WO2005093060A1 - １，３−プロパンジオール及び／又は３−ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法 - Google Patents

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WO2005093060A1
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gene encoding
glycerol
gene
dehydrogenase
seq
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PCT/JP2005/005480
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Inventor
Shinzo Yasuda
Masaharu Mukoyama
Hiroshi Horikawa
Tetsuo Toraya
Hidetoshi Morita
Original Assignee
Nippon Shokubai Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention provides a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase, a gene encoding a medium subunit and a gene encoding a small subunit, glycerol dehydratase reactivating factor,
  • Z or diol dehydratase reactivation A gene encoding a large subunit and a small subunit of a dang factor, a gene encoding an aldehyde dehydrogenase, and a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase , A transformant containing a gene encoding Z or propanol dehydrogenase, a knockout bacterium in which a gene encoding glycerol dehydrogenase has been knocked out, and 1,3-propanediol and Z using the transformant or the knockout bacterium. Or a method for producing 3-hydroxypropionic acid.
  • 1,3-propanediol is a monomer used in the production of polyester fibers and in the production of polyurethanes and cyclic compounds.
  • Various 1,3-propanediol synthesis pathways are known. For example, a process prepared by the conversion of ethylene oxide over a catalyst in the presence of phosphine, water, carbon monoxide, hydrogen and an acid; a process prepared by catalytic liquid-phase hydration of acrolein followed by reduction; a monoacid
  • a hydrocarbon for example, glycerol
  • traditional chemical synthesis methods have the problem of being expensive and generating a series of wastes containing environmental pollutants.
  • EnterobacterJu SalmonellaJu, KlebsiellaJ3 ⁇ 4, Lactobacillus, aloramator and Listeria have been found in a group of bacteria.
  • glycerol is converted to 1,3-propanediol through a two-step enzyme-catalyzed reaction.
  • glycerol dehydratase converts glycerol to 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA) and water (glycerol ⁇ 3—HPA + H 0) o
  • 3-HPA is converted to NAD + — Dependent oxide reducer
  • 1,3-Propanediol is not further metabolized and consequently deposits in the medium.
  • 3-Hydroxypropionic acid is usually produced by adding water to acrylic acid or by reacting ethylene chlorohydrin with sodium cyanide. Since the reaction of hydrating acrylic acid is an equilibrium reaction, there has been a problem that the reaction rate is limited. The reaction of ethylenechlorohydrin requires the use of highly toxic substances and requires an additional hydrolysis step. In this case, a large amount of sodium salt and ammonium salt There is a problem that occurs.
  • Patent Document 1 W098 / 21339
  • Patent Document 2 W098Z21341
  • Patent Document 3 U.S. Pat.No. 5,821,092
  • Patent Document 4 U.S. Pat.No. 5,254,467
  • Patent Document 5 U.S. Patent No. 5,633,362
  • Patent Document 6 U.S. Pat.No. 5,686,276
  • An object of the present invention is to improve the efficiency of producing 1,3-propanediol from glycerol and provide an industrially useful process.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems, and as a result, have found that genes encoding glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase subunits, and that each subunit of glycerol dehydratase reactivating factor is effective.
  • a transformant containing a gene encoding a unit, a gene encoding an aldehyde dehydrogenase, a gene encoding a 1,3-propanediol oxidoreductase and a gene encoding Z or propanol dehydrogenase is contacted with glycerol.
  • glycerol 1,3-propanediol oxidoreductase
  • the present inventors have also found that Lactobacillus genus, Salmonella genus, Klebsiella genus, Listeria ⁇ , Bacteria Clostridium, Escherichia phloem, Enterobacter syrup, aloramator oyster bacterium, Acetobactenum genus By knocking out a gene encoding glycerol dehydrogenase of Itoda, Brucella rotifer, Flavobacterium J, Fusobacterium sp., Citrobacter ⁇ and Propionibacterium ⁇ , and contacting the bacterium with glycerol. In each case, they have found that two useful compounds can be produced efficiently.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase, a gene encoding a medium subunit and a gene encoding a small subunit, glycerol dehydratase reactivating factor and Z or Diol dehydratase reactivation Gene encoding large subunit and small subunit of dang factor, gene encoding aldehyde dehydrogenase, gene encoding 1,3-propanedioloxide reductase, and Z or propanol
  • the protein encoding the large subunit of glycerol dehydratase is the following protein (a) or (b):
  • the gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase is the following protein (c) or (d):
  • the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following protein ( e ) or (£):
  • the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase is the following (e) or (D DNA:
  • the transformant according to (2) which comprises a DNA encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with the unit and the medium subunit.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 or 15 contains an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and further comprises propanol dehydrogenase (propanediol oxidoreductase); ) Active proteins.
  • a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having 1,3-propanediol oxidoreductase activity.
  • Glycerol dehydratase reactivating gene The genes encoding the subunits and the Z or diol dehydratase reactivating factor subunits are derived from Lactobacillus reuteri.
  • the gene encoding the large subunit of the glycerol dehydratase reactivating factor is the following protein (a) or (b):
  • the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase reactivating factor has the following (c) or (d):
  • the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor is the following DNA (a) or (b):
  • the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase reactivating factor has the following DNA of (c) or (d):
  • Lactobacillus bacterium Salmonella bacterium, Klebsiella bacterium, Listeria bacterium, Lostndum Aridensis, Escherichia J3 ⁇ 4 Itoda, Enterobacter J3 ⁇ 4 ⁇ , S. aloramatorJ3 ⁇ 4 Itoda, Acetobacterium Itoda, Brucella
  • (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and having propionaldehyde dehydrogenase activity.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43, and which has propionate kinase activity.
  • the present invention it is possible to reduce the loss of raw material glycerol when producing 1,3-propanediol from glycerol, and to produce 3-hydroxypropionic acid in combination with 1,3-propanediol. Can be.
  • bacteria used for production can be efficiently cultured, 3-hydroxypropionic acid can be produced more efficiently in combination with 1,3-propanediol.
  • FIG. 1 shows the structure of the pdu operon.
  • FIG. 2 shows one embodiment of a mechanism for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid from glycerol.
  • the present invention provides a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase, a gene encoding a medium subunit, a gene encoding a small subunit, and glycerol dehydratase.
  • Reactivating gizogen and Z or diol dehydratase Gene encoding large subunit and gene encoding small subunit of reactivation gamma factor, gene encoding aldehyde dehydrogenase, and 1,3-propanediol oxide reductase
  • a transformant comprising a gene encoding Z or propanol dehydrogenase.
  • the transformant of the first embodiment dehydrates glycerol to give 3-hydroxypropiona.
  • proteins include glycerol dehydratase and zole dehydratase.
  • Glycerol dehydratase and diol dehydratase are composed of three subunits: a large subunit, a medium subunit and a small subunit.
  • the transformants of the present invention include those containing the genes encoding the three subunits of glycerol dehydratase, those containing the genes encoding the three subunits of diol dehydratase, and those containing the glycerol dehydratase. It includes both genes encoding the three subunits of oral dehydratase and those containing the genes encoding the three subunits of diol dehydratase.
  • each subunit of glycerol dehydratase or diol dehydratase known genes can be used, and examples thereof include Lactobacillus, Citrobacter, L. lostndum, KleDsiellayu, Enterobacter J3 ⁇ 4, Caloramator J3 ⁇ 4, Salmonella, and Salmonella. Those derived from bacteria belonging to the genus Listeria and the like can be used. In the present invention!
  • the amino acid sequence of the large subunit of glycerol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri is shown in SEQ ID NOS: 1 and 3, the amino acid sequence of the medium subunit is shown in SEQ ID NOS: 5 and 7, and the amino acid sequence of the small subunit is shown in SEQ ID NO: 9 And 11.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase from Lactobacillus reuteri is shown in SEQ ID NOS: 2 and 4
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the medium subunit is shown in SEQ ID NOs: 6 and 8
  • the small subunit is encoded.
  • SEQ ID NOS: 10 and 12 show examples of the nucleotide sequence of the gene to be expressed.
  • each amino acid sequence was expressed together with the other two subunits. As long as it has glycerol dehydratase activity, one or several amino acids may have mutations such as deletion, substitution, addition, etc. in each amino acid sequence.
  • all or part of the base sequence represented by the SEQ ID NO: is hybridized under stringent conditions to a sequence complementary to the DNA that also constitutes a base, and the other 2
  • the present invention also includes a case where a gene encoding a protein having glycerol dehydratase activity when expressed together with a species subunit is used.
  • each subunit may be introduced into the same vector for transformation as long as it is expressed in the same host, or may be introduced into a separate vector for transformation. Good. Also. Preferably, the three subunits are derived from the same species or the same strain.
  • the transformant of the first embodiment contains a gene encoding propanol dehydrogenase or a gene encoding 1,3-propanediol oxidoxide reductase,! /, A shift, or both.
  • propanol dehydrogenase (sometimes referred to as propanediol oxide reductase) has a meaning commonly used in the art, ie, 3-hydroxypropionaldehyde.
  • propanol dehydrogenase known genes can be used, and examples thereof include bacteria belonging to the genus Lactobacillus, itrobacter, Clostridium rot, Klebsiella J3 ⁇ 4, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, and Listeria. Those derived from them can be used.
  • a propanol dehydrogenase gene derived from a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, particularly a propanol dehydrogenase derived from Lactobacillus reuteri is preferably a propanol dehydrogenase gene, a Lactobacillus reuteri JCM1112 strain and a propanol dehydrogenase gene derived from Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain! / ,.
  • SEQ ID NOS: 13 and 15 show the amino acid sequence of Lactobacillus reuteri-derived propanol dehydrogenase
  • SEQ ID NOS: 14 and 16 show the base sequence of Lactobacillus reuteri-derived propanol dehydrogenase gene.
  • SEQ ID NO: 13 or 15 as long as the protein containing these amino acid sequences has propanol dehydrogenase activity
  • mutation such as deletion, substitution, or addition may occur in one or several amino acids.
  • the DNA hybridizes with a sequence complementary to the DNA consisting of all or part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 or 16 under stringent conditions, and
  • the present invention also includes a case where a gene encoding a protein having prono V-rudehydrogenase activity is used.
  • 1,3-propanediol oxidoreductase has a meaning commonly used in the art, that is, it reduces 3-hydroxypropionaldehyde and forms 1,3-propanediol.
  • genes can be used as the gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase.
  • known genes can be used.
  • Lactobacillus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Enterobacter, Caloramator, Salmonella, and Listeria Those derived from Itoda fungi belonging to the genus etc. can be used.
  • a 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, particularly a 1,3-propanediol oxidoreductase gene derived from Lactobacillus reuteri, and further derived from Lactobacillus reuteri strain JCM1112 and Lactobacillus reuteri ATCC 53608.
  • the 1,3-propanedioloxide reductase gene is preferred.
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of 1,3-propanediol oxidoxide reductase derived from Lactobacillus reuteri
  • SEQ ID NO: 18 shows the nucleotide sequence of 1,3-propanediol oxidoxide reductase gene derived from Lactobacillus reuteri. I do. As long as a protein comprising these amino acid sequences has 1,3-propanediol oxidoreductase activity, mutations such as deletion, substitution, and addition occur in one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17. May be.
  • the present invention also includes a case where a gene encoding a protein having 3-propanediol oxide reductase activity is used.
  • the transformant of the first embodiment comprises a coenzyme B12 in the reaction center portion of glycerol dehydratase or dial dehydratase inactivated by catalyzing a conversion reaction of glycerol into 3-hydroxypropionaldehyde and water. And a gene encoding a protein having a role of regaining activity.
  • Examples of such proteins include glycerol dehydratase reactivating factor and diol dehydratase reactivating factor.
  • Glycerol dehydratase reactivating factor and diol dehydratase reactivating factor are composed of two subunits, a large subunit and a small subunit.
  • the transformants of the present invention include those containing the genes encoding the two subunits of glycerol dehydratase reactivating enzyme and the two subunits of dialdehydratase reactivating enzyme, respectively.
  • a gene encoding the two subunits of the glycerol dehydratase reactivating factor and a gene encoding the two subunits of the diol dehydratase reactivating factor Is also included.
  • Glycerol dehydratase reactivating factors include W098 / 21341; Daniel et al., J. BacterioL, 177, 2151 (1995); Toraya and Mori, J. Biol. Chem., 274, 3372 (1999); and Tobimatsu et al "J. BacterioL 181, 4110 (1999).
  • Genes encoding the subunits of glycerol dehydratase reactivating factor or diol dehydratase reactivating factor include gdh regulon, which is generally possessed by a group of bacteria capable of assimilating glycerol under anaerobic conditions, It includes those present in a gene group called pdu operon, and includes, for example, gdrA, gdrB, pduG, pduH, ddrA, ddrB, dhaF, dhaG, orfZ, and orfY.
  • gdh regulon which is generally possessed by a group of bacteria capable of assimilating glycerol under anaerobic conditions, It includes those present in a gene group called pdu operon, and includes, for example, gdrA, gdrB, pduG, pduH, ddrA, ddrB, dhaF,
  • each subunit of glycerol dehydratase reactivating factor or diol dehydratase reactivating factor known genes can be used.
  • Lactobacillus, CitroDacter genus, lostridiumj U, Klebsiella Those derived from bacteria belonging to the genera, Enterobacter Jobacter, Caloramator, Salmonella, Listeria, and the like can be used.
  • each of glycerol dehydratase reactivating factor and Z or diol dehydratase reactivating factor derived from bacteria of the genus Lactobacillus can be used.
  • genes of the subunits especially the genes of the glycerol dehydratase reactivating factor from Lactobacillus reuteri and the subunits of Z or diol dehydratase reactivating factor, and the Lactobacillus reuteri JCM1112 strain and Lactobacillus reuteri ATCC
  • the glycerol dehydratase reactivating factor and the gene of each subunit of Z or diol dehydratase reactivating factor derived from 53608 strain are preferred.
  • the transformant containing the genes encoding the three subunits of glycerol dehydratase contains at least the genes encoding the two subunits of glycerol dehydratase reactivating factor, respectively, and comprises diol dehydratase.
  • the transformant containing the genes respectively encoding the three subunits contains at least the genes respectively encoding the two subunits of the giard dehydratase reactivating factor.
  • amino acid sequences of the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor derived from Lactobacillus reuteri are exemplified in SEQ ID NOS: 19 and 21, and the amino acid sequences of the small subunit are exemplified in SEQ ID NOS: 23 and 25.
  • SEQ ID NOS: 20 and 22 show the nucleotide sequences of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase derived from Lactobacillus reuteri
  • SEQ ID NOs: 24 and 26 show the nucleotide sequences of the gene encoding the small subunit.
  • the protein containing each amino acid sequence has a glycerol dehydratase reactivating activity when expressed together with the other subunit. Mutations such as substitution and addition may occur.
  • nucleotide sequence represented by each SEQ ID NO: all or part of the base sequence DNA is hybridized under stringent conditions with a sequence complementary to the DNA sequence, and the other sequence is synthesized.
  • the present invention also includes a case where a gene encoding a protein having a glycerol dehydratase reactivating factor activity when expressed together with the subunit is used.
  • each subunit may be introduced into the same vector and transformed, or may be introduced into a separate vector and transformed, as long as it is expressed in the same host. Good. Also. Use three subunits derived from the same species or strain. Is preferred.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids have a mutation such as deletion, substitution, or addition is represented by each SEQ ID NO.
  • One, or preferably 10-20, more preferably 5-10, and even more preferably 2-3 amino acids of the amino acid sequence may be deleted or the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO.
  • One, or preferably, 10-20, more preferably 5-10, and even more preferably 2-3 amino acids may be added, or one of the amino acid sequences represented by each SEQ ID NO. , Or preferably 10-20, more preferably 5-10, and even more preferably 2-3 amino acids may be replaced by other amino acids! /.
  • stringent conditions refers to conditions under which a specific hybrid is formed and non-specific hybrids are not formed, that is, high homology (homology) Is 90% or more, and preferably 95% or more). More specifically, such conditions may occur at 42-68 ° C in the presence of 0.5-1 M NaCl, or at 42 ° C in the presence of 50% formamide, or at 65-68 ° C in aqueous solution. After redidation, this can be achieved by washing the filter at room temperature and at 68 ° C with 0.1 to 2 times concentration of SSC (saline sodium citrate) solution.
  • SSC saline sodium citrate
  • the “partial sequence” is a nucleotide sequence of DNA containing a part of the nucleotide sequence of each gene, and has a length of a nucleotide sequence sufficient to hybridize under stringent conditions. For example, a sequence having at least 50 bases, preferably at least 100 bases, and more preferably at least 200 bases.
  • a known method such as the Kunkel method or the Gapped duplex method or a method similar thereto can be used, for example, a kit for introducing a mutation using a site-directed mutagenesis method (for example, It can be carried out using Mutan-K (manufactured by TAKARA), Mutan-G (manufactured by TAKARA)), or using the TAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis series kit.
  • the present invention can be performed by chemical synthesis, by PCR using chromosomal DNA as type III, or by hybridization using a DNA fragment having the nucleotide sequence as a probe.
  • the aldehyde dehydrogenase has a meaning commonly used in the art, that is, a protein having an enzymatic activity of oxidizing an aldehyde to generate a carboxylic acid or an acyl group.
  • aldehyde dehydrogenase known genes can be used.
  • Alcaiigenes genus Aspergillus genus, Bacillus genus, Candida rot, nromobacterium genus, genus lostndium, genus orynebactenum, dschenchiaj3 ⁇ 4, Lactooacillus
  • a transformant is obtained by ligating the above four genes or a part thereof to an appropriate vector, and introducing the obtained recombinant vector into a host so that the gene of the present invention can be expressed. I can get it.
  • Part refers to a part of each gene that, when introduced into a host, can express the protein encoded by the gene.
  • a suitable genomic library can be prepared by restriction endonuclease digestion and screened using a probe complementary to the desired gene sequence. Once the sequence is isolated, amplify the DNA using standard amplification techniques, such as the polymerase chain reaction (PCR) (US Patent No. 4,683,202), to obtain a suitable amount of DNA for transformation. be able to.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Genes encoding glycerol dehydratase and each subunit of Z or diol dehydratase, 1,3-propanediol oxidoreductase gene, propanol dehydrogenase gene, glycerol dehydratase reactivating factor and Z or diol dehydratase reactivating The genes encoding the respective subunits of the dagger factor and the aldehyde dehydrogenase gene may be separately introduced into vectors and transformed with a plurality of vectors, or a plurality of genes may be introduced into a single vector. Then, transformation may be performed.
  • the vector into which the gene is inserted is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and cosmid DNA.
  • Step Examples of the rasmid DNA include pBR322, pSC101, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pACYC117, pBluescript II SK (+), pETDuet-1, pACYCDuet-1 and the like.
  • Phage DNA includes, for example, gtlO, Charon 4A, EMBL—, M13mpl8, M13mpl9 and the like.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the target gene.
  • Examples of the host include Bacillus, a strain belonging to the genus Pseudomonas such as P. cerevisiae, such as Ralstonia eutropha, and Pseudomonas putida. subtilis and other bacteria belonging to the genus Bacillus, Escherichia rot such as E. coli, and Escherichia rot such as baccharomyces cerevisiae.
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces examples include yeast belonging to the genus Saccharomyces, yeast belonging to the genus Candida such as Candida maltosa, COS cells, CHO cells, animal cells such as mouse L cells, rat GH3, human FL cells, and insect cells such as SF9 cells.
  • a host cell that does not express glycerol dehydrogenase that is, a cell that does not have a glycerol dehydrogenase gene and a cell in which the glycerol dehydrogenase gene is knocked out.
  • the cell in which the glycerol dehydrogenase gene is knocked out refers to a cell in a situation where the glycerol dehydrogenase gene is disrupted and cannot be expressed. Specifically, the cell uses the glycerol dehydrogenase gene in the cell as a target gene and destroys the gene using a vector (targeting vector) that causes homologous recombination at any position of the target gene.
  • a vector targeting vector
  • a method (gene targeting method), a method in which a trap vector (having no promoter !, a reporter gene) is inserted into an arbitrary position of a target gene to destroy the gene and lose its function (gene trap method),
  • the method used in producing knockout cells, transgenic animals (including knockout animals) and the like in the art, such as a method of combining them, is used to disrupt the glycerol monoldehydrogenase gene in the cells. It is produced by The position where the homologous substitution occurs or the position where the trap vector is inserted is the position of the glycerol dehydrogenase gene.
  • the position is not particularly limited as long as it causes a mutation that causes loss of expression.
  • the transcription control region is substituted.
  • Other methods for knocking out the glycerol dehydrogenase gene include introducing a vector expressing the antisense cDNA of the glycerol dehydrogenase gene and introducing a vector expressing the double-stranded RNA of the glycerol dehydrogenase gene into cells. There is a method to do it.
  • the vector includes a virus vector, a plasmid vector, and the like, and can be prepared based on a conventional genetic engineering technique, for example, according to a basic book such as Molecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). . Also, it is advantageous to cut a commercially available vector with an optional restriction enzyme and incorporate a desired gene or the like to perform semi-synthesis.
  • Whether or not the glycerol dehydrogenase gene has been knocked out is determined by performing a Southern plot on the cells into which the vector has been introduced, and confirming that homologous recombination has occurred correctly. By inserting a drug-resistant gene that the host cell does not have into the vector and selecting the one into which the drug-resistant trait has been incorporated, after disruption and introduction, the genome, bacterial cells, bacterial culture, etc. of the selected strain can be obtained.
  • the recombinant vector be capable of autonomous replication in the host, and at the same time contain a promoter, a target DNA, and a transcription termination sequence.
  • expression vectors include pLA2917 (ATCC 37355) having an RK2 origin of replication and pJRD215 (ATCC 37533) having an RSF1010 origin of replication that are maintained in a wide range of hosts.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host.
  • promoters derived from Escherichia coli, phage, and the like such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, and T7 promoter are used.
  • Bacteria The method for introducing the recombinant vector into the vector is not particularly limited, and examples thereof include a method using calcium ion (Current Protocols in Molecular Biology, 1, 181 (1994)) and an electo-portion method.
  • examples of expression vectors include YEpl3, YCp50, and the like.
  • examples of the promoter include gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, GAP promoter and the like.
  • the method for introducing the thread-recombinant vector into yeast is not particularly limited, and for example, an electroporation method and a spheroplast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 192, 9-1933 (1978)) And the lithium acetate method (J. BacterioL, 153, 163-168 (1983)).
  • an animal cell When an animal cell is used as a host, for example, pcDNAI, pcDN AlZAmp (Invitrogen) or the like is used as an expression vector.
  • the promoter include SR ⁇ promoter, SV40 promoter, CMV promoter and the like.
  • the method for introducing the recombinant vector into animal cells is not particularly limited, and examples thereof include an elect-mouth method, a calcium phosphate method, and a lipofection method.
  • the present invention relates to a bacterium belonging to the genus Lactobacillus, a bacterium belonging to the genus Salmonella,
  • Klebsiella Itoda Listeria, Clostridium ⁇ Itoda, Escherichia Itoda,
  • the present invention relates to a bacterium selected from bacteria belonging to the genus Propionibacterium, wherein the gene encoding glycerol dehydrogenase has been knocked out.
  • a bacterium selected from bacteria belonging to the genus Propionibacterium, wherein the gene encoding glycerol dehydrogenase has been knocked out.
  • Lactobacillus J3 ⁇ 4 Itoda Salmonella Otoda, Klebsiella Itoda, Listeria, Lostndum Alitida, EscherichiaJ3 ⁇ 4, Enterobacter J3 ⁇ 4 ⁇ , aloramatorJ3 ⁇ 4, Acetobacterium Itoda, Brucella, FlavobactenumJ Bacteria, FusobactenumJ3 ⁇ 4 bacteria, Citrobacter spp. And Propioniumacterium spp. Are the genes encoding the large subunits of glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase.
  • a gene encoding propionaldehyde dehydrogenase, a gene encoding phosphotrance acylase, a gene encoding propionate kinase, and a gene encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and encoding Z or propanol dehydrogenase There is no particular limitation as long as the gene has the gene to be used.
  • bacteria such as Lactobacillus bacteria, Salmonella bacteria, Klebsiella bacteria, Brucella bacterium, Fusobacterium bacteria which are preferred by bacteria having a coenzyme B12 synthesis system are preferred.
  • LactoDacilius genus Itoda includes Lactobacillus reuteri, Lactooacilius ore vis
  • Lactobacillus buchneri Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri,
  • Lactobacillus helveticus Lactobacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii,
  • Lactobacillus yamanashiensis Lactobacillus yamanashiensis and the like.
  • Salmonella genus Itoda includes Salmonella enterica, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, and Klebsiella bacterium includes Klebsiella aerogenes, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae ⁇ Klebsiella leb, Klebsiella atlantae, Klebsiella atlantae, Klebsiella atlantae ozaenae, Klebsiella planticola, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella rubiacearum, Klebsiella terrigena, and Listeria bacteria such as Listeria denitrificans, Listeria grayi, Listeria innocua, Listeria ivanovu, Listeria monocytogenes ⁇ Listeria seerimeri, Clostridium agricultural bacteria include Clostridium acetobutylicum, lostnaium butyncum, Clostridium pasteunanum, Clos
  • Caloramator genus Itoda is Caloramator coolhaasii, Caloramator fervidus, Caloramator indicus, Caloramator proteoclasticus, Caloramator uzoniensis, Caloramator viterbiensis, and Acetobacterium sp.
  • Brucella Brucella melitensis is mentioned; as a bacterium belonging to the genus Flavobacterium, Fiavobacterium sp. Is shaken; as a bacterium belonging to the genus Fusobactenum, there is Fusobactenum nucleatum; Include
  • Propionibacterium jensenii Propionibacterium microaephilum, Propionibacterium propionicum, Propionibacterium thoenu, Propionibacterium freudenreichii.
  • a bacterium of the genus Lactobacillus preferably a bacterium of the genus Lactobacillus, more preferably
  • Lactobacillus reuteri particularly preferably Lactobacillus reuteri strain JCM1112, preferably KlebsiellaJ3 ⁇ 41 strain, more preferably 3;
  • the bacterium according to the second embodiment is obtained by knocking out a gene encoding glycerol dehydrogenase in the above bacterium. By knocking out the gene, daricerol is converted into dihydroxyacetone by oxidation. Pathways can be blocked and 1,3-propanediol and Z or 3-hydroxypropionic acid can be produced in higher yields.
  • the fact that the gene encoding glycerol dehydrogenase has been knocked out means that the glycerol dehydrogenase gene has been disrupted and cannot be expressed.
  • the knockout bacteria are as described for the knockout cells in the first embodiment.
  • bacteria of the genus Lactobacillus bacteria of the genus Salmonella, bacteria of the genus Klebsiella, Listeria ⁇ , B. Clostridium, E Escherichia, B.
  • enterobacter enterobacter, ⁇ aloramator ⁇ , A Acetobactenum ⁇ , Brucella sp., Flavobacterium J., Fusobacterium sp., Citrobacter ⁇ , and Propionibacterium ⁇ ., Have genes encoding the pdu operon and phosphotransacylase, and the gene encoding glycerol dehydrogenase. Those that are knocked out are preferred.
  • bacteria of the genus Lactobacillus bacteria of the genus Salmonella, bacteria of the genus of Klebsiella, genus of the genus Listeria, bacteria of the lostndum lit.
  • Bacteria other than those of the genus Uho, Fusobactenum J3 ⁇ 4, Citrobacter and Propion3 ⁇ 4acterium, in which the gene encoding the glycerol dehydrogenase is knocked out among the bacteria having the genes encoding the pdu operon and phosphotransacylase. are also included.
  • the pdu operon includes a gene encoding a multi-sided endoplasmic reticulum protein, in which aldehydes derived from 1,2-diols including glycerin are retained in the multi-sided endoplasmic reticulum for a certain period of time. It is thought that it has a function of catalyzing the reaction of aldehyde to acid or alcohol in the endoplasmic reticulum, the endoplasmic reticulum membrane, and its vicinity, thereby reducing the direct adverse effect of aldehyde on bacterial cells.
  • microorganisms having the pdu operon form multi-sided endoplasmic reticulum in the cells, once take up diols into the endoplasmic reticulum, retain aldehydes obtained by dehydration to some extent, and adversely affect the growth of the cells. It is thought that it does not reach. Therefore, it is considered that the aldehyde oxidation or reduction reaction occurs in the polyhedral endoplasmic reticulum, the endoplasmic reticulum membrane, or its vicinity.
  • the bacterium of the present invention contains an orf that encodes a multifaceted endoplasmic reticulum-forming protein or the like that is not limited to the operon directly involved in the direct reaction among the pdu operons, and further contains other orfs contained in the pdu operon. ,.
  • FIG. 1 The structure of the pdu operon is shown in FIG. 1, and the nucleotide sequence of the pdu operon is shown in SEQ ID NO: 53.
  • each orf, its function, and a base sequence derived from Lactobacillus reuteri JCM1112 are shown below.
  • Orfl-4 is thought to be unrelated to the pdu operon.
  • pdu Obis is also considered to be unrelated to the reaction according to the present invention.
  • pduGH diol dehydratase reactivator SEQ ID NOs: 20 and 24
  • pduJK Polyhedral body constituent protein SEQ ID NOs: 60 and 59
  • diol dehydratase and diol dehydratase reactivating factor can be replaced with glycerol dehydratase and glycerol dehydratase reactivating factor, and propanol dehydrogenase can be substituted.
  • the present invention provides a gene encoding a large subunit of glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase, a gene encoding a medium subunit, and a gene encoding a small subunit; Glycerol dehydratase reactivating factor and Z or diol dehydratase reactivating factor Gene encoding large subunit and small subunit encoding gene, gene encoding propionaldehyde dehydrogenase, gene encoding phosphotransylase, propion Genes encoding acid kinases, as well as genes encoding 1,3-propanediol oxidoreductase and genes encoding Z or propanol dehydrogenase And a transformant containing no gene encoding glycerol
  • the transformant of the third embodiment contains a gene encoding a protein having an enzymatic activity that catalyzes a reaction of dehydrating glycerol and converting it to 3-hydroxypropionaldehyde and water.
  • proteins include glycerol dehydratase and diol dehydratase, as described above.
  • the transformants of the second embodiment include those containing the genes encoding the three subunits of glycerol dehydratase, those containing the genes encoding the three subunits of diol dehydratase, and glycerol dehydratase. And the genes encoding the three subunits of diol dehydratase, respectively. , Deviations.
  • the gene encoding each subunit may be introduced into the same vector for transformation as long as it is expressed in the same host, or may be introduced into a separate vector for transformation. Good. Also. Preferably, the three subunits are derived from the same species or the same strain.
  • the transformant of the third embodiment includes a gene encoding a protein having an enzymatic activity capable of catalyzing a reaction of reducing 3-hydroxypropionaldehyde and converting it to propanediol. Examples of the gene encoding such a protein include a gene encoding 1,3-propane pandioloxide reductase and a gene encoding propanol dehydrogenase.
  • the transformant of the third embodiment comprises a coenzyme B12 in the reaction center portion of glycerol dehydratase or dial dehydratase inactivated by catalyzing the conversion reaction of glycerol into 3-hydroxypropionaldehyde and water. And a gene encoding a protein having a role of regaining activity. Examples of such proteins include glycerol dehydratase reactivating factor and diol dehydratase reactivating factor. The glycerol dehydratase reactivating factor and the diol dehydratase reactivating factor are the same as those described in the first embodiment.
  • the transformants of the second embodiment include those containing genes encoding the two subunits of glycerol dehydratase reactivating factor and two subunits of diol dehydratase reactivating factor, respectively. And two genes encoding the two subunits of glycerol dehydratase reactivating factor and the two subunits of diol dehydratase reactivating factor, respectively. Includes genes, but also includes deviations.
  • the transformant containing the genes respectively encoding the three subunits of glycerol dehydratase contains at least the genes encoding the two subunits of glycerol dehydratase reactivating factor, respectively, and comprises diol dehydratase.
  • Transformants containing the genes encoding the three subunits of at least Redehydratase reactivation Including genes encoding the two subunits of the dang factor.
  • the transformant of the third embodiment contains a gene encoding a protein having an enzymatic activity capable of catalyzing a reaction of adding propionaldehyde to CoA and generating propio-CoA.
  • a gene encoding such a protein includes a gene encoding propion aldehyde dehydrogenase. Propionaldehyde dehydrogenase is included in aldehyde dehydrogenase.
  • a propionaldehyde dehydrogenase gene derived from a bacterium belonging to the genus Lactobacillus particularly a propionaldehyde dehydrogenase gene derived from Lactobacillus reuteri, and a propionaldehyde dehydrogenase gene derived from Lactobacillus reuteri JCM1112 strain are preferred.
  • SEQ ID NO: 41 shows the amino acid sequence of Lactobacillus reuteri-derived propionaldehyde dehydrogenase
  • SEQ ID NO: 42 shows the nucleotide sequence of Lactobacillus reuteri-derived propionaldehyde dehydrogenase gene.
  • mutations such as deletion, substitution, addition, etc. may occur in one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41.
  • the transformant of the third embodiment encodes a protein having an enzymatic activity capable of catalyzing a reaction of removing propionyl-CoA from CoA and adding phosphate to generate propionylphosphate.
  • a protein having an enzymatic activity capable of catalyzing a reaction of removing propionyl-CoA from CoA and adding phosphate to generate propionylphosphate.
  • genes include a gene encoding phosphotransacylase.
  • As the gene encoding phosphotransacylase known genes can be used.
  • Lactobacillus bacteria belonging to the genus CitroDacter, the genus lostridiumj U, the genus Klebsiella, the genus Enterobacter Jor, the genus Caloramator, the genus Salmonella, and the genus Listeria Those derived from them can be used.
  • a phosphotransacylase gene derived from a bacterium belonging to the genus Lactobacillus particularly a phosphotransacylase gene derived from Lactobacillus reuteri, and a phosphotransacylase gene derived from Lactobacillus reuteri JCM1112 strain are preferred.
  • the transformant of the third embodiment is a protein having an enzymatic activity capable of removing propionyl phosphate phosphate, adding ADP to generate ATP, and simultaneously catalyzing a reaction for generating propionic acid.
  • a gene encoding Examples of a gene encoding such a protein include a gene encoding propionate kinase.
  • ATP is generated at the same time as the reaction for producing 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid, and the transformant grows efficiently and is cultured. Can be implemented efficiently.
  • proionate kinase known genes can be used.
  • bacteria belonging to the genus CitroDacter, genus lostridiumj U, genus Klebsiella, Enterobacter J3 ⁇ 4, genus Caloramator, genus Salmonella, and genus Listeria are used. Those derived from them can be used.
  • a propionate kinase gene derived from a bacterium belonging to the genus Lactobacillus particularly a propionate kinase gene derived from Lactobacillus reuteri, and a propionate kinase gene derived from Lactobacillus reuteri JCM1112 strain are preferred.
  • SEQ ID NO: 43 illustrates the amino acid sequence of propionate kinase derived from Lactobacillus reuteri
  • SEQ ID NO: 44 illustrates the base sequence of the propionate kinase gene derived from Lactobacillus reuteri.
  • all or a part of the base sequence represented by SEQ ID NO: 44 may be hybridized under stringent conditions with a sequence complementary to the DNA.
  • the present invention also includes a case where a gene encoding a protein having propionate kinase activity is used.
  • the above four genes or a part thereof are ligated to an appropriate vector, and the obtained recombinant vector is placed in a host so that the gene of the present invention can be expressed. You can get it from your mentor.
  • Glycerol dehydratase and Z or diol dehydratase a gene encoding a large subunit, a gene encoding a medium subunit, a gene encoding a small subunit, a glycerol dehydratase reactivating factor, and a Z or a diol dehydratase
  • the gene encoding 1,3-propanediol oxide reductase and the gene encoding Z or propanol dehydrogenase can be separately introduced into a vector and transformed with multiple vectors. We also performed conversion, and may be performed transformed by introducing a plurality of kinds of genes into a single vector.
  • the vector into which the gene is inserted is not particularly limited as long as it can be replicated in a host cell, and examples thereof include plasmid DNA, phage DNA, and cosmid DNA.
  • examples of the plasmid DNA include pBR322, pSC101, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pACYC117, pBluescript II SK (+), pETDuet-1, pACYCDuet-1 and the like.
  • the phage DNA include gtlO, Charon 4A, M13mpl8, M13mpl9 and the like.
  • the host is not particularly limited as long as it can express the gene of interest.
  • Examples of the host include, [Ralstonia spp., Pseudomonas spp., Bacillus J3 ⁇ 4 spp., Escherichia Tota sp., Propionibacterium paniculata, Lactobacillus genus Itoda, Salmonella genus Itoda, Klebsiella ⁇ Itoda, Acetobacterium J. ⁇ , B. Flavobactenum ⁇ , Citrobacter J3 ⁇ 4 Itoda,
  • Propionibacterium jensenii ⁇ Propionibacterium microaephilum, Propionibacterium propionicum, Propionibacterium thoenii, Propionibacterium freudenreichu,
  • Agrobacterium tumefaciens Anabaena sp. ⁇ Bradyrhizobium japonicum, Brucella melitensis, Brucella suis, Chlorobium tepidum, Clostridium tetania Clostridium glycolicum, Clostridium difficile Corynebacterium diphtheriae, Fusobacterium nucleatum, ueobacter sulfUrreducens, Gloeobacter violaceus, Leptospira interrogans, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gingivalis, Prochlorococcus marinus, Rhodobacter capsulatus, Rhodopseudomonas palustris, Sinorhizobium meliloti, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Synechococcus s
  • yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae
  • yeast belonging to the genus Candida such as Candida maltosa
  • COS cells CHO cells
  • mouse L cells animal cells
  • animal cells such as rat GH3, human FL cells, SF9 cells, etc.
  • Insect cells and the like can be used.
  • a host having a coenzyme B12 synthesis system is preferably used as a host.
  • bacteria of the genus Lactobacillus bacteria of the genus Salmonella, bacteria of the genus Klebsiella, bacteria of the genus Propionibacterium, strains of the genus Agrobacterium, strains of the genus Anabaena, bacteria of the genus Bacillus J Uho, strains of the genus Bradyrhizobium, strains of the genus Brucella, genus Chlorobium, Clostridium J 3 ⁇ 4, B. oryneDacterium sp., Fusobactenum Chenda, Geobacter ⁇ , loeoDacter ⁇ , Leptospira ⁇ , Mycobacterium ⁇ , Mycobacterium / ⁇ ⁇
  • Photorhabdus spp. Porphyromonas paniculata, Prochiorococcus sp.
  • Thermoplasma decay protozoa, good 3; Propionibacterium spp.
  • Propionibacterium freudenreichii is used as a host.
  • a host into which a coenzyme B12 synthetic gene has been introduced by recombination may be used.
  • a host cell that does not express glycerol dehydrogenase that is, a cell that does not have a glycerol dehydrogenase gene and a cell that has knocked out a glycerol dehydrogenase gene are used.
  • glycerol dehydrogenase a cell that does not have a glycerol dehydrogenase gene and a cell that has knocked out a glycerol dehydrogenase gene.
  • the method of knocking out the glycerol dehydrogenase gene the same method as described above can be used.
  • the production of 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid is carried out by contacting the bacterium or transformant of the present invention with glycerol and reacting the bacterium or transformant into a reaction product (cultured cells or culture supernatant). It can be carried out by accumulating 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid and collecting 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid.
  • contacting the bacterium or transformant of the present invention with glycerol means that the bacterium or transformant of the present invention is cultured in the presence of glycerol. Performing the reaction using the processed material of the culture is included. Examples of the treated product include a dead cell, a crushed cell, a crushed cell, a crude enzyme prepared from a culture supernatant, and a purified enzyme. In addition, it is possible to use the cells, the processed product, the enzyme, and the like immobilized on a carrier by a conventional method.
  • the method of culturing the bacterium or the transformant of the present invention is performed by using glycerol as a carbon source according to a usual method.
  • aerobic cultivation is performed using a relatively rich medium, for example, two culture mediums, and the fermentation is performed under anaerobic conditions after increasing the amount of cells, and then with glycerol.
  • the pH is adjusted using reagents that do not interfere with the growth of the host and do not interfere with the separation of the acid from the fermentation broth.
  • Sodium carbonate, ammonia, and sodium ion sources, such as sodium salt may be added.
  • aqueous sodium hydroxide aqueous potassium hydroxide, aqueous sodium hydroxide, aqueous ammonium hydroxide, aqueous calcium hydroxide, aqueous potassium carbonate, aqueous sodium carbonate, aqueous potassium acetate, and the like.
  • Reagents may be used.
  • the pH is maintained at 5.0-8.0, preferably 5.5-7.5.
  • Examples of the nitrogen source include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, and the like, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn starch. And the like.
  • Examples of the inorganic substance include potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, and the like.
  • antibiotics such as kanamycin, ampicillin, and tetracycline were added to Sure.
  • an inducer can be added to the medium.
  • IPTG isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside
  • ⁇ indoleacetic acid
  • DMEM medium or a medium obtained by adding fetal serum to these mediums is used. Cultures are usually performed at 30-40 ° C in the presence of 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium.
  • the bacteria or the transformant obtained above are collected by, for example, centrifugation or the like, and suspended in an appropriate buffer.
  • an appropriate buffer By suspending this cell suspension in a buffer containing glycerol and performing a reaction, 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid can be produced.
  • the reaction conditions are, for example, a reaction temperature of 10-80 ° C, preferably 15-50 ° C, a reaction time of 5 minutes-96 hours, preferably 10 minutes-72 hours, and a pH of 5.0-8. 0, preferably 5.5-7.5.
  • 1,3 propanediol and 3-hydroxypropionic acid can be obtained from a culture medium by subjecting the reaction mixture to extraction with an organic solvent, distillation and column chromatography (US Pat. No. 5,356,812). ). Further, it is preferable to concentrate the fermentation broth using an ultrafiltration membrane or a zeolite separation membrane through which only low molecules such as water can pass. By performing concentration, energy for evaporating water can be reduced.
  • Synthetic oligonucleotide primer forward primer: 5'-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3 '(SEQ ID NO: 27), reparse primer: 5 and TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT—3' (SEQ ID NO: 28) were prepared. The PCR reaction was carried out.
  • Genome 1 1 1 ng / 1 1
  • Reaction system volume total 50 reaction cycles: (94 ° C 2 minutes X 1, 94 ° C 15 seconds, 45-65 ° C 30 seconds, 68 ° C 5 minutes) X 30 times, 4 ° C ⁇ .
  • nucleotide sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase represented by SEQ ID NO: 2 the nucleotide sequence of the gene encoding the medium subunit of glycerol dehydratase represented by SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 10
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the small submit of glycerol dehydratase was determined.
  • the forward primer 5'-ATGAAACGTCAAAAACGTTTTGAAGAACTA-3 '
  • Forward primer 5'-ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA-3 '(SEQ ID NO: 31), reverse primer:
  • a forward primer: 5'-ATGGGAGGCATAATGCCGATG-3 '(SEQ ID NO: 33), a reverse primer: 5 and TTAACGAATTATTGCTTCGTAAATCATCTTC- 3' (SEQ ID NO: 34) were prepared, and the genome of Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain was Then, a PCR reaction and a DNA sequence were carried out in the same manner as in Example 1. As a result, the base sequence of the propanol dehydrogenase gene represented by SEQ ID NO: 16 was determined.
  • Example 1 A forward primer: 5 ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG—3 ′ (SEQ ID NO: 35) and a reverse primer: 5′-TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT-3 ′ (SEQ ID NO: 36) were prepared, and the Lactobacillus reuteri JCMl 112 strain genome was transformed into type III. PCR reaction and DNA sequence were performed in the same manner as in 1. As a result, the nucleotide sequence of the 1,3-propanediol oxidoxide reductase gene represented by SEQ ID NO: 18 was determined.
  • Forward primer 5 and ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT—3 '(SEQ ID NO: 37), reverse primer:
  • 5-TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3 ′ (SEQ ID NO: 38) was prepared, and the PCR reaction and DNA sequence were carried out in the same manner as in Example 1 using the genome of Lactobacillus reuteri JCMl 112 strain as type III.
  • the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor shown in SEQ ID NO: 20, and the gene encoding SEQ ID NO: 24 The nucleotide sequence of the gene encoding the small subunit of the glycerol dehydratase reactivating factor was determined.
  • a forward primer: 5'-ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTG- 3 '(SEQ ID NO: 39) and a reverse primer: 5'-TCACCTGTTTACCATTTCCTTAAAGG-3' (SEQ ID NO: 40) were prepared, and the genome of Lactobacillus reuteri ATCC 53608 strain was Then, a PCR reaction and a DNA sequence were performed in the same manner as in Example 1.
  • nucleotide sequence of the gene encoding the large subunit of glycerol dehydratase reactivating factor represented by SEQ ID NO: 22 and the gene encoding the small subunit of glycerol dehydratase reactivating factor represented by SEQ ID NO: 26 The sequence was determined.
  • Forward primer 5'—TTGATGTCAAAAAAAATACTTGCAATTAATTCTG—3 '(SEQ ID NO: 49), reverse primer:
  • SEQ ID NO: 50 5′-TTATTGCTGAGTTAC ATTC ATTAC ATC AC-3 ′ (SEQ ID NO: 50) was prepared, and the genome of Lactobacillus reuteri JCMl 112 strain was made into type III, and a PCR reaction and a DNA sequence were carried out in the same manner as in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding propionate kinase represented by SEQ ID NO: 44 was determined.
  • Adekinol ZD an antifoaming agent
  • IPTG was introduced so as to be ImM, and it took 2 hours!
  • the cells were collected by centrifugation, added to 100 ml of 1 M glycerol, and the gas phase was replaced with nitrogen.
  • a 100 ml bottle was placed on the bottle mouth at 37 ° C for 5 hours, and then the liquid was analyzed.
  • the solution contained 0.4M of 1,3-propanepandiol and 0.4M of 3-hydroxypropionic acid.
  • ATTAATCGTTAACC-3 '(Primer 1: SEQ ID NO: 71) was added to the N-terminal side, and the sequence 5'-CTGGGCGAATACCTGAAGCCGCTGGCAGAAC
  • the mixed solution after application is calorie in 250 ⁇ l of SOC medium, cultured at 37 ° C for lh, and then spread on an agar plate of LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin to select for ampicillin-resistant strains.
  • a strain in which amplification of a fragment of about 2300 bp was confirmed by colony PCR using primers 1 and 2 was defined as a glycerol dehydrogenase gene knockout strain.
  • Probe 1 (SEQ ID NO: 74), which is a conserved region in the ORF of pocR at the head of the operon, and any genus of the pdu operon
  • probe 2 (SEQ ID NO: 75), which is a conserved region in the ORF of pduV in the latter half of the operon, was selected and subjected to co-hybridization to select strains that were both positive. .
  • Adekinol ZD an antifoaming agent
  • IPTG was introduced so as to be ImM, and two hours passed!
  • the cells were collected by centrifugation, and a 100 ml bottle containing 1 M glycerol and 200 mM glycerol and the gas phase was replaced with nitrogen was placed on a bottle roller at 37 ° C for 5 hours, and then the liquid was analyzed.
  • the solution contained 25 mM 1,3-propanediol and 21 mM 3-hydroxypropionic acid! /.
  • Example 9 Production of 1,3-propanediol and 3-hydroxypropionic acid by knockout strain
  • primers for partial amplification of the glycerol dehydrogenase gene of Lactobacillus reuteri strain JCM1112 were prepared as follows.
  • a DNA fragment represented by SEQ ID NO: 46 was synthesized so as to contain a usable erythromycin resistance gene and its promoter and terminator regions and to have Kpnl sites at both ends. This DNA fragment was treated with a restriction enzyme at 37 ° C. for 2 hours with the composition shown in Table 1 below, and purified and recovered to obtain a drug resistance marker sequence.
  • restriction enzyme treatment was carried out at 37 ° C for 2 hours to recover a linearized plasmid of about 4986 bp.
  • the concentration of pCR4-TOPO / Lb_GDH was 30 ng / ⁇ 1.
  • the linear plasmid prepared in a) and the drug resistance marker sequence prepared in 2) were ligated by a ligation reaction and transformed into E. coli TOP10 cells. From among transformants A pCR4-TOPO plasmid (hakai / pCR4-TOPO) having the disrupted fragment as an insertion sequence was selected and recovered.
  • a combi-tent cell was created by the following procedure.
  • test plasmid (5-10 ml; 2-3 mg) was added to the competent cells prepared by the above method.
  • Gene pulsei was set to 2.5 kV, 25 mF, 200 ⁇ , and an electric pulse was applied.
  • Erythromycin resistant strains that grew as a result of the culture in b) were selected and the genome was recovered.
  • the insert was confirmed by PCR using the genome as a template.
  • a strain in which the drug resistance, L, morphology, and gene transfer on the genome were confirmed by PCR was defined as a disrupted strain.
  • SEQ ID NOs: 27-40, 46-52 Synthetic oligonucleotides

Landscapes

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Abstract

　本発明は、グリセロールから１，３−プロパンジオールを製造する際の効率性を改善し、工業上有用なプロセスを提供することを目的とする。 　本発明は、グリセロールデヒドラターゼ及び／又はジオールデヒドラターゼのラージサ ブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び／又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び／又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体に関する。

Description

1， 3—プロパンジオール及び Z又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する 方法
技術分野
[oooi] 本発明は、グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージ サブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモ ールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び
Z又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝 子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコ一 ドする遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝 子及び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含む形質転換体 、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細 菌、ならびに該形質転換体又はノックアウト細菌を用いて 1, 3—プロパンジオール及 び Z又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 1, 3—プロパンジオールはポリエステル繊維の生産並びにポリウレタン及び環状化 合物の製造に使用されるモノマーである。 1, 3—プロパンジオール合成経路としては 、種々ものが知られている。例えば、ホスフィン、水、一酸化炭素、水素及び酸の存在 下、触媒上でのエチレンオキサイドの変換により製造する方法;ァクロレインの触媒的 液相水和、続いての還元により製造する方法;一酸ィ匕炭素及び水素存在下、周期律 表の VIII族の原子を持って ヽる触媒上で炭化水素（例えば、グリセロール)を反応さ せることにより製造する方法などが報告されている。し力しながら、伝統的化学合成法 は、費用が力かるとともに、環境汚染物質を含んでいる一連の廃棄物を発生するとい う問題を有していた。
[0003] これに対し、 1, 3—プロパンジオールを製造するための生物学的方法として、グリセ ロールから 1, 3—プロパンジオールへの発酵を触媒する酵素を有する微生物を利用 する方法が報告されている（特許文献 1一 6参照)。グリセロールから 1, 3—プロパン ジオールを生産できる細菌株が、例えば、 Citrobacter属、 Clostridium属、
EnterobacterJ禹、 SalmonellaJ禹、 KlebsiellaJ¾、 Lactobacillus属、し aloramator為及び Listeria属に属する細菌の群で発見されて 、る。
[0004] 生物学的系において、グリセロールは 2段階の酵素触媒反応を経て、 1, 3—プロパ ンジオールに変換される。第 1段階において、グリセロールデヒドラターゼがグリセ口 ールを 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒド（3— HPA)及び水へ変換する（グリセロール →3— HPA+H 0) o第 2段階において、 3— HPAが NAD+—依存性ォキシドレダクタ
2
ーゼにより 1, 3—プロパンジオールに還元される（3— HPA+NADH+H+→1, 3— プロパンジオール +NAD+)。 1, 3—プロパンジオールはそれ以上代謝されず、結果 として媒体中に堆積する。
[0005] しかし、生物学的系におけるグリセロールからの 1, 3—プロパンジオールの生産は、 一般に嫌気性条件下でグリセロールを単独の炭素源とし、他の外因性還元当量受 容物質の不在下で行われるため、最初に、 NAD+— (又は NADP+—)結合グリセ口 一ルデヒドロゲナーゼによるグリセロールのジヒドロキシアセトン（DHA)への酸化（グ リセロール + NAD+→DHA+NADH + H)というグリセロールに関する平行経路が 働く。そして、 DHAは、 DHAキナーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸へリン酸化 され、生合成及び ATP生成のために利用される。
[0006] 従って、従来の微生物を用いた 1, 3—プロパンジオールの製造方法においては、 原料であるグリセロールの半分が上記平行経路において消費され、原料グリセロー ルに対する生成物の収率が低ぐ効率性及びコストの点で問題があった。
[0007] 一方、 3—ヒドロキシプロピオン酸及びそのエステルは、脂肪族ポリエステルの原料と して有用な化合物であり、また、これらカゝら合成されるポリエステルは生分解性の環境 にやさし ヽポリエステルとして注目されて！/、る。
[0008] 3—ヒドロキシプロピオン酸は、通常、アクリル酸に対する水の付カ卩により、又はェチ レンクロロヒドリンとシアンィ匕ナトリウムとの反応により製造される。アクリル酸を水和す る反応は平衡反応であるため、反応率が制限されるという問題があった。エチレンク ロロヒドリンの反応の場合は、毒性の強い物質の使用が必要であり、さらに加水分解 工程を追加しなくてはならない。この場合、塩ィ匕ナトリウム及びアンモニゥム塩が大量 に生じるという問題がある。
特許文献 1： W098/21339
特許文献 2 :W098Z21341
特許文献 3 :米国特許第 5, 821, 092号
特許文献 4 :米国特許第 5, 254, 467号
特許文献 5 :米国特許第 5, 633, 362号
特許文献 6 :米国特許第 5, 686, 276号
発明の開示
[0009] 本発明は、グリセロールから 1, 3—プロパンジオールを製造する際の効率性を改善 し、工業上有用なプロセスを提供することを目的とする。
[0010] 本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、グリセロールデヒド ラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードする遺伝子、グ リセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の各サブユニットをコードする遺伝子、アルデ ヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレ ダクターゼをコードする遺伝子及び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードす る遺伝子を含む形質転換体を、グリセロールと接触させることにより、 2種類の有用な 化合物を効率的に製造できることを見いだした。
[0011] 本発明者らはまた、 Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Listeria厲糸田菌、 Clostridium属糸田菌、 Escherichia腐糸田菌、 Enterobacter属糸田菌、 し aloramator禺糸田菌、 Acetobactenum属糸田菌、 Brucella腐糸田菌、 FlavobacteriumJ¾細 菌、 Fusobacterium属田菌、 Citrobacter厲糸田菌及び Propionibacterium厲糸田菌のグリ セロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をノックアウトし、該細菌とグリセロール とを接触させることによつても、 2種類の有用な化合物を効率的に製造できることを見 いだした。
[0012] すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[0013] (1)グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブュ- ットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサ ブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又は ジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及び スモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする 遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子及 び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ）を コードする遺伝子、を含む形質転換体。
[0014] (2)グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニット をコードする遺伝子が Lactobacillus reuteriに由来する、（1)記載の形質転換体。
[0015] (3)グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子が以下の (a) 又は (b)のタンパク質：
(a)配列番号 1又は 3で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 1又は 3で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼの ミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロー ルデヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子が以下の (c) 又は (d)のタンパク質：
(c)配列番号 5又は 7で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号 5又は 7で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼの ラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデ ヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が以下の (e) 又は (£)のタンパク質：
(e)配列番号 9又は 11で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(£)配列番号 9又は 11で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠 失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼの ラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発現させたときにグリセロール デヒドラターゼ活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、（2)記載の形質転換体。
[0016] (4)グリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子力 以下の (a)又は (b)の DNA:
(a)配列番号 2又は 4で表される塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 2又は 4で表される塩基配列の全部又は一部力 なる DNAに対し相補 的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつダリ セロールデヒドラターゼのミディアムサブユニット及びスモールサブユニットとともに発 現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA を含み、
グリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子力 以下の (c)又は (d)の DNA:
(c)配列番号 6又は 8で表される塩基配列力 なる DNA
(d)配列番号 6又は 8で表される塩基配列の全部又は一部力 なる DNAに対し相補 的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつダリ セロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びスモールサブユニットとともに発現さ せたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA を含み、
グリセロールデヒドラターゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子が、以下の (e)又は (Dの DNA:
(e)配列番号 10又は 12で表される塩基配列力もなる DNA
(β配列番号 10又は 12で表される塩基配列の全部又は一部力もなる DNAに対し相 補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつグ リセロールデヒドラターゼのラージサブユニット及びミディアムサブユニットとともに発 現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA を含む、（2)記載の形質転換体。
[0017] (5)プロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ）をコード する遺伝子を含み、該遺伝子が Lactobacillus reuteriに由来する、（1)一（4)のいず れかに記載の形質転換体。
[0018] (6)プロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ）をコード する遺伝子が以下の (a)又は (b)のタンパク質をコードする遺伝子である（5)記載の形 質転換体：
(a)配列番号 13又は 15で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 13又は 15で表されるアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロパノールデヒドロゲナー ゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ)活性を有するタンパク質。
[0019] (7)プロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ）をコード する遺伝子が、以下の (a)又は (b)の DNAを含む、（5)記載の形質転換体：
(a)配列番号 14又は 16で表される塩基配列力もなる DNA
(b)配列番号 14又は 16で表される塩基配列の全部又は一部からなる DNAに対し 相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ プロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダクターゼ）活性を有す るタンパク質をコードする DNA。
[0020] (8) 1 , 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝 子が Lactobacillus reuteriに由来する、（1)一（7)のいずれかに記載の形質転換体。
[0021] (9) 1 , 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子が以下の (a)又 は (b)のタンパク質をコードする遺伝子である（8)記載の形質転換体：
(a)配列番号 17で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 17で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ 1, 3-プロパンジオールォキシドレ ダクターゼ活性を有するタンパク質。
[0022] (10) 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子力 以下の (a) 又は (b)の DNAを含む、（8)記載の形質転換体：
(a)配列番号 18で表される塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 18で表される塩基配列の全部又は一部力もなる DNAに対し相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ 1, 3—プ 口パンジオールォキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[0023] (11)グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再 活性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子が Lactobacillus reuteriに由来する
、（1)一（10)のいずれかに記載の形質転換体。
[0024] (12)グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺 伝子が以下の (a)又は (b)のタンパク質：
(a)配列番号 19又は 21で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 19又は 21で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ 再活性ィ匕因子のスモールサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラ ターゼ再活性ィ匕因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子であり、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝 子が以下の (c)又は (d)のタンパク質：
(c)配列番号 23又は 25で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(d)配列番号 23又は 25で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が 欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつグリセロールデヒドラターゼ 再活性ィ匕因子のラージサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラタ ーゼ再活性化因子活性を有するタンパク質
をコードする遺伝子である、 (11)記載の形質転換体。
[0025] (13)グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコードする遺 伝子が、以下の (a)又は (b)の DNA:
(a)配列番号 20又は 22で表される塩基配列力もなる DNA
(b)配列番号 20又は 22で表される塩基配列の全部又は一部からなる DNAに対し 相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のスモールサブユニットとともに発現させた ときにグリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子活性を有するタンパク質をコードする DNA
を含み、
グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする遺伝 子が、以下の (c)又は (d)の DNA:
(c)配列番号 24又は 26で表される塩基配列力もなる DNA
(d)配列番号 24又は 26で表される塩基配列の全部又は一部からなる DNAに対し 相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットとともに発現させたと きにグリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子活性を有するタンパク質をコードする D NA
を含む、（11)記載の形質転換体。
[0026] (14) (1)一（13)のいずれかに記載の形質転換体をグリセロールの存在下で培養す ること〖こより、 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法
[0027] (15) Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Listeria属細菌、 し lostndum晨田菌、 EscherichiaJ¾糸田菌、 EnterobacterJ¾^田菌、し aloramatorJ¾糸田菌、 Acetobacterium 糸田菌、 Brucella属細菌、 FlavobactenumJ禹ホ田菌、 FusobactenumJ¾ 細菌、 Citrobacter属細菌及び Propio bacterium属細菌から選択される細菌にお!ヽて 、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細 菌。
[0028] (16) pduオペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有する細菌に ぉ 、て、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノック アウト細菌。
[0029] (17) (15)又は（16)記載の細菌とグリセロールとを接触させることにより、 1, 3—プロ パンジオール及び Z又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する方法。
[0030] (18)グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブュ ニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモール サブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又 はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及 びスモールサブユニットをコードする遺伝子、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ をコードする遺伝子、ホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子、プロピオン酸キ ナーゼをコードする遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコ ードする遺伝子及び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシ ドレダクターゼ）をコードする遺伝子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードす る遺伝子を含まない、形質転換体。
[0031] (19) pduオペロンを有し、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まな い、（18)記載の形質転換体。
[0032] (20)プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が以下の (a)又は (b) のタンパク質をコードする遺伝子である（18)又は（19)記載の形質転換体：
(a)配列番号 41で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 41で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオンアルデヒドデヒドロゲナ ーゼ活性を有するタンパク質。
[0033] (21)プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子力 以下の (a)又は (b) の DNAを含む、（18)又は（19)記載の形質転換体：
(a)配列番号 42で表される塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 42で表される塩基配列の全部又は一部力 なる DNAに対し相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつプロピオ ンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[0034] (22)プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子が以下の (a)又は (b)のタンパク質をコ ードする遺伝子である（18)又は（19)記載の形質転換体：
(a)配列番号 43で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質
(b)配列番号 43で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつプロピオン酸キナーゼ活性を有す るタンノ ク質。
[0035] (23)プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子が、以下の (a)又は (b)の DNAを含む 、（18)又は（19)記載の形質転換体：
(a)配列番号 44で表される塩基配列力 なる DNA
(b)配列番号 44で表される塩基配列の全部又は一部力 なる DNAに対し相補的な 塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつプロピオ ン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする DNA。
[0036] (24) (18)一 (23)のいずれかに記載の形質転換体とグリセロールとを接触させること により、 1, 3—プロパンジオール及び/又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する方 法。
[0037] 本発明により、グリセロールから 1, 3—プロパンジオールを製造する際の原料グリセ ロールのロスを低減し、かつ 1, 3—プロパンジオールと合わせて 3—ヒドロキシプロピオ ン酸を製造することができる。また、製造に用いる細菌を効率的に培養できるため、よ り効率的に 1 , 3—プロパンジオールと合わせて 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造する ことができる。
図面の簡単な説明
[0038] [図 l]pduオペロンの構造を示す。
[図 2]グリセロールから 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸が生成 される機構の一態様を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0039] 以下に本発明を詳細に説明する。
[0040] 第 1実施形態において本発明は、グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオール デヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコ ードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラ ターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブ ユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒ ドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダ クターゼをコードする遺伝子及び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする 遺伝子を含む形質転換体に関する。
[0041] 第 1実施形態の形質転換体は、グリセロールを脱水して、 3—ヒドロキシプロピオンァ ルデヒド及び水へ変換する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、グリセロールデヒドラターゼ及びジォ ールデヒドラターゼが挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ及びジオールデヒドラタ ーゼは、ラージサブユニット、ミディアムサブユニット及びスモールサブユニットの 3種 のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラター ゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラタ ーゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ならびにグリセ口 ールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒ ドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも 包含する。
[0042] グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードす る遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、 Lactobacillus属、 Citrobacter属、 し lostndum晨、 KleDsiella禺、 EnterobacterJ¾、 CaloramatorJ¾、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する細菌に由来するものを使用することができる。本発明にお！/、て は、 Lactobacillus属細菌に由来するグリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオール デヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来のグリセ口 ールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの遺伝子、さ らに Lactobacillus reuteri JCM1112株及び Lactobacillus reuteri ATCC 53608株由来 のグリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットの 遺伝子が好ましい。
[0043] Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットのアミ ノ酸配列を配列番号 1及び 3に、ミディアムサブユニットのアミノ酸配列を配列番号 5 及び 7に、スモールサブユニットのアミノ酸配列を配列番号 9及び 11に例示する。 Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 2及び 4に、ミディアムサブユニットをコードする遺 伝子の塩基配列を配列番号 6及び 8に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の 塩基配列を配列番号 10及び 12に、例示する。
[0044] 各アミノ酸配列を含むタンパク質は、その他 2種のサブユニットとともに発現させたと きにグリセロールデヒドラターゼ活性を有する限り、各アミノ酸配列にお 、て 1若しくは 数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
[0045] また、各配列番号で表される塩基配列力 なる DNAの全部又は一部の塩基配列 力もなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、か つ、その他 2種のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。
[0046] 各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクタ 一に導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行 つてもよい。また。 3種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用 いるのが好ましい。
[0047] 第 1実施形態の形質転換体は、プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子 若しくは 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼコードする遺伝子の!/、ずれか、 又はその双方を含む。
[0048] 本発明にお!/、て、プロパノールデヒドロゲナーゼ（プロパンジオールォキシドレダク ターゼと称する場合もある）とは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、 すなわち 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、プロパンジオールに変換する 反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質を意味する。
[0049] プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例え 【 、 Lactobacillus属、し itrobacter属、 Clostridium腐、 KlebsiellaJ¾、 Enterobacter晨、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する細菌に由来するものを使用 することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来するプロパノール デヒドロゲナーゼ遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来のプロパノールデヒドロゲナ 一で ¾fe子、 らに Lactobacillus reuteri JCM1112株及ぴ Lactobacillus reuteri ATCC 53608株由来のプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子が好まし!/、。
[0050] 配列番号 13及び 15に Lactobacillus reuteri由来のプロパノールデヒドロゲナーゼの アミノ酸配列を、配列番号 14及び 16に Lactobacillus reuteri由来のプロパノールデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質 がプロパノールデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号 13又は 15で表される アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じ ていてもよい。
[0051] また、配列番号 14又は 16で表される塩基配列力もなる DNAの全部又は一部の塩 基配列からなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィ ズし、かつ、プロノ V—ルデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝 子を用いる場合も本発明に含まれる。
[0052] 本発明において、 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼとは、当技術分野 にお 、て通常用いられる意味を有し、すなわち 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒドを 還元し、 1, 3—プロパンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を 有するタンパク質を意味する。
[0053] 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子は、公知のものを 使用でき、例えば、 Lactobacillus属、 Citrobacter属、 Clostridium属、 Klebsiella属、 Enterobacter属、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する糸田菌に由 来するものを使用することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来 する 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ遺伝子、特に Lactobacillus reuteri 由来の 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ遺伝子、さらに Lactobacillus reuteri JCM1112株及び Lactobacillus reuteri ATCC 53608株由来の 1 , 3—プロパン ジオールォキシドレダクターゼ遺伝子が好ましい。
[0054] 配列番号 17に Lactobacillus reuteri由来の 1, 3—プロパンジオールォキシドレダク ターゼのアミノ酸配列を、配列番号 18に Lactobacillus reuteri由来の 1, 3—プロパン ジオールォキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列 を含むタンパク質が 1 , 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ活性を有する限り、 配列番号 17で表されるアミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換 、付加等の変異が生じていてもよい。
[0055] また、配列番号 18で表される塩基配列力もなる DNAの全部又は一部の塩基配列 力もなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、か つ、 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードす る遺伝子を用いる場合も本発明に含まれる。 [0056] 第 1実施形態の形質転換体は、グリセロールの 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒド及 び水への変換反応を触媒することにより失活したグリセロールデヒドラターゼ又はジ オールデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素 B 12を入れ替えて、再度活性 を取り戻させる役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパ ク質としては、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及びジオールデヒドラターゼ 再活性ィ匕因子が挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及びジォー ルデヒドラターゼ再活性化因子は、ラージサブユニット及びスモールサブユニットの 2 種のサブユニットから構成される。本発明の形質転換体には、グリセロールデヒドラタ ーゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジ オールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝 子を含むもの、ならびにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の 2種のサブュニッ トをそれぞれコードする遺伝子とジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブ ユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもののいずれをも包含する。
[0057] 同様の作用を有するものであれば、特に制限なく使用できる。グリセロールデヒドラ ターゼ再活性化因子としては、 W098/21341 ; Daniel et al., J. BacterioL, 177, 2151(1995);Toraya and Mori, J. Biol. Chem., 274, 3372(1999);及び Tobimatsu et al" J. BacterioL 181, 4110(1999)に記載のものなどが挙げられる。
[0058] グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因 子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、一般に嫌気条件下でグリセロール を資化することのできる細菌群が有する gdhレギュロン、 pduオペロンと呼ばれる遺伝 子郡内に存在するものが含まれ、例えば、 gdrA、 gdrB、 pduG、 pduH、 ddrA、 ddr B、 dhaF、 dhaG、 orfZ、及び orfYなどが挙げられる。
[0059] グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因 子の各サブユニットをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、例えば、 Lactobacillus為、 CitroDacter属、し lostridiumj禹、 Klebsiella属、 EnterobacterJ¾、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する細菌に由来するものを使用 することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来するグリセロール デヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の各 サブユニットの遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ 再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の各サブユニットの 遺伝子、さらに Lactobacillus reuteri JCM1112株及び Lactobacillus reuteri ATCC
53608株由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び Z又はジオールデヒド ラターゼ再活性ィ匕因子の各サブユニットの遺伝子が好ましい。
[0060] 好ましくは、グリセロールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする 遺伝子を含む形質転換体は、少なくともグリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含み、ジオールデヒドラターゼの 3 種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともジォ ールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子 を含む。
[0061] Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブ ユニットのアミノ酸配列を配列番号 19及び 21に、スモールサブユニットのアミノ酸配 列を配列番号 23及び 25に例示する。 Lactobacillus reuteri由来のグリセロールデヒド ラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 20及び 22 に、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 24及び 26に、 例示する。
[0062] 各アミノ酸配列を含むタンパク質は、もう一方のサブユニットとともに発現させたとき にグリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子活性を有する限り、各アミノ酸配列にお いて 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
[0063] また、各配列番号で表される塩基配列力 なる DNAの全部又は一部の塩基配列 力もなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、か つ、もう一方のサブユニットとともに発現させたときにグリセロールデヒドラターゼ再活 性化因子活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合も本発明に含ま れる。
[0064] 各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクタ 一に導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行 つてもよい。また。 3種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用 いるのが好ましい。
[0065] 本明細書において、各配列番号で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個 のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じたアミノ酸配列とは、各配列番号で表 されるアミノ酸配列の 1個、又は好ましくは 10— 20個、より好ましくは 5— 10個、さらに 好ましくは 2— 3個のアミノ酸が欠失してもよぐ又は各配列番号で表されるアミノ酸配 列に 1個、又は好ましくは、 10— 20個、より好ましくは 5— 10個、さらに好ましくは 2— 3個のアミノ酸が付加してもよぐ又は、各配列番号で表されるアミノ酸配列の 1個、又 は好ましくは、 10— 20個、より好ましくは 5— 10個、さらに好ましくは 2— 3個のアミノ 酸が他のアミノ酸に置換してもよ!/、ことを意味する。
[0066] 本明細書にぉ 、て、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い 相同性 (相同性が 90%以上、好ましくは 95%以上）を有する DNAカ 、イブリダィズ する条件をいう。より具体的には、このような条件は、 0. 5— 1Mの NaCl存在下 42— 68°Cで、又は 50%ホルムアミド存在下 42°Cで、又は水溶液中 65— 68°Cで、ハイブ リダィゼーシヨンを行った後、 0. 1— 2倍濃度の SSC (saline sodium citrate)溶液を用 いて室温一 68°Cでフィルターを洗浄することにより達成できる。
[0067] ここで、「一部の配列」とは、各遺伝子の塩基配列の一部分を含む DNAの塩基配 列であって、ストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズさせるのに十分な塩基配列の 長さを有するもの、例えば、少なくとも 50塩基、好ましくは少なくとも 100塩基、より好 ましくは少なくとも 200塩基の配列である。
[0068] なお、遺伝子に変異を導入するには、 Kunkel法、 Gapped duplex法等の公知の手 法又はこれに準ずる方法により、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異 導入用キット（例えば Mutan- K (TAKARA社製）、 Mutan- G (TAKARA社製） )などを用 いて、又は、 TAKARA社の LA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキットを用いて行うこ とができる。なお、上記手法により塩基配列が決定された後は、化学合成によって、 又は染色体 DNAを铸型とした PCR法によって、又は該塩基配列を有する DNA断 片をプローブとしてハイブリダィズさせることにより、本発明の遺伝子を得ることができ る。 [0069] 本発明においてアルデヒドデヒドロゲナーゼとは、当技術分野において通常用いら れる意味を有し、すなわちアルデヒドを酸化してカルボン酸又はァシル基を生成する 酵素活性を有するタンパク質を意味する。
[0070] アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子としては、公知のものを使用でき、 ί列 ば、 Alcaiigenes属、 Aspergillus晨、 Bacillus属、 Candida腐、し nromobacterium為、 し lostndium属、し orynebactenum属、 dschenchiaj¾、 Lactooacillus晨、 Lactococcus属 、 OceanobacillusJ¾、 PichiaJ¾、 Pseudomonas晨、 Rhizobium属、 Rhodobacter属、 Rhodococcus属、 Saccharomyces属、 Salmonella属、 Sulfolobus晨、 Thermotoga属等に 属する細菌に由来するものを使用することができる。
[0071] 形質転換体は、上記 4種の遺伝子又はその一部を適当なベクターに連結し、得ら れた組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ り得ることができる。「一部」とは、宿主中に導入された場合に各遺伝子がコードするタ ンパク質を発現することができる各遺伝子の一部分を指す。
[0072] ノ クテリアゲノム力 所望の遺伝子を得る方法は、分子生物学の分野において周 知である。例えば遺伝子の配列が既知の場合、制限エンドヌクレアーゼ消化により適 したゲノムライブラリを作り、所望の遺伝子配列に相補的なプローブを用いてスクリー ニングすることができる。配列が単離されたら、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) (米国特 許第 4, 683, 202号)のような標準的増幅法を用いて DNAを増幅し、形質転換に適 した量の DNAを得ることができる。
[0073] グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットを コードする遺伝子、 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ遺伝子、プロパノー ルデヒドロゲナーゼ遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジ オールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の各サブユニットをコードする遺伝子及びアルデ ヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、別々にベクターに導入して複数のベクターで形質転 換を実施してもよいし、複数種の遺伝子を 1つのベクターに導入して形質転換を行つ てもよい。
[0074] 遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限 定されず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA、コスミド DNA等が挙げられる。プ ラスミド DNAとしては、例えば pBR322、 pSC101、 pUC18、 pUC19、 pUC118、 p UC119、 pACYC117、 pBluescript II SK ( + )、 pETDuet— 1、 pACYCDuet— 1等が挙げられ、ファージ DNAとしては、例えばえ gtlO、 Charon 4A、 EMBL—、 M13mpl8、 M13mpl9等力挙げられる。
[0075] 宿主としては、 目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例え は、 Ralstonia eutrophaなどの Ralstonia厲に J禹する糸田菌、 Pseudomonas putidaなどの Pseudomonas属に属する細菌、 Bacillus subtilisなどの Bacillus属に属する細菌、大腸 菌などの Escherichia腐【こ禺す 糸田菌、 baccharomyces cerevisiaeなどの
Saccharomyces属に属する酵母、 Candida maltosaなどの Candida属に属する酵母、 C OS細胞、 CHO細胞、マウス L細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞などの動物細胞、 SF9 細胞などの昆虫細胞などが挙げられる。
[0076] 宿主細胞にお!、ては、グリセロールデヒドロゲナーゼを発現しな 、宿主細胞、すな わちグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有しない細胞及びグリセロールデヒドロゲ ナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞を使用するのが好ましい。これらを用いることに より、グリセロールが酸ィ匕されてジヒドロキシアセトンに変換される経路を遮断すること ができ、より高い収率で 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を製 造することができる。
[0077] グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞とは、グリセロールデヒド ロゲナーゼ遺伝子が破壊されて発現できな 、ような状況にある細胞を意味する。具 体的には、該細胞は、細胞中のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を標的遺伝子と して、標的遺伝子の任意の位置で相同組換えを起こすベクター（ターゲティングべク ター）を用いて当該遺伝子を破壊する方法 (ジーンターゲティング法)や、標的遺伝 子の任意の位置にトラップベクター（プロモーターを持たな!、レポーター遺伝子）を揷 入して当該遺伝子を破壊しその機能を失わせる方法 (遺伝子トラップ法)、それらを 組み合わせた方法等の通常当技術分野でノックアウト細胞、トランスジエニック動物（ ノックアウト動物含む)等を作製する際に用いられる方法を用 、て該細胞中のグリセ口 一ルデヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊することによって作製される。相同置換を起こす 位置又はトラップベクターを挿入する位置は、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の 発現の消失をもたらす変異を生じる位置であれば特に限定されないが、好ましくは転 写調節領域、より好ましくは第 2ェクソンを置換する。またグリセロールデヒドロゲナー ゼ遺伝子をノックアウトする他の方法としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子 のアンチセンス cDNAを発現するベクターを導入する方法や、グリセロールデヒドロ ゲナーゼ遺伝子の 2重鎖 RNAを発現するベクターを細胞に導入する方法が挙げら れる。当該ベクターとしては、ウィルスベクターやプラスミドベクター等が包含され、通 常の遺伝子工学的手法に基づき、例えば Molecular cloning 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等の基本書に従い作製することができる。又、巿販さ れているベクターを任意の制限酵素で切断し所望の遺伝子等を組み込んで半合成 することちでさる。
[0078] グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子がノックアウトされているか否かは、該ベクター が導入された細胞にっ 、てサザンプロットを行 、正しく相同組換えが起こって 、るこ とを確認することによって、ターゲテイングベクターに宿主細胞が有しな 、薬剤耐性 遺伝子を入れておき薬剤耐性の形質が組み込まれたものを選抜することによって、 破壊導入後、選抜した株のゲノム、菌体、菌体培養液等をテンプレートにして、破壊 するグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の F側と R側のプライマーを用いて PCRを かけ、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子と破壊導入部位の配列を合わせた大きさ の DNA断片の増幅を確認することによって、もしくはそれをクローユングして配列解 析することによって、又はジヒドロキシアセトンが生成しないことを確認することによつ てち知ることがでさる。
[0079] 大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、組換えベクターが該宿主中で自立複 製可能であると同時に、プロモーター、 目的とする DNA、転写終結配列を含む構成 であることが好ましい。発現ベクターとしては、広範囲の宿主において複製'保持され る RK2複製起点を有する pLA2917 (ATCC 37355)や RSF1010複製起点を有する pJRD215 (ATCC 37533)等が挙げられる。
[0080] プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例 えば、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 PLプロモーター、 PRプロモーター、 T7プ 口モーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌 への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばカルシウムィ オンを用いる方法（Current Protocols in Molecular Biology, 1, 181 (1994) )やエレクト 口ポレーシヨン法等が挙げられる。
[0081] 酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば YEpl3、 YCp50等 が挙げられる。プロモーターとしては、例えば gal 1プロモーター、 gal 10プロモータ 一、ヒートショックタンパク質プロモーター、 GAPプロモーター等が挙げられる。酵母 への糸且換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えばエレクトロボ レーシヨン法、スフエロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 192, 9-1933 (1978 ) )、酢酸リチウム法 (J. BacterioL, 153, 163- 168 (1983) )等が挙げられる。
[0082] 動物細胞を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして例えば pcDNAI、 pcDN AlZAmp (インビトロジェン社)等が用いられる。プロモーターとしては、例えば、 SR αプロモーター、 SV40プロモーター、 CMVプロモーター等が挙げられる。動物細 胞への組換えベクターの導入方法としては、特に限定されないが、例えば、エレクト口 ポレーシヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法等が挙げられる。
[0083] 遺伝子の単離及び形質転換体の作成については、 Sambrook, J. et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている。
[0084] 第 2実施形態において本発明は、 Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、
Klebsiella 糸田菌、 Listeria属細菌、 Clostridium厲糸田菌、 Escherichia属糸田菌、
EnterobacterJ¾糸田菌、 Caloramator厲糸田菌、 Acetobacterium鳥田菌、 BrucellaJ¾糸田菌 、 Flavobacterium属糸田菌、 Fusobacterium属糸田菌、 Citrobacter厲糸田菌及ひ
Propionibacterium属細菌から選択される細菌にお!、て、グリセロールデヒドロゲナー ゼをコードする遺伝子がノックアウトされた細菌に関する。本発明において、
Lactobacillus J¾糸田菌、 Salmonella腐糸田菌、 Klebsiella属糸田菌、 Listeria属細菌、 し lostndum晨田菌、 EscherichiaJ¾糸田菌、 EnterobacterJ¾^田菌、し aloramatorJ¾糸田菌、 Acetobacterium 糸田菌、 Brucella属細菌、 FlavobactenumJ禹ホ田菌、 FusobactenumJ¾ 細菌、 Citrobacter属細菌及び Propion¾acterium属細菌は、グリセロールデヒドラター ゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミデ ィアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子 、グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活 性化因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコー ドする遺伝子、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホトラ ンスアシラーゼをコードする遺伝子、プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子、なら びに 1， 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び Z又はプ ロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を有するものであれば特に制限され ない。
[0085] 第 2実施形態においては、さらに、補酵素 B12合成系を有する細菌が好ましぐそ のような細菌としては、 Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Brucella腐細菌、 Fusobacterium属細菌及び Propionibacterium属細菌; 0举げられる。
[0086] LactoDacilius属糸田菌としては、 Lactobacillus reuteri、 Lactooacilius ore vis
Lactobacillus colli匪 des、 Lactobacillus hilgardii、 Lactobacillus diolivorans、
Lactobacillus buchneri、 Lactobacillus fermentum、 Lactobacillus gasseri、
Lactobacillus helveticus、 Lactobacillus plantarum、 Lactobacillus johnsonii、
Lactobacillus yamanashiensis等力挙げられ 。
[0087] Salmonella属糸田菌としては、 Salmonella enterica、 Salmonella enteritidis、 Salmonella typhi, Salmonella typhimuriumが挙げられ、 Klebsiella属細菌としては、 Klebsiella aerogenes、 Klebsiella oxytoca、 Klebsiella pneumoniae^ Klebsiella atlantae、 Klebsiella edwardsu、 Klebsiella mobilis、 Klebsiella ozaenae、 Klebsiella planticola、 Klebsiella rhinoscleromatis、 Klebsiella rubiacearum、 Klebsiella terrigena げられ、 Listeria属 細菌としては、 Listeria denitrificans、 Listeria grayi、 Listeria innocua、 Listeria ivanovu、 Listeria monocytogenes^ Listeria murrayi、 Listeria seeligeri、 Listeria welshimeri力 S挙げられ、 Clostridium農細菌としては、 Clostridium acetobutylicum、 し lostnaium butyncum、 Clostridium pasteunanum、 Clostridium paraperfringens、 Clostridium perfringens、 Clostridium glycolicum、 Clostridium difficile力 ^挙げられ、 Escherichia属糸田菌としては、 Escherichia blattae、 Escherichia hermannu、 Escherichia vulneris、 Escherichia freundii力挙げられ、 Enterobacter属糸田菌としては、 Enterobacter aerogenes、 Enterobacter agglomerans力 S挙げられ、 Caloramator属糸田菌 としては、 Caloramator coolhaasii、 Caloramator fervidus、 Caloramator indicus、 Caloramator proteoclasticus、 Caloramator uzoniensis、 Caloramator viterbiensis力举 げられ、 Acetobacterium属細菌としては、 Acetobacterium sp.が挙げられ、 Brucella属 細菌としては、 Brucella melitensisが挙げられ、 Flavobacterium属細菌としては、 Fiavobacterium sp.力罕けられ、 Fusobactenum属田菌とし飞は、 Fusobactenum nucleatumが挙げられ、 Citrobacter属細菌としては、 Citrobacter freundiiが挙げられる
[0088] Propionibacterium厲 として【ま、 Propionibacterium acidipropionici、
Propionibacterium acnes ^ Propionibacterium australiense、 Propionioactenum avidum 、 Propionibacterium cyclohexanicum、 Propionibacterium granulosum、
Propionibacterium jensenii、 Propionibacterium microaephilum、 Propionibacterium propionicum、 Propionibacterium thoenu、 Propionibacterium freudenreichii力 S挙けり れる。
[0089] 第 2実施形態においては、好ましくは Lactobacillus属細菌、より好ましくは
Lactobacillus reuteri、特に好ましくは Lactobacillus reuteri JCM1112株、好ましくは KlebsiellaJ¾ l菌、より好 3;しく ί¾に Klebsiella pneumoniae^ Klebsiella oxytoca、特に 好ましくは Klebsiella pneumoniae ATCC 25955株、 Klebsiella oxytoca ATCC 8724株 を用いる。
[0090] 第 2実施形態の細菌は、上記細菌においてグリセロールデヒドロゲナーゼをコード する遺伝子がノックアウトされたものであり、該遺伝子をノックアウトすること〖こより、ダリ セロールが酸ィ匕されてジヒドロキシアセトンに変換される経路を遮断することができ、 より高い収率で 1, 3—プロパンジオール及び Z又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造 することができる。
[0091] グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたとは、グリセ口 一ルデヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊されて発現できないような状況にあることを意味 する。該ノックアウト細菌については、ノックアウト細胞について第 1実施形態におい て述べたとおりである。 [0092] 第 2実施形態において Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Listeria厲糸田菌、 Clostridium属糸田菌、 Escherichia腐糸田菌、 Enterobacter属糸田菌、 し aloramator禺糸田菌、 Acetobactenum属糸田菌、 Brucella腐糸田菌、 FlavobacteriumJ¾細 菌、 Fusobacterium属田菌、 Citrobacter厲糸田菌及び Propionibacterium厲糸田菌 ίま、 pd uオペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有し、かつグリセロール デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされているものが好ましい。
[0093] また、 Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Listeria属細菌、 し lostndum晨田菌、 EscherichiaJ¾糸田菌、 EnterobacterJ¾^田菌、し aloramatorJ¾糸田菌、 Acetobactenum 糸田菌、 Brucella属細菌、 FlavobactenumJ禹ホ田菌、 FusobactenumJ¾ 細菌、 Citrobacter属細菌及び Propion¾acterium属細菌以外の細菌であっても、 pdu オペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有する細菌において、グ リセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた細菌もまた包含さ れる。
[0094] pduオペロンとは、多面小胞体タンパク質をコードする遺伝子を含み、該多面小胞 体の中でグリセリンを含む 1 , 2—ジオール類カゝら誘導されるアルデヒドを一定時間滞 留させるとともに、小胞体内、小胞体膜、およびその近傍において、アルデヒドからの 酸やアルコールへの反応を触媒し、アルデヒドによる菌体への直接の悪影響を減じ る機能を有するものと考えられる。
[0095] 従って、 pduオペロンを有する微生物は、菌体中に多面小胞体を形成し、ジオール 類を一旦小胞体内に取り込み、脱水により得られるアルデヒドをある程度保持して菌 体の生育に悪影響が及ばないようにするものと考えられる。したがって、アルデヒドの 酸化又は還元の反応は、多面小胞体内、小胞体膜あるいはその近傍で起こっている と考えられる。従って、本発明の細菌は、 pduオペロンのうちの直接反応に関与する オペロンだけでなぐ多面小胞体形成タンパク等をコードする orf、さらには pduオペ ロンに含まれるその他の orfを含むことが好まし 、。
[0096] pduオペロンの構造を図 1に示し、 pduオペロンの塩基配列を配列番号 53に示す。
また、以下に、各 orfとその機能及び Lactobacillus reuteri JCM1112株由来の塩基配 列を示す。なお、 orfl— 4は pduオペロンとは無関係であると考えられる。また、 pdu Obisについても本発明に係る反応には無関係であると考えられる。
[0097] pduF グリセロール摂取促進因子（配列番号 54)
orfl エタノールァミン利用系の EutJ (配列番号 55)
pocR 転写制御因子 (配列番号 56)
pduAB 多面小体構成タンパク質 (配列番号 57及び 58)
pduCDE ジオールデヒドラターゼ（配列番号 2、 6、 10)
pduGH ジオールデヒドラターゼ再活性化因子（配列番号 20及び 24) pduJK 多面小体構成タンパク質 (配列番号 60及び 59)
pduLM 不明（配列番号 61及び 62)
pduN 多面小体構成タンパク質 (配列番号 63)
pduOObis アデノシルトランスフェラーゼ（配列番号 64及び 65)
pduP プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ（配列番号 42)
pduQ プロパノールデヒドロゲナーゼ（配列番号 14)
pduW プロピオン酸キナーゼ（配列番号 44)
pduU 多面小体構成タンパク質 (配列番号 66)
orf2 チロシンホスファターゼ（配列番号 67)
orf3 ホスホグリセレートムターゼ（配列番号 68)
orf4 カドミウム耐性 (輸送タンパク質）（配列番号 69)
pduV 不明（配列番号 70)
そして、本発明者らは、 pduオペロン有する Lactobacillus属細菌において、グリセ口 一ルデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をノックアウトすることにより、図 2に示す機 構に基づき、グリセロールから 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸 が生成されることを見 、だした。
[0098] 図 2の作用機構にぉ 、て、酵素の活性を考慮すると、ジオールデヒドラターゼ及び ジオールデヒドラターゼ再活性化因子は、グリセロールデヒドラターゼ及びグリセロー ルデヒドラターゼ再活性ィヒ因子に置換可能であり、プロパノールデヒドロゲナーゼは、
1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼに置換可能であり、同様の反応が生じ る。 [0099] 上記知見に基づき、第 3実施形態において本発明は、グリセロールデヒドラターゼ 及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子、ミディ アムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコードする遺伝子、 グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活性 ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブユニットをコード する遺伝子、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホトラン スアシラーゼをコードする遺伝子、プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子、並び に 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び Z又はプロ パノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼ をコードする遺伝子を含まない形質転換体に関する。本発明者らは、上記第 3実施 形態の形質転換体をグリセロールの存在下で培養することによつても、 1, 3—プロパ ンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造できることを見いだした。
[0100] 第 3実施形態の形質転換体は、グリセロールを脱水して、 3—ヒドロキシプロピオンァ ルデヒド及び水へ変換する反応を触媒する酵素活性を有するタンパク質をコードする 遺伝子を含む。そのようなタンパク質としては、上記のとおり、グリセロールデヒドラタ ーゼ及びジオールデヒドラターゼが挙げられる。第 2実施形態の形質転換体には、グ リセロールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むも の、ジオールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む もの、ならびにグリセロールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする 遺伝子とジオールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を
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、ずれをも包含する。
[0101] グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットをコードす る遺伝子、およびそのアミノ酸配列については、第 1実施形態について記載したのと 同様である。
[0102] 各サブユニットをコードする遺伝子は、同一の宿主で発現させる限り、同一のベクタ 一に導入して形質転換を行ってもよいし、別々のベクターに導入して形質転換を行 つてもよい。また。 3種のサブユニットは、同一の種又は同一の株に由来するものを用 いるのが好ましい。 [0103] 第 3実施形態の形質転換体は、 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒドを還元し、プロパ ンジオールに変換する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質をコ ードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質をコードする遺伝子としては、 1, 3—プ 口パンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子及びプロパノールデヒドロゲ ナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
[0104] プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子および 1, 3—プロパンジオールォ キシドレダクターゼをコードする遺伝子、ならびにそのアミノ酸配列については、第 1 実施形態にっ 、て記載したのと同様である。
[0105] 第 3実施形態の形質転換体は、グリセロールの 3—ヒドロキシプロピオンアルデヒド及 び水への変換反応を触媒することにより失活したグリセロールデヒドラターゼ又はジ オールデヒドラターゼにおける反応中心部分の補酵素 B 12を入れ替えて、再度活性 を取り戻させる役割を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパ ク質としては、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及びジオールデヒドラターゼ 再活性ィ匕因子が挙げられる。グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及びジォー ルデヒドラターゼ再活性ィ匕因子につ 1、ては、第 1実施形態にお 、て記載したのと同 様である。第 2実施形態の形質転換体には、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因 子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、ジオールデヒドラタ ーゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含むもの、な らびにグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子の 2種のサブユニットをそれぞれコー ドする遺伝子とジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞ れコードする遺伝子を含むものの 、ずれをも包含する。
[0106] グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子又はジオールデヒドラターゼ再活性ィ匕因 子の各サブユニットをコードする遺伝子およびそのアミノ酸配列については、第 1実 施形態につ 、て記載したのと同様である。
[0107] 好ましくは、グリセロールデヒドラターゼの 3種のサブユニットをそれぞれコードする 遺伝子を含む形質転換体は、少なくともグリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含み、ジオールデヒドラターゼの 3 種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を含む形質転換体は、少なくともジォ ールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子の 2種のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子 を含む。
[0108] 第 3実施形態の形質転換体は、プロピオンアルデヒドに CoAを追加し、プロピオ- ル -CoAを生成する反応を触媒することができる酵素活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子を含む。そのようなタンパク質をコードする遺伝子としては、プロピオン アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。プロピオンアルデヒド デヒドロゲナーゼは、アルデヒドデヒドロゲナーゼに包含される。
[0109] プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用で さ、 f列 、 Lactobacillus属、し itrobacter属、 Clostridium腐、 KlebsiellaJ¾、
Enterobacter属、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する糸田菌に由 来するものを使用することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来 するプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来の プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、さらに Lactobacillus reuteri JCM1112 株由来のプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が好まし 、。
[0110] 配列番号 41に Lactobacillus reuteri由来のプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼの アミノ酸配列を、配列番号 42に Lactobacillus reuteri由来のプロピオンアルデヒドデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質 がプロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する限り、配列番号 41で表される アミノ酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じ ていてもよい。
[0111] また、配列番号 42で表される塩基配列力 なる DNAの全部又は一部の塩基配列 力もなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、か つ、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝 子を用いる場合も本発明に含まれる。
[0112] 第 3実施形態の形質転換体は、プロピオニル CoAから CoAをはずし、リン酸を付加 してプロピオ二ルリン酸を生成する反応を触媒することができる酵素活性を有するタ ンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質をコードする遺伝子として は、ホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。 [0113] ホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、 Lactobacillus為、 CitroDacter属、し lostridiumj禹、 Klebsiella属、 EnterobacterJ¾、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する細菌に由来するものを使用 することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来するホスホトランス アシラーゼ遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来のホスホトランスアシラーゼ遺伝子 、さらに Lactobacillus reuteri JCM1112株由来のホスホトランスアシラーゼ遺伝子が好 ましい。
[0114] 第 3実施形態の形質転換体は、プロピオニルリン酸力 リン酸をはずし、 ADPに付 加して ATPを生成すると同時にプロピオン酸を生成する反応を触媒することができる 酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む。そのようなタンパク質をコー ドする遺伝子としては、プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
[0115] このような酵素活性を有する遺伝子を含むことにより、 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸が生成する反応と同時に ATPが生成され、形質転換体が 効率的に増殖し、培養を効率的に実施することができる。
[0116] プロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子は、公知のものを使用でき、例えば、 Lactobacillus為、 CitroDacter属、し lostridiumj禹、 Klebsiella属、 EnterobacterJ¾、 Caloramator属、 Salmonella属、及び Listeria属等に属する細菌に由来するものを使用 することができる。本発明においては、 Lactobacillus属細菌に由来するプロピオン酸 キナーゼ遺伝子、特に Lactobacillus reuteri由来のプロピオン酸キナーゼ遺伝子、さ らに Lactobacillus reuteri JCM1112株由来のプロピオン酸キナーゼ遺伝子が好まし い。
[0117] 配列番号 43に Lactobacillus reuteri由来のプロピオン酸キナーゼのアミノ酸配列を 、配列番号 44に Lactobacillus reuteri由来のプロピオン酸キナーゼ遺伝子の塩基配 列を例示する。これらのアミノ酸配列を含むタンパク質がプロピオン酸キナーゼ活性 を有する限り、配列番号 43で表されるアミノ酸配列にお 、て 1若しくは数個のアミノ酸 に欠失、置換、付加等の変異が生じていてもよい。
[0118] また、配列番号 44で表される塩基配列力 なる DNAの全部又は一部の塩基配列 力もなる DNAに対し相補的な配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、か つ、プロピオン酸キナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いる場合 も本発明に含まれる。
[0119] 第 3実施形態の形質転換体は、上記 4種の遺伝子又はその一部を適当なベクター に連結し、得られた組換えベクターを本発明の遺伝子が発現し得るように宿主中に 導人すること〖こより得ることができる。
[0120] グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブュ-ッ トをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブ ユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジ オールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びス モールサブユニットをコードする遺伝子、プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコ ードする遺伝子、ホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子、プロピオン酸キナー ゼをコードする遺伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコード する遺伝子及び Z又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、別々に ベクターに導入して複数のベクターで形質転換を実施してもよ 、し、複数種の遺伝 子を 1つのベクターに導入して形質転換を行ってもよい。
[0121] 遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主細胞で複製可能なものであれば特に限 定されず、例えばプラスミド DNA、ファージ DNA、コスミド DNA等が挙げられる。プ ラスミド DNAとしては、例えば pBR322、 pSC101、 pUC18、 pUC19、 pUC118、 p UC119、 pACYC117、 pBluescript II SK ( + )、 pETDuet— 1、 pACYCDuet— 1等が挙げられ、ファージ DNAとしては、例えばえ gtlO、 Charon 4A、 M13mpl8 、 M13mpl9等が挙げられる。
[0122] 宿主としては、 目的とする遺伝子を発現できるものであれば特に限定されず、例え 【 、 Ralstonia腐糸田菌、 Pseudomonas属糸田菌、 Bacillus J¾糸田菌、 Escherichia鳥田菌、 Propionibacterium禺糸田菌、 Lactobacillus属糸田菌、 Salmonella属糸田菌、 Klebsiella厲糸田 菌、 AcetobacteriumJ禹ホ田菌、 Flavobactenum属糸田菌、 CitrobacterJ¾糸田菌、
Agrobacterium属糸田菌、 Anabaena属糸田菌、 Bradyrhizobium属細菌、 Brucella鳥細菌、 し nlorobium厲田菌、 Clostridium腐糸田菌、し orynebactenum属糸田菌、 Fusobacterium属 糸田菌、 Geobacter 糸田菌、 Gloeobacter厲糸田菌、 Leptospira属糸田菌、 Mycobacterium厲 細菌、 Mycobacterium属細菌、 Photorhabdus属細菌、 Porphyromonas属細菌、 Prochlorococcus農細菌、 Rhodobacter腐細菌、 Rhodopseudomonas属田菌、 Sinorhizobium属細菌、 Streptomyces満田菌、 Synechococcus,禺細菌、
Thermosynechococcus属細菌、 Treponema満田菌、 ArchaeogloDus鳥ヌ台原菌、 Halobacterium属始原菌、 Mesorhizobium腐始原菌、 Methanobacterium厲始原！ ¾、 Methanococcusj¾ 原菌、 Methanopyrusj¾ 原菌、 Methanosarcina属始原菌、 Methanosarcina属始原歯、 Pyrobaculum属始原菌、 Sulfolobus属始甲ヽ菌、
Thermoplasma属 Θ原! ¾、具体的【こ ίま、 Acetobacterium sp.ゝ Citrobacter freundu、 Flavobacterium sp.ゝ Ralstonia solanacearum、 Ralstonia eutropna、 Pseudomonas putida、 Pseudomonas aeruginosa^ Pseudomonas denitrificans、 Bacillus subtilis、 Bacillus megaterium、 Escherichia coli、 Propionibacterium acidipropionici、
Propionibacterium acnes Propionibacterium australiense、 Propionibacterium avidum 、 Propionibacterium cyclohexanicum、 Propionibacterium granulosum、
Propionibacterium jenseniiゝ Propionibacterium microaephilum、 Propionibacterium propionicum、 Propionibacterium thoenii、 Propionibacterium freudenreichu、
Agrobacterium tumefaciens、 Anabaena sp.ゝ Bradyrhizobium japonicum、 Brucella melitensis、 Brucella suis、 Chlorobium tepidum、 Clostridium tetania Clostridium glycolicum、 Clostridium difficile Corynebacterium diphtheriae、 Fusobacterium nucleatum、 ueobacter sulfUrreducens、 Gloeobacter violaceus、 Leptospira interrogans、 Mycobacterium bovis、 Mycobacterium tuberculosis、 Photorhabdus luminescens、 Porphyromonas gingivalis、 Prochlorococcus marinus、 Rhodobacter capsulatus、 Rhodopseudomonas palustris、 Sinorhizobium meliloti、 Streptomyces avermitilis、 Streptomyces coelicolor、 Synechococcus sp.ゝ Thermosynechococcus elongatus、 Treponema denticola、 Archaeoglobus fulgidus、 Halobacterium sp、 Mesorhizobium loti、 Methanobacterium thermoautotrophicum、 Methanococcus jannaschiu Methanopyrus kandleri、 Methanosarcina acetivo ns、 Methanosarcina mazei、 Pyrobaculum aerophilum、 Sulfolobus solfataricus、 Sulfolobus tokodau、 Thermoplasma acidophilum、 Thermoplasma volcanium 举げられる。 [0123] また、 Saccharomyces cerevisiaeなどの Saccharomyces属に属する酵母、 Candida maltosaなどの Candida属に属する酵母、 COS細胞、 CHO細胞、マウス L細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞などの動物細胞、 SF9細胞などの昆虫細胞などを使用できる。
[0124] 第 3実施形態においては、補酵素 B12合成系を有するものを宿主として使用する のが好ましい。例えば、 Lactobacillus属細菌、 Salmonella属細菌、 Klebsiella属細菌、 Propionibacterium 糸田菌、 Agrobacterium属糸田菌、 Anabaena属糸田菌、 Bacillus J禹ホ田菌 、 Bradyrhizobium属糸田菌、 Brucella属糸田菌、 Chlorobium属糸田菌、 ClostridiumJ¾糸田菌、 し oryneDacterium属糸田菌、 Fusobactenum晨ホ田菌、 Geobacter 糸田菌、 loeoDacter属 糸田菌、 Leptospira属糸田菌、 Mycobacterium属糸田菌、 Mycobacterium/禺糸田菌、
Photorhabdus属糸田菌、 Porphyromonas禺糸田菌、 Prochiorococcus腐糸田菌、
PseudomonasJ¾糸田菌、 Ralstonia晨ホ田菌、 Rhodobacter腐糸田菌、 Rhodopseudomonas属 糸田菌、 Sinorhizobium腐糸田菌、 Streptomyces属糸田菌、 SynechococcusJ¾糸田菌、 ThermosynechococcusJ¾糸田菌、 Treponema,禺糸田菌、 Archaeoglobus属始原！ ¾、 Halobacterium禺始原菌、 Mesorhizobium属タ台原 、 Methanobacterium厲始原歯、 Methanococcus腐始原菌、 Methanopyrus腐始原菌、 Methanosarcina属始原菌、 Methanosarcina属始甲、菌、 Pyrobaculum属始原菌、 Sulfolobus腐始原 、
Thermoplasma腐始原菌、好 3；しく ίま Propionibacterium属田菌、特に
Propionibacterium freudenreichiiを宿主として使用する。あるいは、補酵素 B12合成 遺伝子を組み換えにより導入した宿主を用いてもょ 、。
[0125] 宿主細胞にお!、ては、グリセロールデヒドロゲナーゼを発現しな 、宿主細胞、すな わちグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有しない細胞及びグリセロールデヒドロゲ ナーゼ遺伝子をノックアウトした細胞を使用する。これらを用いることにより、グリセ口 ールが酸化されてジヒドロキシアセトンに変換される経路を遮断することができ、より 高！、収率で 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造することが できる。グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトする方法については、上記 と同様の方法を使用できる。
[0126] 発現ベクター、プロモーターおよび組換えベクターの導入方法等については、上記 と同様である。 [0127] 1. 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸の製造
本発明において、 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸の製造は 、本発明の細菌又は形質転換体とグリセロールとを接触させ、反応生成物 (培養菌体 又は培養上清）中に 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を蓄積さ せ、 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を採取することにより実施 できる。
[0128] 本発明の細菌又は形質転換体とグリセロールとを接触させるとは、グリセロールの 存在下で本発明の細菌又は形質転換体を培養すること、また、本発明の細菌又は形 質転換体の培養物の処理物を用いて反応を行うことを包含する。該処理物としては、 菌死体、菌体破砕物、菌体破砕物又は培養上清カゝら調製した粗酵素、精製酵素等 が挙げられる。また、常法により担体に固定ィ匕した菌体、該処理物、酵素等を用いる ことができる。
[0129] 本発明の細菌又は形質転換体を培養する方法は、通常の方法に従って、炭素源と してグリセロールを用いることにより行われる。例えば、比較的リッチな培地、例えば 2 培地等を用いて好気培養し、菌体量を増やしてから嫌気条件にし、グリセロールを与 えて発酵を行う。 pHは、宿主の生育を妨害せず、かつ発酵液から酸を分離するとき の障害とならない試薬を用いて調整する。炭酸ナトリウム、アンモニア、ナトリウムィォ ン供給源、例えば塩ィ匕ナトリウムを添加してもよい。また、水酸化ナトリウム水溶液、水 酸ィ匕カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸ィ匕アンモニゥム水溶液、水酸ィ匕 カルシウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液 等の一般的なアルカリ試薬を用いてもよい。培養期間中 pHは、 5. 0-8. 0、好ましく は 5. 5-7. 5に保持する。
[0130] 窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、リン酸 アンモ-ゥム等のアンモ-ゥム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティ 一プリカ一等が挙げられる。また、無機物としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン 酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム等が挙げられ る。
[0131] 培養中は、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添カロ してもょ 、。誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を 培養する場合は、インデューサーを培地に添加することもできる。例えば、イソプロピ ルー β D チォガラタトピラノシド (IPTG)、インドール酢酸 (ΙΑΑ)等を培地に添加す ることがでさる。
[0132] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば RPMI
1640、 DMEM培地又はこれらの培地にゥシ胎児血清を添カ卩した培地が用いられ る。培養は、通常 5%CO存在下、 30— 40°Cで 1
2 一 30日間行う。培養中はカナマイ シン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
[0133] あるいは、上記において得られた細菌又は形質転換体の培養物力 遠心分離など によって集菌を行い、適当なバッファに懸濁する。この菌体懸濁液をグリセロールを 含むバッファに懸濁し、反応を行うことによって、 1, 3 プロパンジオール及び 3—ヒド ロキシプロピオン酸を製造することができる。反応の条件は、例えば、反応温度は 10 一 80°C、好ましくは 15— 50°C、反応時間は 5分一 96時間、好ましくは 10分一 72時 間、 pHは 5. 0-8. 0、好ましくは 5. 5-7. 5である。
[0134] 培養培地からの 1, 3 プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸の精製法は 当該技術分野において周知である。例えば、有機溶媒を用いる抽出、蒸留及びカラ ムクロマトグラフィーに反応混合物を供することにより、培地から 1, 3 プロパンジォー ル及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を得ることができる（米国特許第 5, 356, 812号)。 また、限外濾過膜や水などの低分子のみが透過できるゼォライト分離膜などで発酵 液の濃縮を行うのが好ましい。濃縮を行うことにより、水を蒸発させるためのエネルギ 一を低減することができる。
[0135] 培地を高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)分析にかけることにより、 1, 3 プロパン ジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸を直接同定することもできる。
[0136] 本発明を、以下の実施例を用いて更に具体的に説明するが、本発明は以下の実 施例に制限されるものではな 、。
実施例
[0137] (実施例 1)グリセロールデヒドラターゼ遺伝子の取得
合成オリゴヌクレオチドプライマー（フォワードプライマー： 5 '-ATGAAACGTCAAAAACGATTTGAAGAACTAGAAAAAC-3 ' (配列番号 27)、リ パースプライマー： 5し TTAGTTATCGCCCTTTAGCTTCTTACGACTTT— 3' (配列番 号 28)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、以下の条 件で PCR反応を実施した。
P C R反応組成 （ l)
1 0 X B u f f e r K O D p l u s 5
2 mM d N T P s 5
2 5 mM M g S 04 2
ゲノム 1 1 1 n g / 1 1
K O D 1 u s 1
水 3 4
フォヮ一ドプライマ一 2 0 Μ 1
リバースプライマー 2 0 Ρ Μ 1
反応系体積 計 5 0 反応サイクル： (94°C 2分 X 1、 94°C 15秒、 45— 65°C 30秒、 68°C 5分） X 30回 、 4°C∞。
[0139] 断片溶液に Taqプレミックスを等量カ卩えて、 72°Cで 10分、 3， A—オーバーハング処 理し、精製したサンプルを pCR4— TOPOに TAクローユングした。シーケンサ一は A BIの PEISM310、 3100を使用した。その結果、配列番号 2で示されるグリセロール デヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列、配列番号 6で示 されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコードする遺伝子の塩基 配列、並びに配列番号 10で示されるグリセロールデヒドラターゼのスモールサブュ- ットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
[0140] また、フォワードプライマー： 5'- ATGAAACGTCAAAAACGTTTTGAAGAACTA- 3'
(配列番号 29)、リバースプライマー： 5'- CTAGTTATCACCCTTGAGCTTCTTT- 3' ( 配列番号 30)を作成し、 Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを铸型にして、 上記と同様に PCR反応及び DNAシークェンスを実施した。その結果、配列番号 4で 示されるグリセロールデヒドラターゼのラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基 配列、配列番号 8で示されるグリセロールデヒドラターゼのミディアムサブユニットをコ ードする遺伝子の塩基配列、並びに配列番号 12で示されるグリセロールデヒドラター ゼのスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
[0141] (実施例 2)プロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー： 5'- ATGGGAGGCATAATTCCAATGGAAAAATA- 3' (配列 番号 31)、リバースプライマー：
5 -TTAACGAATTATTGCTTCGTAAACCATCTTC-3' (配列番号 32)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、実施例 1と同様に PCR反応 及び DNAシークェンスを実施した。その結果、配列番号 14で示されるプロパノール デヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
[0142] また、フォワードプライマー： 5'- ATGGGAGGCATAATGCCGATG- 3' (配列番号 33 )、リバースプライマー： 5し TTAACGAATTATTGCTTCGTAAATCATCTTC— 3' (配 列番号 34)を作成し、 Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを铸型にして、実 施例 1と同様に PCR反応及び DNAシークェンスを実施した。その結果、配列番号 1 6で示されるプロパノールデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
[0143] (実施例 3) 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー： 5し ATGAATAGACAATTTGATTTCTTAATGCCAAG— 3' ( 配列番号 35)、リバースプライマー： 5'- TTAGTAGATGCCATCGTAAGCCTTTT- 3' (配列番号 36)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、実 施例 1と同様に PCR反応及び DNAシークェンスを実施した。その結果、配列番号 1 8で示される 1 , 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼ遺伝子の塩基配列を決定 した。
[0144] (実施例 4)グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子遺伝子の取得
フォワードプライマー： 5し ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTGATATT— 3' ( 配列番号 37)、リバースプライマー：
5 -TCACCTGTTTGCCATTTCCTTAAAAGGGATT-3' (配列番号 38)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、実施例 1と同様に PCR反応 及び DNAシークェンスを実施した。配列番号 20で示されるグリセロールデヒドラター ゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子、並びに配列番号 24で示 されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のスモールサブユニットをコードする 遺伝子の塩基配列を決定した。
[0145] また、フォワードプライマー： 5'— ATGGCAACTGAAAAAGTAATTGGTGTTG— 3' ( 配列番号 39)、リバースプライマー： 5'- TCACCTGTTTACCATTTCCTTAAAGG- 3' (配列番号 40)を作成し、 Lactobacillus reuteri ATCC 53608株のゲノムを铸型にして 、実施例 1と同様に PCR反応及び DNAシークェンスを実施した。その結果、配列番 号 22で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子のラージサブユニットをコ ードする遺伝子、並びに配列番号 26で示されるグリセロールデヒドラターゼ再活性化 因子のスモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
[0146] (実施例 5)プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー： 5'— ATGCAGATTAATGATATTGAAAGTGCTGTA— 3' (配列 番号 47)、リバースプライマー： 5'- TTAATACCAGTTACGTACTGAGAATCC- 3' (配 列番号 48)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、実施 例 1と同様に PCR反応及び DN Aシークェンスを実施した。配列番号 42で示される プロピオンアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定した。
[0147] (実施例 6)プロピオン酸キナーゼ遺伝子の取得
フォワードプライマー： 5'— TTGATGTCAAAAAAAATACTTGCAATTAATTCTG— 3' (配列番号 49)、リバースプライマー：
5 ' -TTATTGCTGAGTTAC ATTC ATTAC ATC AC-3 ' (配列番号 50)を作成し、 Lactobacillus reuteri JCMl 112株のゲノムを铸型にして、実施例 1と同様に PCR反応 及び DNAシークェンスを実施した。配列番号 44で示されるプロピオン酸キナーゼを コードする遺伝子の塩基配列を決定した。
[0148] (実施例 7) 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオン酸の製造
(1)組み換え微生物の作成
Novagen社の pETDuet— 1ベクターのマルチクロー-ングサイト 1に乳酸菌のグリセ ロールデヒドラターゼ遺伝子、マルチクロー-ングサイト 2に 1, 3—プロパンジオール ォキシドレダクターゼ遺伝子を導入したプラスミド 1と、 Novagen社の pACYCDuet— 1 ベクターのマルチクロー-ングサイト 1にグリセロールデヒドラターゼ再活性化因子遺 伝子、マルチクローユングサイト 2にアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（大腸菌の aid Bァクセッションナンバー L40742)を導入したプラスミド 2をそれぞれ作成し、これを B L21 (DE3)— RILに、 Bio- Radの GENE PULSER IIエレクト口ポレーシヨンで導入した
[0149] (2)組み換え微生物の培養
この菌株 1 μ 1/レープ 1搔き分を、クロラムフエ-コール 100 μ g/mUアンピシリン 5 0 μ gZmlを含む 2培地 5ml (グリセロール 40gZl、硫酸アンモ-ゥム 10gZl、 KH
2
PO 2g/ K HPO 6gZl、酵母エキス 40gZl、硫酸マグネシウム七水和物 lgZl
4 2 4
、消泡剤アデ力ノール 20滴 ZDで、 37°Cにて振とうしながら好気条件で、対数増殖 後期（OD = 50)まで培養した。この培養液 lmlをとり、再度 500ml坂口フラスコに
660
入れたクロラムフエ-コール 100 μ g/ml、アンピシリン 50 μ g/mlを含む 2培地 100 mlに植え継ぎ、 37°Cにて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（OD = 50)ま
660 しフ^ 0
[0150] ここで IPTGを ImMとなるように投入し、 2時間お!/、た。菌体を遠心分離で回収し、 1Mのグリセロール 100mlに加え、気相部を窒素に置換した 100mlボトルをボトル口 一ラー上に 37°Cで 5時間おき、その後、液を分析した。その結果、液中には 1, 3—プ 口パンジオールが 0. 4M、 3—ヒドロキシプロピオン酸が 0. 4M含まれていた。
[0151] (実施例 8)ノックアウト菌株による 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオ ン酸の製造
(1)組み換え微生物の作成
5，
-AT
ATTAATCGTTAACC-3 ' (プライマー 1：配列番号 71)を N末側に付カ卩し、配列 5' -CTGGGCGAATACCTGAAGCCGCTGGCAGAAC
GCTGGTTAGTGGTGGGTGACAAATTTG-3，（プライマー 2：配列番号 72)を付カロし たアンピシリン耐性遺伝子（配列番号 73) 5 gと E.coli TOP10エレクト口コンビテント セル 50 1の混合液を、 Bio- Rad社製 Gene- Pulser IIを用いて、 0.1 cmキュベットに移 した。 [0152] Gene- Pulser IIを 2.0 kV、 25 mF、 200 Ω〖こセットし、電気パルスを印加した。印加後 の混合液を SOC培地 250 μ 1にカロえ、 37°Cで lh培養したのち、 50 μ g/mlのアンピシリ ンを含む LB培地の寒天プレートに塗布し、アンピシリン耐性株の選抜を行なった。ァ ンピシリン耐性株の中からプライマー 1とプライマー 2を用いたコロニー PCRにより約 2300bpの断片の増幅が認められた株をグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子ノックァ ゥト菌株とした。
[0153] Klebsiella oxytoca ATCC8724のゲノム 1 μ gを制限酵素 Sau3AIlUで 37°Cで 10分間 処理したサンプルを電気泳動で分離し、 25— 35kb周辺の DNAを回収'精製した。こ れを日本ジーン社製 Charomid9-20ベクターにライゲーシヨンして日本ジーン社製 Lambda INNでパッケージングし、グリセロールデヒドロゲナーゼをノックアウトした E.coli TOP10に感染させて形質転換した。この形質転換体の中から、プローブとして 、どの属の pduオペロンにお!、てもオペロンの先頭部分にある pocRの ORF中の保存 領域であるプローブ 1 (配列番号 74)、どの属の pduオペロンにおいてもオペロンの後 半部分にある pduVの ORF中の保存領域であるプローブ 2 (配列番号 75)を選択し、コ 口-一ハイブリダィゼーシヨンを行い 2つとも陽性だった菌株を選抜した。
[0154] (2)組み換え微生物の培養
この菌株 1 μ 1/レープ 1搔き分を、クロラムフエ-コール 100 μ g/ml,アンピシリン 5 0 μ gZmlを含む 2培地 5ml (グリセロール 40gZl、硫酸アンモ-ゥム 10gZl、 KH
2
PO 2g/ K HPO 6g
2 4 / 酵母エキス 40gZl、硫酸マグネシウム七水和物 lgZl
4
、消泡剤アデ力ノール 20滴 ZDで、 37°Cにて振とうしながら好気条件で、対数増殖 後期（OD = 50)まで培養した。この培養液 lmlをとり、再度 500ml坂口フラスコに
660
入れたクロラムフエ-コール 100 μ g/ml、アンピシリン 50 μ g/mlを含む 2培地 100 mlに植え継ぎ、 37°Cにて振とうしながら好気条件で、対数増殖後期（OD = 50)ま
660 ·¾ ' し/ 0
[0155] ここで IPTGを ImMとなるように投入し、 2時間お!/、た。菌体を遠心分離で回収し、 1Mのグリセロール 200mM〖こカロえ、気相部を窒素に置換した 100mlボトルをボトル ローラー上に 37°Cで 5時間おき、その後、液を分析した。その結果、液中には 1 , 3— プロパンジオールが 25mM、 3—ヒドロキシプロピオン酸が 21mM含まれて!/、た。 [0156] (実施例 9)ノックアウト菌株による 1, 3—プロパンジオール及び 3—ヒドロキシプロピオ ン酸の製造
グリセロールデヒドロゲナーゼの遺伝子を破壊するため、グリセロールデヒドロゲナ ーゼ遺伝子の配列（配列番号 45)を解析し、開始コドン力も 830bp付近の Kpnlサイト を選択し制限酵素サイトに破壊導入確認用の薬剤耐性マーカーを導入した。
[0157] (l)Lactobacillus reuteri JCM1112株のグリセロールデヒドロゲナーゼの取得と
PCR4-TOPOベクターへの導入
ゲノム情報を元に以下のように、 Lactobacillus reuteri JCM1112株のグリセロールデ ヒドロゲナーゼ遺伝子部分増幅用プライマーを作成した。
[0158] フォワードプライマー: 5'- ATGGTTGAAGAATTTGGCTCACC- 3' (配列番号 51) リバースプライマー: 5'- TTACATACGACTATGGTGACAACG- 3' (配列番号 52)
PCRによる増幅の結果、 目的の 1112bpの断片が作成できたので、これを 3'Aオーバ 一ハング処理して更に精製し、インビトロジェン TOPO TAクローユング kitを用いた TA クロー-ングを行い、 TOP10セルへと形質転換した。 pCR4-TOPOベクターの TAクロ 一-ングサイトに Lactobacillus reuteri JCM1112株のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺 伝子部が導入されたプラスミドを持つ形質転換体力ゝらプラスミド
(pCR4- TOPO/Lb_GDH)を回収した。
[0159] (2)薬剤耐性マーカー遺伝子の作成と制限酵素処理
既にインターネット上に公開されてる PIL253プラスミドの配列（http：〃 www. ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=277339参照）を解析し、乳 酸菌で薬剤耐性マーカーとして使用可能なエリスロマイシン耐性遺伝子とそのプロモ 一ター、ターミネータ一領域が含まれかつ両末端に Kpnlサイトが存在するように配列 番号 46で表される DNA断片を合成した。この DNA断片を以下の表 1の組成で 37°C、 2時間、制限酵素処理を行い、精製回収し薬剤耐性マーカー配列とした。
[表 1] 10 x Buffer! ^0μ\
合成した DNA配列（DNA量 1 ju g) 30 μ\
Kpnl 10^1
精製水 50jul _
計 100|
(3)破壊導入断片の作成
a)直線化 pCR4- TOPO/Lb_GDHの作成
以下の表 2の組成で、 37°Cにて 2時間制限酵素処理を行い、約 4986bpの直線化プ ラスミドを回収した。
[表 2]
10 BufferL 10 l
PCR4-TOPO / Lb GDH co ,
Figure imgf000042_0001
精製水 30 I
計 100 1 続いて以下の表 3の組成で、この直線化 pCR4-TOPO/L GDHを 37°Cで 1.5時間ァ ルカリフォスファターゼ処理し、精製回収した。回収された直線化
pCR4- TOPO/Lb_GDHの濃度は 30ng/ μ 1であった。
[表 3]
10ΧΒΑΡ Buffer 10jU I
制限酵素処理済み PCR4-TOPO /Lb GDH 50^(
BAP(2.5U) 10^1
精製水 _ 30jUl
計 100 //1 b)破壊導入断片を挿入配列として持つ pCR-4/ΤΟΡΟベクターの作成
a)で作成した直線ィ匕プラスミドと 2)で作成した薬剤耐性マーカー配列を、ライゲーシ ヨン反応を行って連結し、 E.coli TOP10セルに形質転換した。形質転換体の中から 破壊導入断片を挿入配列として持つ pCR4- TOPOプラスミド（hakai/ pCR4- TOPO)を 選抜し、回収した。
[0163] c)破壊導入断片の作成
b)で作成した hakai/ pCR4-TOPOをテンプレートに 1)で使用したプライマーである フォワードプライマー: 5'- ATGGTTGAAGAATTTGGCTCACC- 3' (配列番号 51) リバースプライマー: 5'- TTACATACGACTATGGTGACAACG- 3' (配列番号 52) を用いて PCRを行なったところ、 2144bpの目的断片が増幅された。この断片を大量に 精製及び濃縮し、平均 5 /z g/ 1の濃度に調製し、遺伝子破壊導入実験に用いた。
[0164] (4)遺伝子破壊の導入
a)コンビテントセルの作成
以下の手順でコンビテントセルを作成した。
[0165] 1. \11¾培地10 1^ 5に、終夜培養したし 61菌液各1001^を植菌し、00 =0.8
660 まで培養した (試験管で培養を行った。ガスパックを使用した嫌気培養で約 5— 5.5 h)
[0166] 2.培養液 X 5本を 50 mlファルコンチューブに移し、集菌後、滅菌蒸留水 (室温） 30— 40 mlで 3回洗浄した。
[0167] 3.滅菌蒸留水 (室温） 800 mlで懸濁後、 1.5 mlマイクロチューブに移し、集菌した。
[0168] 4.上清を廃棄後、 30 % (wt/vol) PEG1500(dH O) 250 mlで懸濁した。
2
[0169] 5. 100 mlずつ分注し、 80°Cで保存した。
[0170] 6.使用直前に溶解し、エレクト口ポレーシヨンに供した。
[0171] b)コンビテントセルへの破壊断片の導入
1.供試プラスミド (5— 10 ml； 2-3 mg)を前記手法で作成したコンビテントセルに添カロ した。
[0172] 2.予め冷却しておいた 0.2 cmキュベットに混合液を移した。
[0173] 3. Gene pulsei^2.5 kV, 25 mF, 200 Ωにセットし、電気パルスを印加した。
[0174] 4.すぐに、予め 37°Cで保温しておいた MRS brothを total 1 mlになるように添加し、 37
°Cで 1.5— 2 hインキュベートした。
[0175] 5. MRS agar containing erythromycin (2 mg/ml)に塗抹し、 37°Cで 24— 48 h嫌気培養 した (ガスパックで嫌気培養を行った)。
[0176] c)破壊導入株の選抜
b)の培養の結果生育してきたエリスロマイシン耐性株を選抜し、ゲノムを回収した。 そのゲノムをテンプレートに PCRにてインサートの確認を行なった。薬剤耐性と L、う形 質と、ゲノム上での遺伝子の導入が PCRにて確認できた株を破壊導入株とした。
[0177] (5)破壊株を用いた反応
通常の MRS培地に 2%グリセリンが入った培地 10mlに終夜培養した破壊株の培養 液 100 1を加え、 37°Cで 24h嫌気条件下で培養する。この菌体を 2500 X gで 10分遠 心分離して回収後、 pH7.5の 50mMカリウムリン酸バッファ 10mlで 2回洗浄後、グリセリ ン 2%を含む pH7.5の 50mMカリウムリン酸バッファ 10mlを入れ 37°Cで反応させた。反 応実績は、以下のとおりである。比較例として破壊導入していない乳酸菌を用いた。 結果を以下の表 4に示す。
[表 4] 破壊株の反応成精
Figure imgf000044_0001
[0178] 以上から、本発明により、グリセロールから 1, 3—プロパンジオールを製造する際の 原料グリセロールのロスを低減し、かつ 1， 3—プロパンジオールと合わせて 3—ヒドロキ シプロピオン酸を製造することができることが明ら力となった。
[0179] (実施例 10)ホスホトランスアシラーゼ活性の確認
対数増殖後期の菌体（Lactobacillus reuteri JCM1112株）ブロス 10mlを pH8の 50m Mカリウムリン酸バッファ 10mlで 2回洗浄し、 pH8の 50mMカリウムリン酸バッファ 10mlに 再懸濁させ、氷冷しながら超音波にて菌体を破砕する。 20,000 X gで 30分遠心し、上 清を粗酵素液とした。この粗酵素液を適当に希釈し、ァセチル CoAを加えた pH7.5の ノ ッファに加え、 37°Cで反応させ、 CoAの生成を定量した。その結果、 CoAの生成が 確認された。
[0180] また、 Lactobacillus reuteri JCM1112株をゲノム解析した結果、ホスホトランスァシラ 一ゼと相同性を持つ ori¾S確認された。
配列表フリーテキスト
[0181] 配列番号 27— 40、 46— 52 :合成オリゴヌクレオチド

Claims

請求の範囲
[1] グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼのラージサブュ-ッ トをコードする遺伝子、ミディアムサブユニットをコードする遺伝子及びスモールサブ ユニットをコードする遺伝子、グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジ オールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子のラージサブユニットをコードする遺伝子及びス モールサブユニットをコードする遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺 伝子、並びに 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子及び
/又はプロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、を含む形質転換体。
[2] グリセロールデヒドラターゼ及び Z又はジオールデヒドラターゼの各サブユニットを コードする遺伝子が Lactobacillus reuteriに由来する、請求項 1記載の形質転換体。
[3] プロパノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子が
Lactobacillus reuteriに由来する、請求項 1又は 2記載の形質転換体。
[4] 1, 3—プロパンジオールォキシドレダクターゼをコードする遺伝子を含み、該遺伝子 が Lactobacillus reuteriに由来する、請求項 1一 3のいずれか 1項記載の形質転換体
[5] グリセロールデヒドラターゼ再活性ィ匕因子及び Z又はジオールデヒドラターゼ再活 性化因子の各サブユニットをコードする遺伝子が Lactobacillus reuteriに由来する、 請求項 1一 4のいずれか 1項記載の形質転換体。
[6] アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がプロピオンアルデヒドデヒドロゲナ ーゼをコードする遺伝子であり、さらにホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子 及びプロピオン酸キナーゼをコードする遺伝子を含み、グリセロールデヒドロゲナー ゼをコードする遺伝子を含まな!/ヽ、請求項 1記載の形質転換体。
[7] pduオペロンを有し、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含まない、 請求項 6記載の形質転換体。
[8」 Lactobacillus属糸田菌、 SalmonellaJ¾細菌、 Klebsiella属糸田菌、 Listeria属糸田菌、
し lostndum晨田菌、 EscherichiaJ¾糸田菌、 EnterobacterJ¾^田菌、し aloramatorJ¾糸田菌、 Acetobacterium 糸田菌、 Brucella属細菌、 FlavobactenumJ禹ホ田菌、 FusobactenumJ¾ 細菌、 Citrobacter属細菌及び Propio bacterium属細菌から選択される細菌にお!ヽて 、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト細 菌。
[9] pduオペロン及びホスホトランスアシラーゼをコードする遺伝子を有する細菌にぉレヽ て、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がノックアウトされたノックアウト 細菌。
[10] 請求項 1一 9のいずれ力 1項記載の形質転換体又は細菌とグリセロールとを接触さ せることにより、 1, 3—プロパンジオール及び/又は 3—ヒドロキシプロピオン酸を製造 する方法。
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