KR101819189B1 - 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 아세토인을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 아세토인을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 아세토인을 생산하는 방법{Genetically engineered yeast cell producing acetoin and method of producing acetoin using the same}

아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 아세토인을 생산하는 방법에 관한 것이다.

아세토인은 버터향이 나는 향료로 식품, 화장품, 담배, 또는 세제 등에 널리 사용될 뿐 아니라 해충의 유인제로 작용하여 방충제로서의 활용도 가능하다. 이러한 아세토인의 다양한 활용 용도와 대량 생산 가능성으로 인해, 아세토인은 미국 에너지국이 정한 바이오 매스로부터 생산 가능한 30개 플랫폼 화학물질에 포함되어 있다.

현재 대부분의 아세토인은 화학적 합성법으로 생산되고 있으나, 화장품이나 식품에 사용될 경우 천연 향료로서의 활용에 대한 선호도가 증가하고 있어, 생물공정을 통한 생산이 주목받고 있다.

최근 많은 미생물 균주 개발 기반의 연구들은 박테리아를 기반으로 진행되고 있으나 이들 중 대부분은 병원성을 가지거나 산성조건, 삼투압이나 고농도의 글루코오스에 대한 내성이 부족하여 산업적 스케일에 적용하는데 한계를 지닌다. 이에, 일반적으로 안전(GRAS: Generally Recognized As Safe) 하다고 여겨지는 미생물을 사용하여 고효율 및 고수율로 아세토인을 생산하는 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 아세토인을 효과적으로 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 유전적으로 조작된 효모 세포를 사용하여 아세토인을 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 제공한다.

상기 효모 세포는 모세포에 비하여 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase), 및 아세토락테이트 디카복실레이즈(acetolactate decarboxylase)의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.

용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 의미할 수 있다. 상기 모세포는 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 사항에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 모세포는 주어진 단백질의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 또는 시작 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다.

또한, 본 발명에서 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 증가된 활성을 갖는 세포 또는 미생물은, 유전적 변형을 갖지 않은 세포 또는 미생물에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아세토인(acetoin)"은 3-히드록시부타논(3-hydroxybutanone) 또는 아세틸 메틸 카르비놀(acetyl methyl carbinol)과 호환적으로 사용되고, C₄H₈O₂의 분자식을 갖는 화합물을 의미할 수 있다. 상기 아세토인은 (R)-아세토인을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "아세토락테이트 신타아제 (acetolactate synthase) (ALS)" (아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase) (AHAS)와 호환적으로 사용됨)는, 류신, 발린 및 이소류신 등의 분지쇄 아미노산 생합성 경로에 대한 조절효소로서, 두 분자의 피루브산으로부터 각각 한 분자의 이산화탄소와 아세토락테이트를 합성하는 효소일 수 있으며, 미생물 또는 식물 전체에 걸쳐 폭넓게 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 아세토락테이트 신타아제는 효소의 이름이 상이하더라도 그와 유사한 활성을 갖는 효소(예를 들면, 동질효소(isoenzyme) 또는 동족체(homolog))를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스 유래의 alsS에 의해 암호화되는 아세토락테이트 신타아제, 대장균 유래의 ilvB 또는 ilvN에 의해 암호화되는 아세토락테이트 신타아제 I, 대장균 유래의 ilvGMEDA에 의해 암호화되는 아세토락테이트 신타아제 II, 또는 대장균 유래의 ilvI 또는 ilvH에 의해 암호화되는 아세토락테이트 신타아제 III를 포함할 수 있다. 또한, 이외에, 대장균, 사카로마이세스 세레비지애, 탄저균(Bacillus anthracis), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium), 써모타가 마리티마(Thermotoga maritima), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 또는 스트렙토마이세스 신나모네시스(Streptomyces cinnamonensis) 유래의 아세토락테이트 신타아제일 수 있다. 추가적으로 식물 유래로는 애기 장대(Arabidopsis thaliana), 고시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 헬리안투스 안누우스(Helianthus annuus), 또는 브라시카 나푸스(Brassica napus) 유래의 아세토락테이트 신타아제일 수 있다. 또한, 상기 아세토락테이트 신타아제는 서열번호 2의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 여기서 "상동성"은 주어진 폴리뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

본 발명에서 용어 "아세토락테이트 디카복실레이즈 (acetolactate decarboxylase) (ALD)"는 아세토락테이트로부터 이산화탄소를 제거하여 아세토인(acetoin)을 생산하는 효소를 의미할 수 있다. 상기 아세토락테이트 디카복실레이즈는 효소의 이름이 상이하더라도 그와 유사한 활성을 갖는 효소(예를 들면, 동질효소(isoenzyme) 또는 동족체(homolog))를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스 유래의 alsD, 락토바실러스 델브루키(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) 유래의 aldB, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis), 사카로마이세스 세레비지애. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 아세토락테이트 디카복실레이즈일 수 있다. 또한, 상기 아세토락테이트 디카복실레이즈는 서열번호 4의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다.

상기 효모 세포는 NADH 산화효소의 활성이 추가적으로 증가되어 있는 것인 효모 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 "NADH 산화효소(NADH oxidase)"는 산소와 NADH를 기질로 하여 물과 NAD⁺를 생산하는 반응을 매개하는 효소를 의미할 수 있다. 상기 NADH 산화효소는 효소의 이름이 상이하더라도 그와 유사한 활성을 갖는 효소(예를 들면, 동질효소(isoenzyme) 또는 동족체(homolog))를 포함할 수 있으며, 예를 들면, nox1, nox3, nox4, 락토코커스 락티스 유래의 noxE를 포함할 수 있고, 이외에, 엔테로코커스 속, 락토바실러스 속, 디설포비브리오 속(Desulfovibrio sp .), 클로스트리디움 속(Clostridium sp .) 스트렙토코커스 속 유래의 NADH 산화효소일 수 있다. 또한, 상기 NADH 산화효소는 서열번호 17의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다.

상기 효모 세포는 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 외인성 유전자 (exogenous gene), 아세토락테이트 디카복실레이즈를 코딩하는 외인성 유전자, 및 NADH 산화효소를 코딩하는 외인성 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이상을 포함하는 것일 수 있다. 용어 "외인성 (exogenous)"은 언급된 분자 (referenced molecule) 또는 언급된 활성 (referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미할 수 있다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산 (encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원 (source)은 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성 (homologous) 또는 이질성 (heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성 (endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성 (heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성 (homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성 (heterologous) 또는 동질성 (homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.

상기 외인성 유전자는, 상기 효모 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 효소의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 외인성 유전자, 아세토락테이트 디카복실레이즈를 코딩하는 외인성 유전자, 및 NADH 산화효소를 코딩하는 외인성 유전자의 상동 유전자(homolog)는 서로 다른 미생물로부터 유래하였으나 그들이 코딩하는 단백질과 유사한 활성을 나타내는 단백질을 암호화하는 유전자를 의미할 수 있다. 상기 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 외인성 유전자, 아세토락테이트 디카복실레이즈를 코딩하는 외인성 유전자, 및 NADH 산화효소를 코딩하는 외인성 유전자는 각각 서열번호 2, 4, 및 17의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 외인성 유전자, 아세토락테이트 디카복실레이즈를 코딩하는 외인성 유전자, 및 NADH 산화효소를 코딩하는 외인성 유전자는 각각 서열번호 1, 3, 및 16의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다. 이러한 외인성 유전자는 미생물에서 발현되기에 적합한 코돈으로 변경된 서열, 최적화된 코돈을 갖는 서열로 변경될 수 있다. 이 코돈 변경은 단백질의 아미노산 서열이 바뀌지 않는 범위 내에서 적절히 이루어질 수 있다.

상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 TDH3 프로모터, TEF 프로모터, 및 FBA1 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 CYC1, GPM1, 및 FBA1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

상기 효모 세포는 단일 유전자, 복수의 유전자 예를 들면, 2 내지 10 카피 수를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는, 예를 들면, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 카피의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 유전자를 포함하는 경우, 각각의 유전자는 동일한 유전자의 카피이거나 둘 이상의 상이한 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자 좌 (locus), 또는 여러 유전자 좌에 포함될 수 있다.

본 발명에서 제1 과 (family) 또는 종 (species)의 본래 효소 또는 유전자와 관련하여 사용된 용어 "동족체 (homolog)"는 기능적, 구조적 또는 유전체적 분석에 의해, 제1 과 또는 종의 본래 효소 또는 유전자에 상응하는 제2 과 (family) 또는 종 (species)의 효소 또는 유전자인 것으로 결정되는 제2 과 또는 종의 별개의 효소 또는 유전자를 지칭한다. 동족체는 기능적, 구조적 또는 유전체적 유사성을 가질 수 있다. 유전자 프로브 및 PCR을 이용하여 효소 또는 유전자의 동족체를 용이하게 클로닝할 수 있는 기술은 공지되어 있다. 클로닝된 서열의 동족체로서의 확인은 기능적 검사법을 이용하고 및/또는 유전자의 유전체 맵핑 (genomic mapping)에 의해 확인될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 "유전자"를 포함하고, 본 명세서에서 사용된 핵산 분자는 "벡터" 또는 "플라스미드"를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 따라서 용어 "유전자" (일명, "구조적 유전자")는 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데, 이것은 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하고, 그리고 예로써, 유전자가 발현되는 조건을 결정하는 조절 (비-전사된) DNA 서열, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 유전자의 전사된 영역은 코딩 서열뿐만 아니라 인트론, 5'-비번역 영역 (UTR), 그리고 3'-UTR을 비롯한 비번역 영역을 포함할 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 모세포에 비하여 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 글리세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase) 또는 2,3-부탄다이올 탈수소효소(2,3-butanediol dehydrogenase)의 활성이 감소되어 있는 것인 효모 세포 일 수 있다.

본 발명에서 용어 "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "활성 감소 (decrease in activity)" 또는 "감소된 활성 (decreased activity)"은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type)의 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 활성 감소 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것, 예를 들면, 불활성화(incactivation)를 포함한다. 상기 감소된 활성을 갖는 세포는, 유전적 변형을 갖지 않은 세포에 비하여 하나 이상의 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 감소시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다.

상기 알코올 탈수소효소, 글리세롤-3-인산 탈수소효소 또는 2,3-부탄다이올 탈수소효소의 활성이 감소된 미생물은 상기 단백질을 코딩하는 내인성 유전자(endogenous gene)가 제거 또는 파괴(disruption)된 것일 수 있다. 용어 "제거(deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자의 발현이 감소되도록 하는 유전적 변형을 나타낸다. 상기 파괴는 유전자의 "불활성화 (inactivation)" 또는 유전자의 "감쇄 (attenuation)"를 포함할 수 있다. 상기 불활성화는 유전자의 기능적 산물 (functional product)이 발현되지 않는 것뿐만 아니라 발현은 되지만 기능적 산물이 발현되지 않는 것을 포함한다. 상기 감쇄는 유전자의 기능적 산물의 발현량 감소를 포함한다. 즉, 상기 감쇄는 유전자의 순 발현량은 증가하였더라도 기능적 산물의 발현량이 감소되는 것을 포함할 수 있다. 여기서 유전자의 기능적 산물이란 모세포 또는 야생형 세포에서 상기 유전자의 산물 (예, 효소)이 갖는 생화학적 또는 생리적 기능 (예, 효소 활성)을 보유하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 제거 또는 파괴는 유전자의 기능적 제거(functional deletion) 또는 파괴(functional disruption)를 포함한다.

상기 제거 또는 파괴하는 단계는 1) 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체의 결실, 2) 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 유전자 서열의 변형 또는 4) 이의 조합 등을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 예를 들면, Cre/loxP 재조합 시스템을 사용하여 유전자 결손을 위한 카세트를 모세포에 형질전환함으로써 수행될 수 있고, 효모 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 예를 들면, 1 내지 700개, 1 내지 500개, 1 내지 300개, 1 내지 100개, 또는 1 내지 50개일 수 있다. 또한, 상기 뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 아울러, 상기 단백질을 암호화하는, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 "알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)"는 NADH의 산화로 알코올 및 알데하이드 또는 케톤 사이의 상호전환을 촉진하는 효소를 의미할 수 있다. 상기 알코올 탈수소효소는 효소의 이름이 상이하더라도, 그와 유사한 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7 또는 SFA1를 포함할 수 있다. 또한, 상기 알코올 탈수소효소는 서열번호 25, 27, 29, 31, 또는 33의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 상기 알코올 탈수소효소 유전자는 서열번호 24, 26, 28, 30, 또는 32의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "글리세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)"는 DHAP(dihydroxyacetone phosphate)의 글리세롤-3-인산(G3P)으로의 전환을 촉진하는 효소를 의미할 수 있다. 상기 글리세롤-3-인산 탈수소효소는 효소의 이름이 상이하더라도, 그와 유사한 활성을 갖는 효소를 포함할 수 있으며, 예를 들면, GPD1 또는 GPD2를 포함할 수 있다. 또한, 상기 글리세롤-3-인산 탈수소효소는 서열번호 35 또는 37의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 상기 글리세롤-3-인산 탈수소효소 유전자는 서열번호 34 또는 36의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "2,3-부탄다이올 탈수소효소(2,3-butnaediol dehydrogense) (BDH)"는 아세토인, NADH, 및 H⁺를 기질로 하여, 2,3-부탄다이올 및 NAD⁺를 생산하는 효소를 의미할 수 있으며, 옥시도리덕타아제(oxidoreductase) 과(family)에 속한다. 상기 2,3-부탄다이올 탈수소효소는 효소의 이름이 상이하더라도 그와 유사한 활성을 갖는 효소(예를 들면, 동질효소(isoenzyme) 또는 동족체(homolog))를 포함할 수 있으며, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 BDH1, 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) 유래의 BDH99::67, 바실러스 서브틸리스, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 엔테로코커스 듀란스(Enterococcus durans) 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp .) 락토바실러스 락티스 유래의 2,3-부탄다이올 탈수소효소일 수 있다. 또한, 상기 2,3-부탄다이올 탈수소효소는 서열번호 39의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다. 상기 2,3-부탄다이올 탈수소효소 유전자는 서열번호 38의 뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.

상기 아세토인 생산능이 증가된 유전적으로 조작된 효모 세포의 제조에 있어서, 아세토락테이트 신타아제, 아세토락테이트 디카복실레이즈, 또는 NADH 산화 효소의 활성 증가 또는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 도입, 알코올 탈수소효소, 글리세롤-3-인산 탈수소효소 또는 2,3-부탄다이올 탈수소효소의 활성 감소 또는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴는 동시에 또는 개별적으로 수행될 수 있다. 일구체예에 있어서, 유전적으로 조작된 효모 세포의 제조는 모세포에 알코올 탈수소효소, 글리세롤-3-인산 탈수소효소, 2,3-부탄다이올 탈수소효소 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자를 제거한 후, 아세토락테이트 신타아제, 아세토락테이트 디카복실레이즈, NADH 산화 효소 또는 그의 조합을 코딩하는 유전자를 도입하는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces) 또는 캔디다(Candida)속에 속하는 균주인 것일 수 있다. 또한, 사카로마이세스(Saccharomyces)속에서 사카로마이세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensustricto) 집합체에 속하는 균주인 것일 수 있다. 사카로마이세스 센수 스트릭토(Saccharomyces sensustricto) 집합체에 속하는 균주는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S. bayanus), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 미카테(S. mikatae), 또는 사카로마이세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii)일 수 있다.

아세토인을 효과적으로 생산할 수 있는 유전적으로 조작된 효모 세포의 아세토인 생산 경로에 대해 도 1을 참조하여 설명한다. 도 1은 일구체예에 따른 아세토인 생산 경로 및 경쟁 경로를 도식화하여 나타낸 도면이다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 일구체예에 따른 효모 세포는 모세포에 비하여 아세토락테이트 신타아제, 및 아세토락테이트 디카복실레이즈의 활성이 증가되어 있어 아세토인을 효과적으로 생산할 수 있다. 또한, 아세토인의 생산에 있어서, 부산물 생성을 억제하고, 아세토인의 생산을 더욱 증진시키고자, 상기 효모 세포는 아세토인의 생산 경로의 경쟁적 대사 경로가 추가적으로 차단된 것일 수 있다. 상기 경쟁적 대사 경로는 도 1에 나타낸 바와 같이, 에탄올 및 글리세롤 합성 대사 경로일 수 있으며, 상기 경쟁적 대사 경로는 알코올 탈수소효소 또는 글리세롤-3-인산 탈수소효소의 활성을 감소시켜 달성될 수 있다. 또한, 아세토인을 2,3-부탄다이올로 전환하는 대사 경로를 제거하여 아세토인의 생산을 더 증가시킬 수 있다. 그에 더하여, 보조인자 불균형을 감소시키기 위한 과정을 추가적으로 수행할 수 있다. 하기 반응에서와 같이 세포는 해당작용을 통해 포도당으로부터 2분자의 피루브산을 생성하면서 2분자의 NAD⁺를 소모하여 2분자의 NADH를 생성한다. 이에 따라, 아세토인 합성 경로에서 NADH(과잉)와 NAD⁺(부족) 현상이 발생할 수도 있다.

따라서, NADH 산화 효소의 활성을 증가시켜 NADH를 산화시킴으로써 보조인자(cofactor, NAD⁺/NADH)의 불균형을 해소할 수 있다.

다른 양상은 모세포에 비하여 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 배양하는 단계;및 상기 배양물로부터 아세토인을 분리하는 단계를 포함하는 아세토인을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 "아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포"에 대해서는 상기한 바와 같다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 상기 효모 세포로부터 아세토인을 생산하기 위하여, 상기 세포를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일련의 행위를 의미할 수 있다. 본 발명에서 상기 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 아세토인으로 대사될 수 있는 하나 이상의 기질을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면, 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈를 주탄소원으로 사용하며, 이외에 자일로즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

통상적으로 세포는 약 20℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 적절한 배지 내에 성장시킬 수 있다. 본 발명에서 성장 배지는, 예를 들면, 효모 질소 베이스(yeast nitrogen base), 암모늄 설페이트, 및 탄소/에너지 공급원으로서의 덱스트로스를 포함하는 브로스(broth) 또는 대부분의 사카로마이세스 세레비지애 균주의 성장을 위한 최적 비율로 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스를 블렌딩한 YPD 배지와 같이 상업적으로 제조된 통상적인 배지일 수 있다. 그밖에 정의되거나 합성된 성장 배지도 사용할 수 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학 분야의 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 상기 분리는 배양물, 예를 들면, 배양한 미생물, 세포, 배지, 배양 매질, 또는 그들의 조합으로부터 분리하는 것일 수 있다.

생물 생산된 아세토인은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 배양 배지로부터 분리할 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 아세토인을 효율적으로 생산하는데 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 아세토인을 생산하는 방법에 의하면, 아세토인을 고효율 및 고수율로 생산할 수 있다.

도 1은 일구체예에 따른 아세토인 생산 경로 및 경쟁 경로를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 일구체예에 따른 아세토인 합성 유전자 발현을 위한 벡터의 개열도를 나타낸 도면이다.
도 3은 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.
도 4는 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.
도 5는 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.
도 6은 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 유가식 배양에서의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 제작

1. 아세토인 합성 유전자 발현 S. cerevisiae 균주의 제작

(1.1) 아세토락테이트 신타아제, 아세토락테이트 디카복실레이즈 및/또는 NADH 산화 효소 유전자 도입용 플라스미드의 제작

(1.1.1) alsS, 및 alsD 유전자 도입용 p413-SD 플라스미드의 제작

아세토인 합성 유전자를 도입하기 위해, 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase), 및 아세토락테이트 디카복실레이즈(acetolactate decarboxylase) 유전자 도입용 플라스미드를 제작하였다.

아세토락테이트 신타아제로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 alsS (서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열), 아세토락테이트 디카복실레이즈로는 바실러스 서브틸리스(Bacilus subtilis) 유래의 alsD (서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열)를 사용하였다. 구체적으로, alsS 유전자 및 alsD는 바실러스 서브틸리스 유전체 DNA를 주형으로 PCR(alsS 유전자: 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, alsD 유전자: 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트)을 통해 확보하였다.

또한, PCR로 확보한 alsS 유전자는 p413GPD 플라스미드 벡터[HIS3, P _TDH3 (서열번호 9) _, T _CYC1 (서열번호 10)] (Mumberg et al., 1995)에 BamHI, XhoI 제한효소를 사용하여 클로닝하고 p413G-alsS-C로 명명하였다. alsD 유전자는 p414P_TEF1-T_GPM1 플라스미드 벡터 [TRP1, P _TEF1 (서열번호 11), T _GPM1 (서열번호 12)] (Kim and Hahn, 2015)에 BamHI, XhoI 제한효소를 사용하여 클로닝하고 p414T-alsD-G로 명명하였다.

최종적으로는 하나의 벡터를 사용하여 필요한 유전자를 모두 발현시키기 위하여, 앞서 클로닝한 p414T-alsD-G벡터를 주형으로 서열번호 13, 15의 프라이머 세트를 사용하여 5' 말단에 MluI 제한효소 서열, 3' 말단에 AscI-NotI-MluI 서열을 갖는 PCR 산물 'P _{TEF1 -} alsD-T _GPM1 '을 확보하였다. 이를 MluI 제한효소로 처리하고 BssHII 제한효소로 처리한 p413GPD 플라스미드 벡터에 클로닝하여 p413-D로 명명하였다. 추가적인 클로닝은 벡터의 AscI, NotI 제한효소 자리와 PCR 산물의 MluI(혹은 MauBI), NotI 제한효소 자리를 이용하여 이루어진다. AscI과 MluI, MauBI 제한효소는 동일한 접착말단(sticky end)을 형성하므로 서로 접착이 가능하고, 접착된 후에는 각 효소에 의해 더 이상 인지되지 않기 때문에 PCR 산물에 포함되어 도입된 새로운 AscI 제한효소 자리를 이용하여 추가적인 클로닝이 가능하다. alsS 유전자를 추가로 클로닝하기 위하여 p413G-alsS-C벡터를 주형으로 서열번호 14, 15의 프라이머 세트를 사용하여 5' 말단에 MauBI 제한효소 서열, 3' 말단에 AscI-NotI-MluI 서열을 갖는 PCR 산물 'P _TDH3 -alsS-T _CYC1 '을 확보하였다. 이를 MauBI, NotI 제한효소로 처리하여 AscI, NotI 제한효소로 처리한 p413-D 벡터에 클로닝하여 p413-SD 벡터를 확보하였다.

(1.1.2) alsD, alsD, 및 noxE 유전자 도입용 p413-SDN 플라스미드의 제작

아세토인 합성 경로에서 발생할 수 있는 보조인자(cofactor, NAD⁺/NADH)의 불균형을 개선하고자 NADH 산화 효소를 추가적으로 발현시키고자 하였다.

NADH 산화 효소로는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 유래의 noxE (서열번호 16의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 17의 아미노산 서열)를 사용하였다. noxE 유전자는 락토코커스 락티스의 유전체 DNA를 주형으로 PCR(서열번호 18 및 19의 프라이머 세트)을 통해 확보하였다. 이 PCR산물을 p414P_FBA1-T_FBA1 벡터 [TRP1, P _FBA1 (서열번호 20), T _FBA1 (서열번호 21)] (Kim and Hahn, 2015)에 HindIII, XhoI 제한효소를 사용하여 클로닝하여 p414F-noxE-F로 명명하였다.

최종적으로 아세토인 합성경로를 과발현하는 p413-SD에 noxE를 추가하기 위하여 상기 실시예 1의 (1.1.1)과 동일한 방법을 사용하였다. p414F-noxE-F벡터를 주형으로 서열번호 22, 23의 프라이머 세트를 사용하여 5' 말단에 MluI 제한효소 서열, 3' 말단에 AscI-NotI-MluI 서열을 갖는 PCR 산물 'P _{FBA1 -} noxE-T _FBA1 '를 확보하였다. 이를 MluI, NotI 제한효소로 처리하여 AscI, NotI 제한효소가 처리된 p413-SD 벡터에 클로닝하여 최종적으로 p413-SDN 벡터를 완성하였다.

도 2는 일구체예에 따른 아세토인 합성 유전자 발현을 위한 벡터의 개열도를 나타낸 도면이다.

(1.2) alsS, 및 alsD 유전자 발현 S. cerevisiae 균주의 제작

S. cerevisiae 균주 CEN.PK2-1C(MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3Δ1 MAL2-8C SUC2) (Euroscarf, 독일)에 alsS, 및 alsD 유전자를 과발현시키기 위하여, 실시예 1의 (1.1.1)에서 제작한 p413-SD 벡터를 상기 균주에 리튬 아세테이트를 이용한 화학적 형질전환 방법에 의하여 도입하였다. 이후, 상기 형질전환 균주를 SC-H 배지 (20 g/L 포도당, 6.7 g/L YNB, 1.92 g/L 히스티딘을 제외한 아미노산 첨가물)에서 배양하여, 상기 유전자가 형질전환된 균주를 선별하였고, 그를 S. cerevisiae WT[SD]라고 명명하였다.

2. 아세토인 합성 유전자 발현 및 알코올 탈수소 효소, 글리세롤 3-인산 탈수소 효소 및/또는 2,3-부탄다이올 탈수소 효소 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 제작

본 실시예에서는 아세토인 합성 경로에서 추가로 경쟁적 대사경로를 차단함으로써 부산물 생성을 억제하고 아세토인 생산을 증진시키고자 하였다. 사카로마이세스 세레비지애는 에탄올을 주요 대사산물로 생산하며 생장하는 균주이다. 아세토인 합성경로가 도입된 균주의 경우 에탄올과 함께 글리세롤이 주요한 경쟁 대사산물로 생성된다. 따라서, 에탄올 및 글리세롤을 합성하는 대사경로를 차단함으로써, 아세토인 생산을 증진시킬 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애에는 보조인자로 NADH를 사용하는 6종의 알코올 탈수소효소 (ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, 및 SFA1) 및 NADPH를 사용하는 알코올 탈수소효소 (ADH6, 및 ADH7)가 존재한다. 또한, NADH를 보조인자로 사용하여 디히드록시아세톤인산 (dihydroxyacetone phosphate, DHAP) 을 글리세롤-3-인산으로 전환시키는 글리세롤-3-인산 탈수소 효소 (GPD1 및 GPD2)가 존재한다.

이에, 본 실시예에서는 상기 ADH1 (서열번호 24의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 25의 아미노산 서열), ADH2 (서열번호 26의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 27의 아미노산 서열), ADH3 (서열번호 28의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 29의 아미노산 서열), ADH4 (서열번호 30의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 31의 아미노산 서열), ADH5 (서열번호 32의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 33의 아미노산 서열), GPD1 (서열번호 34의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 35의 아미노산 서열), 및 GPD2 (서열번호 36의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 37의 아미노산 서열)를 결손시킨 균주를 제작하였다.

또한, 추가적으로, 아세토인을 2,3-부탄다이올로 전환하는 대사 경로를 제거하기 위해, 2,3-부탄다이올 탈수소 효소(BDH1)(서열번호 38의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 39의 아미노산 서열)를 결손시킨 균주를 제작하였다.

(2.1) 알코올 탈수소 효소, 글리세롤 3-인산 탈수소 효소 및/또는 2,3-부탄다이올 탈수소 효소 유전자 결손용 카세트의 제작

ADH1 내지 ADH5, GPD1 및 GPD2 유전자가 결손된 돌연변이는 Cre/loxP 재조합 시스템을 이용하였다. 유전자 결손을 위한 카세트는 pUG27(loxP-his5 ⁺-loxP 결손 카세트를 포함하는 플라스미드, Euroscarf, 독일) 또는 pUG72 (loxP-URA3-loxP 결손 카세트를 포함하는 플라스미드, Euroscarf, 독일) 플라스미드를 주형으로 사용하여 PCR 증폭을 통해 획득하였다. 유전자 결손 카세트 제작을 위한 프라이머 세트로는, 서열번호 40 및 41 (ADH1), 서열번호 42 및 43 (ADH2), 서열번호 44 및 45 (ADH3), 서열번호 46 및 47 (ADH4), 서열번호 48 및 49 (ADH5), 서열번호 50 및 51 (GPD1), 및 서열번호 52 및 53 (GPD2)의 조합을 각각 해당 유전자에 대해 사용하였다.

BDH1 유전자가 결손된 돌연변이는 상동 재조합 시스템을 이용하였다. BDH1 유전자 결손용 카세트는 bdh1Δ (BY4741 bdh1Δ::KanMX6, Euroscarf)균주의 유전체 DNA를 주형으로 하여 BDH1 유전자 위치의 상위 300 bp, 하위 282 bp에 동질성을 가지는 프라이머(서열번호 54 및 55의 조합)를 이용하여 PCR 증폭을 통해 제작하였다.

(2.2) S. cerevisiae 균주의 제작

(2.2.1) alsS, 및 alsD 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, 및 GPD 1 및 2 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 제작

S. cerevisiae 균주 CEN.PK2-1C(MATa ura3 -52 trp1 -289 leu2 -3,112 his3 △1 MAL2-8C SUC2) (Euroscarf, 독일)에 상기 (2.1)에서 제작한 ADH1 내지 ADH5, GPD1 및 GPD2 유전자 결손용 카세트를 리튬 아세테이트를 이용한 화학적 형질전환 방법에 의하여 도입하였다. 상기 형질전환 균주를 SC 배지 (20 g/L 포도당, 6.7 g/L YNB, 적당한 아미노산 첨가물)에서 배양하여, 상기 유전자가 형질전환된 균주를 선별하였다. 상기 유전자의 결손 확인용 프라이머로서, 각각 서열번호 56 및 57 (ADH1), 서열번호 58 및 59 (ADH2), 서열번호 60 및 61 (ADH3), 서열번호 62 및 63 (ADH4), 서열번호 64 및 65 (ADH5), 서열번호 66 및 67 (GPD1), 및 서열번호 68 및 69 (GPD2)의 조합을 사용하여 유전자 결손 여부를 확인하였다. 유전자가 결손된 균주가 지니고 있는 선별마커를 제거하기 위하여 Cre recombinase를 발현시키는 pSH63(TRP1, Cre recombinase under the control of GAL1 promoter, Euroscarf, 독일)를 형질전환 하였고 선별마커 유전자가 제거된 결손 균주를 제작하였고, 최종적으로 수득된 균주를 S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△라고 명명하였다. 이후, 상기 균주에 실시예 1의 (1.1.1)에서 제작한 p413-SD 벡터를 형질전환하였고, 최종적으로 수득된 균주를 S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△[SD]로 명명하였다.

(2.2.2) alsS, 및 alsD 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, GPD 1 및 2 유전자 결손, 및 BDH1 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 제작

상기 (2.1)에서 제작한 ADH1 내지 ADH5, GPD1 및 GPD2 유전자 결손용 카세트, 및 BDH1 유전자 결손용 카세트를 상기 (2.2.1)과 동일한 방법으로 형질전환 한 후, 상기 (1.1.1)에서 제조한 p413-SD 플라스미드를 상기 (2.2.1)과 동일한 방법으로 형질전환하였다. 상기 BDH1 유전자의 결손 확인용 프라이머로서, 서열번호 70 및 71의 조합을 사용하였고, 최종적으로 수득된 균주를 S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SD]라고 명명하였다.

(2.2.3) alsS, alsD, 및 noxE 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, GPD 1 및 2 유전자 결손, 및 BDH1 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 제작

상기 (2.1)에서 제작한 ADH1 내지 ADH5, GPD1 및 GPD2 유전자 결손용 카세트, 및 BDH1 유전자 결손용 카세트를 상기 (2.2.1)과 동일한 방법으로 형질전환 한 후, 상기 (1.1.2)에서 제조한 p413-SDN 플라스미드를 상기 (2.2.1)과 동일한 방법으로 형질전환하였고, 최종적으로 수득된 균주를 S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN]라고 명명하였다.

실시예 2. 제작된 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인

1. alsS , 및 alsD 유전자 발현 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인

아세토인 합성 유전자 발현 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인하기 위해, 실시예 1의 (1.2)에서 제작한 균주를 아세토인 생산 배지에서 배양하였다.

구체적으로, 아세토인 생산 배지로는 SC-H (50 g/L 포도당, 6.7 g/L YNB, 1.92 g/L 히스티딘을 제외한 아미노산 첨가물) 및 YPD5 (50 g/L 포도당, 10 g/L yeast extract, 20 g/L bacto-peptone)을 사용하였다. 세포 배양은 진탕배양기를 이용하여 30 ℃에서 170 rpm으로 진행하였다. SC-H 배지를 사용하는 경우, 초기접종 세포농도는 OD₆₀₀=0.3으로 고정하였고, 100 mL 삼각플라스크에서 10 mL 배지로 진행하였다. YPD5 배지를 사용하는 경우, 초기접종 세포농도는 OD₆₀₀=10으로 고정하였고, 250 mL 삼각플라스크에서 25 mL 배지로 진행하였다. 대사산물을 분석하기 위하여 배양액 1 mL를 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 0.22 ㎛ 필터로 여과하여 HPLC 분석을 진행하였다. UltiMate 3000 HPLC system(Thermo fishers scientific)을 이용하였고 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률검출기(RI detector)를 사용하였다. 이동상은 5 mM 황산을 사용하였고 유속은 0.6 mL/분, 온도는 60 ℃로 설정하여, 대사산물의 생산량을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내였다.

도 3은 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 아세토인 합성 유전자를 발현하는 S. cerevisiae WT[SD] 균주는 50 g/L의 포도당을 소모하여, 9.3 g/L 의 아세토인, 2.1 g/L의 2,3-부탄다이올, 7.9 g/L 의 에탄올, 및 3.8 g/L 의 글리세롤을 생산하는 것을 확인할 수 있다.

2. alsS, 및 alsD 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, 및 GPD 1 및 2 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인

상기한 바와 같은 방법으로, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△[SD]의 물질 대사를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△[SD] 균주는 50 g/L의 포도당을 소모하여, 5.9 g/L의 아세토인을 생산함을 알 수 있다. 또한, 부산물로서, 9.3 g/L의 2,3-부탄다이올이 생성되었음을 알 수 있다.

3. alsS, 및 alsD 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, GPD 1 및 2 유전자 결손, 및 BDH1 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인

상기한 바와 같은 방법으로, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SD]의 물질 대사를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

도 5에 나타낸 바와 같이, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SD] 균주는 50 g/L의 포도당을 소모하여, 15.43 g/L의 아세토인을 생산함을 알 수 있다. 또한, 부산물로서 0.18 g/L의 2,3-부탄다이올이 생성되었고, 그 외의 부산물도 거의 생성되지 않았음을 알 수 있다.

4. alsS, alsD, 및 noxE 유전자 발현, ADH 1 내지 5 유전자 결손, GPD 1 및 2 유전자 결손, 및 BDH1 유전자 결손 S. cerevisiae 균주의 아세토인 생산성 증대 확인

상기한 바와 같은 방법으로, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN]의 물질 대사를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 일구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

도 6에 나타낸 바와 같이, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN] 균주는 50 g/L의 포도당을 소모하여, 20.1 g/L의 아세토인을 생산함을 알 수 있다. 또한, 부산물이 거의 생성되지 않았을 뿐만 아니라, 50 g/L의 포도당을 모두 소모하는데 소요된 시간이 48시간으로 크게 단축되었음을 알 수 있다.

추가적으로, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN] 균주에 대해 유가식 배양을 통한 물질 대사를 확인하였다.

구체적으로 상기한 바와 같이 YPD5 배지를 사용하여 배양하였고, 포도당이 모두 소모되기 전 80% 포도당으로 구성된 유입용액을 추가하여 탄소원을 공급하였다. 상기한 바와 같은 방법으로, S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN]의 물질 대사를 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 일 구체예에 따른 아세토인 생산능이 증가된 S. cerevisiae 균주의 유가식 배양에서의 대사 산물의 생산량을 나타낸 도면이다.

도 7에 나타낸 바와 같이 S. cerevisiae adh1-5△gpd1△gpd2△bdh1△[SDN] 균주는 부산물인 글리세롤(0.2 g/L), 에탄올(0.4 g/L), 및 2,3-부탄다이올(0.9 g/L)은 미미한 수준으로 생성하였고, 아세토인 (80.8 g/L)을 과량 생산하였음을 알 수 있다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> Genetically engineered yeast cell producing acetoin and method of producing acetoin using the same <130> PN111922 <160> 71 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1713 <212> DNA <213> Bacillus subtilis alsS <400> 1 atgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60 gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120 gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180 caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240 ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300 gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360 acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420 gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480 gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540 acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600 agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt 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attaattgat atagtttttt aatgagtatt gaatctgttt agaaataatg 60 gaatattatt tttatttatt tatttatatt attggtcggc tcttttcttc tgaaggtcaa 120 tgacaaaatg atatgaagga aataatgatt tctaaaattt tacaacgtaa gatattttta 180 caaaagccta gctcatcttt tg 202 <210> 22 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal MluIF primer 1 <400> 22 gactacgcgt ggaacaaaag ctggagctc 29 <210> 23 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal R primer <400> 23 gactacgcgt gcggccgcta atggcgcgcc atagggcgaa ttgggtacc 49 <210> 24 <211> 1047 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae ADH1 <400> 24 atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60 tacaaagata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaaatac 120 tctggtgtct gtcacactga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180 ctaccattag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240 aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300 tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt 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aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360 acccacgacg gttctttcca agaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420 cctcaaggta ctgacttggc tgaagtcgcg ccaatcttgt gtgctggtat caccgtatac 480 aaggctttga agtctgccaa cttgagagca ggccactggg cggccatttc tggtgctgct 540 ggtggtctag gttctttggc tgttcaatat gctaaggcga tgggttacag agtcttaggt 600 attgatggtg gtccaggaaa ggaagaattg tttacctcgc tcggtggtga agtattcatc 660 gacttcacca aagagaagga cattgttagc gcagtcgtta aggctaccaa cggcggtgcc 720 cacggtatca tcaatgtttc cgtttccgaa gccgctatcg aagcttctac cagatactgt 780 agggcgaacg gtactgttgt cttggttggt ttgccagccg gtgcaaagtg ctcctctgat 840 gtcttcaacc acgttgtcaa gtctatctcc attgtcggct cttacgtggg gaacagagct 900 gataccagag aagccttaga tttctttgcc agaggtctag tcaagtctcc aataaaggta 960 gttggcttat ccagtttacc agaaatttac gaaaagatgg agaagggcca aattgctggt 1020 agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047 <210> 27 <211> 348 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae ADH2 <400> 27 Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Ala Ile Ile Phe Tyr Glu Ser Asn 1 5 10 15 Gly Lys 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<213> Saccharomyces cerevisiae ADH3 <400> 29 Met Leu Arg Thr Ser Thr Leu Phe Thr Arg Arg Val Gln Pro Ser Leu 1 5 10 15 Phe Ser Arg Asn Ile Leu Arg Leu Gln Ser Thr Ala Ala Ile Pro Lys 20 25 30 Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Lys Gly Lys Leu His Tyr 35 40 45 Lys Asp Ile Pro Val Pro Glu Pro Lys Pro Asn Glu Ile Leu Ile Asn 50 55 60 Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Ala Trp His Gly 65 70 75 80 Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val Gly Gly His Glu Gly 85 90 95 Ala Gly Val Val Val Lys Leu Gly Ser Asn Val Lys Gly Trp Lys Val 100 105 110 Gly Asp Leu Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly Ser Cys Met Thr Cys 115 120 125 Glu Phe Cys Glu Ser Gly His Glu Ser Asn Cys Pro Asp Ala Asp Leu 130 135 140 Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln Phe Ala Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ala Ile Gln Ala Ala Lys Ile Gln Gln Gly Thr Asp Leu Ala Glu Val 165 170 175 Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Glu 180 185 190 Ala Asp Leu Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile Ser Gly 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caaaaacaag gattacaaaa aggctttgat cgttactgat 120 cctggtattg cagctattgg tctctccggt agagtccaaa agatgttgga agaacgtggc 180 ttaaacgttg ctatctatga caaaactcaa ccaaacccaa atattgccaa tgtcacagct 240 ggtttgaagg ttttgaagga agaaaactct gaaattgtcg tttccattgg tggtggttct 300 gctcacgaca atgctaaggc cattgcttta ttggctacta acggtgggga aattggagat 360 tatgaaggtg tcaaccaatc taagaaggct gctttaccgc tatttgccat caacactact 420 gctggtactg cttccgagat gaccagattc actattatct ctaatgaaga aaagaaaatc 480 aagatggcca tcattgacaa caacgtcact ccagctgttg ctgtcaacga cccatctacc 540 atgtttggtt tgccacctgc tttgactgct gctactggtc tagatgcttt gactcactgt 600 atcgaagctt acgtttccac cgcctctaac ccaatcaccg atgcttgtgc tttgaagggt 660 attgatttga tcaatgaaag cttggtcgcc gcatacaaag acggtaaaga caagaaggcc 720 agaactgata tgtgttacgc agaatacttg gcaggtatgg ctttcaacaa tgcttctcta 780 ggttatgttc atgcccttgc tcatcaactt ggtggtttct accacttgcc tcatggtgtt 840 tgtaacgctg tcttgttgcc tcatgttcaa gaggccaaca tgcaatgtcc aaaggccaag 900 aagagattag gtgaaattgc cttgcattgc 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atattcatcg atttcacgga agaaaaagac attgttggtg ctataataaa ggccactaat 720 ggcggttctc atggagttat taatgtgtct gtttctgaag cagctatcga ggcttctacg 780 aggtattgta ggcccaatgg tactgtcgtc ctggttggta tgccagctca tgcttactgc 840 aattccgatg ttttcaatca agttgtaaaa tcaatctcca tcgttggatc ttgtgttgga 900 aatagagctg atacaaggga ggctttagat ttcttcgcca gaggtttgat caaatctccg 960 atccacttag ctggcctatc ggatgttcct gaaatttttg caaagatgga gaagggtgaa 1020 attgttggta gatatgttgt tgagacttct aaatga 1056 <210> 33 <211> 351 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae ADH5 <400> 33 Met Pro Ser Gln Val Ile Pro Glu Lys Gln Lys Ala Ile Val Phe Tyr 1 5 10 15 Glu Thr Asp Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Val Thr Val Pro Glu Pro 20 25 30 Lys Pro Asn Glu Ile Leu Val His Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His 35 40 45 Ser Asp Leu His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Phe Gln Leu Lys Phe 50 55 60 Pro Leu Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Lys Leu Gly 65 70 75 80 Ser Asn Val Lys Gly Trp Lys Val Gly Asp Phe Ala Gly Ile Lys Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Thr Cys Met Ser Cys Glu Tyr Cys Glu Val Gly Asn Glu 100 105 110 Ser Gln Cys Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Gly Phe Thr His Asp Gly Thr 115 120 125 Phe Gln Glu Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro 130 135 140 Pro Asn Val Asn Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile 145 150 155 160 Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Arg Ala Asn Val Ile Pro Gly Gln Trp 165 170 175 Val Thr Ile Ser Gly Ala Cys Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln 180 185 190 Tyr Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Val Ile Gly Ile Asp Gly Gly Asn 195 200 205 Ala Lys Arg Lys Leu Phe Glu Gln Leu Gly Gly Glu Ile Phe Ile Asp 210 215 220 Phe Thr Glu Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Ile Ile Lys Ala Thr Asn 225 230 235 240 Gly Gly Ser His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile 245 250 255 Glu Ala Ser Thr Arg Tyr Cys Arg Pro Asn Gly Thr Val Val Leu Val 260 265 270 Gly Met Pro Ala His Ala Tyr Cys Asn Ser Asp Val Phe Asn Gln Val 275 280 285 Val Lys Ser Ile Ser Ile Val Gly Ser Cys Val Gly Asn Arg Ala Asp 290 295 300 Thr Arg Glu Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Ile Lys Ser Pro 305 310 315 320 Ile His Leu Ala Gly Leu Ser Asp Val Pro Glu Ile Phe Ala Lys Met 325 330 335 Glu Lys Gly Glu Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Glu Thr Ser Lys 340 345 350 <210> 34 <211> 1176 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae GPD1 <400> 34 atgtctgctg ctgctgatag attaaactta acttccggcc acttgaatgc tggtagaaag 60 agaagttcct cttctgtttc tttgaaggct gccgaaaagc ctttcaaggt tactgtgatt 120 ggatctggta actggggtac tactattgcc aaggtggttg ccgaaaattg taagggatac 180 ccagaagttt tcgctccaat agtacaaatg tgggtgttcg aagaagagat caatggtgaa 240 aaattgactg aaatcataaa tactagacat caaaacgtga aatacttgcc tggcatcact 300 ctacccgaca atttggttgc taatccagac ttgattgatt cagtcaagga tgtcgacatc 360 atcgttttca acattccaca tcaatttttg ccccgtatct gtagccaatt gaaaggtcat 420 gttgattcac acgtcagagc tatctcctgt ctaaagggtt ttgaagttgg tgctaaaggt 480 gtccaattgc tatcctctta catcactgag gaactaggta ttcaatgtgg tgctctatct 540 ggtgctaaca ttgccaccga agtcgctcaa gaacactggt ctgaaacaac agttgcttac 600 cacattccaa aggatttcag aggcgagggc aaggacgtcg accataaggt tctaaaggcc 660 ttgttccaca gaccttactt ccacgttagt gtcatcgaag atgttgctgg tatctccatc 720 tgtggtgctt tgaagaacgt tgttgcctta ggttgtggtt tcgtcgaagg tctaggctgg 780 ggtaacaacg cttctgctgc catccaaaga gtcggtttgg gtgagatcat cagattcggt 840 caaatgtttt tcccagaatc tagagaagaa acatactacc aagagtctgc tggtgttgct 900 gatttgatca ccacctgcgc tggtggtaga aacgtcaagg ttgctaggct aatggctact 960 tctggtaagg acgcctggga atgtgaaaag gagttgttga atggccaatc cgctcaaggt 1020 ttaattacct gcaaagaagt tcacgaatgg ttggaaacat gtggctctgt cgaagacttc 1080 ccattatttg aagccgtata ccaaatcgtt tacaacaact acccaatgaa gaacctgccg 1140 gacatgattg aagaattaga tctacatgaa gattag 1176 <210> 35 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae GPD1 <400> 35 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 120 125 Phe Leu Pro Arg Ile Cys Ser Gln Leu Lys Gly His Val Asp Ser His 130 135 140 Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Val Gly Ala Lys Gly 145 150 155 160 Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Glu Glu Leu Gly Ile Gln Cys 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Ile Ala Thr Glu Val Ala Gln Glu His 180 185 190 Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr His Ile Pro Lys Asp Phe Arg Gly 195 200 205 Glu Gly Lys Asp Val Asp His Lys Val Leu Lys Ala Leu Phe His Arg 210 215 220 Pro Tyr Phe His Val Ser Val Ile Glu Asp Val Ala Gly Ile Ser Ile 225 230 235 240 Cys Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Gly Cys Gly Phe Val Glu 245 250 255 Gly Leu Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Val Gly 260 265 270 Leu Gly Glu Ile Ile Arg Phe Gly Gln Met Phe Phe Pro Glu Ser Arg 275 280 285 Glu Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile Thr 290 295 300 Thr Cys Ala Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Arg Leu Met Ala Thr 305 310 315 320 Ser Gly Lys Asp Ala Trp Glu Cys Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Gln 325 330 335 Ser Ala Gln Gly Leu Ile Thr Cys Lys Glu Val His Glu Trp Leu Glu 340 345 350 Thr Cys Gly Ser Val Glu Asp Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr Gln 355 360 365 Ile Val Tyr Asn Asn Tyr Pro Met Lys Asn Leu Pro Asp Met Ile Glu 370 375 380 Glu Leu Asp Leu His Glu Asp 385 390 <210> 36 <211> 1323 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae GPD2 <400> 36 atgcttgctg tcagaagatt aacaagatac acattcctta agcgaacgca tccggtgtta 60 tatactcgtc gtgcatataa aattttgcct tcaagatcta ctttcctaag aagatcatta 120 ttacaaacac aactgcactc aaagatgact gctcatacta atatcaaaca gcacaaacac 180 tgtcatgagg accatcctat cagaagatcg gactctgccg tgtcaattgt acatttgaaa 240 cgtgcgccct tcaaggttac agtgattggt tctggtaact gggggaccac catcgccaaa 300 gtcattgcgg aaaacacaga attgcattcc catatcttcg agccagaggt gagaatgtgg 360 gtttttgatg aaaagatcgg cgacgaaaat ctgacggata tcataaatac aagacaccag 420 aacgttaaat atctacccaa tattgacctg ccccataatc tagtggccga tcctgatctt 480 ttacactcca tcaagggtgc tgacatcctt gttttcaaca tccctcatca atttttacca 540 aacatagtca aacaattgca aggccacgtg gcccctcatg taagggccat ctcgtgtcta 600 aaagggttcg agttgggctc caagggtgtg caattgctat cctcctatgt tactgatgag 660 ttaggaatcc aatgtggcgc actatctggt gcaaacttgg caccggaagt ggccaaggag 720 cattggtccg aaaccaccgt ggcttaccaa ctaccaaagg attatcaagg tgatggcaag 780 gatgtagatc ataagatttt gaaattgctg ttccacagac cttacttcca cgtcaatgtc 840 atcgatgatg ttgctggtat atccattgcc ggtgccttga agaacgtcgt ggcacttgca 900 tgtggtttcg tagaaggtat gggatggggt aacaatgcct ccgcagccat tcaaaggctg 960 ggtttaggtg aaattatcaa gttcggtaga atgtttttcc cagaatccaa agtcgagacc 1020 tactatcaag aatccgctgg tgttgcagat ctgatcacca cctgctcagg cggtagaaac 1080 gtcaaggttg ccacatacat ggccaagacc ggtaagtcag ccttggaagc agaaaaggaa 1140 ttgcttaacg gtcaatccgc ccaagggata atcacatgca gagaagttca cgagtggcta 1200 caaacatgtg agttgaccca agaattccca ttattcgagg cagtctacca gatagtctac 1260 aacaacgtcc gcatggaaga cctaccggag atgattgaag agctagacat cgatgacgaa 1320 tag 1323 <210> 37 <211> 440 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae GPD2 <400> 37 Met Leu Ala Val Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Thr Phe Leu Lys Arg Thr 1 5 10 15 His Pro Val Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Tyr Lys Ile Leu Pro Ser Arg 20 25 30 Ser Thr Phe Leu Arg Arg Ser Leu Leu Gln Thr Gln Leu His Ser Lys 35 40 45 Met Thr Ala His Thr Asn Ile Lys Gln His Lys His Cys His Glu Asp 50 55 60 His Pro Ile Arg Arg Ser Asp Ser Ala Val Ser Ile Val His Leu Lys 65 70 75 80 Arg Ala Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr 85 90 95 Thr Ile Ala Lys Val Ile Ala Glu Asn Thr Glu Leu His Ser His Ile 100 105 110 Phe Glu Pro Glu Val Arg Met Trp Val Phe Asp Glu Lys Ile Gly Asp 115 120 125 Glu Asn Leu Thr Asp Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr 130 135 140 Leu Pro Asn Ile Asp Leu Pro His Asn Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu 145 150 155 160 Leu His Ser Ile Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Phe Asn Ile Pro His 165 170 175 Gln Phe Leu Pro Asn Ile Val Lys Gln Leu Gln Gly His Val Ala Pro 180 185 190 His Val Arg Ala Ile Ser Cys Leu Lys Gly Phe Glu Leu Gly Ser Lys 195 200 205 Gly Val Gln Leu Leu Ser Ser Tyr Val Thr Asp Glu Leu Gly Ile Gln 210 215 220 Cys Gly Ala Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Pro Glu Val Ala Lys Glu 225 230 235 240 His Trp Ser Glu Thr Thr Val Ala Tyr Gln Leu Pro Lys Asp Tyr Gln 245 250 255 Gly Asp Gly Lys Asp Val Asp His Lys Ile Leu Lys Leu Leu Phe His 260 265 270 Arg Pro Tyr Phe His Val Asn Val Ile Asp Asp Val Ala Gly Ile Ser 275 280 285 Ile Ala Gly Ala Leu Lys Asn Val Val Ala Leu Ala Cys Gly Phe Val 290 295 300 Glu Gly Met Gly Trp Gly Asn Asn Ala Ser Ala Ala Ile Gln Arg Leu 305 310 315 320 Gly Leu Gly Glu Ile Ile Lys Phe Gly Arg Met Phe Phe Pro Glu Ser 325 330 335 Lys Val Glu Thr Tyr Tyr Gln Glu Ser Ala Gly Val Ala Asp Leu Ile 340 345 350 Thr Thr Cys Ser Gly Gly Arg Asn Val Lys Val Ala Thr Tyr Met Ala 355 360 365 Lys Thr Gly Lys Ser Ala Leu Glu Ala Glu Lys Glu Leu Leu Asn Gly 370 375 380 Gln Ser Ala Gln Gly Ile Ile Thr Cys Arg Glu Val His Glu Trp Leu 385 390 395 400 Gln Thr Cys Glu Leu Thr Gln Glu Phe Pro Leu Phe Glu Ala Val Tyr 405 410 415 Gln Ile Val Tyr Asn Asn Val Arg Met Glu Asp Leu Pro Glu Met Ile 420 425 430 Glu Glu Leu Asp Ile Asp Asp Glu 435 440 <210> 38 <211> 1149 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae BDH1 <400> 5 atgagagctt tggcatattt caagaagggt gatattcact tcactaatga tatccctagg 60 ccagaaatcc aaaccgacga tgaggttatt atcgacgtct cttggtgtgg gatttgtggc 120 tcggatcttc acgagtactt ggatggtcca atcttcatgc ctaaagatgg agagtgccat 180 aaattatcca acgctgcttt acctctggca atgggccatg agatgtcagg aattgtttcc 240 aaggttggtc ctaaagtgac aaaggtgaag gttggcgacc acgtggtcgt tgatgctgcc 300 agcagttgtg cggacctgca ttgctggcca cactccaaat tttacaattc caaaccatgt 360 gatgcttgtc agaggggcag tgaaaatcta tgtacccacg ccggttttgt aggactaggt 420 gtgatcagtg gtggctttgc tgaacaagtc gtagtctctc aacatcacat tatcccggtt 480 ccaaaggaaa ttcctctaga tgtggctgct ttagttgagc ctctttctgt cacctggcat 540 gctgttaaga tttctggttt caaaaaaggc agttcagcct tggttcttgg tgcaggtccc 600 attgggttgt gtaccatttt ggtacttaag ggaatggggg ctagtaaaat tgtagtgtct 660 gaaattgcag agagaagaat agaaatggcc aagaaactgg gcgttgaggt gttcaatccc 720 tccaagcacg gtcataaatc tatagagata ctacgtggtt tgaccaagag ccatgatggg 780 tttgattaca gttatgattg ttctggtatt caagttactt tcgaaacctc tttgaaggca 840 ttaacattca aggggacagc caccaacatt gcagtttggg gtccaaaacc tgtcccattc 900 caaccaatgg atgtgactct ccaagagaaa gttatgactg gttcgatcgg ctatgttgtc 960 gaagacttcg aagaagttgt tcgtgccatc cacaacggag acatcgccat ggaagattgt 1020 aagcaactaa tcactggtaa gcaaaggatt gaggacggtt gggaaaaggg attccaagag 1080 ttgatggatc acaaggaatc caacgttaag attctattga cgcctaacaa tcacggtgaa 1140 atgaagtaa 1149 <210> 39 <211> 382 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae BDH1 <400> 6 Met Arg Ala Leu Ala Tyr Phe Lys Lys Gly Asp Ile His Phe Thr Asn 1 5 10 15 Asp Ile Pro Arg Pro Glu Ile Gln Thr Asp Asp Glu Val Ile Ile Asp 20 25 30 Val Ser Trp Cys Gly Ile Cys Gly Ser Asp Leu His Glu Tyr Leu Asp 35 40 45 Gly Pro Ile Phe Met Pro Lys Asp Gly Glu Cys His Lys Leu Ser Asn 50 55 60 Ala Ala Leu Pro Leu Ala Met Gly His Glu Met Ser Gly Ile Val Ser 65 70 75 80 Lys Val Gly Pro Lys Val Thr Lys Val Lys Val Gly Asp His Val Val 85 90 95 Val Asp Ala Ala Ser Ser Cys Ala Asp Leu His Cys Trp Pro His Ser 100 105 110 Lys Phe Tyr Asn Ser Lys Pro Cys Asp Ala Cys Gln Arg Gly Ser Glu 115 120 125 Asn Leu Cys Thr His Ala Gly Phe Val Gly Leu Gly Val Ile Ser Gly 130 135 140 Gly Phe Ala Glu Gln Val Val Val Ser Gln His His Ile Ile Pro Val 145 150 155 160 Pro Lys Glu Ile Pro Leu Asp Val Ala Ala Leu Val Glu Pro Leu Ser 165 170 175 Val Thr Trp His Ala Val Lys Ile Ser Gly Phe Lys Lys Gly Ser Ser 180 185 190 Ala Leu Val Leu Gly Ala Gly Pro Ile Gly Leu Cys Thr Ile Leu Val 195 200 205 Leu Lys Gly Met Gly Ala Ser Lys Ile Val Val Ser Glu Ile Ala Glu 210 215 220 Arg Arg Ile Glu Met Ala Lys Lys Leu Gly Val Glu Val Phe Asn Pro 225 230 235 240 Ser Lys His Gly His Lys Ser Ile Glu Ile Leu Arg Gly Leu Thr Lys 245 250 255 Ser His Asp Gly Phe Asp Tyr Ser Tyr Asp Cys Ser Gly Ile Gln Val 260 265 270 Thr Phe Glu Thr Ser Leu Lys Ala Leu Thr Phe Lys Gly Thr Ala Thr 275 280 285 Asn Ile Ala Val Trp Gly Pro Lys Pro Val Pro Phe Gln Pro Met Asp 290 295 300 Val Thr Leu Gln Glu Lys Val Met Thr Gly Ser Ile Gly Tyr Val Val 305 310 315 320 Glu Asp Phe Glu Glu Val Val Arg Ala Ile His Asn Gly Asp Ile Ala 325 330 335 Met Glu Asp Cys Lys Gln Leu Ile Thr Gly Lys Gln Arg Ile Glu Asp 340 345 350 Gly Trp Glu Lys Gly Phe Gln Glu Leu Met Asp His Lys Glu Ser Asn 355 360 365 Val Lys Ile Leu Leu Thr Pro Asn Asn His Gly Glu Met Lys 370 375 380 <210> 40 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for ADH1 deletion <400> 40 ttcaagctat accaagcata caatcaacta tctcatatac acagctgaag cttcgtacgc 60 60 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for ADH1 deletion <400> 41 cttatttaat aataaaaatc ataaatcata agaaattcgc gcataggcca ctagtggat 59 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for ADH2 deletion <400> 42 tacaatcaac tatcaactat taactatatc gtaatacaca cagctgaagc ttcgtacgc 59 <210> 43 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for ADH2 deletion <400> 43 ataatgaaaa ctataaatcg taaagacata agagatccgc gcataggcca ctagtggat 59 <210> 44 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for ADH3 deletion <400> 44 gttaaaacta ggaatagtat agtcataagt taacaccatc cagctgaagc ttcgtacgc 59 <210> 45 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for ADH3 deletion <400> 45 acaaagactt tcataaaaag tttgggtgcg taacacgcta gcataggcca ctagtggat 59 <210> 46 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for ADH4 deletion <400> 46 caagtttaca tttgcaacaa ctaatagtca aataagaaaa cagctgaagc ttcgtacgc 59 <210> 47 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for ADH4 deletion <400> 47 gcacacgcat aattgacgtt tatgagttcg ttcgattttt gcataggcca ctagtggat 59 <210> 48 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for ADH5 deletion <400> 48 agaaaattat ttaactacat atctacaaaa tcaaagcatc cagctgaagc ttcgtacgc 59 <210> 49 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for ADH5 deletion <400> 49 taaaaagtaa aaatatattc atcaaattcg ttacaaaaga gcataggcca ctagtggat 59 <210> 50 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for GPD1 deletion <400> 50 cacccccccc ctccacaaac acaaatattg ataatataaa gcagctgaag cttcgtacgc 60 60 <210> 51 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for GPD1 deletion <400> 51 aagtggggga aagtatgata tgttatcttt ctccaataaa tgcataggcc actagtggat 60 60 <210> 52 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for GPD2 deletion <400> 52 tctctttccc tttccttttc cttcgctccc cttccttatc acagctgaag cttcgtacgc 60 60 <210> 53 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for GPD2 deletion <400> 53 ggcaacagga aagatcagag ggggaggggg ggggagagtg tgcataggcc actagtggat 60 60 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for BDH1 deletion <400> 54 gatttgctca cgctactttg 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for BDH1 deletion <400> 55 gccatgcttt gttttagacg 20 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of ADH1 deletion <400> 56 caccatatcc gcaatgac 18 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of ADH1 deletion <400> 57 gtgttgtcct ctgaggac 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of ADH2 deletion <400> 58 accgggcatc tccaactt 18 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of ADH2 deletion <400> 59 ccatgtctac agtttagagg 20 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of ADH3 deletion <400> 60 atgagcagca gccattttg 19 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of ADH3 deletion <400> 61 tgatggtgat aatgtctctc a 21 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of ADH4 deletion <400> 62 aagaactagt ttttagttcg cg 22 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of ADH4 deletion <400> 63 agaacttccg ttcttctttt 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of ADH5 deletion <400> 64 ctgctatctg cttgtagaag 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of ADH5 deletion <400> 65 gaaacgtttg tataggttgt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of GPD1 deletion <400> 66 cgccttgctt ctctcccctt 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of GPD1 deletion <400> 67 ccgacagcct ctgaatgagt 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of GPD2 deletion <400> 68 tacggaccta ttgccattgt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of GPD2 deletion <400> 69 ttaagggcta tagataacag 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer for identification of BDH1 deletion <400> 70 gatttgctca cgctactttg 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer for identification of BDH1 deletion <400> 71 gccatgcttt gttttagacg 20

Claims (14)

1. 모세포에 비하여 아세토락테이트 신타아제(acetolactate synthase), 및 아세토락테이트 디카복실레이즈(acetolactate decarboxylase)의 활성이 증가되어 있는, 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포로서,
   상기 효모 세포는 모세포에 비하여 2,3-부탄다이올 탈수소효소(2,3-butanediol dehydrogenase), 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, ADH), 및 글리세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase, GPD)의 활성이 감소되어 있고,
   상기 효모 세포는 모세포에 비하여 NADH 산화효소(NADH oxidase, nox)의 활성이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
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4. 청구항 1에 있어서, 상기 아세토락테이트 신타아제는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 아세토락테이트 디카복실레이즈는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 아세토락테이트 신타아제를 코딩하는 외인성 유전자(exogenous gene), 및 아세토락테이트 디카복실레이즈를 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것인 효모 세포.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 알코올 탈수소효소는 ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5 또는 그들의 조합인 것이고, 상기 ADH1은 서열번호 25의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 ADH2는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 ADH3는 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 ADH4는 서열번호 31의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 ADH5는 서열번호 33의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 글리세롤-3-인산 탈수소효소는 GPD1, GPD2 또는 그들의 조합인 것이고, 상기 GPD1은 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 GPD2는 서열번호 37의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 2,3-부탄다이올 탈수소효소는 서열번호 39의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
10. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 2,3-부탄다이올 탈수소효소를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 NADH 산화효소는 noxE인 것이고, 상기 noxE은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 것인 효모 세포.
12. 청구항 1에 있어서, 상기 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속에 속하는 것인 효모 세포.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 사카로마이세스속은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스(S. bayanus), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 미카테(S. mikatae), 및 사카로마이세스 쿠드리아브제비(S. kudriavzevii)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 효모 세포.
14. 청구항 1의 효모 세포를 배지에서 배양하는 단계;및
    배양된 효모 세포, 상기 효모 세포를 배양한 배지 또는 그의 조합으로부터 아세토인을 분리하는 단계를 포함하는 아세토인을 생산하는 방법.
    

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