MED4)，其基因簇分布如图1所示。

合成模式菌株海洋原绿球藻(Prochlorococcus MED4)(NC_005072.1)来源的壳体蛋白csoS1(PMM0549)、csoS4A/B(PMM0554/PM0555)、csoS2(PMM0552)、csoS1D(PMM0547)的编码基因簇，同时，保留各自的核糖体结合位点(RBS)，模拟其在宿主菌内的表达情况；将串联合成的基因片段通过分子克隆手段，导入到工程化原核表达载体pETDuet-1中，构建原核表达载体pETDuet-ProCB5。该组合可以在细菌体内自组装成类细胞器空壳；于此同时，利用同源重组的方式，引入由cbbl(PMM0550)、cbbs(PMM0551)、csoSCA(PMM0553)串联分布的三片段酶促反应体系基因簇，构建具有完整固定、转化外源CO₂功能的类细胞器原核表达载体，名称为pETDuet-CB；体外合成的这种功能性类细胞器具有通透小分子底物分子如CO₂、HCO₃、及参与CO₂固定、转化底物分子核酮糖-1，5-二磷酸(RuBp)等，并可以高效率、稳定性的固定、转化外源CO₂为有机物。

具体操作步骤如下：将模式菌株海洋原绿球藻(Prochlorococcus MED4)中的相关基因：壳体蛋白csoS1、csoS4A/B、壳体蛋白csoS2和维持稳定结构的csoS1D蛋白的相关基因进行体外串联合成形成csoS1-csoS4A/B-csoS2-csoS1D，测序比对正确后，再进行常规克隆，获得扩增产物。将扩增产物以基因簇的方式导入到工程化原核表达载体pETDuet-1中以构建载体质粒pETDuet-ProCB5。其中，所设计的引物如下：

ProCB-F：gctctagaaagttaatttaatagaaaaaaaagaaccctaatc

ProCB-R：ataagaatgcggccgcttaattagattcccagtaatc

将合成获得的Prochlorococcus marinus subsp.MED4编码类细胞器空壳的相关组分csoS1-csoS4A/B-csoS2-csoS1D为模板，使用引物ProCB-F和ProCB-R进行PCR扩增，扩增出串联基因簇分布在同一操纵子下的csoS1-csoS4A/B-csoS2-csoS1D的基因片段A，并回收纯化。利用XbaI和NotI双酶切片段A，将其与XbaI和NotI双酶切之后的pETDuet载体利用T4连接酶，4℃连接过夜，转化感受态细胞BL21(DE3)，获得质粒pETDuet-ProCB5。

以上述构建的质粒pETDuet-ProCB5为模板，利用引物LP-pETDuet-F和LP-pETDuet-R进行PCR扩增，得到扩增产物B；以合成编码固定、转化CO₂功能的酶促反应体系串联三片段基因簇cbbl-cbbs-csoSCA为模板，使用引物LP-E3-F和LP-E3-R进行PCR扩增，得到扩增产物C。利用Vazyme Biotech公司的同源重组酶试剂盒(ClonExpress Entry One StepCloning Kit)将扩增产物B和扩增产物C连接，并将其转入感受态细胞BL21(DE3)，将其涂板生长18h后，挑取单菌落，既为构建成功的功能性类细胞器的多组分(csoS1、csoS2、csoS4A/B、csoS1D、cbbl、cbbs、csoSCA)的原核表达载体pETDuet-CB的BL21表达菌株，pETDuet-CB载体如图2所示。其中，使用引物如下：

LP-pETDuet-F：ataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcg

LP-pETDuet-R：gcggccgcaagcttgtcgacctgcagg

LP-E3-F：ggtcgacaagcttgcggccgcaaataatttcccttaatagacc

LP-E3-R：ctttctgttcgacttaagcattatttaatgggcctcctttgttttttg

实施例2类细胞器多组分的表达及分析

将实施例1构建的能够表达类细胞器组分(csoS1、cbbl、cbbs、csoS2、csoSCA、csoS4A/B和csoS1D)的表达载体pETDuet-CB的BL21转到LB培养基中，扩大培养至对数期(OD600＝0.6左右)，然后再向培养基中加入诱导剂IPTG，25℃，诱导表达10h。然后收集菌体，一般都是6-8g菌体左右，利用75ml左右的TEMB buffer重悬(TEMB:10mM Tris-HCl，10mMMgCl₂，20mM NaHCO₃，1mM EDTA,pH8.0)；然后破碎，可以选用超声破碎，也可以利用压力破碎仪破碎细菌，要求破碎充分，可以反复破碎，破碎过程中也可以加入适量的蛋白酶抑制剂，避免目标蛋白降解；将破碎后样品，利用冷冻离心机，12.000g，离心30min；收集上清，利用等体积的BPER II(Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL)混匀，室温摇床培养30min后，再12.000g x 30min，收集上清，将上清装入超速离心管，48.000g x 30min，收集沉淀，利用TEMB重悬沉淀，4℃过夜，然后再次离心3.000g x10min；收集上清，将上清利用预先铺好的10％-50％的蔗糖密度离心，SW41，24.000rpm，40min；可以发现类细胞器主要集中在中间条带区域。收集样品后，利用TEMB透析，浓缩，利用SDS-PAGE、Western blotting分析类细胞器多组分的表达结果，其结果如图3A和图3B所示。

由图3A和图3B可知，实施例1中构建的类细胞器的各组分均通过大肠杆菌进行了异源表达。

实施例3利用分子伴侣辅佐类细胞器的合成

类细胞器自组装分子伴侣的引入及表征：利用分子克隆手段，向实施例2中构建的类细胞器的异源表达菌株体内引入分子伴侣，如GroEL/S、RbcX、Raf1、Hsp70、Hsp60、Hsp68、DnaK/DnaJ、Bip、Hsc1、Hsc 2、Hsc4或Hsc70、核质素、T受体结合蛋白(TRAP)、大肠杆菌的SecB和触发因子及PapD、噬菌体编码的支架蛋白等。

本实施例中选择GroEL/S和RbcX作为分子伴侣。人工合成分子伴侣RbcX(NatureStructural and Molecular Biology 22.9(2015):720；Cell 129.6(2007):1189-1200)完整的基因序列，利用分子克隆手段导入到工程载体pCDFDuet-1上形成质粒pCDFDuet-RbcX。具体过程如下：

以人工合成的RbcX基因序列为模板，利用引物RbcX-F和RbcX-R进行PCR扩增，获得含有酶切位点NdeI/XhoI的RbcX序列D，并回收纯化。利用NdeI和XhoI双酶切D，将其与NdeI和XhoI双酶切之后的pCDFDuet-1载体利用T4连接酶，4℃连接过夜，转化感受态细胞BL21(DE3)，获得能够表达分子伴侣RbcX的质粒pCDFDuet-RbcX。

将能够表达GroEL/S分子伴侣的pGro7质粒(购置于TaKaRa公司)导入到BL21(DE3)菌株中，制备含有pGro7质粒的大肠杆菌BL21-pGro7。

将能够表达类细胞器的质粒pETDuet-CB(同实施例1)、能够表达分子伴侣RbcX的质粒pCDFDuet-RbcX共转进入大肠杆菌BL21-pGro7中，加入诱导剂IPTG诱导表达蛋白，从而实现可以将分子伴侣引入到类细胞器异源合成的表达系统中来。通过蔗糖密度梯度离心和凝胶排阻层析等技术手段纯化类细胞器，以超薄切片电镜显微成像技术(TEM)(如图4所示)及透射电子显微镜对类细胞器在大肠杆菌体内外的组装情况进行分析(图5A、图5B和图5C所示)。

由图4可知，在不同浓度诱导剂IPTG作用下大肠杆菌体内合成的类羧化体细胞器结构的TEM表征图。0uM IPTG作用下，无类羧化体细胞器结构出现；随着诱导剂IPTG浓度的提高，菌体内组装体的结构越来越完整，数目也越来越多；但是浓度过高，会出现明显的包涵体现象；说明在大肠杆菌体内异源表达的类羧化体多组分发生了正确自组装并形成了类羧化体结构的类细胞器，同时也证实了高浓度诱导剂IPTG不利于羧化体组分正确自组装，为实现类羧化体细胞器在大肠杆菌体内大规模批量生产提供了可能。

由图5A、图5B和图5C可知，没有分子伴侣表达的类细胞器的结构与野生型羧化体的形态类似，但结构不够完整，类细胞器结构边缘模糊，界限不清楚；且通过纯化手段获得的发生了有序自组装并形成类羧化体结构的类细胞器数目也较少，尺寸也偏小；而利用分子伴侣辅佐表达的类细胞器结构，其显微形态、结构与野生型α-羧化体形态、结构更加趋同，尺寸大小也更为相近。说明在含有分子伴侣的辅助作用下，羧化体组分可以更有效的发生自组装。

实施例4利用合成的类细胞器固定外源CO₂

利用大肠杆菌毒性试验证实大肠杆菌体内合成的类细胞器具有固定CO₂功能。在大肠杆菌内引入一种对大肠杆菌具有毒性的蛋白，磷酸核酮糖激酶(PRK)，它可以通过细菌的戊糖磷酸代谢途径(Pentose phosphate pathway)，催化5-磷酸核酮糖(R5P)转化成1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)。1,5-二磷酸核酮糖是有毒的代谢中间产物，可抑制细菌生长；而类细胞器表达菌株可以利用自组装形成的类细胞器，吸收外源的CO₂，将有毒的代谢中间产物1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)转化成促进大肠杆菌生长的糖酵解(Glycolysis)中间产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)，使细菌生长抑制得到缓解。其实验原理如图6所示。

因此，本实施例中通过引入磷酸核酮糖激酶(prk)基因及类细胞器的表达载体，进而验证类细胞器具有固定外源CO₂的功能。具体操作步骤如下：设置四组重组表达菌株，WT：代表野生型菌株，既将空载质粒pETDuet-empty和pCDFuet-empty共转入大肠杆菌工程表达菌株BL21(DE3)中，作为空白对照；ProCB：表示仅含有类细胞器表达载体的表达菌株，将实施例1中构建的含有类细胞器各组分的的异源表达质粒pETDuet-CB和空载质粒pCDFDuet-empty共转入大肠杆菌工程表达菌株BL21(DE3)，实现类细胞器在大肠杆菌体内的异源合成，以验证类细胞器异源合成不影响菌株生长趋势；PRK：既仅含有磷酸核酮糖激酶的重组表达菌株。具体是将含有磷酸核酮糖激酶(prk)基因的表达菌株pCDFDuet-PRK与空载pETDuet-empty共转入大肠杆菌的工程表达菌株BL21(DE3)中，构建仅仅含有磷酸核酮糖激酶基因的表达菌株，验证单独表达磷酸核酮糖激酶可以明显抑制正常菌株的生长，具有典型的细胞毒性效果。具体含有磷酸核酮糖激酶基因表达载体pCDFDuet-PRK构建策略如下，使用引如下：

PRK-F：ggaattccatatgagcaaaccggatcgcgtggtg

PRK-R：ccgctcgagttaaacgcttgctgcaacagg

将从南京金斯瑞生物科技有限公司合成的来源于Synechococcus elongatusPCC7942(GenBank:BAA96253.1)的磷酸核酮糖激酶基因，PCR扩增，引入NdeI/XhoI的酶切位点，胶回收后，将PCR产物与空载质粒pCDFDuet-empty同时利用Thermo Scientific公司的快切酶NdeI/XhoI酶切，37℃，30min，胶回收后，获得含有粘性末端的线性化PCR片段及线性化空载质粒，最后，利用Thermo T4DNA lingase，4℃，连接过夜后，转化大肠杆菌工程表达菌株BL21(DE3)中，37℃，恒温培养箱内培养过夜，挑取单菌落，经过DNA测序最终获得含有磷酸核酮糖激酶基因的工程表达载体pCDFDuet-PRK；ProCB/PRK，既将上述描述的含有类细胞器及磷酸核酮糖激酶基因的重组的工程表达载体pETDuet-CB和pCDFDuet-PRK共转入大肠杆菌的工程化表达菌株BL21(DE3)中，同样，37℃培养过夜后，挑取单菌落，既可以获得重组菌株，实现在大肠杆菌体内同时表达类细胞器及磷酸核酮糖激酶，用以验证异源合成的类细胞器具有解毒功能。表达菌株的生长状况如图7所示。

实验结果如图7所示。图7中，WT表示野生型菌株，其共转入pETDuet-empty质粒和pCDFuet-empty质粒的菌株；ProCB表示共转入pETDuet-CB质粒和pCDFDuet-empty质粒的菌株；PRK表示共转入pETDuet-empty质粒和pCDFDuet-PRK质粒的菌株；ProCB/PRK表示共转入pETDuet-CB质粒和pCDFDuet-PRK质粒的菌株。如图7所示，通过对细菌生长曲线分析可知：大肠杆菌中合成的类细胞器，能够吸收外源的CO₂，将有毒的代谢中间产物1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)转化成促进大肠杆菌生长的糖酵解(Glycolysis)中间产物3-磷酸甘油酸(3-PGA)，使细菌生长抑制得到缓解，说明异源表达的类细胞器具有完整的固定二氧化碳的功能。

此外，本实施例通过验证纯化获得的这种类细胞器体外是否具有固定CO₂的功能，既测定纯化获得的类细胞器是否具有RuBisCO酶活力的方法，来证实合成的类细胞器结构同样具有高效固定、转化二氧化碳的功能。具体原理及方法如下：

测定原理：核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/环加氧酶(EC 4.1.1.39)是光合作用中的一个关键酶，它在卡尔文循环中(Calvin)参与CO₂固定，生成2分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA)，同时它也是一个双功能酶，具有更强的催化将O₂加入到核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)的C-2位置上，生成一分子的磷酸乙醇胺和一分子的3-磷酸甘油酸，这两个反应速率的调节依赖O₂和CO₂浓度的调节；本次实验采用酶偶联的方法测定将3-磷酸甘油酸(3-PGA)转化NADH的能力以测定RuBisCO酶活力。测定原理如图8A所示，通过上述反应体系可知，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)每羧化固定一分子CO₂，就会有2分子的NADH被氧化，通过利用酶标仪测定340nm处NADH的减少来计算RuBisCO酶活，也既是纯化所得类细胞器的RuBisCO酶活。

测定方法：利用上述构建的异源表达、体外纯化获得的类细胞器，加入下列酶活性测定反应体系中，测定合成获得的类细胞器所具有核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCO)酶活力，具体操作如下：将3.75ug/ml纯化获得的类细胞器加入到下列反应体系中。100mMTris(pH8.0)，25mM NaHCO₃，20mM MgCl₂，10mM KCl，3.5mM ATP，2mM DTT，0.25mM NADH，5mMcreatine phosphate(磷酸肌酸)，5U/ml creatine phosphokinase(磷酸肌酸激酶)，5U/ml3-phosphoglycerate kinase(3-磷酸甘油酸激酶)，5U/ml NAD-dependentglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(NAD依赖性甘油醛-3-磷酸脱氢酶)(以上所有试剂均采购为Sigma公司)，放于30℃，激活10min；再加入D-核酮糖-1,5-二磷酸，混匀，酶标仪测量30℃下，测量340nm吸光值变化检测NADH的变化，初始酶速率适合于使用非线性回归的Michaelis-Menten类型模型，MATLAB(Mathworks)推导出Vmax和Km参数。与此同时，分别测定了在有无分子伴侣协作作用下，体外纯化获得的类细胞器其RuBisCO酶活力动力学参数结果，并与相关文章报道的野生菌体内羧化体结构RuBisCO酶活力参数作比较，测定实验结果如图8B、8C和8D所示。由实验结果可知，本实验合成的类细胞器结构可以有效的固定、转化外源二氧化碳。在没有分子伴侣协作下，RuBisCO的最大酶促反应速率为：18.23±0.63uM·min^-1·mg^-1CBs，比野生型RuBisCO酶活力(1.27±0.05uM·min^-1·mg^-1CBs)高出了近十三倍多，而在分子伴侣协作下，其最大反应速率更是得到了指数级别的增加(536.06±16.88uM·min^-1·mg^-1CBs)。

对于Km值，纯化获得没有分子伴侣协作下的类细胞器的Km相比野生型的羧化体没有明显的变化；而有分子伴侣协同作用下获得的类细胞器的Km降低明显(106.23±51.17uM)，既其亲和底物的能力相较野生型及没有分子伴侣协作下的类细胞器具有明显提升。也进一步证实了分子伴侣能够明显改善异源合成的类细胞器结构的稳定性、底物通透性，提高其内部包装的RuBisCO酶活力，为实现其工程化应用提供了可能。

本实施例成功构建了类细胞器，并利用分子伴侣辅佐该类细胞器能够在大肠杆菌表达系统中高效的表达及异源自组装，且具有高效的RuBisCO酶活力，能够固定、转化无机CO₂，为实现无机碳向有机碳的转化提供了支撑，为高效的利用无机碳并将其转化为有机能源的工业化生产提供基础。

通过实施例3和实施例4的实验结果可知，利用分子伴侣GroEL/S和RbcX可以有效促进多蛋白组分在大肠杆菌体内的可溶表达及有序自组装，促进自组装形成的类细胞器形态更加完整，结构更加有序，更有效促进了自组装形成类细胞器腔内包装酶促分子RuBisCO的有序折叠，提高了其固定、转化外源CO₂的能力。

实施例5类细胞器的应用1

利用合成的二氧化碳固定类细胞器偶联相关高效率乙醇代谢酶促体系，增加细菌体内乙醇产量。

乙醇(俗称酒精)是一种重要的工业原料，广泛应用于化工、食品、饮料工业、军工、日用化工和医药卫生等领域，还能作为能源工业的基础原料、燃料。其中，燃料乙醇就可以作为燃料添加到汽油、柴油中,可部分替代石油,缓解石油资源短缺。因此，世界上许多经济发达国家都注重以碳水化合物为原料低成本发酵生产乙醇的生物技术开发，并期望由此稳定能源供应，改善能源保障，拉动农业及其他相关传统经济的发展。为此，我们尝试将利用上述实施例构建的含有固定、转化外源二氧化碳功能的改造菌株BL21，基于其可以增加碳源，利用环境中游离的二氧化碳作为自身生长所需，因此，通过对二氧化碳转化下游代谢产物-丙酮酸的下游代谢通路改造，既利用遗传工程手段，引入高活性的丙酮酸脱羧酶(Pdc)及乙醇脱氢酶(Adh)酶促级联反应体系：促使高效率固定、转化外源二氧化碳进一步生成乙醇，代谢通路的示意图如9A所示。

具体操作步骤为：首先，人工合成编码催化乙醇代谢过程的双酶组分丙酮酸脱羧酶(Pdc-EC 4.1.1.1)及乙醇脱氢酶(Adh-GeneID:33074106)编码序列，利用引物LP-Pdc-Adh-F/R，扩增得到Pdc-Adh单一片段序列，然后，利用引物LP-pCDFDuet-F/R扩增pCDFDuet-empty，获得质粒模板，利用Biotech公司的同源重组酶试剂盒(ClonExpress Entry OneStep Cloning Kit)连接过夜，转化BL21(DE3)，挑取单菌落，测序获得稳定表达Pdc-Adh的工程载体pCDFDuet-Pdc-Adh。其中，所用引物序列如下:

LP-pCDFDuet-F：gcccatggtatatctccttattaaag

LP-pCDFDuet-R：ggatccgaattcgagctcgg

LP-Pdc-Adh-F：aaggagatataccatgggc agttatactgtcggtacc

LP-Pdc-Adh-R：agctcgaattcggatccttacaagcttgcaagcag

将载体pETDuet-CB(同实施例1)和pCDFDuet-Pdc-Adh共转进入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂抗性筛选平板，37℃，过夜培养，次日，挑取获得单菌落既是稳定表达上述两种质粒的表达菌株，也既是能够稳定表达、并发生有序自组装形成的催化乙醇代谢产生的的功能性类细胞器结构。

通过以下试验验证引入高活性的丙酮酸脱羧酶及乙醇脱氢酶酶促体系进入具有外源二氧化碳转化功能的改造菌株，且具有明显乙醇代谢增加。具体操作：

试验组分为野生型BL21菌株(野生型组)，仅含类细胞器结构的改造菌株(类细胞器组)，以及本实施例构建的同时含有类细胞器结构及双酶体系的改造菌株(类细胞器+双酶组)三组试验组，接种到含有4％葡萄糖的LB培养基中，37℃，摇菌到对数期OD₆₀₀＝0.6～0.8左右，加入200uM诱导剂IPTG，25℃持续诱导，定时取2ml样品，离心去细胞沉淀，上清做GC-MS分析，测试乙醇代谢量变化，详细结果如图9B所示。

由图9B可知：野生型菌株在代谢后期可以催化产生约7.69mM的乙醇；含有类细胞器结构的改造菌株在20h左右将时，产生的乙醇产量较野生型菌株略有提高；而同时含有类细胞器结构及双酶组分的改造菌株可以快速的催化产生乙醇，相较之野生型菌株，其产量约为1.2倍。由此可见，本申请构建的类细胞器能够高效的固定二氧化碳，而且将其与乙醇代谢酶促体系相结合，能够显著的增加细菌体内乙醇代谢产量。

实施例6类细胞器应用2

利用合成的二氧化碳固定类细胞器偶联相关高效率异丁醛代谢酶促体系，催化异丁醛及相关衍生物的代谢产生

异丁醛(IBA)及其衍生物(如异丁醇、异丁酸等)是塑料工业中重要的化工原料，广泛用作溶剂或增塑剂。特别是异丁醛经氧化、脱氢，最后酯化为甲基丙烯酸甲酯(MMA)是异丁醛的重要用途。目前，生产异丁醛的方法是丙烯与合成气(CO/H₂)羰基化反应制正丁醛时副产异丁醛，产量受到限制，而且这也是一个耗能、不经济的过程。为此，我们尝试利用上述实施例构建的含有固定、转化外源二氧化碳功能的转基因大肠杆菌菌株，基于其可以增加碳源，利用环境中游离的二氧化碳作为自身生长所需，因此，通过对二氧化碳转化下游代谢产物-丙酮酸的下游代谢通路进行精准靶向改造，既利用遗传工程手段，引入枯草芽孢杆菌细胞内高活性的乙酰乳酸合成酶(AlsS-NC_000964.3)及乳酸乳球菌体内的高活性的2-酮酸脱羧酶(Kivd-NC_002662)酶促级联反应体系：促使高效率固定、转化外源二氧化碳进一步转化生成异丁醛，具体代谢通路示意图如10A所示：首先是细菌体内固定、转化的二氧化碳转化为3-磷酸甘油酸(3-PGA)，经过细菌代谢产生丙酮酸，然后利用外源引入枯草芽孢杆菌来源高活性的乙酰乳酸合成酶(AlsS)将其高效率、特异性的催化产生2-乙酰乳酸；通过大肠杆菌体内自身含有的乙酰羟酸异构酶及脱水酶的作用下，经过正常的细菌代谢过程，造成2-酮异戊酸的富集；细菌体内富集的2-酮异戊酸在外源引入高活性的2-酮酸脱羧酶作用下特异性的催化产生高密度的异丁醛。细菌体内催化产生的异丁醛又可经过相关脱水酶、脱氢酶、氧化酶作用下催化产生诸如异丁醇、异丁酸、甚至某些酸酯类等衍生物。本实施例为异丁醛的代谢合成、应用提供了新的思路。

具体操作步骤为：首先，人工合成编码催化异丁醛代谢过程的多酶组分乙酰乳酸合成酶(AlsS-NC_000964.3)及2-酮酸脱羧酶(Kivd-NC_002662)编码序列，利用引物LP-AlsS-Kivd-F/R，扩增得到AlsS-Kivd单一片段序列，然后，利用引物LP-pCDFDuet-F/R扩增pCDFDuet-empty，获得质粒模板，利用Biotech公司的同源重组酶试剂盒(ClonExpressEntry One Step Cloning Kit)连接过夜，转化BL21(DE3)，挑取单菌落，测序获得稳定表达AlsS-Kivd的工程载体pCDFDuet-AlsS-Kivd。其中，所用引物序列如下:

LP-pCDFDuet-F：gcccatggtatatctccttattaaag(同实施例5)

LP-pCDFDuet-R：ggatccgaattcgagctcgg(同实施例5)

LP-AlsS-Kivd-F：aaggagatataccatgggcagttatactgtcggtacc

LP-AlsS-Kivd-R：agctcgaattcggatccttattgaaataagtgctgg

将载体pETDuet-CB(同实施例1)和pCDFDuet-AlsS-Kivd共转进入大肠杆菌BL21(DE3)中，涂抗性筛选平板，37℃，过夜培养，次日，挑取获得单菌落既是稳定表达上述两种质粒的表达菌株，也既是能够稳定表达、并发生有序自组装形成的催化异丁醛代谢产生的的功能性类细胞器结构。

通过以下试验验证引入高活性的乙酰乳酸合成酶及酮酸脱羧酶酶促体系进入具有外源二氧化碳转化功能的改造菌株，且具有异源异丁醛代谢产生，具体操作如下：

实验组分为：野生型BL21菌株(野生型)，作为对照组，以及本实施例构建的同时含有类细胞器结构及双酶体系的改造菌株(类细胞器+双酶)两组试验组。首先，接菌到新鲜的LB培养基，37℃，摇菌到对数期OD600＝0.6～0.8左右，加入200uM诱导剂IPTG，25℃诱导过夜后，收集菌体，1x PBS清洗三次，然后再利用含有50mM NaHCO₃，10mg/L硫胺素，BG-11基础培养基重新悬浮菌体，其中在BG-11培养基表层添加一层矿物油，隔绝空气，放置室温，静置培养。其中，每天定时取2ml样品，离心去细胞沉淀，1xPBS清洗后，保留上清做GC-MS分析，测试异丁醛代谢产量变化。详细结果如图10B所示。

由图10B可知：野生型菌株在正常代谢中可以催化产生约10mg/l异丁醛，含量很少且几乎稳定不变；而含有类细胞器结构的改造菌株可以在生长过程中持续产生异丁醛，经过12天静置培养，异丁醛的含量甚至增加到了近85mg/l，其异丁醛产量较之野生型菌株得到明显提升。

本申请通过，利用遗传工程及代谢工程手段，将具有高效光合固碳效率的模式菌株海洋原绿球藻(Prochlorococcus MED4，简写为Pro.MED4，CCMP1986)中编码光合固碳代谢途径的基因在大肠杆菌体内高效、大规模的自组装成形态、结构、功能完整的类细胞器器件，从而实现在大肠杆菌这种工程菌株体内高效率的固定温室效应气体二氧化碳。而且，通过对大肠杆菌体内二氧化碳固定转化的下游代谢途径的精准靶向调控，最终实现了在大肠杆菌体内进行高效率的二氧化碳固定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 细菌内CO2固定类细胞器的合成及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ProCB-F

<400> 1

gctctagaaa gttaatttaa tagaaaaaaa agaaccctaa tc 42

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ProCB-R

<400> 2

ataagaatgc ggccgcttaa ttagattccc agtaatc 37

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-pETDuet-F

<400> 3

ataatgctta agtcgaacag aaagtaatcg 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-pETDuet-R

<400> 4

gcggccgcaa gcttgtcgac ctgcagg 27

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-E3-F

<400> 5

ggtcgacaag cttgcggccg caaataattt cccttaatag acc 43

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-E3-R

<400> 6

ctttctgttc gacttaagca ttatttaatg ggcctccttt gttttttg 48

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRK-F

<400> 7

ggaattccat atgagcaaac cggatcgcgt ggtg 34

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> PRK-R

<400> 8

ccgctcgagt taaacgcttg ctgcaacagg 30

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-pCDFDuet-F

<400> 9

gcccatggta tatctcctta ttaaag 26

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-pCDFDuet-R

<400> 10

ggatccgaat tcgagctcgg 20

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-Pdc-Adh-F

<400> 11

aaggagatat accatgggca gttatactgt cggtacc 37

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-Pdc-Adh-R

<400> 12

agctcgaatt cggatcctta caagcttgca agcag 35

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP- AlsS-Kivd-F

<400> 13

aaggagatat accatgggca gttatactgt cggtacc 37

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LP-AlsS-Kivd-R

<400> 14

agctcgaatt cggatcctta ttgaaataag tgctgg 36

Claims

1.一种表达载体，其特征在于，其包括能够表达类细胞器的组分的表达载体和表达分子伴侣的表达载体；

所述类细胞器包括壳体蛋白csoS1，csoS2，csoS4A/B，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶RuBisCO，碳酸酐酶csoSCA，维持所述壳体稳定结构的csoS1D蛋白；

所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX；

所述类细胞器组分来源于模式菌株海洋原绿球藻菌株Prochlorococcus MED4。

2.一种表达系统，其特征在于，包括能够表达类细胞器的表达载体和表达分子伴侣的表达载体；

所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX；

所述表达系统为大肠杆菌表达系统。

3.分子伴侣在促进类细胞器表达和/或组装中的应用，其特征在于，所述分子伴侣为GroEL/S和RbcX；

4.权利要求1所述表达载体和/或权利要求2所述表达系统在制备类细胞器中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述类细胞器为体外合成的类羧化体，其能够固定二氧化碳。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，其包括：通过基因重组，将所述类细胞器所包含的基因导入到表达载体和/或表达系统中进行表达；

将表达分子伴侣的相关基因导入到表达载体和/或表达系统中进行表达。