CN114591994B - 一种生产高纯度3-hpa的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用 - Google Patents

一种生产高纯度3-hpa的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产高纯度3‑HPA的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用。所述制备方法包括如下步骤：敲除野生型罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和/或金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因。本发明最终获得敲除pduQ基因和ADH7基因的LR2(△pduQADH7)双敲菌株和敲除pduQ基因的LR1(△pduQ)单敲除株。通过全细胞转化生产实验表明：LR2(△pduQADH7)双敲菌株的3‑HPA产量(217.18±5.40mM)明显高于LR1(△pduQ)单敲菌株(193.13±1.08mM)以及野生型菌株(143.13±1.35mM)，而副产物1,3‑PDO产量明显下降。

Description

一种生产高纯度3-HPA的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产高纯度3-HPA的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用。
背景技术
罗伊氏乳杆菌是目前已报道的几乎可存在于所有脊椎动物和哺乳动物肠道内的乳酸杆菌，是一种具有改善过敏体质、预防过敏反复发作，以及调节肠道功能的益生菌。它代谢甘油产生一种特殊的抑菌物质——罗伊氏素(reuterin)。
罗伊氏素是一种广谱抗菌剂，可抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌、病原虫、原生动物等的生长，不仅可以有效作用于细菌，同样也可以作用于某些真菌和原生动物。罗伊氏素的主要成分是3-羟基丙醛(3-HPA)的单体、水合物和环化二聚体。除了抗菌外，3-HPA单体还是一种潜在的重要化工原料，可作为多种新兴化学品如丙烯醛、丙烯酸、1,3-丙二醇等的前体，用于制备新型聚合物材料；可和蛋白质中的氨基反应形成交联，有望取代化学合成的戊二醛和环氧化合物作为新型生物交联剂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何生产高纯度的3-羟基丙醛(3-HPA)。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法。
本发明提供的产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法包括如下步骤：敲除野生型罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和/或金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因。
上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法为如下1)或2)：
所述方法1)包括如下步骤：敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因；
所述方法2)包括如下步骤：敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因。
所述金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因编码的蛋白质为b1)或b2)所示的蛋白质：
b1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b2)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有金属离子依赖性脱氢酶活性的由b1)衍生的蛋白质。
所述金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因为b11)-b13)中的任一种DNA分子：
b11)SEQ ID No.2的cNDA分子或基因组DNA；
b12)在严格条件下与b11)限定的DNA分子杂交且编码所述金属离子依赖性脱氢酶pduQ的cDNA分子或基因组DNA；
b13)与b11)或b12)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述金属离子依赖性脱氢酶pduQ的cDNA分子或基因组DNA。
所述金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因编码的蛋白质为b3)或b4)所示的蛋白质：
b3)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b4)由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有金属离子依赖性脱氢酶活性的由b3)衍生的蛋白质。
所述金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因为b31)-b33)中的任一种DNA分子：
b31)SEQ ID No.4的cNDA分子或基因组DNA；
b32)在严格条件下与b31)限定的DNA分子杂交且编码所述金属离子依赖性脱氢酶ADH7的cDNA分子或基因组DNA；
b33)与b31)或b32)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述金属离子依赖性脱氢酶ADH7的cDNA分子或基因组DNA。
进一步的，敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因的物质可为CRISPR/Cas9系统。
更进一步的，敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因的CRISPR/Cas9系统中sgRNA的靶序列为序列5所示的DNA分子。
敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因的CRISPR/Cas9系统中sgRNA的靶序列为序列6所示的DNA分子。
上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法中，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CGMCC 1.3264。
按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌也属于本发明的保护范围。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法或按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌的新用途。
本发明提供了上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法或按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌在制备3-羟基丙醛中的应用。
本发明还提供了上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法或按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌在提高3-羟基丙醛产量中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了制备3-羟基丙醛的方法。
本发明提供的制备3-羟基丙醛的方法包括如下步骤：将按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌进行发酵培养的步骤。
上述制备3-羟基丙醛的方法可包括如下步骤：
x1)将按照上述产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌在发酵培养基中进行培养，离心，收集菌体；
x2)将所述菌体在全细胞反应体系中反应，离心，收集上清液；从所述上清液中获得3-羟基丙醛。
进一步的，所述x1)中，所述发酵培养基为MMRS发酵培养基，其配方具体如下：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，柠檬酸铵2.4g/L，醋酸钠6.2g/L，磷酸氢二钾1.8g/L，硫酸锰0.16g/L，硫酸镁0.21g/L，吐温80 0.8g/L。
所述x2)中，所述菌体在全细胞反应体系中浓度为(1.8±0.7)×108cfu/L。
所述全细胞反应体系的配方如下：溶剂为pH6.2磷酸缓冲液，溶质及其浓度分别如下：10mmol/L Mg2+(如MgSO4)、0.02g/L维生素B12、250mmol/L甘油、37.5mmol/L蔗糖(葡萄糖)。
更进一步的，所述x1)中，所述培养的条件为37℃培养24h；所述离心的条件为5000rpm离心10min。
所述x2)中，所述反应的条件为30℃反应2h；所述离心的条件为1000rpm离心10min。
所述x1)和所述x2)之间还包括清洗菌体的步骤，如使用pH 6.2磷酸缓冲液洗1遍菌体，去除表面培养基残留。
本发明提供了一种生产高纯度3-HPA的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用。本发明以野生型罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因为目标基因，获得敲除pduQ基因和ADH7基因的LR2(△pduQADH7)双敲菌株和敲除pduQ基因的LR1(△pduQ)单敲除株。通过全细胞转化生产实验表明：LR2(△pduQADH7)双敲菌株的3-HPA产量(217.18±5.40mM)明显高于LR1(△pduQ)单敲菌株(193.13±1.08mM)以及野生型菌株(143.13±1.35mM)，而副产物1,3-PDO产量明显下降。
附图说明
图1为LR1(△pduQ)菌株的鉴定。1、阴性对照(水)；2、阳性对照(野生菌株)；3、LR1(△pduQ)菌株。
图2为LR2(△pduQADH7)菌株的鉴定。1、LR2(△pduQADH7)菌株；2、阳性对照(野生菌株)；3、阴性对照(水)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的野生型罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter，CGMCC)，保藏编号为1.3264。
下述实施例中的发酵培养基(MMRS)的配方如下：溶剂为水，溶质及其浓度分别如下：酵母粉24g/L，葡萄糖24g/L，柠檬酸铵2.4g/L，醋酸钠6.2g/L，磷酸氢二钾1.8g/L，硫酸锰0.16g/L，硫酸镁0.21g/L，吐温80 0.8g/L，pH 6.3，37℃静置培养。
下述实施例中的3-HPA含量测定方法如下：
A.通过比色法测定反应体系中3-羟基丙醛(3-HPA)的浓度：配制丙烯醛标准品(FLUKA公司产品，其产品目录号为SIAL-89116-1ML)浓度0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L、3mmol/L、3.5mmol/L、4mmol/L、4.5mmol/L、5mmol/L(溶剂为水)。色氨酸溶于0.05mmol/L HCl至终浓度为10mmol/L。取不同浓度的1mL丙烯醛标准品溶液，0.75mL色氨酸溶液，3mL浓盐酸(质量分数为37％)，37℃条件下反应20min。OD560nm条件下测定吸光度值，以丙烯醛标准品浓度为横坐标(x)，以OD560nm为纵坐标(y)制作标准曲线。
B.以待测反应液的过滤液替代步骤A中的丙烯醛标准品溶液，其余按照步骤A的操作进行，测定OD560nm，将所得OD560nm代入步骤A获得的标准曲线方程中，计算得到丙烯醛的含量(单位：mmol/L)。由于丙烯醛与3-HPA按照1:1的摩尔比转化，因此，根据标准曲线所得丙烯醛的含量即可表示3-HPA的含量。
下述实施例中的1,3-PDO的含量测定使用安捷伦高效液相色谱仪按照下述条件测定：AminexHPX-87H有机酸柱，流动相为6mmol/L H2SO4，流速为0.5mL/min，柱温55℃，温示差检测器(RID)35℃。
下述实施例中的pH 6.2磷酸缓冲液的组成如下：每100mL所述pH 6.2磷酸缓冲液中含19.2mL 0.1mol/L K2HPO4，80.8mL 0.1mol/L KH2PO4。
下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示。
表1
实施例1、产高纯度3-HPA的工程菌株的构建
pduQ(GenBank:ABQ83973.1)和ADH7(GenBank:ABQ82306.1)是罗伊氏乳杆菌中主要的催化醛类化合物生成醇类的金属离子依赖性脱氢酶，本实施例对野生型罗伊氏乳杆菌中的pduQ进行敲除，构建得到重组菌LR1(△pduQ)，对野生型罗伊氏乳杆菌中的pduQ和ADH7进行敲除，构建得到重组菌LR2(△pduQADH7)。具体步骤如下：
一、重组质粒的构建
1、PTRK669-cas9质粒的构建
以PTRK669质粒(Addgene，71313)为骨架质粒构建PTRK669-cas9质粒。具体步骤如下：
1)使用BglII和BsmBI对PTRK669质粒进行双酶切并使用纯化试剂盒纯化酶切产物。
2)以pmg36e质粒(北京华奥正生科技有限公司，货号：Trans 23-97)为模板，采用引物P32-cas9-R和p32-F扩增得到p32启动子片段；以pcas9(Addgene，42876)质粒为模板，采用引物cas9-p32-F和Cas9-R扩增得到cas9片段。同样使用纯化试剂盒纯化扩增得到的DNA片段。
3)按照无缝克隆试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司，货号：CL116-02)说明加入一定比例的步骤1)获得的纯化后的酶切质粒和步骤2)获得的纯化后的DNA片段进行连接；连接完成后转化大肠杆菌EC1000，涂布于含有25mg/L的氯霉素抗性平板；挑取单克隆进行测序验证得到正确的质粒，将其命名为PTRK669-cas9。
2、poRI28-target质粒的构建
以poRI28质粒(Addgene，71595)为骨架构建poRI28-target质粒。
1)敲除pduQ基因的靶向质粒
敲除pduQ基因的靶向质粒的具体构建步骤如下：
1-1)使用BglII和SalI对poRI28质粒进行双酶切并使用纯化试剂盒纯化酶切产物。
1-2)以野生型罗伊乳杆菌基因组为模板，采用引物pduQ-UF和pduQ-UR进行扩增得到上游同源臂；以野生型罗伊乳杆菌基因组为模板，采用引物pduQ-DF和pduQ-DR进行扩增得到下游同源臂；以pmg36e质粒为模板，采用引物p32-target-F和p32-pduQ-R进行扩增得到p32启动子片段；以pTarget质粒(Addgene，62226)为模板，采用引物pduQ-N20-F和ter-R进行扩增得到sgRNA(sgRNA靶序列：tccaccactagataaaatta)。同样使用纯化试剂盒纯化扩增得到的DNA片段。
1-3)按照无缝克隆试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司，货号：CL116-02)说明加入一定比例的步骤1-1)获得的纯化后的酶切质粒和步骤1-2)获得的纯化后的DNA片段进行连接；连接完成后转化大肠杆菌EC1000，涂布于含有100mg/L的红霉素抗性平板，挑取单克隆进行测序验证得到正确的质粒，将其命名为poRI28-target(pduQ)质粒。
2)敲除ADH7基因的靶向质粒
敲除ADH7基因的靶向质粒的具体构建步骤如下：
2-1)使用BglII和SalI对poRI28质粒进行双酶切并使用纯化试剂盒纯化酶切产物。
2-2)以野生型罗伊乳杆菌基因组为模板，采用引物ADH7-UF和ADH7-UR进行扩增得到上游同源臂；以野生型罗伊乳杆菌基因组为模板，采用引物ADH7-DF和ADH7-DR进行扩增得到下游同源臂；以pmg36e质粒为模板，采用引物p32-target-F和p32-ADH7-R进行扩增得到p32启动子片段；以pTarget质粒为模板，采用引物ADH-N20-F和ter-R进行扩增得到sgRNA(sgRNA靶序列：agctgaaatgcttgccggaa)。同样使用纯化试剂盒纯化扩增得到的DNA片段。
2-3)按照无缝克隆试剂盒(北京博迈德基因技术有限公司，货号：CL116-02)说明加入一定比例的步骤2-1)纯化后的酶切质粒和步骤2-2)获得的纯化后的DNA片段进行连接；连接完成后转化大肠杆菌EC1000，涂布于含有100mg/L的红霉素抗性平板，挑取单克隆进行测序验证得到正确的质粒，将其命名为poRI28-target(ADH7)质粒。
二、LR1(△pduQ)的构建
对野生型罗伊氏乳杆菌中的pduQ进行敲除，构建得到重组菌LR1(△pduQ)。具体敲除步骤如下：
1、制备野生型罗伊氏乳杆菌菌株电转化感受态，转入质粒PTRK669-cas9，涂布于含有氯霉素(终浓度5μg/mL)的MMRS平板。
2、制备含有质粒PTRK669-cas9的菌株电转化感受态，转入质粒poRI28-target(pduQ)，涂布于含有氯霉素(终浓度5μg/mL)和红霉素(终浓度5μg/mL)的MMRS平板。
3、约24-48h平板上有单菌落长出，使用上下游同源臂两端的验证引物(pduQ-UF和pduQ-DR)进行菌落PCR验证。和野生菌株相比较，敲除后的菌株PCR条带是缺失靶基因大小的单一条带(图1)。
上述罗伊氏乳杆菌电转化步骤如下：
1、在发酵培养基(MMRS)中37℃过夜培养罗伊氏乳杆菌。
2、0.6mL过夜培养接种于30mL含0.5M蔗糖和3％甘氨酸的发酵培养基(MMRS)中，接种至OD600nm(0.6～0.8)。
3、冰点冷却约10min，离心。
4、30mL冷MgCl2(30mM)洗涤2次。
5、用5mL 30mM MgCl2在45℃下重悬15min，然后冰上保存10min。
6、收获后用10mL 0.3M蔗糖洗净。
7、重悬于0.3mL 0.3M蔗糖中，每管分成100微升。
8、电穿孔时，将100μL细胞悬液与不超过10μL DNA混合，0.2cm电转杯2.5kV电压。
9、900μL含0.3M蔗糖以及0.1M MgCl2的发酵培养基(MMRS)，37℃孵育3h后涂于添加相应的抗生平板。在37℃厌氧条件下培养1-3天。
三、LR2(△pduQADH7)的构建
对LR1(△pduQ)中的ADH7进行敲除，构建得到LR2(△pduQADH7)。具体敲除步骤如下：
1、制备LR1(△pduQ)菌株电转化感受态，转入质粒PTRK669-cas9，涂布于含有氯霉素(终浓度5μg/mL)的MMRS平板。
2、制备含有质粒PTRK669-cas9的菌株电转化感受态，转入质粒poRI28-target(ADH7)，涂布于含有氯霉素(终浓度5μg/mL)和红霉素(终浓度5μg/mL)的MMRS平板。
3、约24-48h平板上有单菌落长出，使用上下游同源臂两端的验证引物(ADH7-UF和ADH7-DR)进行菌落PCR验证。和野生菌株相比较，敲除后的菌株PCR条带是缺失靶基因大小的单一条带(图2)。
罗伊氏乳杆菌电转化步骤同步骤二中的方法。
实施例2、工程菌株全细胞转化生产3-HPA
供试工程菌株：野生型罗伊氏乳杆菌菌株以及实施例1中构建的工程菌株LR1(△pduQ)、LR2(△pduQADH7)。
实验方法：将供试工程菌株使用发酵培养基(MMRS)37℃培养24h，5000rpm离心10min，收集菌体，并且用pH 6.2磷酸缓冲液洗1遍去除表面培养基残留。按照如下组成配制全细胞反应体系：每1L所述反应体系中含有10mmol Mg2+(如MgSO4)、0.02g维生素B12、250mmol甘油、37.5mmol蔗糖、(1.8±0.7)×108cfu罗伊氏乳杆菌(上述清洗后的菌体)；余量为pH6.2磷酸缓冲液。30℃反应2h，1000rpm离心10min，取上清溶液按照上述方法进行产物测定。
结果如表2所示。结果表明：LR2(△pduQADH7)双敲菌株的3-HPA产量明显高于LR1(△pduQ)单敲菌株以及野生型菌株，而副产物1,3-PDO产量明显下降。
表2
菌株 3-HPA(mM) 1,3-PDO(mM)
WT 143.13±1.35 16.06±0.46
LR1(△pduQ) 193.13±1.08 6.52±0.70
LR2(△pduQADH7) 217.18±5.40 3.89±0.002
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古蒙肽生物工程有限公司
<120> 一种生产高纯度3-HPA的罗伊氏乳杆菌工程菌株及其制备方法与应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 373
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Glu Lys Tyr Ser Met Pro Thr Arg Ile Tyr Ser Gly Thr Asp Ser
1 5 10 15
Leu Lys Glu Leu Glu Thr Leu Asn Asn Glu Arg Ile Leu Leu Val Cys
20 25 30
Asp Ser Phe Leu Pro Gly Ser Asp Thr Leu Lys Glu Ile Glu Ser His
35 40 45
Ile Lys Asp Asn Asn Lys Cys Glu Ile Phe Ser Asp Val Val Pro Asp
50 55 60
Pro Pro Leu Asp Lys Ile Met Glu Gly Val Gln Gln Phe Leu Lys Leu
65 70 75 80
Lys Pro Thr Ile Val Ile Gly Ile Gly Gly Gly Ser Ala Leu Asp Thr
85 90 95
Gly Lys Gly Ile Arg Phe Phe Gly Glu Lys Leu Gly Lys Cys Lys Ile
100 105 110
Asn Glu Tyr Ile Ala Ile Pro Thr Thr Ser Gly Thr Gly Ser Glu Val
115 120 125
Thr Asn Thr Ala Val Ile Ser Asp Thr Lys Glu His Arg Lys Ile Pro
130 135 140
Ile Leu Glu Asp Tyr Leu Thr Pro Asp Cys Ala Leu Leu Asp Pro Lys
145 150 155 160
Leu Val Met Thr Ala Pro Lys Ser Val Thr Ala Tyr Ser Gly Met Asp
165 170 175
Val Leu Thr His Ala Leu Glu Ser Leu Val Ala Lys Asp Ala Asn Leu
180 185 190
Phe Thr Val Ala Leu Ser Glu Glu Ala Ile Asp Ala Val Ile Lys His
195 200 205
Leu Val Glu Cys Tyr Arg His Gly Asp Asn Val Asp Ala Arg Lys Ile
210 215 220
Val His Glu Ala Ser Asn Ile Ala Gly Thr Ala Phe Asn Ile Ala Gly
225 230 235 240
Leu Gly Ile Cys His Ser Ile Ala His Gln Leu Gly Ala Asn Phe His
245 250 255
Val Pro His Gly Leu Ala Asn Thr Met Leu Leu Pro Tyr Val Ile Ala
260 265 270
Tyr Asn Ala Glu His Ser Glu Glu Ala Leu His Lys Phe Ala Ile Ala
275 280 285
Ala Lys Lys Ala Gly Ile Ala Ala Pro Gly Val Gly Asp Arg Leu Ala
290 295 300
Val Lys Arg Leu Ile Ala Lys Ile Arg Glu Met Ala Arg Gln Met Asn
305 310 315 320
Cys Pro Met Thr Leu Gln Ala Phe Gly Val Asp Pro Ala Lys Ala Glu
325 330 335
Glu Leu Ala Asp Thr Val Val Ala Asn Ala Lys Lys Asp Ala Thr Phe
340 345 350
Pro Gly Asn Pro Val Val Pro Ser Asp Asn Asp Leu Lys Met Val Tyr
355 360 365
Glu Ala Ile Ile Arg
370
<210> 2
<211> 1140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgggaggca taatgccgat ggaaaaattt agtatgccaa cccgaattta ttcgggaaca 60
gatagtttga aggaattaga aacccttcat aatgaacgaa ttttgttagt ttgtgactca 120
ttcttacctg gtagtgacac attaaaggaa attgagagtc atattaacga cagtaataaa 180
tgtgaaattt tctctgatgt tgtccctgat ccaccactag ataaaattat ggaaggggtt 240
caacagttct taaagctgaa accaacaatt gtaattggta tcggtggtgg ttctgcaatg 300
gacaccggta agggaattcg tttcttcggt gaaaagcttg gcaagtgcaa aattaatgaa 360
tatattgcaa ttccaacaac cagcggaacc ggttcagaag ttactaatac tgcggttatt 420
tctgatacta aggaacaccg gaagattccg attcttgaag attacttaac accagattgt 480
gcattgcttg atcctaagtt agtaatgaca gcaccaaaga gtgttactgc ctactcagga 540
atggatgtat taactcatgc tcttgaatca ttggttgcta aggacgctaa tttgtttacc 600
gttgcattat cagaagaagc cattgatgcg gtaactaagt atcttgttga atgttatcgt 660
catggcgata atgtcgatgc acgaaagatc gttcacgaag catcaaatat tgccggaaca 720
gcctttaaca ttgctggact aggtatttgc cactcaattg cccaccaatt aggtgctaac 780
ttccatgttc ctcatggttt agcaaacaca atgttattgc catatgttgt tgcatacaat 840
gctgaacact gtgaagaagc cttacacaag tttgcaattg ccgctaagaa agccggaatt 900
gctgcacctg gcgttggtga ccgtttggct gttaagcggc tgattgcaaa gattcgtgaa 960
atggcacggc aaatgaattg tccaatgact ctccaagcat ttggagttga ccacgcaaaa 1020
gcagaagcag ctgctgatac ggttgttgct aatgcgaaga aggatgcaac attcccaggc 1080
aatccagttg ttccttcaga tgatgatctg aagatgattt acgaagcaat aattcgttaa 1140
<210> 3
<211> 390
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Asn Arg Gln Phe Asp Phe Leu Met Pro Ser Val Asn Phe Phe Gly
1 5 10 15
Pro Gly Val Ile Ala Lys Ile Gly Asp Arg Ala Lys Met Leu Asn Met
20 25 30
His Lys Pro Leu Ile Val Thr Thr Glu Gly Leu Ser Lys Ile Asp Asn
35 40 45
Gly Pro Val Lys Gln Thr Val Ala Ser Leu Glu Lys Ala Gly Val Asp
50 55 60
Tyr Ala Val Phe Thr Gly Ala Glu Pro Asn Pro Lys Ile Arg Asn Val
65 70 75 80
Gln Ala Gly Lys Lys Met Tyr Gln Asp Glu Asn Cys Asp Ser Ile Ile
85 90 95
Thr Val Gly Gly Gly Ser Ala His Asp Cys Gly Lys Gly Ile Gly Ile
100 105 110
Val Leu Thr Asn Gly Asp Asp Ile Ser Lys Leu Ala Gly Ile Glu Thr
115 120 125
Leu Lys Asn Pro Leu Pro Pro Leu Met Ala Val Asn Thr Thr Ala Gly
130 135 140
Thr Gly Ser Glu Leu Thr Arg His Ala Val Ile Thr Asn Glu Lys Thr
145 150 155 160
His Leu Lys Phe Val Val Val Ser Trp Arg Asn Ile Pro Leu Val Ser
165 170 175
Phe Asn Asp Pro Met Leu Met Leu Asp Ile Pro Lys Asp Ile Thr Ala
180 185 190
Ala Thr Gly Cys Asp Ala Phe Val Gln Ala Ile Glu Pro Tyr Val Ser
195 200 205
Val Asp His Asn Pro Ile Thr Asp Ser Gln Cys Lys Glu Ala Ile Gln
210 215 220
Leu Ile Gln Thr Ala Leu Pro Glu Val Val Ala Asn Gly His Asn Ile
225 230 235 240
Glu Ala Arg Thr Lys Met Val Glu Ala Glu Met Leu Ala Gly Met Ala
245 250 255
Phe Asn Asn Ala Asn Leu Gly Tyr Val His Ala Met Ala His Gln Leu
260 265 270
Gly Gly Gln Tyr Asp Ala Pro His Gly Val Cys Cys Ala Leu Leu Leu
275 280 285
Thr Thr Val Glu Glu Tyr Asn Leu Ile Ala Cys Pro Glu Arg Phe Ala
290 295 300
Glu Leu Ala Lys Val Met Gly Phe Asp Thr Thr Gly Leu Thr Leu Tyr
305 310 315 320
Glu Ala Ala Gln Lys Ser Ile Asp Gly Met Arg Glu Met Cys Arg Leu
325 330 335
Val Gly Ile Pro Ser Ser Ile Lys Glu Ile Gly Ala Lys Pro Glu Asp
340 345 350
Phe Glu Met Met Ala Lys Asn Ala Leu Lys Asp Gly Asn Ala Phe Ser
355 360 365
Asn Pro Arg Lys Gly Thr Val Glu Asp Ile Val Lys Leu Tyr Gln Lys
370 375 380
Ala Tyr Asp Gly Ile Tyr
385 390
<210> 4
<211> 1173
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgaatagac aatttgattt cttaatgcca agtgtgaact tctttggtcc tggtgttatt 60
gctaaaattg gtgatcgtgc aaagatgctc aatatgcaca aaccattgat tgttactact 120
gaaggtttat ccaagattga caatggtcct gtaaagcaaa ccgttgcttc attggaaaag 180
gctggcgttg actatgccgt atttactggc gctgaaccta accctaagat ccggaatgtt 240
caagctggta aaaagatgta ccaagatgaa aactgtgact caattattac tgttggtggg 300
ggttctgctc acgactgtgg taagggtatc ggtattgttt taactaacgg tgatgacatt 360
tccaagcttg ccggaattga aacattgaag aatccacttc caccattgat ggctgttaac 420
actactgccg gaactggttc tgaattaact cgtcacgctg ttattactaa cgaaaagact 480
catttgaagt ttgttgttgt ttcatggcgt aacattccat tggtatcatt caacgatcca 540
atgttgatgc ttgatattcc aaaagacatt accgctgcta ctggttgtga tgcttttgtt 600
caggctattg aaccatacgt ttctgttgac cataacccaa ttactgatag tcaatgtaaa 660
gaagctattc aattaattca aactgcttta ccagaagtag ttgctaatgg tcacaatatt 720
gaagcacgga ctaagatggt tgaagctgaa atgcttgccg gaatggcctt caataatgcc 780
aacttaggct atgttcacgc aatggctcac caactcggtg gtcaatatga tgctcctcat 840
ggtgtttgct gtgccttgct cttgaccact gttgaagaat ataacttaat cgcatgtcca 900
gagcggtttg ctgaattggc taaggtaatg ggctttgaca ctactggtct taccctttac 960
gaagcagcac aaaagtcaat tgacggtatg cgtgaaatgt gccggcttgt tggtattcca 1020
tcatcaatca aggaaattgg tgctaagcca gaagactttg aaatgatggc caagaatgcc 1080
ctcaaggatg gtaatgcctt ctctaaccca cgtaagggta ctgttgaaga tattgtaaag 1140
ctttatcaaa aggcttacga tggcatctac taa 1173
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tccaccacta gataaaatta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agctgaaatg cttgccggaa 20

Claims (5)

1.产3-羟基丙醛的重组菌的构建方法，包括如下步骤：敲除罗伊氏乳杆菌中的金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因和金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因；
所述金属离子依赖性脱氢酶pduQ基因为SEQ ID No.2所示的DNA分子；
所述金属离子依赖性脱氢酶ADH7基因为SEQ ID No.4所示的DNA分子；
所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CGMCC 1.3264。
2.按照权利要求1所述方法构建得到的产3-羟基丙醛的重组菌。
3.权利要求2所述的产3-羟基丙醛的重组菌在制备3-羟基丙醛中的应用。
4.权利要求2所述的产3-羟基丙醛的重组菌在提高3-羟基丙醛产量中的应用。
5.制备3-羟基丙醛的方法，包括如下步骤：将权利要求2所述的产3-羟基丙醛的重组菌进行发酵培养的步骤。
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Redox Balance in Lactobacillus reuteri DSM20016: Roles of Iron-Dependent Alcohol Dehydrogenases in Glucose/ Glycerol Metabolism.;Lu Chen等;PLoS ONE;摘要，第9-13页 *

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