KR102548752B1 - 마이코스포린 유사 아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법 - Google Patents
마이코스포린 유사 아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마이코스포린 유사 아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 양상에 따라 시키메이트 경로에 관여하는 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 불활성화시키는 경우 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능이 향상되므로, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 마이코스포린 유사 아미노산 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.
자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 다양한 화학, 물리적 자외선 차단 소재들이 사용되고 있다. 특히, 옥시벤존(oxybenzone), 산화아연(ZnO), 및 이산화타이타늄(TiO2)은 화장품 첨가제로 널리 사용되는 자외선 차단 물질이지만, 피부염을 초래하거나 환경오염 문제 등의 부정적인 효과 때문에 보다 안전한 바이오 기반의 자외선 차단 소재의 개발이 요구된다.
마이코스포린 유사 아미노산 (mycosporine-like amino acids; MAAs)은 강한 빛에 노출되는 해양 미생물 또는 조류 등이 생산하는 천연 자외선 차단 소재이다. 4-데옥시가두솔(4-Deoxygadusol: 4-DG)은 MAA의 일반적인 전구체로 아미노산의 단일 치환 및 이중 치환은 각각 아미노시클로헥세논(aminocyclohexenone)과 아미노클로헥세이민(aminocycloheximine) 구조를 가진다. 또한 결합된 아미노산의 종류와 추가 변형에 따라 30여개 이상의 다양한 마이코스포린 유사 아미노산이 존재한다. 이러한 다양한 종류의 MAA는 UV-A (315~400 nm)와 UV-B (310~360 nm)를 모두 포함하는 서로 다른 흡수 스펙트럼을 가질 수 있다.
마이코스포린 유사 아미노산은 미세조류 등의 미생물에서 자연적으로 생산되지만, 그 양이 극소량이며 배양 및 추출/정제하는 조건들이 복잡하여 대량 생산하기 어려운 문제가 있다. 따라서, 마이코스포린 유사 아미노산 생산 효율이 우수한 새로운 미생물의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명은 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase)의 활성이 비변형 미생물에 비해 불활성화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 미생물을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 양상은 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase)의 활성이 비변형 미생물에 비해 불활성화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소"는 포스포에놀피루브산 (phosphoenolpyruvate: PEP)와 D-에리트로스 4-포스페이트 (D-erythrose 4-phosphate: E4P)를 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate: DAHP)로 전환하는데 관여하는 효소이다.
PED + E4P → DAHP
마이코스포린 유사 아미노산은 오탄당 인산경로의 중간물인 세도헵툴로스 7-인산 (sedoheptulose 7-phosphate: S7P)로부터 생산되므로(도 1 참조), 본 발명에서는 오탄당 인산경로의 하위 경로인 시키메이트 경로 (shikimate pathway)를 약화시키고자 하였다. 따라서 시키메이트 경로의 첫번째 단계인 포스포에놀피루브산 (PEP)와 D-에리트로스 4-포스페이트 (E4P)를 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트 (DAHP)로 전환하는데 관여하는 효소인 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 불활성화시키도록 하였다.
본 명세서에서 용어 "불활성화"는 본래 미생물이 가진 효소 단백질의 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 그 활성이 약화되는 경우; 단백질이 전혀 발현이 되지 않는 경우; 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다. 상기 불활성화는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 약화하거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 미생물에 비하여 낮거나 제거된 경우; 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체가 결실된 경우; 및 이들의 조합 역시 포함하는 개념으로, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 용어 "비변형 미생물"은, 비교 대상 미생물의 특정 단백질이 자연적 또는 인위적 요인에 의해 유전적 변이되어 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 갖고 있는 미생물을 말한다. 본원에서 "비변형 미생물"은 유전적 변이가 일어나지 않은 "내재적 활성을 갖는 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 코딩하는 염색체 상의 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오티드는 기능을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드 집합체인 경우 유전자로 기재될 수 있다. 본원에서 폴리뉴클레오티드와 유전자는 혼용될 수 있으며, 폴리뉴클레오티드 서열과 뉴클레오티드 서열은 혼용될 수 있다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 미생물은 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "마이코스포린 유사 아미노산(mycosporine-like amino acids; MAAs)"은 자외선을 흡수하는 고리형 화합물을 의미한다. 상기 마이코스포린 유사 아미노산은 자외선을 흡수할 수 있는 한 제한이 없으나, 구체적으로, 사이클로헥세논(cyclohexanone) 또는 사이클로헥센이민(cyclohexenimine)의 중심 링을 가지는 화합물; 또는 상기 중심 링에 아미노산 등의 다양한 물질이 결합된 화합물일 수 있다. 더욱 구체적으로, 마이코스포린-2-글라이신 (mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (palythinol), 팰라이텐산 (palythenic acid), 데옥시가두솔 (deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (mycosporine-methylamine-threonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴 (palythine), 아스테리나-330 (asterina-330), 시노린 (shinorine), 포피라-334 (porphyra-334), 유하로테스-362 (euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신 (mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신 (mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린 (mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린 (mycosporine-taurine), 팰라이텐 (palythene), 팰라이텐-세린 (palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트 (palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(palythinol), 및 우수지렌 (usujirene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 마이코스포린 유사 아미노산은 MAA 및 MAAs와 혼용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물"은 마이코스포린 유사 아미노산의 생합성에 관여하는 효소의 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함하는 미생물을 의미할 수 있다. 또한, 본원에서 용어, "마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자"는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 의미하는 것으로, 상기 유전자들의 클러스터도 포함한다. 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 미생물의 외래 및/또는 내재적인 유전자를 모두 포함한다. 상기 외래 유전자는 동종 및/또는 이종일 수 있다.
상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는, 이를 포함하는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산 생합성에 관여하는 효소를 생산하고 결과적으로 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한, 상기 유전자들의 유래 미생물 종에는 제한이 없으나, 구체적으로, 남세균(cyanobacteria)인 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노스탁 펑크티포르메(Nostoc punctiforme), 노두라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 시아노테스 속 PCC 7424(Cyanothecesp. PCC 7424), 라인비아 속 PCC 8106(Lyngbyasp. PCC 8106), 마이크로카이스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 마이크로코레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 시아노테스 속 ATCC 51142(Cyanothecesp. ATCC 51142), 크로코스파에라 와트소니(Crocosphaerawatsonii), 시아노테스 속 CCY 0110(Cyanothecesp. CCY 0110), 시린드로스페르멈 스태그날 속 PCC 7417(cylindrospermumstagnale sp,PCC 7417), 아파노테스 할로피티카(Aphanothecehalophytica) 또는 트리코데스미운 에리트라에움(Trichodesmiumerythraeum)이거나, 또는 균류(fungi)인 마그나포르테 오르지아에(Magnaportheorzyae), 피레노포라 트리티씨-레펜티스(Pyrenophora tritici-repentis), 아스퍼질러스 클라바투스(Aspergillus clavatus), 넥트리아 헤마토코카(Nectriahaematococca), 아스퍼질러스 니두란스(Aspergillus nidulans), 지베렐라 제아에(Gibberellazeae), 베르티씰리움 알보-아트룸(Verticillium albo-atrum), 보트리오티니아 푸케리아나(Botryotinia fuckeliana), 파에오스파에리아 노도룸(Phaeosphaerianodorum)이거나, 또는 네마토르텔라 벡텐시스(Nematostellavectensis), 헤테로카프사 트리퀘트라(Heterocapsa triquetra), 옥시리스 마리나(Oxyrrhis marina), 칼로디니움 미크룸(Karlodinium micrum), 악티노신네마 미룸(Actinosynnemamirum) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에 따르면, 미생물은 서로 유래가 다른 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자들을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자는 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한되지 않으나, 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소, O-메틸 전이 효소, ATP-grasp 라이게이즈, 및 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상, 구체적으로, 1이상, 2이상, 3이상, 또는 모든 효소 단백질; 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은, 마이코스포린 유사 아미노산에 추가적인 아미노산 잔기를 부착하는 활성을 가진 효소의 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터를 포함할 수 있다. 상기 유전자 또는 상기 유전자들의 클러스터는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물이 두 개이상의 아미노산 잔기가 부착된 마이코스포린 유사 아미노산을 생산할 수 있는 한 효소 명칭이나 유래 미생물에 제한되지 않으나, 구체적으로 논-리보좀 펩티드 신테타제 (non-ribosomal peptide synthetase: NRPS), 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 (non-ribosomal peptide synthetase-like enzyme: NRPS-like enzyme) 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제 (D-Ala D-Ala ligase: DDL) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 구체적으로, 1이상, 2이상, 3이상, 또는 모든 효소 단백질; 또는 이와 동일 및/또는 유사한 활성을 가진 효소 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 일부 마이코스포린 유사 아미노산은, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 논-리보좀 펩티드 신테타제, 논-리보좀 펩티드 신테타제 유사 효소 및 D-알라닌 D-알라닌 리가제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소는, 마이코스포린-글라이신에 두 번째 아미노산 잔기를 부착시킬 수 있다.
본 명세서에서 유전자의 도입 및/또는 유전자의 결실은 순서에 상관없이 동시, 순차, 역순으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 미생물은 상기 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자를 원래부터 가지고 있는 천연형 미생물; 및 이종 및/또는 동종 유래 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자가 도입된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 미생물은 내재적 및/또는 도입된, 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 관련 유전자가 코딩하는 효소의 활성이 강화된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 미생물은 구체적으로 효모일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula), 말라세지아(Malassezia) 등의 속의 효모일 수 있다.
구체적으로, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 트로피칼리스(Candidatropicalis), 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candidaboidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyceslactis), 피키아 파스토리스(Pichiapastoris), 피키아 스티피티스(Pichiastipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomycespombe), 한세눌라 폴리모르파(Hansenulapolymorpha), 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomycesoccidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans), 말라세지아 리스트릭타(Malassezai restricta), 말라세지아 퍼퍼(Malassezai furfur) 등일 수 있다.
상기 미생물은 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 마이코스포린 유사 아미노산 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 2.5% 이상, 약 5% 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 11% 이상, 약 11.5% 이상, 약 12% 이상, 약 12.5% 이상, 약 13% 이상, 약 13.5% 이상, 약 14% 이상, 약 14.5% 이상, 약 15% 이상, 약 15.5% 이상, 약 16% 이상, 약 16.5% 이상, 약 17% 이상, 약 17.5% 이상, 약 18% 이상, 약 18.5% 이상, 약 19% 이상, 약 19.5% 이상, 약 20% 이상, 약 20.5% 이상, 약 21% 이상, 약 21.5% 이상, 약 22% 이상, 약 22.5% 이상, 약 23% 이상, 약 23.5% 이상, 약 24% 이상, 약 24.5% 이상, 약 25% 이상, 약 26% 이상, 약 27% 이상, 약 27.5% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 또는 약 85% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하 또는 약 100% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, 마이코스포린 유사 아미노산 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.03배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.06배 이상, 약 1.07배 이상, 약 1.08배 이상, 약 1.09배 이상, 약 1.10배 이상, 약 1.11배 이상, 약 1.12배 이상, 약 1.13배 이상, 약 1.14배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.16 배 이상, 약 1.17배 이상, 약 1.18배 이상, 약 1.19배 이상, 약 1.20배 이상, 약 1.5배 이상, 약 2.0배 이상, 약 2.5배 이상, 약 3.0배 이상, 약 4.0배 이상, 약 5.0배 이상, 약 10배 이상, 약 15배 이상, 약 20배 이상, 약 25배 이상, 약 30배 이상, 약 35배 이상, 약 40배 이상, 약 45배 이상, 약 50배 이상, 약 55배 이상 또는 약 60배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 100배 이하 또는 약 80배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "약(about)"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ± 0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서에서 숫자 앞에 "약"이 쓰여져 있지 않더라도, "약"이 쓰여져 있는 것과 동일하다.
본 명세서에서 용어 "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 숙주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 숙주 또는 천연형 숙주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형 질이 변화되기 전 숙주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 숙주", "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 숙주", "비변이 균주", "비변이 미생물", "비변형 숙주", "비변형 균주" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소 (2-demethyl 4-deoxygadusol synthase: DDGS), O-메틸 전이 효소 (O-methyltransferase: O-MT), ATP-grasp 라이게이즈 (ATP-grasp ligase), 및 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈 (D-Ala D-Ala ligase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소(DDGS)는, 예컨대, 도 1에 나타낸 바와 같이, 세도헵툴로스 7-인산(S7P)으로부터 2-디메틸-4-데옥시가두솔 (2-demethyl 4-deoxygadusol: DDG)을 합성할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 O-메틸 전이 효소(O-MT)는 예컨대 2-디메틸-4-데옥시가두솔(DDG)을 4-데옥시가두솔 (4-deoxygadusol: 4-DG)로 전환시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 ATP-grasp 라이게이즈는 예컨대 글리신 결합 (glycylation)을 촉매하여 4-데옥시가두솔 (4-DG)를 마이코스포린-글리신 (mycosporine-glycine: MG)으로 전환시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈는 마이코스포린-글리신 (MG)에 L-세린 (L-serine) 또는 L-트레오닌 (L-threonine)이 부착되어 시노린 (shinorine) 또는 포피라-334 (porphyra-334)이 형성되는데 관여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소, O-메틸 전이 효소, ATP-grasp 라이게이즈, 및 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈는 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다.
일 구체예에 있어서, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 (glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제 (6-phosphogluconate dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 활성이 비변형 미생물에 비해 강화된 것일 수 있다.
상기 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제는 오탄당 인산경로의 첫번째 단계인 글루코스 6-포스페이트 (glucose 6-phosphate: G6P)를 6-포스포-D-글루코노-1,5-락톤 (6-phospho-D-glucono-1,5-lactone)으로 전환하는데 관여하는 효소이며, 이에 한정되지 않는다.
상기 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제는 D-글루코네이트 6-포스페이트 (D-gluconate 6-phophate)를 D-리불로스 5-포스페이트 (D-ribulose 5-phosphate)로 전환하는데 관여하는 효소이며, 이에 한정되지 않는다.
상기 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제는 미생물의 종 또는 미생물에 따라 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 그 유래나 서열에 한정되지 않는다. 예컨대, 글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로는 ZWF (YALI0E22649)가 있으며, 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로는 GND (YALI0B15598p)가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 자연적 혹은 인위적으로 나타나게 되는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 활성 강화는 외래의 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및/또는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제를 도입하여 강화하는 것; 또는 내재적 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및/또는 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다.
구체적으로, 본원에서 활성 강화의 방법으로는, 1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는 4) 이의 조합에 의해 변형하는 방법 등에 의하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 통상의 기술자가 적절히 선택하여 수행할 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행할 수 있다.
마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자는 UAS1B8TEF 프로모터와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, UAS1B8TEF 프로모터는 서열번호 18로 구성된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로모터"는 전사단위의 발현을 제어하는 핵산 서열을 지칭한다. "프로모터 영역 (promoter region)"은 세포 내에서 RNA 중합효소를 결합시키고 다운스트림 (3'방향) 암호화 부위의 전사를 개시할 수 있는 조절 영역을 의미한다. 프로모터 영역 내에서는 추정 -35번째 구역 및 프리브노 구역 (Pribnow box, -10번째 구역)과 같은 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 영역 (공통서열)이 발견될 것이다. 또한, 프로모터 영역은 전사 개시부위 및 조절 단백질을 위한 결합부위를 포함할 수 있다.
본원에서 "아미노산 서열을 포함하는 단백질"은 "아미노산 서열을 가지는 단백질", 또는 "아미노산 서열로 구성되는 단백질"이라는 표현과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 상기 효소들은 각각의 효소와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95%이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다.
또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 효소 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 명세서에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건(stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
일 구체예에 있어서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코 스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pCRE계, pYL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "재조합 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 재조합 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
라이게이션 후에, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터는 숙주세포에 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질전환" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야 한다. 구체적으로, 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야 한다.
상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 통상의 기술자라면 과도한 실험적인 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야 한다.
본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양상은 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법을 제공한다.
이때, 미생물 및 마이코스포린 유사 아미노산은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 통상의 기술자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "배지"는 상기 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 상기 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 상기 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기 화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양에 의하여 생산된 마이코스포린 유사 아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 상기 미생물로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계에서, 상기 회수는 상기 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심 분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 마이코스포린 유사 아미노산을 회수할 수 있다.
또한, 상기 생산방법은 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 일 예에서, 상기 생산방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 미생물을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
이때, 미생물 및 마이코스포린 유사 아미노산은 전술한 바와 같다.
상기 조성물은 (i) 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소, O-메틸 전이 효소, ATP-grasp 라이게이즈 및 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; (ii) 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 유전자를 결실시키거나 상기 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키도록 조작된 재조합 벡터; (iii) 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제, 이를 암호화하는 유전자 또는 이를 포함하는 재조합 벡터; 및/또는 (iv) 상기 (i), (ii), (iii) 또는 이들의 조합을 포함하는 변이 미생물을 포함하는 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물을 제공한다. 상기 조성물 또는 상기 조성물에 포함된 변이 미생물은 오탄당 인산경로(pentose phosphate pathway) 강화를 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양상에 따라 시키메이트 경로에 관여하는 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 불활성화시키는 경우 마이코스포린 유사 아미노산의 생산능이 향상되므로, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 마이코스포린 유사 아미노산 생산 경로 및 경쟁경로를 도식화한 것이다. 여기서 ZWF 및 GND (초록색)은 과발현 타겟이며 ARO3 및 ARO4 (빨간색)는 불활성화 타겟이다.
도 2는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로 구축을 위한 유전자 삽입용 플라스미드의 제작 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 CBEYL002, CBEYL002aro3△, CBEYL002aro4△, CBEYL002aro3△aro4△ 균주의 성장과 마이코스포린 유사 아미노산 생산량을 나타낸 그래프이다. 여기서 PO는 포피라-334를 지칭하고, SH는 시노린을 지칭한다.
도 4는 CBEYL002aro3△aro4△ [EV], CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-ZWF], CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-ZWF], CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-GND] 균주의 마이코스포린 유사 아미노산 생산량을 나타낸 그래프이다. 여기서 PO는 포피라-334를 지칭하고, SH는 시노린을 지칭한다.
도 2는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로 구축을 위한 유전자 삽입용 플라스미드의 제작 방법을 도식화한 것이다.
도 3은 CBEYL002, CBEYL002aro3△, CBEYL002aro4△, CBEYL002aro3△aro4△ 균주의 성장과 마이코스포린 유사 아미노산 생산량을 나타낸 그래프이다. 여기서 PO는 포피라-334를 지칭하고, SH는 시노린을 지칭한다.
도 4는 CBEYL002aro3△aro4△ [EV], CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-ZWF], CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-ZWF], CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-GND] 균주의 마이코스포린 유사 아미노산 생산량을 나타낸 그래프이다. 여기서 PO는 포피라-334를 지칭하고, SH는 시노린을 지칭한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 미세조류 유래 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자의 유전체 삽입용 벡터 제작
효모 Yarrowia lipolytica는 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로가 존재하지 않아 외래의 유전자를 도입하여 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 경로를 구축해야 한다 (도 1 참조). 마이코스포린 유사 아미노산인 시노린 및 포피라-334은 오탄당 인산경로의 중간체인 세도헵툴로스 7-인산 (sedoheptulose 7-phosphate: S7P)으로부터 4단계의 효소 전환 반응을 통해 합성된다. 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소 (2-demethyl 4-deoxygadusol synthase: DDGS)에 의하여 세도헵툴로스 7-인산이 2-디메틸-4-데옥시가두솔 (2-demethyl 4-deoxygadusol: DDG)로 전환되며 이후 O-메틸 전이 효소 (O-methyltransferase: O-MT)에 의하여 4-데옥시가두솔 (4-deoxygadusol: 4-DG)로 전환된다. 이후 효소 ATP-grasp 라이게이즈 (ATP-grasp ligase)가 글리신 결합 (glycylation)을 촉매하여 4-DG를 마이코스포린-글리신 (mycosporine-glycine: MG)으로 전환시킨다. 마지막으로 효소 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈 (D-Ala D-Ala ligase)에 의하여 마이코스포린-글리신 (MG)에 L-세린 (L-serine) 또는 L-트레오닌 (L-threonine)이 부착되어 시노린 (shinorine) 또는 포피라-334 (porphyra-334)가 형성된다 (도 1 참조).
DDGS (Ava3858), O-MT (Ava3857), 그리고 ATP-grasp ligase (Ava3856)를 암호화하는 유전자는 아나베나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis, ATCC 29413) 유래의 것을 코돈 최적화하여 사용하였으며 D-Ala D-Ala ligase (NpF5597)를 암호화하는 유전자는 노스탁 펑크티포르메 (Nostoc punctiforme, ATCC29133) 유래의 것을 코돈 최적화하여 사용하였다. 각 유전자는 UAS1B8TEF(136) 프로모터로 발현하고자 UAS1B8TEF(136) 프로모터 - 유전자 - CYC1 터미네이터 카세트를 제작하였다.
이들 4종의 유전자 카세트는 Cre-LoxP 시스템을 활용하여 유전체에 삽입하였다. 유전체 삽입 위치는 문헌 (Holkenbrink et al, Biotechnol. J. 2018, 13, 1700543)을 참고하여 유전자 발현이 잘 되는 곳으로 선정하였다. 먼저 선별 마커 (LoxP-URA3-LoxP) 양 말단에 유전체 삽입 위치의 서열 (0.9~1.0 kb)이 포함되도록 플라스미드를 제작하였다. 유전체 삽입 위치는 IntC3, IntD1, IntE3로 명명하며 이에 해당하는 서열은 서열 목록에서 확인할 수 있다. 4종의 유전자 카세트는 NPF5597, Ava3856, Ava3857, 그리고 Ava3858 순으로 클로닝 하였으며 최종적으로 유전자 삽입용 플라스미드 'IntC3-NAAA', 'IntD1-NAAA', 그리고 'IntE3-NAAA'로 명명하였다 (도 2 및 표 1 참조).
| Plasmid | Description |
| *유전자 삽입용 | |
| IntC3-NAAA | IntC3:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 , loxP-URA3-loxP, Amp R , ColE1 |
| IntD1-NAAA | IntD1:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 , loxP-URA3-loxP, Amp R , ColE1 |
| IntE3-NAAA | IntE3:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 , loxP-URA3-loxP, Amp R , ColE1 |
| pCRE | P EXP1 -Cre-T CYC1 , LEU, ARS18, Amp R , ColE1 |
실시예 2: 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자가 삽입된 균주 제작
실시예 1에서 제작된 IntD1-NAAA 플라스미드를 NdeI 제한효소로 처리하여 마이코스포린 유사 아미노산 생합성 유전자 삽입용 카세트를 제작하였다. 해당 카세트를 Polgku70△ura3△ 균주 (Beag et al., Metabolic Engineering of Yarrowia lipolytica for the production of carotenoids, ß-carotene, and crocetin 참조)에 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법을 사용하여 형질 전환시킨 후 SC-Ura 플레이트에서 선별하였다. URA3 선별마커는 Cre 재조합효소를 발현시키는 pCRE를 이용하여 제거하였다. 동일한 방법을 이용하여 상기 실시예 1에서 제작된 IntC3-NAAA와 IntE3-NAAA도 순차적으로 삽입하였고 이를 'CBEYL002' 균주로 명명하였다.
실시예 3: 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHP synthase)를 불활성화 시킬 수 있는 벡터 제작
마이코스포린 유사 아미노산은 오탄당 인산경로의 중간물인 S7P로부터 생산 (도 1 참조)되므로 오탄당 인산경로의 하위 경로인 시키메이트 경로 (shikimate pathway)를 약화시켜 중간물인 S7P이 축적될 수 있도록 하였다. 따라서 시키메이트 경로의 첫번째 단계인 포스포에놀피루브산 (phosphoenolpyruvate: PEP)와 D-에리트로스 4-포스페이트 (D-erythrose 4-phosphate: E4P)를 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트 (3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate: DAHP)로 전환하는데 관여하는 효소인 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase: DAHPS)를 불활성화 시키고자 하였다.
효모 Yarrowia lipolytica 내에는 2가지 이상의 DAHPS isoform이 존재한다. 이에 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 암호화하는 유전자 ARO3 (YALI0B20020) 또는 ARO4 (YALI0C06952)를 불활성화시켜 마이코스포린 유사 아미노산 생산 증가 효과가 있는지 확인하고자 하였다.
ARO3 또는 ARO4를 불활성화시키기 위하여 CRISPR 시스템 기반의 염기 편집(base editing) 기술 (Bae et al., Biotechnol. J. 2020, 15, 1900238)을 사용하여 타겟 유전자에 종결 코돈을 삽입하고자 하였다. 해당 유전자에 종결 코돈이 삽입될 수 있도록 표 2와 같이 gRNA 서열을 디자인하였으며 해당 서열이 삽입되어 있는 플라스미드는 pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[W] 플라스미드를 주형으로 inverse PCR을 수행하여 pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO3], pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO4] 플라스미드를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 표 3과 같다.
| 타겟 유전자 | gRNA | 서열번호 |
| ARO3 | ACCGAAACCGGACCGAGGAC | 26 |
| ARO4 | GCTGCGATCCAAGTCCAAGG | 27 |
| Plasmid | Description |
| * 유전자 불활성화용 | |
| pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[W] | P TEFin -nCAS9-T CYC1 , P SCR1  |
| pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO3] | pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[W] replacing TRP1 gRNA with ARO3 gRNA |
| pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO4] | pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[W] replacing TRP1 gRNA with ARO3 gRNA |
실시예 4:
ARO3
와
ARO4
가 불활성된 균주 제작
CBEYL002 균주에 실시예 3에서 제작된 pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO3], 또는 pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO4] 플라스미드를 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법을 사용하여 형질 전환시켰다. 상기 얻어진 형질전환 효모 균주를 SC-Leu 배지에 접종하여 약 16~18시간 배양한 후 적절히 희석하여 YPD (yeast extract-peptone-dextrose) 플레이트에 배양하였다. 단일 콜로니를 선별하여 ARO3 또는 ARO4 유전자를 PCR 한 후 시퀀싱하여 넌센스 돌연변이가 삽입되었는지 확인하였다 (표 4). 동일한 방법을 사용하여 CBEYL002aro4△ 균주에 pCRISPRyl-P TEFin -nCas9-pmCDA1-UGI[ARO3]를 형질전환하여 CBEYL002aro3△aro4△를 제작하였다. 제작된 균주는 표 4에 나타내었다.
| Strain | Description |
| CBEYL002 | Polgku70△ura3△ IntC3:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 -loxP, IntD1:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 -loxP, IntE3:: PUAS1B8- TEF (136)-NpF5597-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3856-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3857-T CYC1 , PUAS1B8- TEF (136)-Ava3858-T CYC1 -loxP |
| CBEYL002aro3△ | CBEYL001, Aro3 14R->stop |
| CBEYL002aro4△ | CBEYL001, Aro4 40R->stop |
| CBEYL002aro3△aro4△ | CBEYL001, Aro3 14R->stop, Aro4 40R->stop |
| CBEYL002aro3△aro4△ [EV] | CBEYL002aro3△aro4△ harboring pYL-LEU |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-ZWF] | CBEYL002aro3△aro4△ harboring pYL-PEXP-ZWF-LEU |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-GND] | CBEYL002aro3△aro4△ harboring pYL-PEXP-GND-LEU |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-ZWF] | CBEYL002aro3△aro4△ harboring pYL-PUAS1B8TEF(136)-ZWF-LEU |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-GND] | CBEYL002aro3△aro4△ harboring pYL-PUAS1B8TEF(136)-GND-LEU |
실시예 5:
ARO3
와
ARO4
가 불활성화된 균주의 마이코스포린 유사 아미노산 생산능 평가
실시예 2 및 4에서 제작된 균주 CBEYL002, CBEYL002aro3△, CBEYL002aro4△, CBEYL002aro3△aro4△ 균주의 마이코스포린 유사 아미노산의 생산 효과를 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로 먼저, YPD 배지 (20 g/L 포도당, 10 g/L yeast extract, 20 /L bacto-peptone)에 O.D600=0.2로 접종하여 30 ℃ 및 220 rpm 조건하에서 148시간 동안 배양하였다. 배지 내 마이코스포린 유사 아미노산 (MAA)을 정량하기 위하여 배양액 1 mL을 원심분리 한 후 상등액을 얻고, 이를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 HPLC 분석을 수행하였다. Agilent Eclipse XDB-C18 컬럼 (5 μm, 4.6 Х 250 mm)을 갖춘 1260 infinity HPLC 시스템 (Agilent)를 이용하였고, 컬럼 온도는 40 ℃로 유지하며 0.5 mL/분의 유속으로 용매 (0.25% Trifluoroacetic acid가 포함된 물 : 0.25% Trifluoroacetic acid가 포함된 아세토니트릴 = 97.5 : 2.5)를 흘려주었다. 파장 334 nm에서 UV-vis 검출기로 시노린 및 포피라-334를 검출하였다. 상기와 같이 HPLC를 이용하여 마이코스포린 유사 아미노산 (시노린 및 포피라-334)을 정량한 결과를 도 3 및 표 5 에 나타내었다.
도 3 및 표 5에 나타낸 바와 같이, CBEYL002 균주와 비교하여 ARO3 유전자가 불활성화된 CBEYL002aro3△ 균주는 마이코스포린 유사 아미노산 생산량이 약 38% 증가하였고 ARO4 유전자가 불활성화된 CBEYL002aro4△ 균주는 마이코스포린 유사 아미노산 생산량이 약 88% 증가하였다. 또한, ARO3 및 ARO4 유전자가 모두 불활성화된 CBEYL002aro3△aro4△ 균주는 마이코스포린 유사 아미노산 생산량이 약 74% 증가하였다.
| 148 h | O.D 600 | 마이코스포린 유사 아미노산 (mg/L) | ||
| 시노린 | 포피라-334 | 합계 | ||
| CBEYL002 | 27.36±1.48 | 10.20 | 5.96 | 16.16 |
| CBEYL002aro3△ | 25.77±1.28 | 16.23 | 6.08 | 22.31 |
| CBEYL002aro4△ | 30.05±2.50 | 20.01 | 10.41 | 30.42 |
| CBEYL002aro3△aro4△ | 25.40±0.28 | 18.34 | 9.90 | 28.24 |
상기와 같은 실험결과로부터 본 발명의 일 구체예에 따라 시키메이트 경로에 관여하는 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 암호화하는 유전자 ARO3 (YALI0B20020) 및/또는 ARO4 (YALI0C06952)를 불활성화시키는 경우 마이코스포린 유사 아미노산의 생산이 증가함을 알 수 있다.
실시예 6: 오탄당 인산경로의 강화를 위한
GND
및
ZWF
의 과발현용 벡터 제작
마이코스포린 유사 아미노산은 오탄당 인산경로의 중간물인 S7P로부터 생산되므로(도 1 참조) 해당경로를 강화하여 마이코스포린 유사 아미노산의 생산량을 증대시키고자 하였다. 이에 오탄당 인산경로의 첫번째 단계인 글루코스 6-포스페이트 (glucose 6-phosphate: G6P)를 6-포스포-D-글루코노-1,5-락톤 (6-phospho-D-glucono-1,5-lactone)으로 전환하는데 관여하는 효소 글루코스 6-포스페이트 1-데하이드로게나제 (glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 ZWF (YALI0E22649)를 강화하고자 하였다. 또한 D-글루코네이트 6-포스페이트 (D-gluconate 6-phophate)를 D-리불로스 5-포스페이트 (D-ribulose 5-phosphate)로 전환하는데 관여하는 효소 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제 (6-phosphogluconate dehydrogenase)를 암호화하는 유전자 GND (YALI0B15598p)를 강화하고자 하였다.
GND 및 ZWF의 과발현 효과를 확인하기 위해, 이들 유전자를 개별적으로 발현하는 플라스미드를 제작하였다. 각각 유전자의 단편은 CBEYL002의 genomic DNA로부터 PCR을 통해 확보하였고 각 유전자는 EXP 프로모터 또는 UAS1B8TEF(136) 프로모터의 조절하에 발현하였다. 프로모터-유전자-터미네이터 (PEX20) 카세트를 pYL-LEU 플라스미드에 삽입하여 pYL-LEU, pYL-P EXP -ZWF-LEU, pYL-P EXP -GND-LEU, pYL-P UAS1B8TEF(136) -ZWF-LEU, 또는 pYL-P UAS1B8TEF(136) -GND-LEU 플라스미드를 제작하였다. 제작된 플라스미드는 표 6에 나타내었다.
| Plasmid | Description |
| *유전자 발현용 | |
| pYL-LEU | LEU, CEN, Ori1001, Amp R , ColE1 |
| pYL-PEXP-ZWF-LEU | P EXP -ZWF-T PEX20 , LEU, CEN, Ori1001, Amp R , ColE1 |
| pYL-PEXP-GND-LEU | P EXP -GND-T PEX20 , LEU, CEN, Ori1001, Amp R , ColE1 |
| pYL-PUAS1B8TEF(136)-ZWF-LEU | P UAS1B8TEF(136) -ZWF-T PEX20 , LEU, CEN, Ori1001, Amp R , ColE1 |
| pYL-PUAS1B8TEF(136)-GND-LEU | P UAS1B8TEF(136) -GND-T PEX20 , LEU, CEN, Ori1001, Amp R , ColE1 |
실시예 7:
GND
및
ZWF
의 과발현을 통한 마이코스포린 유사 아미노산 생산능 평가
GND 또는 ZWF를 과발현 시켰을 때 마이코스포린 유사 아미노산의 생산량이 증가하는지 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, CBEYL002aro3△aro4△ 균주에 실시예 6에서 제작된 pYL-LEU, pYL-P EXP -ZWF-LEU, pYL-P EXP -GND-LEU, pYL-P UAS1B8TEF(136) -ZWF-LEU, 또는 pYL-P UAS1B8TEF(136) -GND-LEU 플라스미드를 LiAc/SS carrier DNA/PEG 방법을 사용하여 형질 전환시켰다. 형질전환 효모 균주는 표 4에 나타내었다. 상기 얻어진 형질전환 효모 균주를 SC-Leu 배지 (20 g/L 포도당, 6.7 g/L YNB without amino acid, 류신을 제외한 아미노산 첨가물)에 O.D600=0.2로 접종하여 30 ℃ 및 220 rpm 조건하에서 148시간 동안 배양하였다. 실시예 5에 명시한 방법과 같이 마이코스포린 유사 아미노산의 농도를 측정하여 도 4 및 표 7에 나타내었다.
도 4 및 표 7에 나타난 바와 같이, 두 유전자를 EXP 프로모터 조절하에 발현한 경우 효과가 없었지만 UAS1B8TEF(136) 프로모터 조절하에 발현한 경우 마이코스포린 유사 아미노산 생산량이 크게 증가하였다. 또한, 공벡터를 보유하는 CBEYL002aro3△aro4△ [EV] 균주와 비교하여 CBEYL002aro3△aro4△ [P UAS1B8TEF(136) -ZWF] 균주와 CBEYL002aro3△aro4△ [P UAS1B8TEF(136) -GND] 균주의 마이코스포린 유사 아미노산 생산량은 각각 2.4배, 2.7배 증가하였다.
| 120 h | 마이코스포린 유사 아미노산 (mg/L) | ||
| 시노린 | 포피라-334 | 합계 | |
| CBEYL002aro3△aro4△ [EV] | 11.93±0.77 | 12.35±1.73 | 24.28±1.76 |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-ZWF] | 13.31±2.82 | 16.22±4.02 | 29.54±4.84 |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PEXP-GND] | 9.58±1.70 | 10.19±1.94 | 19.77±2.57 |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-ZWF] | 24.30±0.67 | 26.90±1.91 | 57.25±1.82 |
| CBEYL002aro3△aro4△ [PUAS1B8TEF(136)-GND] | 32.94±2.70 | 38.13±3.01 | 65.02±4.04 |
상기와 같은 실험결과로부터 본 발명의 일 구체예에 따라 본 발명에 따라 시키메이트 경로에 관여하는 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (DAHPS)를 암호화하는 유전자가 불활성화된 균주에 UAS1B8TEF(136) 프로모터 조절하에 GND 또는 ZWF를 과발현시킨 경우 마이코스포린 유사 아미노산의 생산이 현저히 증가함을 알 수 있다. 이는 본 발명의 일 구체예에 따른 미생물이 마이코스포린 유사 아미노산 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 시사한다.
Claims (8)
- 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물로서 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성 효소 (3-deoxy-7-phosphoheptulonate synthase)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 미생물이 2-디메틸 4-데옥시가두솔 합성 효소 (2-demethyl 4-deoxygadusol synthase), O-메틸 전이 효소 (O-methyltransferase), ATP-grasp 라이게이즈 (ATP-grasp ligase), 및 D-알라닌 D-알라닌 라이게이즈 (D-Ala D-Ala ligase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 (glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase) 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제 (6-phosphogluconate dehydrogenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
- 청구항 3에 있어서, 글루코오스-6-포스페이트 1-데하이드로게나아제 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 유전자는 UAS1B8TEF 프로모터와 작동가능하게 연결된, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 미생물은 효모인 것인, 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물.
- 청구항 1에 있어서, 마이코스포린 유사 아미노산은 마이코스포린-2-글라이신 (mycosporine-2-glycine), 팰라이티놀 (palythinol), 팰라이텐산 (palythenic acid), 데옥시가두솔 (deoxygadusol), 마이코스포린-메틸아민-트레오닌 (mycosporine-methylamine-threonine), 마이코스포린-글라이신-발린 (mycosporine-glycine-valine), 팰라이틴 (palythine), 아스테리나-330 (asterina-330), 시노린 (shinorine), 포피라-334 (porphyra-334), 유하로테스-362 (euhalothece-362), 마이코스포린-글라이신 (mycosporine-glycine), 마이코스포린-오르니틴 (mycosporine-ornithine), 마이코스포린-라이신 (mycosporine-lysine), 마이코스포린-글루탐산-글라이신 (mycosporine-glutamic acid-glycine), 마이코스포린-메틸아민-세린 (mycosporine-methylamine-serine), 마이코스포린-타우린 (mycosporine-taurine), 팰라이텐 (palythene), 팰라이텐-세린 (palythine-serine), 팰라이텐-세린-설페이트 (palythine-serine-sulfate), 팰라이티놀(palythinol), 및 우수지렌 (usujirene)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 재조합 미생물.
- 청구항 1의 미생물을 배양하는 단계; 및
상기 배양된 미생물 또는 배지로부터 마이코스포린 유사 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법. - 청구항 1의 미생물을 포함하는, 마이코스포린 유사 아미노산 생산용 조성물.
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