KR102163724B1

KR102163724B1 - 내산성을 갖는 효모 세포 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102163724B1
Application number: KR1020140016790A
Authority: KR
Inventors: 임휘섭; 강창덕; 송지윤; 이승현; 조광명
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2014-02-13
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2020-10-08
Also published as: US20150225752A1; US9617570B2; KR20150095452A

Abstract

pH 2 내지 7.0의 산에 내성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애, 이의 제조 방법, 및 이를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

내산성을 갖는 효모 세포 및 이의 용도{Yeast cell having acid tolerant property and use thereof}

내산성을 갖는 효모 세포 및 이를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

유기산은 그의 pKa 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면 젖산은 pKa 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산(free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 음이온 형태의 유기산은 분리시에 염을 첨가하여 염의 형태로 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성 (acid resistance)이 결여된 세포는 유기산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.

따라서, 산성에 대한 내성을 갖는 미생물에 대한 요구가 있다.

일 양상은 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 산물을 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 pH 2 내지 7.0의 산에 내성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 제공한다.

"내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.

또한 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.

또한 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이 때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또한 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.

젖산에 내성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 세포는 젖산을 포함하지 않는 배지에서의 생장률에 비하여 젖산을 포함하는 배지에서의 생장성이 더 큰 사카로마이세스 세레비지애 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면 상기 세포는 모균주에 비하여 약 1.6 배 내지 약 12.5 배의 더 큰 생장성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 젖산에 내성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 세포는 모균주(parent cell)에 비하여 더 큰 젖산 생산성 또는 수율을 갖는 것일 수 있다. 예를 들면 모균주에 비하여 상기 세포는 젖산 생산의 수율이 약 1.4 내지 약 13.4배 큰 수율을 갖는 것일 수 있다. 모균주는 돌연변이원을 처리하여 제조된 효모 세포가 유래된 모세포 또는 야생형의 세포를 포함할 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애 세포에 돌연변이원을 처리하여 제조된 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가", "효소 활성 증가", "증가된 활성", 또는 "증가된 효소 활성"은 세포 또는 단리된 효소가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 효소의 증가된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

반면, 본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 "불활성화" 또는 "감소", 활성이 "불활성화"되었거나 "감소"된 효소는 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소의 감소된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.

상기 효소의 활성이 불활성화되거나 또는 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실에 의한 것일 수 있다. 일례로 상기 효소의 불활성화 또는 감소는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있으며, 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 명세서에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 정렬(align)시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 정렬하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 개수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 개수를 비교 범위 내의 위치의 총 개수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign^TM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.

여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성일 수 있다.

상기 돌연변이원은 화학적 돌연변이원 및/또는 물리적 돌연변이원을 포함할 수 있다. 화학적 돌연변이원은 에틸메탄술포네이트(EMS), 에틸에탄술포네이트(EES), 메틸메탄술포네이트(MMS), 에틸렌 옥시드(EO), 프로플라빈(proflavine), 아크리딘 오렌지(acridine orage), 4-nitroqyinoline 1-oxide(4-NQO), 아질산(HNO2), 하드록실아민(NH2OH), dimethylsulfate(DMS), diethylsulfate(DES), NMC(N-methylcarbazole), N-니트로소-N-메틸요소(N-Nitroso-N-methylurea), ENNG (N-ethyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine), MNNG (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine), ENU(N-ethyl-N-nitrosurea), MNU(N -Methyl-N-nitrosourea), 아미노시티딘 (aminocytidine), 디아조우라실 (diazouracil), 아자시티딘 (azacytidine), 아미노퓨린 (aminopurine), 머캅토퓨린 (mercaptopurine), 글리옥살 (glyoxal), 포름알데히드(formaldehyde), CHP(cumene hydroperoxide), BHP(t-butyl hydroperoxide), 4-NQO(4-nitroqyinoline 1-oxide), AF-2(2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2- furyl)acrylamide), 캅탄(captan), 포스메트(phosmet), 또는 NaN₃일 수 있다. 에틸메탄술포네이트는 세포 내 DNA의 G 염기의 구조를 변화시켜 T와 결합하게 하여 G-C쌍을 A-T쌍으로 변화시킴으로써 세포 내 유전자의 돌연변이를 유발할 수 있다.

상기 에틸메탄설포네이트의 농도는 약 1 % 내지 약 5%(v/v), 약 1.5% 내지 4.5%(v/v), 약 2% 내지 4%(v/v), 약 2.5% 내지 약 3.5%(v/v) 또는 약 3%(v/v)일 수 있다. 또한, 에틸메탄설포네이트의 처리 시간은 약 15 내지 약 90분, 약 30 분 내지 약 90 분, 약 45분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 90분, 또는 약 75분 내지 약 90분일 수 있다.

상기 돌연변이원이 처리된 효모 세포를 배양하고, 배양된 효모 세포를 선별하여 제조된 젖산에 내성을 갖는 사카로마이에스 세레비지애의 수탁번호는 KCTC 12532BP일 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 일례로 상기 폴리펩티드는 피루베이트 데카르복실라제이다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: Pdc)를 코딩하는 pdc1일 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 추가로 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (Cyb2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 추가로 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 Gpd1은 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 Gpd1은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Gpd1을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 추가로 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 상기 효모 세포에 도입 및 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자의 카피수가 증가되거나 상기 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 증가는 내인성 유전자의 증폭 또는 외인성 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 조절 영역의 변이는 내인성 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성 (homogenous) 또는 이종성 (heterogenous) 유전자일 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 피루베이트를 락테이트로의 전환을 촉매할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리(Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 7, 8, 9 및 10의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 Ldh를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 13, 14, 15, 및 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제 또는 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.

상기 사카로마이세스 세레비지애는 단일 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 1 내지 10 카피수의 복수의 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 복수의 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 Ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.

또한 상기 사카로마이세스 세레비지애 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고, 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 상기 사카로마이에스 세레비지애는 KCTC 12415BP 균주일 수 있다.

다른 양상은 효모 세포에 돌연변이원(mutagen)을 처리하는 단계; 돌연변이원이 처리된 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양된 효모 세포를 선별하는 단계를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 사카로마이세스 세레비지애 변이주는 pH 2 내지 7.0의 젖산에 내성을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이주에 관하여는 전술한 사카로마이세스 세레비지애와 같다.

상기 방법에 있어서, 돌연변이원의 처리는 예를 들면 약 1 % 내지 약 5%(v/v), 약 1.5% 내지 4.5%(v/v), 약 2% 내지 4%(v/v), 약 2.5% 내지 약 3.5%(v/v) 또는 약 3%(v/v)의 농도 범위의 화학적 돌연변이원에 상기 사카로마이세스 세레비지애를 예를 들면 약 15 내지 약 90분, 약 30 분 내지 약 90 분, 약 45분 내지 약 90분, 약 60분 내지 약 90분, 또는 약 75분 내지 약 90분 동안 이루어지는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있고; 상기 사카로마이세스 세레비지애 세포에 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애 세포일 수 있다. 상기 사카로마이세스 세레비지애 세포에 관하여 전술한 바와 같다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다. 발효액의 pH는 2 에서 7 범위로 유지되도록 조절할 수 있다.

상기 효모 세포는 연속, 반연속식, 배치식, 또는 이들의 조합의 방식으로 배양될 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 호기성 또는 혐기성 조건에서 배양될 수 있다. 일례로, 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 또는 무기질소화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면 내산성을 가질 수 있다.

일 양상에 따른 사카로마이세스 세레비지애 변이주를 제조하는 방법에 의하면 내산성을 갖고 증가된 생장과 젖산 생산량을 갖는 효모 세포를 제조할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pUC57-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 선별된 균주 중 5종의 젖산-내성 효모 세포 및 대조군의 세포 성장 (cell growth)을 나타내는 그래프이다.
도 5는 선별된 균주 중 5종의 젖산-내성 효모 세포 및 대조군의 젖산 생산량을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (MAT α ura3 -52; trp1 -289; leu2 -3,112; his3 ㅿ 1; MAL2 -8 ^C ; SUC2 , EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다.

(1.1) L- Ldh 과발현 벡터 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화 벡터의 제조

(1.1.1) L- Ldh 과발현 벡터 제조

L-Ldh 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 18과 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.

그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh(서열번호 7)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 20와 21의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다.

또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 12의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 13의 CYC 프로모터, 서열번호 15의 GPD 프로모터, 및 서열번호 17의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 7의 일본 자라 유래의 L-ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다.

도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 Ldh를 코딩하는 유전자가 도입되어 있다.

(1.1.2) 유전자 교환 벡터 제조

Pdc1, Cyb2, Gpd1을 코딩하는 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 2는 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987) 벡터를 나타내는 도면이다. 도 3은 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.

제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 22과 23의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 제작하였다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 pdc1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

cyb2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 26과 27의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 cyb2 유전자 결실카세트를 제작하였다.

gpd1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-CCW12p-LDH-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 28과 29의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 gpd1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

(1.2) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 Pdc1을 코딩하는 유전자가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

pdc1 유전자 제거를 위해, 실시예 1.1.2에서 제작된 pdc1 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 유전자 결실을 확인하기 위해 서열번호 30과 31의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 pdc1 유전자 결실 카세트의 선별 마커인 URA3 유전자를 다음과 같이 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1+ldh)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1 ㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 30과 31의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)에서 Cyb2를 코딩하는 유전자가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

cyb2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 유전자의 결실을 확인하기 위해, 서열번호 32와 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 유전자의 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 cyb2 유전자의 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1 ㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 32과 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldh)에서 Gpd1을 코딩하는 유전자가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

gpd1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 gpd1 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 uracil 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 유전자 결실을 확인하기 위해 서열번호 34와 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 gpd1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1 ㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 34와 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.

실시예 2. 화학적 돌연변이에 의한 돌연변이 균주 제작

실시예 1에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh) (수탁번호 제KCTC 12415BP호)의 돌변변이 균주를 제작하기 위해, 에틸메탄술포네이트(EMS)를 이용하여 돌연변이를 유발하였으며 구체적으로 하기와 같이 실시하였다.

50 ml의 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh) 배양액 내의 세포 농도를 분광광도계를 이용하여 광학 밀도 (optical density, OD)가 약 600 nm에서 0.5이 되는 양에서 OD가 10이 될 때까지 농축하여 세포수가 약 1×10⁸ 콜로니 수가 되었다. 농축된 배양액으로부터 1 ml의 배양액을 15 ml 튜브로 옮겼다. 상기 15 ml의 튜브를 원심분리하여 상층액을 버린 후 5 ml의 증류수로 세척하였다. 그 후, 상층액을 버리고 pH 7의 0.1 M 소듐 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer)에 1.7 ml의 배양액을 재현탁하였다. 살균된 유리 테스트 튜브에 50 ul의 약 3%(v/v) 에틸메탄술포네이트 (Sigma, M08880, Liquid) 를 15분부터 90분까지 15분 간격으로 처리하였다. 수득된 배양액을 롤러 쉐이커(Roller shaker)에 접종하였다.

실시예 3. 돌연변이 균주 세포의 선별

그 후 에틸메탄술포네이트에 의해 돌연변이가 유발된 세포를 회수하기 위해 하기와 같이 실시하였다.

약 15분 간격으로 8 ml의 5%의 멸균된 티오황산나트륨(NaS₂O₃)을 돌연변이 유발 반응을 멈추게 하기 위해 첨가하였다. 구체적으로 각각의 튜브를 준비하여 각각 다른 튜브에 상기 멸균된 티오황산나트륨을 첨가하였다. 그 후, 9 ml의 증류수로 튜브를 세척하였다. 수득된 세포를 10^-4로 희석시켜 100~200 Colony/0.1 mL 를 플레이트에 도말하여 세포 생존율을 측정하였다. 세포 생존율이 약 60 내지 70%에서 약 10%가 될 때를 에틸메탄술포네이트에 의한 세포의 돌연변이 유발 시점으로 보고, 이 때의 세포를 회수하여 선별하였다.

선별된 세포를 포함하는 상층액 1000 ul을 10 ml의 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 18시간 동안 약 30℃ 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여, 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 4-5시간 후, OD₆₀₀이 0.5 정도가 되면 4,500 rpm, 10분 조건으로 배양액을 원심 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수득한 다음, 멸균수로 희석하여 이를 고체 배지에 도말하였다. 수득된 세포를 10^-3로 희석하여 약 500~1000 Colony/ 0.1 mL를 플레이트에 도말하였다.

실시예 4. 선별된 젖산-내성 효모 세포의 성장 분석

실시예 3에서 선별된 균주를 호기성 조건 하에서 배양하였다. 배양조건은 다음과 같다. 250 ml 플라스크에서, 2% 글루코스, 4% 젖산, 1% 효모 추출물, 및 2% Bacto-peptone를 포함하는 50 ml의 젖산 배지(pH 3.2)를 호기성 조건 하에서 230 rpm으로 30℃에서 배양하였다. 초기 세포의 OD는 약 0.1이었다. 대조군으로 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh) 세포를 이용하였다.

두 샘플의 세포에 대한 O.D는 약 64시간 동안은 600 nm spectrophotometer (DU730, beckman coulter)를 사용하여 측정하였고, 젖산과 당 소모량은 HPLC (Alliance 2695, Waters)를 사용하였다. 수득된 결과는 두 샘플의 평균값으로 나타내었다.

도 4는 선별된 균주 중 5종의 젖산-내성 효모 세포 및 대조군의 세포 성장(cell growth)을 나타내는 그래프이다. 표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 세포 성장이 우수한 변이 균주 5종을 확보하였다. 5종의 변이 균주는 대조군 대비 약 1.6 배 내지 약 12.5 배의 더 큰 생장성을 나타낸다.

균주	O.D	당 소모량 (g/L)	젖산 (g/L)	젖산 수율 (%, g/g)
대조군	7.8±0.1	31±2.4	2.8±0.5	9.03
실험군 1	9.7±0	55±0	11±0.2	20.00
실험군 2	9.7±0.3	54±1.2	9.8±0	18.15
실험군 3	7.6±0.5	38±1.7	5.1±0.2	13.42
실험군 4	8.4±0.2	44±1	5.8±0.5	13.18
실험군 5	9.1±0	4.3±0.6	5.2±0.1	120.93

실시예 5. 선별된 젖산-내성 효모 세포의 젖산 생산량 분석

실시예 3에서 선별된 균주 5종을 혐기성 조건 하에서 약 48시간 동안 배양하였다. 배양조건은 다음과 같다. 250 ml 플라스크에서, 5.5% 글루코스, 4% 젖산, 1% 효모 추출물, 및 2% Bacto-peptone를 포함하는 50 ml의 젖산 배지(pH 3.2)를 혐기성 조건 하에서 230 rpm으로 30℃에서 배양하였다. 초기 세포의 OD는 약 0.5이었다. 대조군으로 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh) 세포를 이용하였다.

도 5는 선별된 균주 중 5종의 젖산-내성 효모 세포 및 대조군의 젖산 생산량을 나타낸 그래프이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군 대비 젖산 생산량이 우수한 변이 균주 5종을 확보하였다. 5종의 변이 균주는 대조군 대비 약 1.9 배 내지 약 3.8 배의 더 큰 젖산 생산량을 나타내며, 또한 수율이 약 1.4 내지 약 13.4배 큰 젖산의 수율을 타낸다.

실시예 4 및 5에서 실험군 1 내지 5 중 실험군 1의 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 돌연변이 균주를 2013년 12월 16일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12532BP 호를 부여받았다.

한국생명공학연구원

KCTC12415BP

20130530

한국생명공학연구원

KCTC12532BP

20131216

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Yeast cell having acid tolerant property and use thereof <130> PN101886 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Thr 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Ile Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 2 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Tyr Asp Leu Thr Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp 115 120 125 Val Ile Lys Phe Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro 130 135 140 Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Pro Leu Gln Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro 165 170 175 Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu 180 185 190 Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe 195 200 205 Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr 210 215 220 Ser Ser Gly Ala Asn Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala 225 230 235 240 Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys 245 250 255 Val Asp Ile Ser Thr Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe 260 265 270 Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly 275 280 285 Glu Lys Asp Val Ala Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro 290 295 300 Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Ala Ala Pro Ser Asp Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Ile Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu 340 345 350 Gly Val Lys Ala Leu Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln 355 360 365 Arg Glu Lys Asp Met Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro 370 375 380 Lys Ala Met Lys Lys Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg 385 390 395 400 Ala Leu Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln 420 425 430 Arg Thr Glu Asp Val Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val 435 440 445 Val Leu Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Phe Ser Arg Ala Pro 450 455 460 Ile Glu Val Leu Ala Glu Thr Met Pro Ile Leu Glu Gln Arg Asn Leu 465 470 475 480 Lys Asp Lys Leu Glu Val Phe Val Asp Gly Gly Val Arg Arg Gly Thr 485 490 495 Asp Val Leu Lys Ala Leu Cys Leu Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Gly 500 505 510 Arg Pro Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Cys Tyr Gly Arg Asn Gly Val Glu 515 520 525 Lys Ala Ile Glu Ile Leu Arg Asp Glu Ile Glu Met Ser Met Arg Leu 530 535 540 Leu Gly Val Thr Ser Ile Ala Glu Leu Lys Pro Asp Leu Leu Asp Leu 545 550 555 560 Ser Thr Leu Lys Ala Arg Thr Val Gly Val Pro Asn Asp Val Leu Tyr 565 570 575 Asn Glu Val Tyr Glu Gly Pro Thr Leu Thr Glu Phe Glu Asp Ala 580 585 590 <210> 3 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 120 125 Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His 130 135 140 Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210> 4 <211> 1692 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60 accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 5 <211> 1776 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 atgctaaaat acaaaccttt actaaaaatc tcgaagaact gtgaggctgc tatcctcaga 60 gcgtctaaga ctagattgaa cacaatccgc gcgtacggtt ctaccgttcc aaaatccaag 120 tcgttcgaac aagactcaag aaaacgcaca cagtcatgga ctgccttgag agtcggtgca 180 attctagccg ctactagttc cgtggcgtat ctaaactggc ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 6 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 7 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 7 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Thr Val Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Val Ser Ser Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Tyr Ala Gly Ile Thr Asp Val Val 290 295 300 Lys Met Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Glu Lys Leu Arg Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 8 <211> 332 <212> PRT <213> Ornithorhynchus anatinus <400> 8 Met Ala Gly Val Lys Glu Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Ala Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asn Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Ile His Ser Thr Ser Cys His Gly Trp Val Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Val Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Asp Glu Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Val Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Ile Thr Leu Lys Ser Glu Glu Glu Ala His Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 9 <211> 332 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 9 Met Ala Thr Val Lys Asp Gln Leu Ile Gln Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 His Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Val Pro Asn Ile Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro His Cys Lys Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Asn Leu His Pro Glu Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Ala Ile His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Val Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Pro Glu Glu Gln Ala Cys Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 10 <211> 332 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 Met Ala Ala Leu Lys Asp Gln Leu Ile Val Asn Leu Leu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Gln Val Pro Gln Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Lys Thr Pro Lys Ile Val Ser Ser 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Gln Cys Lys Leu Leu Ile Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Arg Leu Gly Val His Pro Leu Ser Cys His Gly Trp Val Leu Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ser Leu Asn Pro Gln Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu Gln Trp Lys Asp Val His Lys Gln Val Val Asp Ser Ala Tyr Glu 225 230 235 240 Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Ser Val 245 250 255 Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu Arg Arg Val His Pro 260 265 270 Ile Ser Thr Met Ile Lys Gly Leu Tyr Gly Ile Lys Glu Asp Val Phe 275 280 285 Leu Ser Val Pro Cys Ile Leu Gly Gln Asn Gly Ile Ser Asp Val Val 290 295 300 Lys Val Thr Leu Thr Pro Asp Glu Glu Ala Arg Leu Lys Lys Ser Ala 305 310 315 320 Asp Thr Leu Trp Gly Ile Gln Lys Glu Leu Gln Phe 325 330 <210> 11 <211> 999 <212> DNA <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 11 atgtccgtaa aggaactact tatacaaaac gtccataagg aggagcattc tcacgctcac 60 aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg tgaagatgac attgaaatca gaggaagagg aaaaactaag aaagtcagcc 960 gatactctgt ggggcattca aaaggaattg cagttttaa 999 <210> 12 <211> 1267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ARS/CEN <400> 12 gagctccttt catttctgat aaaagtaaga ttactccatt tatcttttca ccaacatatt 60 catagttgaa agttatcctt ctaagtacgt atacaatatt aattaaacgt aaaaacaaaa 120 ctgactgtaa aaatgtgtaa aaaaaaaata tcaaattcat agcagtttca aggaatgaaa 180 actattatga tctggtcacg tgtatataaa ttattaattt taaacccata taatttatta 240 tttttttatt ctaaagttta aagtaatttt agtagtattt tatattttga ataaatatac 300 tttaaatttt tatttttata ttttattact tttaaaaata atgtttttat ttaaaacaaa 360 attataagtt aaaaagttgt tccgaaagta aaatatattt tatagttttt acaaaaataa 420 attattttta acgtattttt tttaattata tttttgtatg tgattatatc cacaggtatt 480 atgctgaatt tagctgtttc agtttaccag tgtgatagta tgattttttt tgcctctcaa 540 aagctatttt tttagaagct tcgtcttaga aataggtggt gtataaattg cggttgactt 600 ttaactatat atcattttcg atttatttat tacatagaga ggtgctttta attttttaat 660 ttttattttc aataatttta aaagtgggta cttttaaatt ggaacaaagt gaaaaatatc 720 tgttatacgt gcaactgaat tttactgacc ttaaaggact atctcaatcc tggttcagaa 780 atccttgaaa tgattgatat gttggtggat tttctctgat tttcaaacaa gaggtatttt 840 atttcatatt tattatattt tttacattta ttttatattt ttttattgtt tggaagggaa 900 agcgacaatc aaattcaaaa tatattaatt aaactgtaat acttaataag agacaaataa 960 cagccaagaa tcaaatactg ggtttttaat caaaagatct ctctacatgc acccaaattc 1020 attatttaaa tttactatac tacagacaga atatacgaac ccagattaag tagtcagacg 1080 cttttccgct ttattgagta tatagcctta catattttct gcccataatt tctggattta 1140 aaataaacaa aaatggttac tttgtagtta tgaaaaaagg cttttccaaa atgcgaaata 1200 cgtgttattt aaggttaatc aacaaaacgc atatccatat gggtagttgg acaaaacttc 1260 aatcgat 1267 <210> 13 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC promoter <400> 13 atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg 60 ccaggcgtgt atatatagcg tggatggcca ggcaacttta gtgctgacac atacaggcat 120 atatatatgt gtgcgacgac acatgatcat atggcatgca tgtgctctgt atgtatataa 180 aactcttgtt ttcttctttt ctctaaatat tctttcctta tacattagga cctttgcagc 240 ataaattact atacttctat agacacgcaa acacaaatac acacactaa 289 <210> 14 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 14 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 15 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 15 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360 ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420 ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480 aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540 agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600 tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655 <210> 16 <211> 1468 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH promoter <400> 16 gccgggatcg aagaaatgat ggtaaatgaa ataggaaatc aaggagcatg aaggcaaaag 60 acaaatataa gggtcgaacg aaaaataaag tgaaaagtgt tgatatgatg tatttggctt 120 tgcggcgccg aaaaaacgag tttacgcaat tgcacaatca tgctgactct gtggcggacc 180 cgcgctcttg ccggcccggc gataacgctg ggcgtgaggc tgtgcccggc ggagtttttt 240 gcgcctgcat tttccaaggt ttaccctgcg ctaaggggcg agattggaga agcaataaga 300 atgccggttg gggttgcgat gatgacgacc acgacaactg gtgtcattat ttaagttgcc 360 gaaagaacct gagtgcattt gcaacatgag tatactagaa gaatgagcca agacttgcga 420 gacgcgagtt tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg gccttccttc cagttacttg aatttgaaat aaaaaaaagt 1320 ttgctgtctt gctatcaagt ataaatagac ctgcaattat taatcttttg tttcctcgtc 1380 attgttctcg ttccctttct tccttgtttc tttttctgca caatatttca agctatacca 1440 agcatacaat caactccaag ctggccgc 1468 <210> 17 <211> 252 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYC1 terminator <400> 17 tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60 aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120 tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180 acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240 taatttgcgg cc 252 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 18 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 19 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 20 ggatccatgt ccgtaaagga actact 26 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 21 acgcgtcgac ttaaaactgc aattcctttt gaat 34 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 22 gagctcaatt aaccctcact aaaggg 26 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 23 gagctccaaa ttaaagcctt cgagcg 26 <210> 24 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 24 aagatctacg aagttgaagg tatgagatgg gctggtaacg ccagtcacga cgttgtaaaa 60 60 <210> 25 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 25 gcttccttaa cttctggctt ggacaaggta ccgacgtaaa aggtttcccg actggaaagc 60 60 <210> 26 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 26 cgatgcgtat tttaagtggt tctctgaaca gcacaatgtc ctcgacacca ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 27 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 27 ggatcacccc ccactcaagt cgttgcattg ctaacatgtg gcattctgcc caaggtttcc 60 cgactggaaa gc 72 <210> 28 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 28 ccctatgtct ctggccgatc acgcgccatt gtccctcaga aacaaatcaa ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 29 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 29 tagaagcaac tgtgccgaca gcctctgaat gagtggtgtt gtaaccaccc aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 30 gctcttctct accctgtcat tc 22 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 31 tagtgtacag ggtgtcgtat ct 22 <210> 32 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 32 ggagttgaag gcaaaattag aagtga 26 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 33 attccctttc ctgcacaaca cgagat 26 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 34 tcaatgagac tgttgtcctc ctact 25 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 35 tacatccttg tcgagccttg ggca 24

Claims

pH 2 내지 7.0의 산에 내성을 갖는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로서, 수탁번호 KCTC 12532BP인 것인 사카로마이세스 세레비지애.
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청구항 1의 사카로마이세스 세레비지애를 배양하는 단계; 및
상기 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.