KR20150056114A - 락테이트를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하기 위한 방법, 및 상기 세포를 이용한 락테이트 생산 방법 - Google Patents

Abstract

조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성이 증가되어 있거나, 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포, 상기 세포를 제조하는 및 방법, 및 상기 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

락테이트를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하기 위한 방법, 및 상기 세포를 이용한 락테이트 생산 방법{A genetically engineered yeast cell capable of producing lactate, a method for producing the same, and a method for producing lactate using the cell}

락테이트를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포, 그를 제조하는 방법, 및 상기 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 락테이트를 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성이 증가되어 있는, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된 것인, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "유전적으로 조작된 (genetically engineered), 또는 유전적 조작"은 유전공학에 의해 제조되거나, 그의 결과인 것을 의미한다. 상기 용어 "유전적으로 조작된"은 "재조합 (recombination)"을 포함할 수 있다. 상기 재조합은 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 또는 그에 의하지 않고, 외인성 (exogenous) 핵산이 도입되거나, 그의 결과인 것을 의미한다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 재조합체 (recombinant)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 재조합체는 하나 이상의 재조합 핵산 또는 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 상기 재조합체는 발현 벡터 또는 클로닝 벡터를 포함하거나, 숙주 세포의 내인성 게놈 중 클로닝된 핵산 서열을 포함하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 유전적 조작은 유전자 변형을 포함하며, 상기 유전자 변형은 선택 및/또는 확인된 배양 조건 하에 효소 활성 및/또는 선택성의 변화를 일으키는 전사, 번역 및 번역-후 변형, 및/또는 락테이트 생산과 관련된 효소의 카피수 및/또는 재조합체를 포함한 돌연변이체를 증가시키기 위한 것과 같은 추가의 폴리뉴클레오티드의 제공에 관한 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가", "효소 활성 증가", "증가된 활성", 또는 "증가된 효소 활성"은 세포 또는 단리된 효소가 비교가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 공지된 표준 조건하에 나타낸 기질에서 나타낸 생성물로의 효소 전환은 특정된 표준 조건 하에 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환에 대한 효소 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 효소의 증가된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.

반면, 본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드의 활성이 "불활성화" 또는 "감소", 활성이 "불활성화"되었거나 "감소"된 효소는 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포 또는 그의 본래 효소에서 측정된 활성 수준보다 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성이 없는 것을 의미한다. 즉 해당 효소에 대해 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 본래 조작되지 않은 효소에 의한 동일한 생화학적 전환 활성보다 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소의 감소된 효소 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.

상기 효소의 활성이 불활성화되거나 또는 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실에 의한 것일 수 있다. 일례로 상기 효소의 불활성화 또는 감소는 상동 재조합에 의해 야기될 수 있으며, 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 글루코스 대비 34% 이상, 예를 들면 34 내지 45%, 34 내지 41%, 35 내지 41%, 36 내지 41%, 37 내지 41%, 38 내지 41%, 38.5 내지 40.5%, 또는 39 내지 40.5%의 수율로 락테이트를 생산할 수 있다. 상기 글루코스는 상기 효모 세포가 소비하는 글루코스를 의미한다.

또한, 상기 유전적으로 조작된 세포의 락테이트 생산능은 조작되지 않은 세포의 락테이트 생산능에 비하여 9% 이상, 예를 들면 9 내지 25%, 10 내지 25%, 11 내지 25%, 12 내지 25%, 13 내지 25%, 14 내지 25%, 15 내지 25%, 16 내지 25%, 17 내지 25%, 18 내지 25%, 19 내지 25%, 15 내지 20%, 16 내지 20%, 17 내지 20%, 18 내지 20%, 또는 19 내지 20%의 수율이 증가된 것일 수 있다. 상기 유전적 조작은 트리오스 포스페이트 이소머라제의 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 명세서에서 유전적으로 조작되지 않은 세포에는 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성이 증가된 효모 세포가 유래된 모세포 또는 야생행의 세포가 포함된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "트리오스 포스페이트 이소머라제 (triose-phosphate isomerase: TPI)"는 디히드록시아세톤 포스페이트 (dihydroxyacetone phosphate: DHAP)와 글리세르알데히드-3-포스페이트 (glyceraldehyde-3-phosphate: GA3P)의 가역적 전환을 촉매하는 효소를 의미한다.

트리오스 포스페이트 이소머라제는 EC 5.3.1.1유래의 폴리펩티드일 수 있다.

상기 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성이 증가되어 있는, 유전적으로 조작된 효모 세포에 있어서, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성 증가는 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 효모 세포의 내재적 트리오스 포스페이트 이소머라제보다 활성이 좋은 외래 세포의 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자의 도입에 의할 수 있다. 상기 카피수 증가는 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자는 상기 유전자의 발현 조절 서열도 포함할 수 있다.

상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자는 내재적 (endogenous) 또는 이종 (heterologous) 유전자일 수 있다. 용어 "이종 유전자", 또는 "이종 폴리뉴클레오티드"는 하기 중 하나 이상에 해당하는 핵산 서열을 지칭한다: (a) 핵산 서열이 소정의 숙주 세포에 대해 이질적이거나 천연으로 발견되지 않거나; (b) 서열이 소정의 숙주 세포에서 천연이지만, 비천연의 양 예를 들면 예상했던 것보다 많은 양으로 발견될 수 있는 서열일 수 있다.

용어 "이종"은 용어 "외인성"을 포함하는 것으로 의도되며, 후자의 용어가 당업계에서 일반적으로 사용된다. 이종 핵산 서열의 도입 전 숙주 미생물의 게놈과 관련하여, 효소를 코딩하는 핵산 서열은 이종 핵산 서열이 상기 게놈에 도입되든지 안되든지 간에 이종이다. 다양한 구체예에서, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성 증가는 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 이종 유전자의 도입에 의해 일어날 수 있다.

또한, 상기 증가는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 유전자 발현은 전사 및 번역을 모두 포함할 수 있고, 또한, 단백질 생성을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, 증가된 자가-상동성(self-homology)을 갖는 영역, 천연 유전자에 대해 증가된 상동성을 갖는 영역, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 및 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.

조절 서열은 또한 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 뉴클레오티드 서열인 적절한 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 돌연변이, 절단 및 혼성 프로모터를 포함한, 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 대해 동종 또는 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득될 수 있다.

조절 서열은 또한 전사를 종결하도록 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 적합한 전사 종결자 서열일 수 있다. 종결자 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3'말단에 작동가능하게 연결될 수 있다. 효모 세포에서 기능하는 임의의 종결자가 사용될 수 있다. 또한, 숙주 세포의 성장에 대해 폴리펩티드의 발현을 조절하는 조절 서열이 추가될 수 있다. 조절 시스템의 예는, 조절 화합물의 존재를 비롯한 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응에 있어서 유전자의 발현이 켜지거나 꺼지도록 하는 시스템이다.

또한, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성 증가는 트리오스 포스페이트 이소머라제의 돌연변이에 의한 변형에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 박테리아, 효모, 진균, 또는 포유동물 유래의 것일 수 있다. 상기 효모는 사카로마이세스 속을 포함할 수 있다. 상기 포유동물은 토끼를 포함할 수 있다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 트리파노소마 브루세이 (Trypanosoma brucei), 토끼 근육 (rabbit muscle) 세포, 또는 그의 조합 유래의 것일 수 있다. 상기 사카로마이세스 세레비지애 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제는 표 1에 나타낸 단백질 중 하나일 수 있다. 또한, 트리파노소마 브루세이 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제는 표 2에 나타낸 단백질 중 하나일 수 있다. 토끼 근육 세포 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제는 표 3에 나타낸 단백질 중 하나일 수 있다.

[표 1]

사카로마이세스 세레비지애 트리오스포스 페이트 이소머라제 및 그의 유전자

[표 2]

트리파노소마 브루세이 감비엔스 유래의 트리오스포스페이트 이소머라제 및 그의 유전자

[표 3]

토끼 세포 유래의 트리오스포스페이트 이소머라제 및 그의 유전자

상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자는 표 1 내지 3에 나타낸 유전자 중 어느 하나일 수 있다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 10 내지 13 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 락테이트 생산용 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 이러한 변이 효모 세포는 예를 들면, 설파구아니딘 또는 설파티아졸에 대한 내성을 가지거나, 아자세린 내성, 트리메토프림 내성, 또는 모노플루오로아세테이트 내성을 가질 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 자낭균류(ascomycota)일 수 있다. 상기 자낭균류는 사카로미세타시에(saccharomycetaceae) 일 수 있다. 상기 사카로미세타시에는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 속, 캔디다 (Candida) 속, 피치아 (Pichia) 속, 이사첸키아 (Issatchenkia) 속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속, 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces) 속, 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속 일 수 있다. 상기 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 클루이베로마이세스 속은 클루이베로마이세스 서모톨러란스 (Kluyveromyces thermotolerans)일 수 있다. 캔디다 속은 캔디다 글라브라타 (Candida glabrata)일 수 있다. 자이고사카로마이세스 속은 자이고사카로마이세스 바일리 (Zygosaccharomyces bailli) 또는 자이고사카로마이세스 룩시이 (Zygosaccharomyces rouxii)일 수 있다.

또한, 유전적으로 조작된 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 효소는 피루베이트 데카르복실라제일 수 있다. 일례로 상기 효소는 PDC1일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (PDC)를 코딩하는 pdc1일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 일례로 Cyb2일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있다. 상기 효소는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매할 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있으며, GPD1일 수 있다. 상기 GPD1은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 GPD1을 코딩하는 유전자는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다.

상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 상기 효모 세포에 도입 및 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다. 상기 발현의 증가는 유전자의 카피수가 증가되거나 상기 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 증가는 내인성 유전자의 증폭 또는 외인성 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자의 조절 영역의 변이는 내인성 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 동종성 (homogenous) 또는 이종성 (heterogenous) 유전자일 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 피루베이트를 락테이트로의 전환을 촉매할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 데히드로게나제 또는 D-락테이트 데히드로게나제 일 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다.

상기 효모 세포는 복수개의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 또는 개구리(Xenopus laevis)로부터 선택되는 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 20, 21, 22, 및 23의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 26, 27, 28, 및 29의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. 상기 L-락테이트 데히드로게나제 또는 D-락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.

상기 효모 세포는 단일 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 1 내지 10 카피수의 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.

또한 상기 효모 세포는 트리오스 포스페이트 이소머라제 및 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소되어 있는 것인 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된 것인, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포를 제작하기 위한, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시키기에 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다.

상기 발현 벡터는 효모 발현 벡터, 박테리오파지 벡터, 또는 코스미드 벡터가 사용될 수 있다. 상기 효모 발현 벡터는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터일 수 있고, 그의 예로 pYepSec1, 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa, pJRY88, pYES2, 또는 사카로마이세스 세레비지애/에스케리키아 콜라이 셔틀 벡터 (Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli shuttle vector), 또는 pRS416 벡터와 같은 pRS400 시리즈 벡터를 포함할 수 있다.

발현 벡터로서 작동하려면, 복제원점, 프로모터, 다중 클로닝 사이트 (multiple cloning site: MCS) 및 선별 마커를 포함할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해주고, 프로모터는 삽입되는 외래 유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 하며, 선택 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 도입되었는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선택 마커는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 선별 마커는 영양요구성 유전자 (auxotrophic gene)를 포함하며, 예를 들어 우라실, 트립토판, 루신, 및 히스티딘으로부터 선택되는 것에 대해 영양요구성을 제공하는 유전자를 포함할 수 있다.

사카로마이세스 속을 포함한 효모 숙주 세포에서 핵산 구축물의 전사를 지시하기 위한 적합한 프로모터의 예로는 PGK 프로모터, GPD 프로모터, PDC1 프로모터, 및 TEF1 프로모터 가 있다.

다른 양상은 효모로 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포는 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된 것일 수 있다. 상기 카피수 증가는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)를 글리세르알데히드-3-포스페이트로 전환시키는 것을 촉매하는 것일 수 있다.

다른 양상은 효모로 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 상기 유전적으로 조작된 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제 및 유전적으로 조작된 효모 세포에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 제조하는 방법에 있어서, 피루베이트 데카르복실라제 유전자, 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제, 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 유전자, 또는 그의 조합을 불활성화 또는 감쇄시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 피루베이트 데카르복실라제 유전자, 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제, 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 유전자에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 제조하는 방법에 있어서, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제에 대해서는 상기한 바와 같다.

다른 양상은 상기 유전적으로 조작된 효모 세포를 이용한, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 유전적으로 조작된 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법일 수 있다. 상기 유전적으로 조작된 효모 세포에 대해서는 상기한 바와 같다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 배양은 호기성 또는 혐기성 조건에서 배양가능하다. 일례로 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%일 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류 등이 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 갈락토오즈 등이 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소 화합물, 무기질소 화합물 등 일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 암모늄염 등 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기 중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물이 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

상기 방법은 락테이트를 중합하여 폴리락테이트 중합체를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 유전적으로 조작된 효모 세포에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.

일 양상에 따른 벡터에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있는 효모 세포의 제조 방법에 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 미생물 제조 방법에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있는 효모 세포를 제조할 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 높은 수율로 생산할 수 있다.

도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987) 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 p416TEF-S.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 제작된 p416TEF-T.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 제작된 p416TEF-R.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제 (TPI), 트리파노소마 브루세이 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제, 토끼 근육(rabbit muscle) 세포 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP에 도입된 경우, 유전적으로 조작되지 않은 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP에 비하여 유전적으로 조작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP의 락테이트의 생산량 증대 백분율과 수율 백분율을 나타내는 도면이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작

사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae CEN . PK2 -1D( MAT α ura3 -52; trp1-289; leu2 -3,112; his3 △ 1; MAL2 -8 ^C ; SUC2 ) EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 제거하여 락테이트 생산을 위한 균주로 활용하였다. 또한, 락테이트 생산을 위해 상기 3개의 유전자를 제거하는 동시에 각 제거 위치에 서열번호 24의 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 삽입 하여, 3개의 카피의 락테이트 데히드로게나제를 삽입하였다.

상기 각 유전자의 제거 및 락테이트 데히드로게나제 유전자의 동시 삽입은 제거하고자 하는 각 유전자의 코딩 영역 (open reading frame) 또는 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 영역의 표적 유전자좌 (target locus)의 상류부와 하류부에 상동 재조합을 통해 이루어졌다.

(1.1) L- LDH 과발현 벡터 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화 벡터의 제조

(1.1.1) L- LDH 과발현 벡터 제조

L-ldh 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31과 32의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.

그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh(서열번호 24)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 33와 34의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다.

또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 25의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 26의 CYC 프로모터, 서열번호 27의 GPD 프로모터, 및 서열번호 28의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 24의 일본 자라 유래의 L-ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다.

도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 LDH가 도입되어 있다.

(1.1.2) 유전자 교환 벡터 제조

PDC1, CYB2, GPD1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 2는 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987) 벡터를 나타내는 도면이다. 도 3은 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.

제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 35과 36의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 제작하였다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 37와 38의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 39과 40의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 CYB2 유전자 결실카세트를 제작하였다.

GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 41과 42의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 GPD1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

(1.2) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 pdc1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

pdc1 유전자 제거를 위해, 실시예 1.1.2에서 제작된 PDC1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 결실을 확인하기 위해 서열번호 43과 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 pdc1결실 카세트의 선별 마커인 URA3 유전자를 다음과 같이 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1+ldh)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix, 1μg/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 43과 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)에서 cyb2가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

cyb2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1 및 2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 결실을 확인하기 위해, 서열번호 45과 46의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 cyb2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix, 1μg/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 45과 46의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhΔcyb2::ldh)에서 gpd1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1::ldhΔcyb2::ldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

gpd1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.2에서 제작된 gpd1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 uracil 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 결실을 확인하기 위해 서열번호 47과 48의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 gpd1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix, 1 ㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 47과 48의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhΔgpd1::ldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.

실시예 2. 트리오스 포스페이트 이소머라제 1을 코딩하는 유전자 발현 벡터 제작 및 트리오스 포스페이트 이소머라제1을 코딩하는 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애의 제작

해당과정에서 탄소 흐름 (carbon flux)을 강화시킨 락테이트 생산 균주를 제작하기 위해, 트리오스 포스페이트 이소머라제 중 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세르알데히드-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 좋은 트리오스 포스페이트 이소머라제를 과발현시키거나 외래 세포의 트리오스 포스페이트 이소머라제를 도입하였다.

(2.1) 트리오스 포스페이트 이소머라제1을 코딩하는 유전자 발현 벡터 제작

사카로마이세스 세레비지애의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 49 및 50의 프라이머 서열을 이용하여 PCR하여 서열번호 10의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1(S. TPI1)을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

수득된 사카로마이세스 세레비지애 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1을 코딩하는 유전자를 제한효소 BamHI/SalI을 이용하여 low copy number centromeric 플라스미드인 p416 TEF 플라스미드 (ATCC catalog #87368)에 도입하여 p416 TEF-S.TPI1을 제작하였다. 도 4는 p416TEF-S.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.

또한, 트리파노소마 브루세이의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 51 및 52의 프라이머 서열을 이용하여 PCR하여 서열번호 12의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1(T. TPI1)을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

수득된 트리파노소마 브루세이 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1을 코딩하는 유전자를 제한효소 BamHI/SalI을 이용하여 low copy number centromeric 플라스미드인 p416 TEF 플라스미드 (ATCC catalog #87368)에 도입하여 p416 TEF-T.TPI1을 제작하였다. 도 5는 제작된 p416TEF-T.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.

또한, 토끼 근육 세포의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 53 및 54의 프라이머 서열을 이용하여 PCR하여 서열번호 13의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1(R. TPI1)을 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

수득된 토끼 근육 세포 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제 1을 코딩하는 유전자를 제한효소 BamHI/SalI을 이용하여 low copy number centromeric 플라스미드인 p416 TEF 플라스미드 (ATCC catalog #87368)에 도입하여 p416 TEF-R.TPI1을 제작하였다. 도 6은 제작된 p416TEF-R.TPI1 벡터를 나타내는 도면이다.

(2.2) 트리오스 포스페이트 이소머라제1을 코딩하는 유전자가 도입된 사카로마이세스 세레비지애의 제작

제작된 KCTC12415BP호 균주를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50ml에 1%(v/v) 접종하여 230rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.

약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100ul씩 분주하였다.

실시예 2.1에서 제작된 p416 TEF-S.TPI1, p416 TEF-T.TPI1, 및 p416 TEF-R.TPI1 각각을 50% 폴리에틸렌글리콜, single stranded carrier DNA와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실 (ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 상기 p416 TEF-S.TPI1, p416 TEF-T.TPI1, 및 p416 TEF-R.TPI1가 각각 균주 내로 도입된 것을 확인하였다.

실시예 3. 유전적으로 조작된 S. cerevisiae 의 락테이트 생산 발효 평가

실시예 2에서 제작된 균주 및 대조군으로서 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP의 락테이트 생산 발효를 평가하기 위해 다음과 같이 배양하였다.

50 ml 진탕 플라스크에서 상기 우라실 무첨가 최소 액체 배지인YSD (ura-))에서 하기 제1 단계 및 제2 단계의 배양조건에 따라 배양하였다.

1 단계 배양 조건은 다음과 같다: 우라실이 없는, 4% 글루코스를 함유한 2x YSD (ura-)액체배지 50ml을 250 ml 진탕 플라스크에 약 30˚C 에서 약 250 rpm으로 배양하였다. 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제 1 발현 벡터가 도입된 균주를 상기 진탕 플라스크에 각각 접종 후, 상기 균주가 대수 증식기에 도달할 달 때까지, 즉 상기 접종 후 약 15 내지 약 16 시간 후, 또는 OD₆₀₀이 5 내지 8에 도달할 때 까지 상기 균주를 배양하였다.

2 단계 배양 조건은 다음과 같다: 상기 각 50 ml의 배양액을 10분 동안 약 3000 rpm으로 원심분리시켜 상등액을 제거 한 후, 균주를 신선하고, 최종 부피가 50 ml인, 우라실이 없는 8% 글루코스를 함유한 50 ml의 YSD (ura-) 배지에 재현탁시킨 후 250 ml의 플라스크에 옮겨 30℃에서 250 rpm으로 배양하였다. 상기 배양은 글루코스가 모두 소비될 때까지, 즉 약 24 내지 약 30 시간동안 수행하였다. 균주의 락테이트를 포함한 대사 산물을 HPLC로 측정하여 락테이트 생산 수율을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

도입된 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자의 기원	O D 600	락테이트의 생산량 (g/L)	수율 (%)
무(無)	7.23	22	33.8
사카로마이세스 세레비지애	7.97	22.5	37.1
트리파노소마 브루세이	8.32	25	38.9
토끼 근육 세포	8.11	25.5	40.4

표 4로부터 알 수 있듯이, 사카로마이세스 세레비지애, 트리파노소마 브루세이, 및 토끼 근육 세포로부터 유래한 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주들은 트리오스 포스페이트 이소머라제가 도입되지 않은 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP보다 락테이트의 고생산성 및 고수율을 나타내었다. 상기 생산성 및 수율의 증가 정도는 유사 조건하의 초기 미생물인 대조군의 락테이트 생산성 및 수율 수준과의 비교로 측정하였다.

또한, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP의 락테이트 생산량 및 수율 대비, 사카로마이세스 세레비지애, 트리파노소마 브루세이, 및 토끼 근육으로부터 유래한 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 균주의 락테이트의 생산량 및 수율을 도 7 및 표 5에 나타내었다. 도 7은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제, 트리파노소마 브루세이 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제, 토끼 근육 세포 유래의 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP에 도입된 경우, 유전적으로 조작되지 않은 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP에 비하여 유전적으로 조작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D KCTC12415BP의 락테이트의 생산량 증대와 수율%를 나타내는 도면이다.

트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자의 기원	락테이트의 생산량 (g/L)	수율 (%)
사카로마이세스 세레비지애	2.3	9.9
트리파노소마 브루세이	13.6	15.1
토끼 근육	15.9	19.6

도 1 및 표 5로부터 알 수 있듯이, 사카로마이세스 세레비지애, 트리파노소마 브루세이, 및 토끼 근육으로부터 유래한 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 순으로 락테이트의 고생산성 및 고수율을 나타내었다.

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> A genetically engineered yeast cell capable of producing lactate, a method for producing the same, and a method for producing lactate using the cell <130> PN100464 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ala Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Leu Asn Gly Ser 1 5 10 15 Lys Gln Ser Ile Lys Glu Ile Val Glu Arg Leu Asn Thr Ala Ser Ile 20 25 30 Pro Glu Asn Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Thr Tyr Leu Asp 35 40 45 Tyr Ser Val Ser Leu Val Lys Lys Pro Gln Val Thr Val Gly Ala Gln 50 55 60 Asn Ala Tyr Leu Lys Ala Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Asn Ser Val 65 70 75 80 Asp Gln Ile Lys Asp Val Gly Ala Lys Trp Val Ile Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ser Tyr Phe His Glu Asp Asp Lys Phe Ile Ala Asp Lys 100 105 110 Thr Lys Phe Ala Leu Gly Gln Gly Val Gly Val Ile Leu Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Glu Glu Lys Lys Ala Gly Lys Thr Leu Asp Val Val Glu 130 135 140 Arg Gln Leu Asn Ala Val Leu Glu Glu Val Lys Asp Trp Thr Asn Val 145 150 155 160 Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Pro Glu Asp Ala Gln Asp Ile His Ala Ser Ile Arg Lys Phe Leu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Gly Asp Lys Ala Ala Ser Glu Leu Arg Ile Leu Tyr 195 200 205 Gly Gly Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ala Val Thr Phe Lys Asp Lys Ala 210 215 220 Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe 225 230 235 240 Val Asp Ile Ile Asn Ser Arg Asn 245 <210> 2 <211> 248 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Ala Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Leu Asn Gly Ser 1 5 10 15 Lys Gln Ser Ile Lys Glu Ile Val Glu Arg Leu Asn Thr Ala Ser Ile 20 25 30 Pro Glu Xaa Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Thr Tyr Leu Asp 35 40 45 Tyr Ser Val Ser Leu Val Lys Lys Pro Gln Val Thr Val Gly Ala Gln 50 55 60 Asn Ala Tyr Leu Lys Ala Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Asn Ser Val 65 70 75 80 Asp Gln Ile Lys Asp Val Gly Ala Lys Trp Val Ile Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ser Tyr Phe His Glu Asp Asp Xaa Phe Ile Ala Asp Lys 100 105 110 Thr Lys Phe Ala Leu Gly Gln Gly Val Gly Val Ile Leu Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Glu Glu Lys Lys Ala Gly Lys Thr Leu Asp Val Val Glu 130 135 140 Arg Gln Leu Asn Ala Val Leu Glu Glu Val Lys Asp Trp Thr Asn Val 145 150 155 160 Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Pro Glu Asp Ala Gln Asp Ile His Ala Ser Ile Arg Lys Phe Leu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Gly Asp Lys Ala Ala Ser Glu Leu Arg Ile Leu Tyr 195 200 205 Gly Gly Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ala Val Thr Phe Lys Asp Lys Ala 210 215 220 Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe 225 230 235 240 Val Asp Ile Ile Asn Ser Arg Asn 245 <210> 3 <211> 252 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ala Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Leu Asn Gly Ser 1 5 10 15 Lys Gln Ser Ile Lys Glu Ile Val Glu Arg Leu Asn Thr Ala Ser Ile 20 25 30 Pro Glu Asn Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Thr Tyr Leu Asp 35 40 45 Tyr Ser Val Ser Leu Val Lys Lys Pro Gln Val Thr Val Gly Ala Gln 50 55 60 Asn Ala Tyr Leu Lys Ala Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Asn Ser Val 65 70 75 80 Asp Gln Ile Lys Asp Val Gly Ala Lys Trp Val Ile Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ser Tyr Phe His Glu Asp Asp Lys Phe Ile Ala Asp Lys 100 105 110 Thr Lys Phe Ala Leu Gly Gln Gly Val Gly Val Ile Leu Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Glu Glu Lys Lys Ala Gly Lys Thr Leu Asp Val Val Glu 130 135 140 Arg Gln Leu Asn Ala Val Leu Glu Glu Val Lys Asp Trp Thr Asn Val 145 150 155 160 Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Pro Glu Asp Ala Gln Asp Ile His Ala Ser Ile Arg Lys Phe Leu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Gly Asp Lys Ala Ala Ser Glu Leu Arg Ile Leu Tyr 195 200 205 Gly Gly Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ala Val Thr Phe Lys Asp Lys Ala 210 215 220 Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe 225 230 235 240 Val Asp Ile Ile Asn Ser Arg Lys Leu Arg Leu Ile 245 250 <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 Met Ala Arg Thr Phe Phe Val Gly Gly Asn Phe Lys Leu Asn Gly Ser 1 5 10 15 Lys Gln Ser Ile Lys Glu Ile Val Glu Arg Leu Asn Thr Ala Ser Ile 20 25 30 Pro Glu Asn Val Glu Val Val Ile Cys Pro Pro Ala Ile Tyr Leu Asp 35 40 45 Tyr Ser Val Ser Leu Val Lys Lys Pro Gln Val Thr Val Gly Ala Gln 50 55 60 Asn Ala Tyr Leu Lys Ala Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Asn Ser Val 65 70 75 80 Asp Glu Ile Lys Asp Val Gly Ala Lys Trp Val Val Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ser Tyr Phe His Glu Asp Asp Lys Phe Val Ala Glu Lys 100 105 110 Thr Lys Phe Ala Leu Gly Gln Gly Val Gly Val Ile Leu Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Glu Glu Lys Lys Ala Gly Lys Thr Leu Asp Val Val Glu 130 135 140 Arg Gln Leu Asn Ala Val Leu Glu Glu Val Lys Asp Trp Thr Asn Val 145 150 155 160 Val Val Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Ser Gly Leu Ala Ala 165 170 175 Thr Pro Glu Asp Ala Gln Asp Ile His Ala Ser Ile Arg Lys Phe Leu 180 185 190 Ala Ser Lys Leu Gly Asp Lys Thr Ala Ser Glu Leu Arg Ile Leu Tyr 195 200 205 Gly Gly Ser Ala Asn Gly Ser Asn Ala Val Thr Phe Lys Thr Lys Ala 210 215 220 Asp Val Asp Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro Glu Phe 225 230 235 240 Val Asp Ile Ile Asn Ser Arg Asn 245 <210> 5 <211> 250 <212> PRT <213> trypanosoma brucei <400> 5 Met Ser Lys Pro Gln Pro Ile Ala Ala Ala Asn Trp Lys Cys Asn Gly 1 5 10 15 Ser Gln Gln Ser Leu Ser Glu Leu Ile Asp Leu Phe Asn Ser Thr Ser 20 25 30 Ile Asn His Asp Val Gln Cys Val Val Ala Ser Thr Phe Val His Leu 35 40 45 Ala Met Thr Lys Glu Arg Leu Ser His Pro Lys Phe Val Ile Ala Ala 50 55 60 Gln Asn Ala Ile Ala Lys Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Val Ser Leu 65 70 75 80 Pro Ile Leu Lys Asp Phe Gly Val Asn Trp Ile Val Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Glu Thr Asn Glu Ile Val Ala Asp Lys 100 105 110 Val Ala Ala Ala Val Ala Ala Gly Phe Met Val Ile Ala Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Gln Glu Arg Glu Ser Gly Arg Thr Ala Val Val Val Leu 130 135 140 Thr Gln Ile Ala Ala Ile Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ala Asp Trp Ala 145 150 155 160 Lys Val Val Ile Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Lys 165 170 175 Val Ala Thr Pro Gln Gln Ala Gln Glu Ala His Ala Leu Ile Arg Ser 180 185 190 Trp Val Ser Ser Lys Ile Gly Ala Asp Val Ala Gly Glu Leu Arg Ile 195 200 205 Leu Tyr Gly Gly Ser Val Asn Gly Lys Asn Ala Arg Thr Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Arg Asp Val Asn Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Ala Thr Gln 245 250 <210> 6 <211> 250 <212> PRT <213> trypanosoma brucei <400> 6 Met Ser Lys Pro Gln Pro Ile Ala Ala Ala Asn Trp Lys Cys Asn Gly 1 5 10 15 Ser Gln Gln Ser Leu Ser Glu Leu Ile Asp Leu Phe Asn Ser Thr Ser 20 25 30 Ile Asn His Asp Val Gln Cys Val Val Ala Ser Thr Phe Val His Leu 35 40 45 Ala Met Thr Lys Glu Arg Leu Ser His Pro Lys Phe Val Ile Ala Ala 50 55 60 Gln Asn Ala Ile Ala Lys Ser Gly Ala Phe Thr Gly Glu Val Ser Leu 65 70 75 80 Pro Ile Leu Lys Asp Phe Gly Val Asn Trp Ile Val Leu Gly His Ser 85 90 95 Glu Arg Arg Ala Tyr Tyr Gly Glu Thr Asn Glu Ile Val Ala Asp Lys 100 105 110 Val Ala Ala Ala Val Ala Ser Gly Phe Met Val Ile Ala Cys Ile Gly 115 120 125 Glu Thr Leu Gln Glu Arg Glu Ser Gly Arg Thr Ala Val Val Val Leu 130 135 140 Thr Gln Ile Ala Ala Ile Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ala Asp Trp Ala 145 150 155 160 Lys Val Val Ile Ala Tyr Glu Pro Val Trp Ala Ile Gly Thr Gly Lys 165 170 175 Val Ala Thr Pro Gln Gln Ala Gln Glu Ala His Ala Leu Ile Arg Ser 180 185 190 Trp Val Ser Ser Lys Ile Gly Ala Asp Val Ala Gly Glu Leu Arg Ile 195 200 205 Leu Tyr Gly Gly Ser Val Asn Gly Lys Asn Ala Arg Thr Leu Tyr Gln 210 215 220 Gln Arg Asp Val Asn Gly Phe Leu Val Gly Gly Ala Ser Leu Lys Pro 225 230 235 240 Glu Phe Val Asp Ile Ile Lys Ala Thr Gln 245 250 <210> 7 <211> 355 <212> PRT <213> trypanosoma brucei <400> 7 Met Glu Ala Glu Thr Ser Lys Ile Ser Glu Val Pro Leu Pro Ile Pro 1 5 10 15 Ile Gly Ile Asn Gly Phe Gly Ala Val Gly Arg Ala Val Leu Phe Ala 20 25 30 Ser Met Thr Glu Pro Gln Val Thr Val Val Ala Val Asn Asp Phe Ser 35 40 45 Val Ser Ile Asn Tyr Val Leu Tyr Val Leu Gln Asn Glu Ser Pro 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tcaactctag aaactaa 747 <210> 11 <211> 1648 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 gaatccatca atagatacgt cctgaggacc gtgctaccca aatggactga ttgtgaggga 60 gacctaacta catagtgttt aagattacgg atatttaact tacttagaat aatgccattt 120 ttttgagtta taataatcct acgttagtgt gagcgggatt taaactgtga ggaccttaat 180 acattcagac acttctgacg gtatcaccct acttattccc ttcgagatta tatctaggaa 240 cccatcaggt tggtggaaga ttacccgttc taagactttt cagcttcctc tattgatgtt 300 acacttggac accccttttc tggcatccag tttttaatct tcagtggcat gtgagattct 360 ccgaaattaa ttaaagcaat cacacaattc tctcggatac cacctcggtt gaaactgaca 420 ggtggtttgt tacgcatgct aatgcaaagg agcctatata cctttggctc ggctgctgta 480 acagggaata taaagggcag cataatttag gagtttagtg aacttgcaac atttactatt 540 ttcccttctt acgtaaatat ttttcttttt aattctaaat caatcttttt caattttttg 600 tttgtattct tttcttgctt aaatctataa ctacaaaaaa cacatacata aactaaaaat 660 ggctagaact ttctttgtcg gtggtaactt taaattaaac ggttccaaac aatccattaa 720 ggaaattgtt gaaagattga acactgcttc tatcccagaa aatgtcgaag ttgttatctg 780 tcctccagct acctacttag actactctgt ctctttggtt aagaagccac aagtcactgt 840 cggtgctcaa aacgcctact tgaaggcttc tggtgctttc accggtgaaa actccgttga 900 ccaaatcaag gatgttggtg ctaagtgggt tattttgggt cactccgaaa gaagatctta 960 cttccacgaa gatgacaagt tcattgctga caagaccaag ttcgctttag gtcaaggtgt 1020 cggtgtcatc ttgtgtatcg gtgaaacttt ggaagaaaag aaggccggta agactttgga 1080 tgttgttgaa agacaattga acgctgtctt ggaagaagtt aaggactgga ctaacgtcgt 1140 tgtcgcttac gaaccagtct gggccattgg taccggtttg gctgctactc cagaagatgc 1200 tcaagatatt cacgcttcca tcagaaagtt cttggcttcc aagttgggtg acaaggctgc 1260 cagcgaattg agaatcttat acggtggttc cgctaacggt agcaacgccg ttaccttcaa 1320 ggacaaggct gatgtcgatg gtttcttggt cggtggtgct tctttgaagc cagaatttgt 1380 tgatatcatc aactctagaa actaagatta atataattat ataaaaatat tatcttcttt 1440 tctttatatc tagtgttatg taaaataaat tgatgactac ggaaagcttt tttatattgt 1500 ttctttttca ttctgagcca cttaaatttc gtgaatgttc ttgtaaggga cggtagattt 1560 acaagtgata caacaaaaag caaggcgctt tttctaataa aaagaagaaa agcatttaac 1620 aattgaacac ctctatatca acagaaga 1648 <210> 12 <211> 753 <212> DNA <213> Trypanosoma brucei <400> 12 atgtccaagc cacaacccat cgcagcagcc aactggaagt gcaacggctc ccaacagtct 60 ttgtcggagc ttattgatct gtttaactcc acaagcatca accacgacgt gcaatgcgta 120 gtggcctcca cctttgttca ccttgccatg acgaaggagc gtctttcaca ccccaaattt 180 gtgattgcgg cgcagaacgc cattgcaaag agcggtgcct tcaccggcga agtctccctg 240 cccatcctca aagatttcgg tgtcaactgg attgttctgg gtcactccga gcgccgcgca 300 tactatggtg agacaaacga gattgttgcg gacaaggttg ccgccgccgt tgctgctggt 360 ttcatggtta ttgcttgcat cggcgaaacg ctgcaggagc gtgaatcagg tcgcaccgct 420 gttgttgtgc tcacacagat cgctgctatt gctaagaaac tgaagaaggc tgactgggcc 480 aaagttgtca tcgcctacga acccgtttgg gccattggta ccggcaaggt ggcgacacca 540 cagcaagcgc aggaagccca cgcactcatc cgcagctggg tgagcagcaa gattggagca 600 gatgtcgcgg gagagctccg cattctttac ggcggttctg ttaatggaaa gaatgcgcgc 660 actctttacc aacagcgaga cgtcaacggc ttccttgttg gtggtgcctc actgaagcca 720 gaatttgtgg acatcatcaa agccactcag tga 753 <210> 13 <211> 750 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 13 atggcgccct ccaggaaatt cttcgttggg ggcaactgga agatgaacgg aaggaagaag 60 aacctggggg agctcatcac caccctgaac gcagccaagg tgccggccga caccgaggtg 120 gtttgtgcac cccccactgc ctacattgac tttgcccggc agaaactgga tcccaagatt 180 gctgtggctg cacagaactg ctacaaagtg actaacgggg ccttcactgg ggagatcagc 240 cctggcatga tcaaagactg tggagccacg tgggtggtcc tgggccactc tgagaggagg 300 catgtctttg gggaatcaga tgagctgatt gggcagaaag tggcccacgc cctgtcagag 360 ggccttggtg tgattgcctg catcggggag aagctggatg aaagggaggc tggcatcacg 420 gagaaggtcg tgtttgagca aaccaaggtc atcgcagata acgtaaagga ctggagcaag 480 gttgtcctgg cctatgagcc tgtgtgggcc atcggaaccg gcaagactgc aacaccccaa 540 caggcccagg aagtccatga gaagctccga gggtggctca agtccaacgt ctctgacgct 600 gtggctcaga gtacccgcat catctacgga ggttctgtga ctggagcaac ctgcaaggaa 660 ctggcaagcc agcctgacgt ggatggcttc cttgtgggag gtgcttccct caaacctgaa 720 ttcgtggaca tcatcaatgc caaacaataa 750 <210> 14 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 14 Met Ser 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tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctctgctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccactat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc 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tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 18 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 18 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys 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taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 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gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg tgaagatgac attgaaatca gaggaagagg aaaaactaag aaagtcagcc 960 gatactctgt ggggcattca aaaggaattg cagttttaa 999 <210> 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27 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEF promoter <400> 27 atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg actccgcgca 60 tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa atttcccctc tttcttcctc 120 tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga ccgcctcgtt 180 tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt tcttgaaaat 240 tttttttttg atttttttct ctttcgatga cctcccattg atatttaagt taataaacgg 300 tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc 360 ttgctcatta gaaagaaagc atagcaatct aatctaagtt t 401 <210> 28 <211> 655 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GPD promoter <400> 28 agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60 tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120 ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180 tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240 aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300 tcttagcgca 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tgccggtggt gcgaacaata gagcgaccat gaccttgaag gtgagacgcg 480 cataaccgct agagtacttt gaagaggaaa cagcaatagg gttgctacca gtataaatag 540 acaggtacat acaacactgg aaatggttgt ctgtttgagt acgctttcaa ttcatttggg 600 tgtgcacttt attatgttac aatatggaag ggaactttac acttctccta tgcacatata 660 ttaattaaag tccaatgcta gtagagaagg ggggtaacac ccctccgcgc tcttttccga 720 tttttttcta aaccgtggaa tatttcggat atccttttgt tgtttccggg tgtacaatat 780 ggacttcctc ttttctggca accaaaccca tacatcggga ttcctataat accttcgttg 840 gtctccctaa catgtaggtg gcggagggga gatatacaat agaacagata ccagacaaga 900 cataatgggc taaacaagac tacaccaatt acactgcctc attgatggtg gtacataacg 960 aactaatact gtagccctag acttgatagc catcatcata tcgaagtttc actacccttt 1020 ttccatttgc catctattga agtaataata ggcgcatgca acttcttttc tttttttttc 1080 ttttctctct cccccgttgt tgtctcacca tatccgcaat gacaaaaaaa tgatggaaga 1140 cactaaagga aaaaattaac gacaaagaca gcaccaacag atgtcgttgt tccagagctg 1200 atgaggggta tctcgaagca cacgaaactt tttccttcct tcattcacgc acactactct 1260 ctaatgagca acggtatacg 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Claims (18)

1. 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제의 활성이 증가되어 있는, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 증가는 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피 수가 증가되거나 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것인 효모 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 증가는 트리오스 포스페이트 이소머라제의 돌연변이에 의한 변형에 의한 것인 효모 세포.
5. 청구항 3에 있어서, 상기 유전자는 내재적 또는 외인성 유전자인 것인 효모 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 사카로미세스 세레비지애, 트리파노조마 브루세이, 토끼 세포, 또는 그의 조합 유래의 것인 효모 세포.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제는 서열번호 1 내지 9 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 10 내지 13 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
9. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트-로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 각각 서열번호 14, 16, 및 18의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
11. 청구항 9에 있어서, 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 15, 17, 및 19의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
12. 청구항 9에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 활성이 불활성화되거나 감소된 것은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체의 치환, 부가 또는 결실에 의한 것인 효모 세포.
13. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포가 복수개의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것인 효모 세포.
14. 조작되지 않은 세포에 비하여 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가되거나 그 발현이 증가되도록 변형된 것인, 락테이트 생산능을 가진 유전적으로 조작된 효모 세포.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 카피수 증가는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것인 효모 세포.
16. 효모로 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 청구항 14의 세포를 제조하는 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 효모 세포는 조작되지 않은 세포에 비하여 락테이트를 더 많이 생산하는 것인 방법.
18. 청구항 1 또는 15의 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.

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