KR102144997B1 - 락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 상기 변이체의 제조 방법 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 상기 변이체의 제조 방법 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법을 제공한다.

Description

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 상기 변이체의 제조 방법 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법{Lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide coding the mutant, yeast cell having the polynucleotide, method of the mutant, and method of producing the lactate using the same}

락테이트 데히드로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포, 상기 변이체의 제조 방법 및 이를 이용한 락테이트의 생산 방법에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도 락테이트 데히드로게나제 변이체, 및 이를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제공한다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체의 제조 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 효모 세포를 제공한다. 다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체 및/또는 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 효모 세포를 이용한 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체를 제공한다. 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1, 25, 27, 29, 31 또는 33의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.

상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 기질인 피루베이트와 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위(catalytic site)간의 거리를 단축시키도록 기질 결합 부위의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변이된 것일 수 있다. 일례로 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위는 서열번호 1에서 106번째 Arg, 169번째 Arg, 및 193번째 His일 수 있다. 또다른 일례로 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위는 서열번호 25에서 181번째 His, 서열번호 27에서 181번째 His, 서열번호 29에서 181번째 His, 서열번호 31에서 179번째 His, 또는 서열번호 33에서 179번째 His일 수 있다. 피루베이트와 상기 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위간의 거리를 단축시키도록 변이의 대상이 되는 아미노산 잔기는 서열번호 1에서 108번째 Asn일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 서열번호 1에서 108번째 Asn이 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 Asn을 교체시키는 아미노산은 Arg, Gly, Leu 및 Met으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 구체적으로는 상기 Asn을 교체하는 아미노산은 Gly 또는 Leu일 수 있다.

또한, 락테이트 데히드로게나제 변이체는 양성자 공여체(proton donor) 잔기(residue)의 pKa가 증가되도록 하나 이상의 아미노산 잔기가 변이된 것일 수 있다. 일례로, 서열번호 1의 193번째 His, 서열번호 25의 181번째 His, 서열번호 27의 181번째 His, 서열번호 29의 181번째 His, 서열번호 31의 179번째 His, 또는 서열번호 33의 179번째 His의 pKa 값을 증가시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기가 변이된 것일 수 있다. 상기 서열번호 1의 193번째 His의 pKa값을 증가시키도록 변이의 대상이 되는 아미노산 잔기는 서열번호 1에서 108번째 Asn일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 서열번호 1에서 108번째 Asn이 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 Asn을 교체시키는 아미노산은 Arg, Gly, Leu 및 Met으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 구체적으로는 상기 비극성 아미노산은 Gly 또는 Leu일 수 있다.

락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase, LDH) 또는 그의 변이체는 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 피루베이트에 작용할 수 있으며, L-락테이트 또는 D-락테이트에 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 보스 타우루스 (Bos Taurus), 또는 보스 인디커스 (Bos Indicus) 유래일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제의 GenBank Accession number는 AAI46211.1이고, GI는 148878492일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 보스 타우루스 (Bos Taurus)에서 유래한 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 유래일 수 있고, 서열번호 25의 아미노산 서열을 갖고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열 (GenBank: D12591.1)을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) 유래일 수 있고, 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열 (GenBank: M33585.1)을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 유래일 수 있고, 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열 (GenBank: M22305.1)을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 락토바실러스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus) 유래일 수 있고, 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열 (GenBank: Z81318.1)을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 또는 그의 변이체는 페디오코커스 아시딜락티시 (Pediococcus acidilactici) 유래일 수 있고, 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖고, 이를 코딩하는 유전자는 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열 (GenBank: X70927.1)을 갖는 것일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성 (specific activity)보다 개선된 비활성을 갖도록 변형된 것일 수 있다. 상기 변이체의 비활성은 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 비활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 일례로 서열번호 1의 락테이트 데히드로게나제 변이체는 비변형된 락테이트 데히드로게나제보다 0.020 U/mg 이상, 0.025 U/mg 이상, 0.030 U/mg 이상, 또는 약 0.033 U/mg 이상 증가된 비활성을 가질 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체는 비변형된 락테이트 데히드로게나제의 Km 또는 Kcat보다 개선된 Km 또는 Kcat을 갖도록 변형된 것일 수 있다. 상기 변이체의 Km은 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 Km보다 예를 들면 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배 이상의 증가된 값을 가질 수 있다.. 상기 변이체의 Kcat은 비-변형된 락테이트 데히드로게나제의 Kcat보다 예를 들면 약 1.5배, 약 2배, 또는 약 2.5배 이상의 증가된 값을 가질 수 있다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

다른 양상은 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터, 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 또한 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다.

다른 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제 변이체의 제조 방법을 제공한다.

상기 제조 방법은 피루베이트와 락테이트 데히드로게나제의 촉매 부위 (catalytic site)간의 거리를 단축시키도록 하나 이상의 아미노산 잔기를 변이시키는 단계를 포함한다. 또한 상기 제조 방법은 양성자 공여체 잔기의 pKa가 증가되도록 하나 이상의 아미노산 잔기를 변이시키는 단계를 포함한다. 상기 아미노산 잔기에 관해서는 상술한 바와 같다.

다른 양상은 피루베이트로부터 락테이트로의 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다.

상기 세포는 효모 세포일 수 있으며, 일례로 자낭균류 (ascomycota)일 수 있다. 상기 자낭균류는 사카로미세타시에 (saccharomycetaceae) 일 수 있다. 상기 사카로미세타시에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 캔디다 (Candida) 속, 피치아 (Pichia) 속, 이사첸키아 (Issatchenkia) 속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 속, 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 서모톨러란스 (Kluyveromyces thermotolerans)일 수 있다. 캔디다 속은 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata)일 수 있다. 자이고사카로마이세스 속은 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailli) 또는 자이고사카로마이세스 룩시이 (Zygosaccharomyces rouxii)일 수 있다.

상기 효모 세포는 비-천연 효모 세포를 포함할 수 있다. 용어 "비-천연"은 기준 종의 야생형 균주를 포함하여, 상기 기준 종의 천연 균주에서 통상적으로 발견되지 않는 하나 이상의 유전자 변경을 가짐을 의미한다. 유전자 변경은 예를 들면 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 도입, 다른 뉴클레오티드의 첨가, 뉴클레오티드의 결실 및/또는 상기 효모 세포 유전 물질의 다른 작용성 파괴의 변형들을 포함한다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 기준 종들에 대한 이종, 동종, 또는 이종 및 동종 모두의 폴리펩티드에 대한 코딩 부위 및 그의 작용성 단편을 포함한다. 추가적인 변형은 예를 들어 상기 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 부위를 포함한다. 예시적인 대사 폴리펩티드는 락테이트를 포함한 락테이트에 대한 생합성 경로 내의 효소 또는 단백질을 포함한다. 따라서, 비-천연 효모 세포는 대사 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 그의 작용성 단편에 대한 유전자 변형을 포함할 수 있다.

상기 효모 세포는 상기한 락테이트 데히드로게나제 변이체를 발현할 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트로부터 락테이트로의 전환 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 활성의 증가는 모균주보다 상기 피루베이트로부터 락테이트로의 전환 활성이 높다는 것을 의미하며, 모균주는 효모 세포의 기원이 되는 균주를 의미할 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 피루베이트로부터 락테이트로의 전환을 촉매하는 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 활성은 대조군 대비 약 5.0% 이상, 약 5.5% 이상, 약 6.0% 이상, 약 6.5%이상, 약 7.0%이상, 약 7.5% 이상, 약 8.0% 이상, 약 8.5% 이상, 약 9.0% 이상, 약 9.5%이상, 약 10.0%이상, 약 10.5% 이상, 약 11.0% 이상, 약 11.5% 이상, 약 12.0% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13.0% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14.0% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15.0% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16.0% 이상, 또는 약 16.5% 이상의 락테이트 생산성을 갖도록 증가된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 조작된 상기 효모 세포에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다. 상기 활성은 적절한 대조군 종에 비하여, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 불활성화 또는 감소는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 선별 마커는 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　

피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1, pdc2, pdc5, 또는 pdc6일 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

용어 "배양", "발효", 또는 "발효적으로 생산"은 상호교환적으로 사용되며, 이는 균주의 성장 및/또는 원하는 생성물인 락테이트의 생산을 위해서 사용되는 것인 탄소 공급원을 포함한 적절한 성장 배양 배지 상에서 균주를 성장시키는 것을 의미한다. 상기 적절한 배지는 균주의 배양 및 성장에 적절한 배지이다. 그러한 배지는 배양시키고자 하는 균주에 따라 균주의 발효 분야에서 주지되어 있다. 적절한 배양 배지는 균주에 의해 대사될 수 있는 임의의 탄소 공급원을 의미하는 탄소의 공급원을 포함한다. 상기 대사는 균주가 성장할 수 있거나 적어도 생명을 유지할 수 있게 해주는 에너지 및 물질의 변환을 의미한다.

상기 배양에서 세포는 배치식, 유가식 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양한다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 또는 무기질소화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포에 의하면, 락테이트 생산능을 가질 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트 데히드로게나제 변이체의 제조 방법에 따르면, 효율적인 락테이트 생산능을 가지는 변이체를 제조할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 pRS416 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다.
도 3은 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.
도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 효모 세포의 락테이트를 생산하는 경로에 대한 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. homology modeling 을 통한 락테이트 데히드로게나제 변이체의 선별

(1.1) 효소 구조 예측

보스 타우루스 (Bos taurus) 유래의 락테이트 데히드로게나제(BtLDH)의 구조를 Discovery studio 3.5 소프트웨어 (Accelrys Inc.)를 이용한 homology modeling으로 예측하였다. homology modeling은 이미 구조가 알려져 있는 주형(template) 단백질의 구조를 바탕으로 새로운 단백질의 구조를 예측하는 방법으로, Squalus acanthias 유래의 L-LDH (PDB database ID: 3LDH,Mol.Biol. 102 (1976): 759-779 ) 구조를 주형으로 하여 야생형 BtLDH의 구조를 예측하였다. 그 결과 예측된 야생형 BtLDH의 구조는 Discovery Studio 3.5를 이용해 에너지 최소화 (energy minimization)하여 BtLDH의 야생형 구조를 더 안정되게 예측하였다. 야생형BtLDH의 구조를 이용하여 Discovery Studio 3.5의 "build mutant" 옵션으로 BtLDH의 변이체의 구조를 예측하고, 상술한 방법과 동일하게 BtLDH 변이체의 구조를 에너지 최소화하여 더 안정된 구조를 예측하였다. 상기 변이체는 야생형 BtLDH의 108번 잔기를 다른 아미노산으로 각각 바꾸어 19개의 변이체를 생성하였다. 표 1에 BtLDH의 변이체를 나타내었다.

(1.2) 락테이트 데히드로게나제 변이체의 촉매 부위와 피루베이트간의 거리 측정

예측한 락테이트 데히드로게나제의 변이체 구조 중에서 락테이트 데히드로게나제의 리간드인 피루베이트와 상기 변이체의 촉매 부위 (catalytic site)인 106번, 193번 및 169번 잔기 간의 거리를 각각 측정하였다. 표 1에 BtLDH의 변이체의 촉매 부위와 피루베이트간의 거리를 나타내었다. 상기 피루베이트와 상기 잔기 간의 거리가 야생형 락테이트 데히드로게나제의 거리보다 근접할수록 피루베이트와 락테이트 데히드로게나제 간의 강한 결합이 가능하여 락테이트 데히드로게나제 변이체의 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성이 유리할 것으로 예상된다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 락테이트 데히드로게나제 변이체 Asn108Gly, Asn108Leu, Asn108Arg, 및 Asn108Met의 경우 피루베이트와 변이체의 106번째 잔기인 Arg간의 거리(d106), 피루베이트와 변이체의 193번째 잔기인 His 간의 거리(d193), 및 피루베이트와 변이체의 169번째 잔기인 Arg간의 거리(d169)가 모두 야생형 락테이트 데히드로게나제의 거리(각각 6.48, 5.04, 및 4,49)보다 근접하였다.

(1.3) 락테이트 데히드로게나제 변이체 중 His193 의 pKa 예측

표 1에 나타낸 변이체의 구조와 야생형의 구조 중에서, 활성 부위(active site)로 양성자 공여자(proton donor) 역할을 하는 His193의 pKa 값을 Discovery Studio 3.5 소프트웨어(Accelrys Inc.)를 이용하여 예측하였다. 상기 His193의 pKa가 높아지면 양성자를 더 잘 방출할 수 있으므로 락테이트 데히드로게나제 변이체의 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 활성이 유리할 것으로 예상된다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 락테이트 데히드로게나제 변이체 Asn108Gly, Asn108Leu, Asn108Ala, Asn108Asp, Asn108Gln, Asn108Glu, Asn108His, Asn108Phe, Asn108Ser, Asn108Trp, 및 Asn108Tyr의 경우 피루베이트와 변이체 중 His193의 pKa가 야생형 락테이트 데히드로게나제 중 His193의 pKa보다 높았다.

실시예 1.2 및 1.3에 나타난 결과로부터 락테이드 데히드로게나제 변이체의 촉매 부위와 피루베이트간의 거리가 가까울 뿐만 아니라 변이체 중 His193의 pKa가 높은 변이체는 상기 변이체의 108번째 잔기가 Gly 또는 Leu로 치환된 것임을 알 수 있다.

Pyr과의 거리 Asn108 변이체	d106 (Å)	d193 (Å)	d169 (Å)	His193의 pK
Asn(W/T)	6.48	5.04	4.49	5.93
Ala	6.08	4.17	4.71	5.99
Arg	6.42	4.27	4.48	5.73
Asp	6.32	4.28	4.54	6.09
Cys	6.52	4.26	4.36	5.86
Gln	6.26	4.31	4.54	5.97
Glu	6.25	4.25	4.56	6.46
Gly	6.42	4.31	4.43	6.07
His	6.40	4.25	4.49	6.00
Ile	6.32	4.21	4.51	5.79
Leu	6.41	4.26	4.47	6.15
Lys	6.68	4.24	4.45	5.89
Met	6.41	4.22	4.41	5.81
Phe	6.11	4.22	4.72	5.96
Pro	6.11	4.22	4.70	5.49
Ser	6.57	4.22	4.45	6.04
Thr	6.01	4.22	4.93	5.92
Trp	6.37	4.21	4.52	6.10
Tyr	6.45	4.29	4.57	6.15
Val	6.63	4.24	4.34	5.86

실시예 2. 락테이트 생산을 위한 락테이트 데히드로게나제 (L- LDH ) 발현 벡터의 제작

야생형 락테이트 데히드로 게나제 또는 락테이트 데히드로게나제 (L-LDH) 변이체를 도입하기 위한 카세트를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애에서 유전자 발현을 유도한다고 알려진 CCW12 유전자의 프로모터 부분 (CCW12p)을 클로닝하기 위해 사카로 마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, 유전자형: MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3ㅿ1; MAL2-8^C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9와 10의 프라이머를 사용하여 PCR (98℃ 5분, 30번 반복으로 98℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 수행 후 72℃ 1분)을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 pRS416 벡터(ATCC^®87521™에 도입하여 pRS416-CCW12p를 제작하였다. 도 1은 pRS416 벡터를 나타낸 도면이다.

보스 타우루스 (Bos Taurus)의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 11과 12의 프라이머 서열을 이용하여 PCR하여 서열번호 2의 야생형의 락테이트 데히드로게나제 유전자를 증폭하였다. 수득된 락테이트 데히드로게나제 야생형을 코딩하는 유전자를 제한효소 EcoR1/SalI를 이용하여 pRS416-CCW12p에 도입하여 pRS416-CCW12p-BtLDH_wt를 제작하였다.

또한, 수득된 야생형의 락테이트 데히드로게나제 유전자를 주형으로 하여 부위 지정 돌연변이 유발(site direct mutagenesis)을 하여 각각 락테이트 데히드로게나제의 변이체인 BtLDH(N108G) 및 BtLDH(N108L)를 코딩하는 유전자(Btldh_M)를 수득하였다. 상기 변이체 유전자의 서열번호는 각각 서열번호 5 또는 6이다. 상기 변이체를 코딩하는 유전자 각각을 제한효소 EcoR1/SalI를 사용하여 pRS416-CCW12p에 도입하여 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108G) 및 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108L)을 각각 제작하였다.

실시예 3. PDC1 유전자 결실 카세트 제작

피루베이트로부터 에탄올을 생산하는데 관여하는 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase 1, PDC1)을 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 유전자 결실 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

항생제 마커를 사용하기 위하여 상기 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae, CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 13과 14의 프라이머를 사용하여 Gal10 터미네이터 (Gal10t) PCR절편을 제작한 후 NotI으로 절단하고 이를 pGEM-5Zf (Promega USA)에 도입하여 pGEM-Gal10t를 제작하였다.

또한 서열번호 15와 16을 사용하여 PDC 프로모터 (PDCp)를 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae , CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후 제작된 절편을 EcoRI으로 절단하고 이를 동일한 EcoRI으로 절단된 pGEM-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-Gal10t을 제작하였다. 도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 제네티신 항생제 저항성 유전자인 NPT를 삽입하여 과발현하기 위하여 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터를 제작하였다.

그 후, 서열번호 17과 18의 프라이머를 사용하여 제네티신 (G418) 항생제에 내성을 갖게 할 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neomycin phosphotransferase, NPT) 유전자를 pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen 社)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후, 수득된 절편을 XhoI과 BamHI으로 절단하고 이를 동일한 제한효소로 절단된 pGEM-PDCp-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t을 제작하였다. 도 3은 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t를 주형으로 하고, 하기 서열번호 19와 20의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

실시예 4. PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

사카로마이세스 세레비지애에서 PDC1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 도 4는 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이 균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여, 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수득한 다음, 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 재현탁한 세포를 수득한 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

PDC1 제거를 위해 실시예 3에서 제작된 PDC1 유전자 결실카세트 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD 고체 배지에 옮겼다. 이와 동시에, 동일한 성분의 액체 배지에 선별된 콜로니를 배양한 후 배양한 콜로니로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 변이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PDC1 결실을 확인하기 위해 하기 서열번호 21과 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PDC1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)를 수득하였다.

실시예 5. PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 L- LDH 발현 벡터 도입된 균주 제작

실시예 2에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108G) 및 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108L) 각각을 실시예 4의 PDC1이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1) 균주에 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

실시예 2에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108G)를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 BtLDH(N108G)를 포함한 플라스미드를 확인하기 위해 서열번호 23과 24의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 pRS416-CCW12- BtLDH(N108G)임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ BtLDH(N108G))를 수득하였다.

또한, 실시예 2에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDH(N108L)를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDH(N108L))를 수득하였다. 또한, 실시예 2에서 제작한 pRS416-CCW12p-BtLDHwt도 상기와 같은 방법으로 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)에 형질전환하여, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+BtLDHwt)를 수득하였다.

실시예 6. L- LDH 변이체가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용한 L-락 테이 트 생산

실시예 5에서 제작된 야생형, BtLDH(N108G) 및 BtLDH(N108L) 변이체를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주를 각각 YSD (-ura) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YSD (-ura)에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

발효는 상기의 각 50 ml의 배양액 내의 세포 농도를 분광광도계를 이용하여 광학 밀도 (optical density, OD)가 약 600 nm에서 약 5.0이 되는 양을 정량한 후, 원심분리하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 약 40 g/L 포도당이 포함된 새로운 약 50 ml의 YSD (-ura)에 다시 접종하여 실시하였다. 약 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 약 30℃에서 약 8시간 동안 배양하여 세포를 각각 발효하였다. 초기에 제공한 당은 80 g이었으며, 세포가 초기에 제공한 당을 거의 다 소비한 경우, 약 17시간 후에 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하였다. 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 락테이트, 글리세롤, 및 에탄올의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다. 수율은 락테이트(g)를 초기에 제공한 당(g)으로 나눈 값의 백분율로 나타내었다.

표 2에 나타낸 바와 같이, BtLDH(N108G) 발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ BtLDH(N108G)) 균주는 약 10.97 g/L의 생산성을 나타내고, 13.49%의 수율을 나타내어 야생형 L-LDH(BtLDH)가 도입된 균주보다 향상된 락테이트 생산성 및 수율을 나타내었다. 또한 상기 균주는 글리세롤 및 에탄올의 낮은 생산성을 나타내었다.

또한, BtLDH(N108L) 발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+ BtLDH(N108L)) 균주는 약 10.10 g/L의 생산성을 나타내고, 12.55%의 수율을 나타내어 야생형 L-LDH(BtLDH)가 도입된 균주보다 향상된 락테이트 생산성 및 수율을 나타내었다. 또한 상기 균주는 글리세롤 및 에탄올의 낮은 생산성을 나타내었다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN. PK2 -1D (ㅿ PDC1 ) 균주에 도입된 벡터	락테이트 (g/L)	수율 % (g/g)	글리세롤 (g/L)	EtOH (g/L)
btLDH 야생형	9.40	11.68	2.31	32.28
btLDH(N108G)	10.97	13.49	2.15	31.23
btLDH(N108L)	10.10	12.55	2.08	31.67

실시예 7. 락테이트 데히드로게나제 변이체의 활성 평가

실시예 2에서 제작한 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 그 변이체 발현 벡터를 히스티딘 태그를 가진 E. coli에서 발현시키고 TALON® metal affinity resin (Clontech, Inc.)에 의해 정제하였다. 그 후 야생형 락테이트 데히드로게나제 및 그 변이체의 비활성 (specific activity)을 측정하여 표 3에 나타내었다. 또한, 실시예 6에서 높은 락테이트 생산성을 나타낸 btLDH(N108G)의 Km 및 Kcat도 측정하여 표 4에 나타내었다. 비활성, Km, 및 Kcat은 Microbiology 1994 140:2077-2084에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

표 3에 나타낸 바와 같이 BtLDH(N108G)의 비활성은 pH 7.5에서 약 0.167 U/mg로, 대조군인 야생형 BtLDH의 비활성에 비하여 약 24.6% 증가하였다. 또한 BtLDH(N108L)의 비활성은 pH 7.5에서 약 0.156 U/mg로, 대조군인 야생형 BtLDH의 비활성에 비하여 약 11.6% 증가하였다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제 BtLDH(N108G)는 pH 5.2와 같은 작은 pH에서 더 높은 비활성을 나타내었으며, 야생형 락테이트 데히드로게나제의 pH변화에 따른 비활성 값의 변화량보다 작은 비활성 값의 변화량을 나타내었다.

효소	비활성 (U/ mg , pH 7.5)
야생형 BtLDH	0.134
BtLDH(N108G)	0.167
BtLDH(N108L)	0.156

또한, 표 4에 나타낸 바와 같이 BtLDH(N108G)의 Km 및 Kcat은 각각 약 0.48 mM 및 2279 /min로, 대조군인 야생형 BtLDH의 Km 및 Kcat에 비하여 약 4.36배 및 약 2.76배 증가하였다.

효소	Km (mM)	Kcat (/min)
야생형 BtLDH	0.11	826
BtLDH(N108G)	0.48	2279

<110> Samsung Electronic Co. Ltd <120> Lactate dehydrogenase mutant, polynucleotide coding the mutant, yeast cell having the polynucleotide, method of the mutant, and method of producing the lactate using the same <130> PN102303 <160> 34 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 1 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 2 <211> 999 <212> DNA <213> Bos Taurus <400> 2 atggcaacat taaaagatca actaatccag aatttgttga aagaggagca tgttccacaa 60 aacaaaatca caatcgtcgg cgtaggtgca gtaggtatgg cttgtgccat atccatcttg 120 atgaaagact tagctgatga ggtcgcgctg gttgatgtaa tggaggacaa acttaaagga 180 gaaatgatgg atcttcaaca tggttcactc tttttgagaa ctcctaaaat tgtatccggg 240 aaagattata acgttaccgc caattctaga cttgttataa tcacggctgg tgcaagacaa 300 caggaaggcg aatcaagact taacttagtt cagagaaacg taaacatttt caagtttatc 360 atcccaaata ttgtaaaata ctccccaaat tgcaagttgc tggttgtttc aaatcctgtt 420 gacatattga cttacgttgc ttggaagatt tcaggtttcc caaagaatag agtaatcgga 480 tctggttgca atctcgattc tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt 540 catccattga gttgtcacgg atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt 600 tggtcaggtg tcaacgtagc aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca 660 gatgccgaca aggaacaatg gaaggccgtc cacaaacaag tggtggattc tgcctacgaa 720 gtcatcaaat tgaagggcta cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct 780 gaatcaataa tgaaaaacct ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta 840 tacgggatca aggaagatgt ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt 900 tctgacgttg ttaaagtgac acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca 960 gacaccttat ggggcatcca aaaggaatta caattctaa 999 <210> 3 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 3 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Gly Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 4 <211> 332 <212> PRT <213> Bos Taurus <400> 4 Met Ala Thr Leu Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Ile Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Met Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Asn Val Thr Ala Asn Ser Arg Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Leu Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Ala Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr His Glu Glu Glu Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 5 <211> 999 <212> DNA <213> Bos Taurus <400> 5 atggcaacat taaaagatca actaatccag aatttgttga aagaggagca tgttccacaa 60 aacaaaatca caatcgtcgg cgtaggtgca gtaggtatgg cttgtgccat atccatcttg 120 atgaaagact tagctgatga ggtcgcgctg gttgatgtaa tggaggacaa acttaaagga 180 gaaatgatgg atcttcaaca tggttcactc tttttgagaa ctcctaaaat tgtatccggg 240 aaagattata acgttaccgc caattctaga cttgttataa tcacggctgg tgcaagacaa 300 caggaaggcg aatcaagact tggcttagtt cagagaaacg taaacatttt caagtttatc 360 atcccaaata ttgtaaaata ctccccaaat tgcaagttgc tggttgtttc aaatcctgtt 420 gacatattga cttacgttgc ttggaagatt tcaggtttcc caaagaatag agtaatcgga 480 tctggttgca atctcgattc tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt 540 catccattga gttgtcacgg atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt 600 tggtcaggtg tcaacgtagc aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca 660 gatgccgaca aggaacaatg gaaggccgtc cacaaacaag tggtggattc tgcctacgaa 720 gtcatcaaat tgaagggcta cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct 780 gaatcaataa tgaaaaacct ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta 840 tacgggatca aggaagatgt ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt 900 tctgacgttg ttaaagtgac acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca 960 gacaccttat ggggcatcca aaaggaatta caattctaa 999 <210> 6 <211> 999 <212> DNA <213> Bos Taurus <400> 6 atggcaacat taaaagatca actaatccag aatttgttga aagaggagca tgttccacaa 60 aacaaaatca caatcgtcgg cgtaggtgca gtaggtatgg cttgtgccat atccatcttg 120 atgaaagact tagctgatga ggtcgcgctg gttgatgtaa tggaggacaa acttaaagga 180 gaaatgatgg atcttcaaca tggttcactc tttttgagaa ctcctaaaat tgtatccggg 240 aaagattata acgttaccgc caattctaga cttgttataa tcacggctgg tgcaagacaa 300 caggaaggcg aatcaagact tttattagtt cagagaaacg taaacatttt caagtttatc 360 atcccaaata ttgtaaaata ctccccaaat tgcaagttgc tggttgtttc aaatcctgtt 420 gacatattga cttacgttgc ttggaagatt tcaggtttcc caaagaatag agtaatcgga 480 tctggttgca atctcgattc tgctcgtttt aggtatctga tgggtgaaag attaggggtt 540 catccattga gttgtcacgg atggattcta ggtgaacatg gagatagttc tgtgcctgtt 600 tggtcaggtg tcaacgtagc aggtgtctct ttgaaaaatc tacacccaga actaggaaca 660 gatgccgaca aggaacaatg gaaggccgtc cacaaacaag tggtggattc tgcctacgaa 720 gtcatcaaat tgaagggcta cacatcttgg gcaattggct tatccgtcgc tgatctggct 780 gaatcaataa tgaaaaacct ccgtagagtg catcctataa gtactatgat taagggttta 840 tacgggatca aggaagatgt ttttctatct gtgccatgta ttttgggcca aaatggaatt 900 tctgacgttg ttaaagtgac acttactcat gaagaggaag cgtgtttgaa aaagagcgca 960 gacaccttat ggggcatcca aaaggaatta caattctaa 999 <210> 7 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 8 <211> 1692 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60 accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccaatat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta cgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga ggttatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 11 aattgaattc atggcaacat taaaagatca acta 34 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 aattgtcgac ttagaattgt aattcctttt ggatg 35 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 13 gcggccgcga attcggatcc gtagatacat tgatgctatc 40 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 gcggccgctc cgcggctcgt gctatattc 29 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 gaattcaaca agctcatgca aag 23 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 gaattcctcg aggatttgac tgtgtta 27 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 17 ccgctcgaga tgattgaaca agatgg 26 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 cgcggatcct cagaagaact cgtcaag 27 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 19 aagatctacg aagttgaagg tatgagatgg gctggtaacg taatacgact cactataggg 60 60 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 20 gcttccttaa cttctggctt ggacaaggta ccgacgtaaa aacaagctca tgcaaagagg 60 t 61 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 21 gctcttctct accctgtcat tc 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 tagtgtacag ggtgtcgtat ct 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 23 actaaaggga acaaaagctg g 21 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 24 gacataacta attacatgac tcga 24 <210> 25 <211> 326 <212> PRT <213> Lactobacillus casei <400> 25 Met Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly 1 5 10 15 Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly 20 25 30 Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys 35 40 45 Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys 50 55 60 Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp 85 90 95 Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile 100 105 110 Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val 115 120 125 Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn 130 135 140 Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr 165 170 175 Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala 180 185 190 Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu 195 200 205 Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala 210 215 220 Ala Tyr Glu Ile Ile Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala 225 230 235 240 Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala 245 250 255 Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp 260 265 270 Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn 275 280 285 Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys 290 295 300 Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Val Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn 305 310 315 320 Asp Ile Glu Thr Arg Gln 325 <210> 26 <211> 1364 <212> DNA <213> Lactobacillus casei <400> 26 aagcttttag tcctcgtgaa aatcgctcat gcaagcgttt tcgttcctga aagcgagctt 60 gtcacaggat tcacaagtct tgctattgta aggctgagcg cgacttttta accatggcaa 120 aattatgaaa aagtctgtga attttgttcc ggcgaattga taatgtgtta tactcacaat 180 gaaatgcagt ttgcatgcac ataagaaagg atgatatcac cgtggcaagt attacggata 240 aggatcacca aaaagttatt ctcgttggtg acggcgccgt tggttcaagt tatgcctatg 300 caatggtatt gcaaggtatt gcacaagaaa tcgggatcgt tgacattttt aaggacaaga 360 cgaagggtga cgcgattgac ttatcgaacg cgctgccatt caccagccca aagaagattt 420 attcagctga atacagcgat gccaaggatg ctgatctggt tgttatcact gctggtgctc 480 ctcagaagcc aggcgaaacc cgcttggatc tggttaacaa gaacttgaag atcttgaagt 540 ccattgttga tccgattgtg gattctggct ttaacggtat cttcttggtt gctgccaacc 600 cagttgatat cttgacctat gcaacttgga aactttccgg cttcccgaag aaccgggttg 660 ttggttcagg tacttcattg gataccgcac gtttccgtca gtccattgct gaaatggtta 720 acgttgatgc acgttcggtc catgcttaca tcatgggtga acatggtgac actgaattcc 780 ctgtatggtc acacgctaac atcggtggcg ttactattgc cgaatgggtt aaagcacatc 840 cggaaatcaa ggaagacaag cttgttaaga tgtttgaaga cgttcgtgac gctgcttacg 900 aaatcatcaa actcaagggc gcaaccttct atggtatcgc aactgctttg gcacgtatct 960 ccaaggctat cctgaacgat gaaaatgctg ttctgccact gtccgtttac atggatggtc 1020 aatatggctt gaacgacatc tacatcggta ccccagctgt gatcaaccga aatggtatcc 1080 agaacattct ggaaattcca ttgaccgacc acgaagagga atccatgcag aaatctgctt 1140 cacaattgaa gaaggttctg actgatgcct tcgcgaagaa cgacatcgaa acccgtcagt 1200 aatcatcatc atgactgagt ctagaacagc cgggcaactg cccggttgtt ctttttttaa 1260 tctcgaaaat gattagggac tttagcgcat ttctctcgct tggcagcatc ctgaaagtat 1320 aatgtttttt taaagttgtc agatgccgtc cgctaatggt taac 1364 <210> 27 <211> 320 <212> PRT <213> Bifidobacterium longum <400> 27 Met Ala Glu Thr Thr Val Lys Pro Thr Lys Leu Ala Val Ile Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Val Gly Ser Thr Leu Ala Phe Ala Ala Ala Gln Arg Gly Ile 20 25 30 Ala Arg Glu Ile Val Leu Glu Asp Ile Ala Lys Glu Arg Val Glu Ala 35 40 45 Glu Val Leu Asp Met Gln His Gly Ser Ser Phe Tyr Pro Thr Val Ser 50 55 60 Ile Asp Gly Ser Asp Asp Pro Glu Ile Cys Arg Asp Ala Asp Met Val 65 70 75 80 Val Ile Thr Ala Gly Pro Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Arg Leu Glu 85 90 95 Leu Val Gly Ala Thr Val Asn Ile Leu Lys Ala Ile Met Pro Asn Leu 100 105 110 Val Lys Val Ala Pro Asn Ala Ile Tyr Met Leu Ile Thr Asn Pro Val 115 120 125 Asp Ile Ala Thr His Val Ala Gln Lys Leu Thr Gly Leu Pro Glu Asn 130 135 140 Gln Ile Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Asp Ser Ala Arg Leu Arg Phe 145 150 155 160 Leu Ile Ala Gln Gln Thr Gly Val Asn Val Lys Asn Val His Ala Tyr 165 170 175 Ile Ala Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Val Pro Leu Trp Glu Ser Ala 180 185 190 Thr Ile Gly Gly Val Pro Met Cys Asp Trp Thr Pro Leu Pro Gly His 195 200 205 Asp Pro Leu Asp Ala Asp Lys Arg Glu Glu Ile His Gln Glu Val Lys 210 215 220 Asn Ala Ala Tyr Lys Ile Ile Asn Gly Lys Gly Ala Thr Asn Tyr Ala 225 230 235 240 Ile Gly Met Ser Gly Val Asp Ile Ile Glu Ala Val Leu His Asp Thr 245 250 255 Asn Arg Ile Leu Pro Val Ser Ser Met Leu Lys Asp Phe His Gly Ile 260 265 270 Ser Asp Ile Cys Met Ser Val Pro Thr Leu Leu Asn Arg Gln Gly Val 275 280 285 Asn Asn Thr Ile Asn Thr Pro Val Ser Asp Lys Glu Leu Ala Ala Leu 290 295 300 Lys Arg Ser Ala Glu Thr Leu Lys Glu Thr Ala Ala Gln Phe Gly Phe 305 310 315 320 <210> 28 <211> 1767 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <400> 28 gtcgacgcgg tcaatgacgt gttggcggac atcgaaggca cggcctcgat tccgcgtatt 60 ctcgtattca acaaggccga tcaggcggac gaggcgactc gtgaacgact cgccgcgctg 120 cagccagatg cgttcatcgt ctccgcctat accggtgagg gattggacga gctgcgtacc 180 gcggtcgaaa gtctgctgcc ggtcccgcat gtgcatgtca acgctctgct gccgtatacc 240 gctggctccc tgatctctcg tgtacgcgaa tacggcaagg tagacaaggt ggagtaccgc 300 gatgatggca tacagcttga agcggacgtt gatgcccatc ttgcgctcag gtggtcgaac 360 agtccattga ctaacgtgat aaacatcaca gtatattcgt gagcgctaac aaccgttgaa 420 aacattacca tacggttgtc aaacagggtg gtgtgccggt agcaaaacgt cttagcgggt 480 ttatagagtg aagacgttag ttacaaggcc tgccattcat cagcagaccg cctttgaaga 540 gaggttcatc catcatggcg gaaactaccg ttaagcccac gaagcttgct gttattggtg 600 ccggtgccgt tggctccacc ctcgccttcg ccgctgccca gcgtggcatc gctcgcgaga 660 tcgtgcttga agacatcgcc aaggagcgcg tggaagccga agtgctcgac atgcagcatg 720 gctccagctt ctacccgacc gtgtccatcg acggttccga cgatcctgag atctgccgcg 780 acgccgacat ggtcgtcatc accgctggtc cgcgtcagaa gccgggtcag tctcgtcttg 840 agctcgttgg cgctaccgtc aacatcctca aggccatcat gccgaacctg gtcaaggtgg 900 ctccgaacgc catctacatg ctcatcacca acccggtcga catcgctacc cacgtggctc 960 agaagctcac cggtctgccc gagaaccaga tcttcggttc cggcaccaac ctggactccg 1020 ctcgtctgcg cttcctgatt gcccagcaga ccggcgtcaa cgtcaagaac gtgcacgcct 1080 acatcgccgg cgagcacggc gactccgaag tcccgctgtg ggagtccgcc accatcggtg 1140 gcgtccccat gtgcgactgg accccgctgc ccggccacga tccgctcgac gccgacaagc 1200 gcgaggagat ccaccaggaa gtcaagaacg ccgcttacaa gatcatcaac ggtaagggtg 1260 ccaccaacta cgccatcggc atgtccggcg tcgacatcat cgaagccgtc ctgcacgaca 1320 ccaaccgcat tctgcccgtg agctccatgc tcaaggactt ccacggcatc tccgacatct 1380 gcatgtccgt gccgaccctc ctcaaccgtc agggcgtcaa caacaccatc aacaccccgg 1440 tctccgacaa ggagctcgcc gctctgaagc gctctgccga gacgctgaag gaaaccgccg 1500 cccagttcgg cttctgataa aaaatcgctg tacggagcgc ctttcgcacc gcagcaagac 1560 tcgacctacc tttgtaggcc ttcaccttgt gcggcacgaa aatcgcacac gtacagcgat 1620 tttttatacc ctgctgaatg ctcccgttgg gagcattttt tattcgtgga gttcgttgga 1680 ggagggggag ctatagccct cgggctcgag ctggaaggtg gtgtggggga ccgagaccgg 1740 gaagtgctcg cgcaggcaat cctgcag 1767 <210> 29 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 29 Met Lys Thr Gln Phe Thr Pro Lys Thr Arg Lys Val Ala Val Ile Gly 1 5 10 15 Thr Gly Phe Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Met Val Asn Gln Gly 20 25 30 Ile Ala Asn Glu Leu Val Leu Ile Asp Met Asn Lys Glu Lys Ala Glu 35 40 45 Gly Glu Ala Arg Asp Ile Asn His Gly Met Pro Phe Ala Thr Pro Met 50 55 60 Lys Ile Trp Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Ala 65 70 75 80 Val Ile Thr Ala Gly Ala Asn Gln Ala Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp 85 90 95 Leu Val Glu Lys Asn Val Lys Ile Phe Glu Cys Ile Val Lys Asp Ile 100 105 110 Met Asn Ser Gly Phe Asp Gly Ile Ile Leu Val Ala Thr Asn Pro Val 115 120 125 Asp Ile Leu Ala His Val Thr Gln Lys Val Ser Gly Leu Pro Asn Gly 130 135 140 Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr 145 150 155 160 Leu Leu Ser Asp Tyr Phe Glu Val Asp Ser Arg Asn Val His Ala Tyr 165 170 175 Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala 180 185 190 Gln Ile Gly Gly Val Lys Leu Glu His Phe Ile Asn Thr Ala Ala Ile 195 200 205 Glu Lys Glu Pro Asp Met Gln His Leu Phe Glu Gln Thr Arg Asp Ala 210 215 220 Ala Tyr His Ile Ile Asn Arg Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly Ile Ala 225 230 235 240 Met Gly Leu Val Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ser 245 250 255 Ile Leu Thr Val Ser Ala Leu Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Ile Ser Asp 260 265 270 Val Tyr Ile Gly Val Pro Ala Ile Ile Asn Lys Asn Gly Val Arg Gln 275 280 285 Ile Ile Glu Leu Asn Leu Thr Pro His Glu Gln Gln Gln Leu Glu His 290 295 300 Ser Ala Ser Ile Leu Lys Gln Thr Arg Asp Arg Ala Phe Val 305 310 315 <210> 30 <211> 1423 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <400> 30 taacatacaa atagagaatg ttaaactctt tagctttctg caaaacaagt tgcctttact 60 caacacttta aacgtttaag atctttctaa atgtggcact tcatgtagaa ggacattttt 120 ttaaatcgcc ctgtaaaatt gtttactatt ttttaaaggg tgtgattttt atcacagctg 180 aagctattta ttcttgttac actaacattg tgaaaaacat cacaaaataa aattcaaagg 240 atgatacaaa tgaaaacaca atttacacca aaaacacgaa aagttgccgt tatcggaact 300 ggttttgttg gctcaagcta cgctttttca atggtgaatc aaggtattgc caatgaatta 360 gtgttaatcg atatgaacaa agaaaaagca gaaggtgaag cacgtgatat caatcatgga 420 atgccatttg ccacaccgat gaaaatctgg gctggagatt ataaagactg tgctgacgct 480 gatttagcag ttattacagc gggcgctaat caagctccag gggaaacacg cttagatcta 540 gttgaaaaaa acgttaaaat tttcgaatgc attgtaaaag atattatgaa cagcggattt 600 gacggcatca ttttagtggc aacaaatcca gttgatattc tcgcacacgt tacacaaaaa 660 gtatcaggat taccaaacgg acgggtaatt ggttcaggaa cgattcttga cacagctcgc 720 ttccgctact tgttaagcga ctatttcgaa gtagattctc gcaacgtcca cgcttatatt 780 atgggggaac atggagatac ggaatttcct gtttggagcc acgcgcaaat tggcggtgtg 840 aagctcgaac attttatcaa tactgccgct attgaaaaag aaccggatat gcagcatcta 900 ttcgaacaaa cccgcgatgc ggcttaccat attattaatc gaaaaggagc gacttattac 960 ggaattgcaa tggggcttgt acgcattacc aaggctattt tagatgatga aaattctatt 1020 ttaacagtat ctgctttatt agaaggacaa tacggtattt ctgatgtgta tatcggcgta 1080 ccagctatca ttaataaaaa cggcgtgcgt caaattattg aattgaattt aactcctcac 1140 gaacagcagc agctcgagca ctctgctagc attcttaagc aaactcgcga cagagctttt 1200 gtgtaacatc taaagatttt tgcgggggac tcccccgcac cttgttttaa atatgtagta 1260 gaggtgtatg aatatgacgt ggactcaggt atataatcct ttagataata tttggctttc 1320 tgcactaatt gcactcattc ccattatctt tttctttatt gctttaactc ttttgaaatt 1380 aaaaggacac attgcttgcc ggtattacgg tgcttctttc tat 1423 <210> 31 <211> 323 <212> PRT <213> Lactobacillus helveticus <400> 31 Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Thr Phe Ala Phe Ser Met Val Gln Gln Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Ala Lys Glu His Val Glu Gly Asp 35 40 45 Ala Ile Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn Ile 50 55 60 Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Ser Ser Ile Val Glu Pro Val Val Glu 100 105 110 Ser Gly Phe Glu Gly Ile Phe Leu Val Val Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr His Ala Thr Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Val Ile 145 150 155 160 Gly Lys Met Glu Asn Val Asp Pro Ser Ser Val Asn Ala Tyr Met Leu 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Val 180 185 190 Ala Gly Val Lys Val Ala Asp Trp Val Lys Ala His Asn Met Pro Glu 195 200 205 Ser Lys Leu Glu Asp Ile His Gln Glu Val Lys Asp Met Ala Tyr Asp 210 215 220 Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Thr Ala Ser 225 230 235 240 Ala Met Ile Ala Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu His Arg Val Leu Pro 245 250 255 Leu Ser Val Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Val Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Val Ile Glu 275 280 285 Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp 290 295 300 Gln Leu Lys Lys Val Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Val Lys 305 310 315 320 Val Arg Gln <210> 32 <211> 1350 <212> DNA <213> Lactobacillus helveticus <400> 32 cattaatttt ttgcttagtc caatgtcctt caaacttgtc tttgtctaat gacaaacctt 60 tttcattaag ataatggtcc aacgtcataa aaccagtgtt gtgcttggtt ttatcatact 120 tttgacctgg attacctaaa cctgcaatta ttttcattta tatatacccc tcattacatc 180 ataatctttc atataatagc acaatcagca aattaataat tttattaatg cctactatca 240 tggtataatt tttttgttaa aattatcact aataaaaagg agatttattg ttatggcaag 300 agaggaaaaa cctcgtaaag ttattttagt cggtgatggt gctgtaggtt ctacctttgc 360 attttcaatg gtacaacaag gtatcgctga agaattaggt attatcgata tcgctaagga 420 acacgttgaa ggtgacgcaa tcgatttagc tgacgcaact ccttggactt ctccaaagaa 480 catttacgca gctgactacc cagattgtaa ggatgctgac ttagttgtta ttactgctgg 540 tgctccacaa aagccaggcg aaactcgtct tgatcttgtt aacaagaact tgaagatttt 600 atcatcaatc gttgaaccag ttgttgaatc aggttttgaa ggtattttct tagtagttgc 660 taacccagtt gatatcttaa ctcacgcaac ttggagaatg tcaggcttcc ctaaggatcg 720 tgttatcggt tcaggtactt cacttgatac tggtcgtctt caaaaagtta ttggtaaaat 780 ggaaaacgtt gacccaagtt cagttaatgc atacatgctt ggtgaacacg gtgatactga 840 attcccagca tggagctaca acaatgttgc tggcgtaaag gttgctgact gggttaaggc 900 tcacaacatg cctgaatcta agcttgaaga catccaccaa gaagttaagg acatggctta 960 cgacattatt aacaagaaag gtgctacctt ctacggtatc ggtactgctt cagcaatgat 1020 cgctaaggct atcttgaacg atgaacaccg tgtacttcca ctttcagtac caatggatgg 1080 tgaatatggt ttacacgatc ttcacatcgg tactcctgca gttgttggcc gcaagggtct 1140 tgaacaagtt atcgaaatgc cattaagcga taaggaacaa gaattaatga ctgcttcagc 1200 agatcaatta aagaaggtta tggacaaggc cttcaaagaa actggcgtta aggttcgtca 1260 ataatcttta attttgttca ttaataaaga gcatctcttt tcttaggaag agatgctttt 1320 ttatttcact aactattgtt aaaatatata 1350 <210> 33 <211> 323 <212> PRT <213> Pediococcus acidilactici <400> 33 Met Ser Asn Ile Gln Asn His Gln Lys Val Val Leu Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Met Ala Glu Glu Gly Ile Ala 20 25 30 Glu Glu Phe Val Ile Val Asp Val Val Lys Val Arg Thr Val Gly Asp 35 40 45 Ala Leu Asp Leu Glu Asp Ala Thr Pro Phe Thr Ala Pro Lys Asn Ile 50 55 60 Tyr Ser Gly Glu Tyr Ser Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Val Val Ile 65 70 75 80 Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val 85 90 95 Asn Lys Asn Leu Asn Ile Leu Ser Thr Ile Leu Lys Pro Val Val Asp 100 105 110 Ser Gly Phe Asp Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile 115 120 125 Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu Lys Val 130 135 140 Ile Gly Ser Gly Ile Ser Leu Asp Thr Ala Arg Leu Arg Val Ala Leu 145 150 155 160 Gly Lys Lys Phe Asn Val Ser Pro Glu Ser Val Asp Ala Tyr Ile Leu 165 170 175 Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Ala Tyr Ser Ser Ala Thr Ile 180 185 190 Gly Thr Lys Pro Leu Leu Glu Ile Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Thr 195 200 205 Asp Glu Leu Ala Glu Ile Glu Asp Ser Val Arg Asn Lys Ala Tyr Glu 210 215 220 Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Val Gly Thr Ala Leu 225 230 235 240 Met Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Arg Asp Glu Asn Ala Val Leu Pro 245 250 255 Val Gly Ala Tyr Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu Asn Asp Ile Tyr Ile 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Gly Gln Gly Leu Asn Arg Val Ile Glu 275 280 285 Ala Pro Leu Ser Asp Asp Glu Lys Lys Lys Met Thr Asp Ser Ala Thr 290 295 300 Thr Leu Lys Lys Val Leu Thr Asp Gly Leu Asn Ala Leu Ala Glu Lys 305 310 315 320 Gln Asp Lys <210> 34 <211> 1628 <212> DNA <213> Pediococcus acidilactici <400> 34 gctagtgcgt ctaccaccat aaagccggtg ttgtgccgcg tttgatcata ttcttttcca 60 atgtttccta aaccaacaat cattttcatt atttatcatc ctcatacgca aaaatagctg 120 aaaccaatcc gccccttcag cttgagctcg ttttaaataa tcttatcata tatcgccaca 180 aaagcttaga tattacttct gttcgctcgg taattatttt tggcaaactt atttgttttc 240 tgaaaattag gtctcaactt tcccctgtta aaatgctata atactttggt ggaccaaata 300 tataatctaa taaatgaagg gaatggatat tatgtctaat attcaaaatc atcaaaaagt 360 tgtcctcgtc ggtgacggtg ccgtaggttc tagttacgca ttcgcgatgg cagaagaagg 420 aatcgctgaa gaattcgtca ttgtcgacgt tgttaaggta cgtacagttg gggacgcatt 480 ggaccttgaa gatgctactc cattcacagc tccaaagaac atctactctg gtgaatactc 540 agactgcaag gatgctgact tagttgttat cacagctggc gcaccacaaa agccaggtga 600 aacacgtctt gaccttgtta acaagaactt aaacatcctt tcaacgattc ttaaaccagt 660 tgttgattct ggttttgatg gtatcttcct tgttgctgct aacccagttg atatccttac 720 ttacgcaaca tggaaattct ctggcttccc taaggaaaaa gttatcggtt caggtatctc 780 acttgacaca gctcgtttgc gcgtagctct tggtaagaaa ttcaacgtta gcccagaatc 840 tgtagatgct tacatcttag gtgaacatgg tgacagtgaa tttgctgctt actcatcagc 900 tacaatcggt acaaagccat tgcttgaaat cgctaaagaa gaaggcgttt caactgacga 960 attggctgaa atcgaagaca gcgtacgtaa caaagcttac gaaatcatca acaagaaggg 1020 tgctacattc tacggtgttg gtactgcatt gatgcgcatt tctaaagcaa ttcttcgcga 1080 cgaaaacgcc gtattgcctg ttggtgcata catggatggc gaatatggtt tgaacgacat 1140 ttacattggt actcctgcag ttatcaatgg tcaaggtcta aaccgcgtta tcgaagcacc 1200 acttagcgat gacgaaaaga agaagatgac tgactcagca actactttga agaaggttct 1260 tactgacggt ctaaacgctc ttgctgaaaa acaagacaaa taatcattaa atttatcaac 1320 gaaagcaccg gttgcaaccg gtgctttttt tgtacctatt tttatgtccc ttccccaaac 1380 agcttgtact aaaatcagtt aattgtgcaa atattggtgt caaacccaga tttttttgtt 1440 aagattctca tagtagactt gatatattcg aaatattacg taatgttaca gtaatgttac 1500 agaagaaagt aaaagtaaaa gtaaagaatt aaatcatttg ggggaagtac tatgcaacaa 1560 cgcaaacatc agcaccagca gccacaccat tctaagatcg ccatcacaat cggcgcggtg 1620 gttatctt 1628

Claims (20)

1. 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 활성을 갖는 락테이트 데히드로게나제로서, 변이 전의 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것이고, 서열번호 1에서 108번째 Asn이 Gly 또는 Leu으로 치환된 것인 락테이트 데히드로게나제.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 청구항 1의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
11. 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 청구항 10의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
12. 삭제
13. 청구항 10의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 세포.
14. 청구항 13에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 제거되거나 감소된 것인 효모 세포.
15. 청구항 14에 있어서, 제거되거나 감소되기 전의 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
16. 청구항 15에 있어서, 제거되거나 감소되기 전의 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
17. 청구항 13에 있어서, 자낭균류 (ascomycota)인 것인 효모 세포.
18. 청구항 13에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
19. 청구항 13에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
20. 청구항 13 내지 19 중 어느 한 항의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.

Images