KR101965364B1

KR101965364B1 - Upc2를 발현하는 재조합 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101965364B1
Application number: KR1020170098246A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 손민정; 박현주; 배정훈; 성봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2016-08-03
Filing date: 2017-08-02
Publication date: 2019-04-03
Also published as: KR20180015591A

Abstract

본 발명은 UPC2 (Uptake Control protein 2) 또는 ECM22 (ExtraCellular Mutant 22)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22 발현 카세트, 상기 카세트를 포함하는 UPC2 또는 ECM22 발현 벡터, 및 상기 벡터가 도입된 재조합 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 유기산 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 UPC2 또는 ECM22를 과발현하는 재조합 균주는 내산성을 나타내어, 효율적인 유기산의 생산이 가능하다.

Description

UPC2를 발현하는 재조합 균주 및 이의 용도 {A recombinant yeast strain expressing UPC2 and use thereof}

본 발명은 UPC2 (Uptake Control protein 2) 또는 ECM22 (ExtraCellular Mutant 22)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22발현 카세트, 상기 카세트를 포함하는 UPC2 또는 ECM22 발현 벡터, 및 상기 벡터가 도입된 재조합 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 유기산 생산 방법에 관한 것이다.

석유로부터 추출되는 여러 가지 화합물 중에서 젖산과 같은 유기 생성물은 산업적으로 가소성 재료 및 다른 생성물을 합성하는데 필수적이므로 그 사용이 중요시 되고 있다.

이러한 수요의 증대에 대응하여, 유기 생성물의 효율적인 생산방법으로서 미생물을 활용하는 방법이 개발되고 있다. 그 중 효모 균주는 미생물과는 달리 여러 가지 외부 환경에 대한 저항성이 높기 때문에 유전자 조작을 거친 후 젖산과 같은 유기산 생산 균주로 널리 사용되고 있다.

그러나, 효모 균주를 이용할 경우, 높은 에탄올 발효능으로 인하여 젖산과 함께 에탄올이 부산물로서 함께 생성되어 젖산의 생산성을 감소시키는 단점이 있다.

또한, 젖산 발효 과정에서 축적되는 젖산은 배지의 pH를 산성화시켜 균주 성장을 저해하기 때문에 지금까지 사용되는 젖산 발효에서는 중화제를 배양액에 첨가하는 방법을 사용하고 있다.

중화제로 가장 널리 사용되는 탄산칼슘은 젖산과 결합하여 칼슘염을 형성하며 발효 후에 침전물을 산용액으로 처리하여 젖산을 회수하는 과정에서 젖산과 동일 몰수의 석회가 형성된다.

그러나, 이러한 중화제를 사용하는 방법은 정제공정을 복잡하게 하고 강산성 폐수를 발생시킬 뿐만 아니라, 부산물을 형성하기 때문에 젖산의 생산 단가를 높이는 요인이 된다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 중화제 사용을 최소화할 수 있는 내산성 균주에 대한 관심이 증가하고 있다(Biotechnolbi Advances, 2013;31:877-902).

이와 같이, 효모에서 고농도 젖산을 생산하기 위해서는 효모 균주의 내산성이 가장 중요한 특성으로 인식되어서, 최근 야생 균주들 중에서 내산성을 가지고 있는 균주로 선별된 클루베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus)나 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavezevii)균주와 같은 균주를 유전자 조작한 후 젖산 생산 균주로 활용하는 연구가 집중되고 있다. 예를 들어, 본 발명자들의 선행 출원인, 대한민국 공개특허 제10-2015-0146459호에는 내산성을 나타내는 피키아 쿠드리압즈비 NG7 균주가 개시되어 있다.

한편, 에르고스테롤 항상성(homeostasis)은 균류 세포에 있어서 중요한 과정이며, 특히 사카로마이세스 세리비지에에서 에르고스테롤 생합성의 중요한 조절자로 UPC2가 공지되어 있다. 스테롤 수준이 감소되면 ERG 유전자 발현이 UPC2에 의해 증대되고, 또한, 스테롤이 UPC2에 의해 세포내로 수송되는 것으로 알려져있다 (J. Bacteriol., 2001;183, 830-834).

이러한 배경 하에 본 발명자들은, 산성 환경에서도 젖산을 생산할 수 있는 내산성을 가지는 균주를 개발하기 위해, UPC2 또는 ECM22 유전자의 발현을 증가시킨 효모 균주를 개발하였다. 상기 균주가 젖산에 대한 저항성이 향상되고, 젖산을 생산하는 조건에서 최종 산물의 생산량이 증가하였으며 동시에 부산물인 에탄올의 생성이 감소됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 UPC2 (Uptake Control protein 2) 또는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22 발현 카세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22발현 카세트를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 내산성 증가용 UPC2 또는 ECM22발현 벡터가 도입된 UPC2 또는 ECM22 유전자를 과발현하는 재조합 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 UPC2 또는 ECM22 유전자를 과발현하는 재조합 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 유기산 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 UPC2 (Uptake Control protein 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 "UPC2 (Uptake Control protein 2)"는 에르고스테롤 생합성유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려진 유전자로서, 구체적으로, 사카로마이세스 세레비지에 등의 발효 미생물 내에서 에르고스테롤 농도에 반응하는 전사인자를 암호화하고 있어, 세포막에 존재하는 UPC2 전사인자가 에르고스테롤이 고갈될 경우 핵으로 이동하여 에르고스테롤 생합성 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 ECM22 발현 카세트를 제공한다.

본 발명의 "ECM22 (ExtraCellular Mutant 22)"는 사카로마이세스 세레비지에는 UPC2와 동일한 유전자에서 유래된 파라로그(paralog) 유전자이다. 구체적으로, 사카로마이세스 세레비지에 등의 발효 미생물 내에서 UPC2와 유사한 기능을 하는 것으로 에르고스테롤 농도에 반응하는 전사인자를 암호화하고 있어, 세포막에 존재하는 ECM22 전사인자가 에르고스테롤이 고갈될 경우 핵으로 이동하여 에르고스테롤 생합성 유전자의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 UPC2 또는 ECM22는 pH 2.0의 산성 환경에서도 발현량이 감소하지 않은 유전자로, 이를 과발현하는 균주는 에르고스테롤의 생합성을 통해 산성 환경에서도 균주의 성장이 저해되지 않는 특징을 가진다.

본 발명의 "에르고스테롤(ergosterol)"은 에르고스테린(ergosterin)이라고도 하며, 햇빛에 노출시키면 자외선에 의해 비타민 D2가 되므로 프로비타민 D로 작용하는 것으로 알려져 있다. 효모에서 주로 발견되는 스테롤의 한 종류로서, 세포막의 구성 요소이자, 동물 세포에서의 콜레스테롤과 유사한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 기존의 피키아 쿠드리압즈비 균주 (KCTC12840BP, 대한민국 공개 특허 제10-2015-0146459호)에서, 스테롤 조절 요소 결합 단백질이 다른 유전자들과 달리, pH 2.0의 산성 조건에서도 발현량이 감소하지 않는 것을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 실시예로부터 에르고스테롤의 생합성을 통해 산성 환경에 대한 저항성을 증대시킬 수 있는 가능성을 확인하였고, 균주 조작이 용이한 사카로마이세스 세레비지에에서 상기 스테롤 조절 요소 결합 단백질과 상동성을 가지는 UPC2를 내산성 연관 유전자로 선별하였다 (실시예 1). 또한 사카로마이세스 세레비지에는 UPC2와 동일한 유전자에서 유래된 파라로그(paralog)인 ECM22가 존재하는 것을 확인하였다. 피키아 쿠드리압즈비의 SREBP의 아미노산 서열(PkUPC2)과 사카로마이세스 세레비지에 유래의 UPC2 아미노산 서열을 비교한 결과, 43%의 유사성을 나타내었으며(도 3) UPC2 아미노산 서열과 ECM22 아미노산 서열은 48% 유사성을 나타냄을 확인하였다(도 4).

따라서, 사카로마이세스 세리비지에 유래 UPC2가 아니더라도, UPC2와 동등하게 에르고스테롤 생합성에 관여하는 유전자라면 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

본 발명의 용어, "폴리뉴클레오티드"는, DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드에서 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 UPC2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 UPC2 또는 ECM22를 비롯한 유전자 서열은 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들 조합에 의해 용이하게 변형될 수 있다. 따라서, 상기 유전자 서열과 높은 상동성을 갖는 DNA 또는 단백질, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 DNA와 단백질도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 UPC2 또는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 및 서열번호 7의 서열 또는 이와 30% 이상의 상동성을 갖는 UPC2 또는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 발명의 UPC2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 및 상기 서열번호 3과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7 및 상기 서열번호 7과 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 폴리뉴클레오티드에 상응하는 효능을 나타내는 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 UPC2 또는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

그 예로, 본 발명의 서열번호 3과 동일한 활성을 가지는 UPC2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 사카로마이세스 세레비지에 유래의 UPC2 이외에 피키아 쿠드리압즈비의 SREBP의 폴리뉴클레오티드 서열(PkUPC2)을 이용할 수 있다. 구체적으로, 상기 효모 균주의 내산성에 연관된 유전자로 선별된, 피키아 쿠드리압즈비의 SREBP의 폴리뉴클레오티드 서열(PkUPC2)과 사카로마이세스 세레비지에 유래의 UPC2 폴리뉴클레오티드 서열을 비교한 결과, 43%의 유사성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).

또한, 사카로마이세스 세레비지에는 UPC2와 동일한 유전자에서 유래된 파라로그(paralog)인 ECM22가 존재하는 것을 확인하였으며, UPC2 아미노산 서열과 ECM22 아미노산 서열은 48% 유사성을 나타냄을 확인하였다(도 4).

본 발명에서 용어, "상동성(homology)"은 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.

본 발명의 용어, "내산성" 은 균주가 산성 환경에서도 성장을 유지하여 유기산의 생합성능이 유지되는 특성을 의미한다. 유기산을 생산하는 균주는 유기산 생산에 따라 조성되는 산성 환경에서 성장이 저해되어, 종국적으로는 유기산 생산 수율이 저하되는 문제점이 있다. 그러나, 본 발명의 UPC2를 과발현하는 균주는 에르고스테롤 합성능이 증대되어 산성 조건에서도 성장이 유지되는 내산성을 가지며, 유기산 생합성능이 저해되지 않아서 효율적으로 젖산을 비롯한 유기산을 생산할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 용어, "발현 카세트"는 UPC2 또는 ECM22 유전자를 포함하고 있어서 UPC2를 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 상기 카세트는 UPC2 또는 ECM22 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 발현 조절에 필요하다고 당업계에서 인정되는 다양한 요소들, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결자 등을 추가로 포함할 수 있고, 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 용어, "작동가능하게 연결"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본 발명의 다른 양태는 상기 발현 카세트를 포함하는 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 용어, "벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 UPC2를 미생물에서 효율적으로 발현시키기 위한 수단으로서, 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다.

상기 벡터의 제작 시에는 UPC2 또는 ECM22 유전자뿐만 아니라, UPC2 또는 ECM22를 발현하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 목적상, 상기 벡터는 UPC2 또는 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 벡터가 도입된 형질전환체는 산성 환경에서도 성장을 유지할 수 있는 내산성을 가지는 특징을 가진다.

본 발명의 용어, "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

상기 UPC2 발현 카세트가 벡터에 포함되는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 UPC2 또는 ECM22 발현 벡터가 도입된, UPC2 또는 ECM22 유전자를 과발현하는 재조합 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 스테롤 합성 조절 유전자(UPC2 또는 ECM22)를 인듀서에 의해 발현이 조절될 수 있도록 제작한 발현벡터를 제작하여(도 5), 상기 벡터가 도입된 형질전환 균주를 제작하였다 (실시예 2 및 실시예 8).

그 결과, 상기 균주에서 UPC2 또는 ECM22 단백질이 과발현되는 것을 확인하였으며(실시예 3, 실시예 9 및 도 6), 상기 UPC2 또는 ECM22를 과발현하는 균주가 에르고스테롤 합성 저해제에 대한 내성을 가지며(도 7), 에르고스테롤을 다량 축적하고 있는 것을 확인하였다(도 9).

본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 UPC2 또는 ECM22가 도입되고 이를 과발현하는 균주가 내산성을 가지는지 여부를 확인한 결과, UPC2 또는 ECM22 과발현 균주가 젖산이 첨가된 고체 및 액체 배지에서 대조군 균주에 비해 성장이 우수한 것을 확인하였을 뿐만, 아니라, 대조군 균주와 달리, 4% 젖산이 포함된 배지에서도 성장이 가능한 것을 확인하였다 (도 10).

본 발명자들은 균주 조작이 용이한 사카로마이세스 속 미생물, 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에를 하나의 예로서 이용하여, UPC2 또는 ECM22 발현 증대를 통한 에르고스테롤의 합성이 증진되고, 유기산 생산능 증대 효과 및 내산성을 확인하였으나, 본 발명의 재조합 균주는 유기산 생산능을 가질 수 있는 이상, 특정 미생물로 제한되지 않는다.

상기 재조합 균주는, 예를 들어, 캔디다 속(Candida sp .), 디베리오마이세스 속 (Debaryomyces sp .), 한세눌라 속(Hansenula sp .), 클루이베로마이세스 속 (Kluyveromyces sp .), 피키아 속(Pichia sp .), 스키조사카로마이세스 속 (Schizosaccharomyces sp .), 야로이야 속(Yarrowia sp .), 사카로마이시스 속 (Saccharomyces sp .), 슈완니오마이세스 속(Schwanniomyces sp .) 및 아르술라 속(Arxula sp .) 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 예시로 든 미생물은 모두 에르고스테롤 합성 경로를 갖는 미생물로서, UPC2 발현 증대로 에르고스테롤 합성이 증진될 수 있다.

상기 사카로마이세스 속 미생물은 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오커스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomycescerevisiae), 사카로마이세스 시바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이더스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 마르티니에(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomycesparadoxus), 사카로마이세스 파스토리아누그(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로럼(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 츄리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 유니스포러스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바럼(Saccharomyces uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus) 등이 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태는 상기 균주가 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae)인 재조합 균주를 제공한다.

일반적으로, 상기 사카로마이세스 세레비지에는 다양한 발효 과정에 사용되는 효모 균의 하나로 알려져 있으며, 당분을 에탄올로 전환하는 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 다른 구체적인 일 양태는 야생형 효모에 비해 UPC2 또는 ECM22 유전자의 발현량이 증가한 재조합 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 구체적인 양태는 야생형 효모에 비하여 증가된 내산성을 가지는 재조합 균주를 제공하고, 더욱 구체적으로, 상기 균주는 pH 5.0, pH 4.0, pH 3.0, pH 2.0 이하에서도 성장 가능하나, 가장 구체적으로 pH 3.0 이하에서도 성장 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 UPC2 또는 ECM22 를 과발현하는 균주는 산성 환경에서도 성장 가능한 것을 확인하여 내산성을 가지는 것을 확인하였다 (실시예 5 및 실시예 10).

본 발명의 용어, "야생형"은 "천연형"과 동일한 의미이며, 생물의 자연집단 중에서 가장 고빈도로 존재하는 표현형을 의미하는 것으로, 돌연변이가 일어나지 않은 본래의 유전형질을 의미한다. 본 발명의 목적상, UPC2가 도입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되지 않은 효모를 의미할 수 있다.

본 발명의 UPC2 발현 균주는 야생형 효모에 비해 증가된 내산성을 나타내어 산성 환경에서도 성장이 저해되지 않는 특징을 가진다.

본 발명의 다른 구체적인 일 양태는 PDC1 (Pyruvate Decarboxylase, 피루베이트 탈탄산 효소) 유전자가 추가로 결실된 재조합 균주를 제공한다. 더 구체적으로는, LDH (Lactate Dehydrogenase, 젖산 탈수소 효소)가 추가적으로 도입된 재조합 균주를 제공한다.

본 발명의 용어, "피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase, PDC1)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트 알데히드를 생성하는 반응(CH₃COCOOH -> CH₃CHO + CO₂)를 촉매하는 효소이다. 알코올 생성과 관련해서는 알코올 발효의 한 단계에서 필수적인 효소이다. 따라서, 본 발명에서 상기 균주에 존재하는 피루베이트 탈탄산 효소를 불활성화시켜 발효에 의한 알코올 생성이 저해된 균주를 제공할 수 있다.

구체적으로는, 상기 균주는 당이 포함된 배지에서 배양시 에탄올의 생성이 피루베이트 탈탄산 효소가 불활성화되지 않은 균주에 비해 감소되는 것인 균주일 수 있다. 또한, 상기 피루베이트 탈탄산 효소의 불활성화는 해당 효소의 유전자에 치환, 결손, 또는 부가되어 이루어지는 균주일 수 있다.

상기 피루베이트 탈탄산 효소의 서열 등과 같은 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있다.

일반적으로 균주 내 유전자의 불활성화는 여러 가지 형태로 제작할 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호구조의 변형 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이며, 이에 한정되지 않는다.

또한, 목적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 가닥과 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 가닥으로 구성되는 이중가닥 RNA(dsRNA)을 도입하여 목적유전자 mRNA의 분해를 유도함으로서 목적유전자의 발현을 억제하는 메커니즘인 RNA 간섭(RNA interference:RNAi) 방법을 사용할 수 있다. 또는, 단일 세포의 게놈 내에서 다른 위치로 이동할 수 있는 DNA 서열인 트랜스포존을 매개로 한 돌연변이를 일으켜 목적 유전자의 기능을 차단하여 불활성화하는 방법을 사용할 수도 있다. 유전자 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다(Qiu와 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617(1997))).

구체적으로는, 유전자의 불활성화는 단일 또는 복합 염기서열의 변이, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 유전자 내에 외래 유전자의 삽입, 유전자군 전체의 결손, 유전자군의 프로모터의 억제 서열 삽입, 프로모터의 돌연변이, 유전자군의 발현 억제 조절 삽입, 유전자군의 단일 또는 복합 염기서열에 대한 RNAi 도입, 트랜스포존 매개 돌연변이 또는 이러한 변이체들의 조합 중 하나의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기에 기술한 방법들은 본 기술 분야에 통상의 사람에게 일반적으로 이해되어지며, Sambrook et al.(Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press 2001)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

유전자의 염기 서열 중 활성 부위의 단일 또는 복합 서열을 변화하여, 유전자로부터 발현되는 단백질의 활성을 매우 낮출 수도 있고, 단일 또는 복합 유전자의 결손, 염기서열 내부에 외래 유전자인 항생제 내성 유전자나 다른 유전자를 삽입하여 완전한 단백질이 발현되지 못하게 하는 방법일 수 있다. 바람직하게는 염색체에 존재하는 유전자의 염기 서열을 모두 결손하는 방법을 사용할 수도 있다. 또는 상기 방법에 의한 변이체의 조합으로 불활성화시킬 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 균주는 피루베이트 탈탄산 효소의 활성이 내재적 활성보다 약화되고 젖산 탈수소 효소 활성이 추가로 도입된 것일 수 있다. 상기 내재적 활성 약화는 천연형 균주에 내재적으로 존재하는 2 카피의 피루베이트 탈탄산 효소 유전자 중 하나를 불활성화 시키는 것일 수 있고, 더 나아가 상기 피루베이트 탈탄산 효소 유전자 중 하나를 젖산 탈수소 효소로 치환하는 것일 수 있다.

본 발명자들은 에탄올의 생성을 최소화하고 유기산만을 고농도로 생산하는 균주를 제공하고자, 재조합 균주에서 PDC1 유전자를 불활성화 시키는 동시에, 유기산 생성과 관련된 외인성 유전자가 도입된, UPC2 과발현 균주를 제작하였다. 또한, 상기 균주를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 2016년 7월 15일자로 기탁하고, 기탁번호 KCTC18477P를 부여받았다.

본 발명의 용어, "젖산 탈수소 효소(Lactate Dehydrogenase, LDH)"는 일반적으로 NAD⁺를 이용하여 L-젖산 혹은 D-젖산에서 수소를 이탈시켜 피루브산으로 만드는 효소로, 이와는 역반응인 해당의 최종단계를 촉매할 때에는 NADH를 이용하여 피루브산을 환원하여 L-젖산 혹은 D-젖산을 생성하는 효소이다. 즉, 본 발명의 젖산 탈수소 효소는 L-젖산 탈수소 효소 또는 D-젖산 탈수소 효소일 수 있다.

상기 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 유전자는 천연형 젖산 탈수소 효소뿐 아니라, 이와 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 상동성을 가지는 동일한 활성을 갖는 효소의 유전자를 포함할 수 있다. 천연형 젖산 탈수소 효소에 돌연변이를 유도한 변이 유전자 또한 젖산 탈수소 효소 활성을 갖는 이상, 서열에 무관하게 본 발명의 젖산 탈수소 효소에 포함될 수 있다.

상기 젖산 탈수소 효소의 서열 등과 같은 정보는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 확인할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, UPC2 과발현 균주의 유기산 생산능을 확인한 결과, PDC1이 결실되고 LDH가 추가적으로 도입된, UPC2를 발현하는 재조합 균주는 에탄올 발효 경로가 일부 봉쇄된 반면, 산성 환경에서도 젖산을 생산할 수 있는 특징을 가져, 보다 효율적인 유기산의 생산이 가능한 것을 확인하였다 (실시예 7).

본 발명의 다른 구체적인 일 양태는 야생형 효모보다 에탄올 생산능은 감소하면서도 유기산 생산량이 증대된 재조합 균주를 제공하고, 더욱 구체적으로는 상기 유기산은 젖산인 재조합 균주를 제공한다.

본 발명의 균주가 생산하는 유기산은 광학이성질체인 L-형 혹은 D-형일 수 있으며, 구체적으로는 L-젖산 또는 D-젖산일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 생성하고자 하는 유기산의 광학이성질체 형태에 따라 필요한 유전자를 도입하여 생성해 낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 상기 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체적인 양태는 상기 유기산은 젖산인 유기산 생산 방법을 제공하고, 더욱 구체적으로는 상기 젖산은 L-젖산 또는 D-젖산인, 유기산 생산 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공되는 UPC2 또는 ECM22를 발현하는 균주는 내산성을 가지므로, 유기산의 생산 및 축적에도 불구하고 유기산 생산능이 저해되지 않으므로, pH를 조절하지 않는 환경에서도 상기 균주의 배양을 통한 효율적인 유기산의 생산이 가능하다.

상기 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 상기 배지에서 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등이 포함될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄 등이 포함될 수 있고, 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염 등이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명자들은 UPC2 발현 균주를 배양하는 배지를 최적화하고자 하였다. 그 결과, 라피노오스를 포함하는 배지에서 상기 재조합 균주의 갈락토오스의 인듀서로서의 기능이 유지되어, UPC2 발현을 유지하여 젖산 생산량이 약 54% 증가하는 것을 확인하였다 (실시예 7).

또한, 본 발명의 유기산을 생산하는 방법은 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 유기산을 회수하는 방법을 포함할 수 있으며, 상기 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 구체적으로는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태는 UPC2 유전자 또는 ECM22 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 내산성이 증가된 균주의 제조방법을 제공한다.

상기 UPC2 유전자 또는 ECM22 유전자를 과발현시키는 단계는 프로모터 교체 또는 유전자의 추가 도입 등에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 제공되는 UPC2 유전자 또는 ECM22 유전자가 과발현되는 재조합 균주는 세포막 지질을 구성하는 에르고스테롤의 합성을 촉진하여 야생형 효모 균주에 비하여 내산성이 우수한 효과를 가진다. 이러한 내산성이 우수한 효모 균주는 중화제를 사용하지 않거나 최소화하는 조건에서도 효율적으로 젖산을 비롯한 유기산을 생산할 수 있다.

도 1은 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii, KCTC 12840BP)의 전사체에서 얻은 유전자를 KEGG 데이터베이스를 이용해 대사회로에 맵핑하여 도식한 그림이다.
도 2는 에르고스테롤 생합성 경로를 도식한 그림이다.
도 3은 피키아 쿠드리압즈비 균주의 SREBP 단백질 서열과 사카로마이세스 세레비지에 UPC2 단백질 서열을 비교한 모식도이다.
도 4는 사카로마이세스 세레비지에 UPC2와 ECM22의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 5는 UPC2 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 UPC2 발현이 에르고스테롤 생합성 유전자 발현에 미치는 영향을 정량적 중합효소 반응으로 확인한 결과이다.
도 7은 UPC2 과발현 균주의 에르고스테롤 합성 저해제의 대한 내성을 나타낸 그림이다
도 8은 UPC2 과발현 균주의 세포내 세포질에 있는 지질분포를 확인한 현미경사진이다.
도 9는 UPC2 과발현 균주의 세포에 있는 에르고스테롤 함량을 확인한 그래프이다.
도 10은 젖산이 3% 및 4% 포함된 고체배지에서 WT 균주와 UPC2 과발현 균주의 세포성장 비교 결과(A)이며 0, 1, 2, 3 및 4% 젖산이 포함된 YPG 액체배지에서의 각 세포의 성장을 비교한 그림이다.
도 11은 UPC2 과발현 균주와 WT균주(pdc1::D-LpLDH)를 pH 조절하지 않은 조건에서 배양하면서 D-젖산 생산 및 에탄올 생성을 비교한 그래프이다.
도 12는 UPC2 과발현 균주와 WT균주(pdc1::L-LpLDH)를 pH 조절하지 않은 조건에서 배양하면서 L-젖산 생산 및 에탄올 생성을 비교한 그래프이다.
도 13은 UPC2 과발현 균주와 WT균주(pdc1::L-LpLDH)를 전배양 조건을 최적화 한 후, pH를 조절하지 않은 조건에서 진탕 배양하면서 L-젖산 생산을 확인한 그래프이다.
도 14는 사카로마이세스 세레비지에 ECM22 발현 벡터의 모식도를 나타낸 것이다.
도 15는 ECM22 과발현이 에르고스테롤 생합성 유전자 발현에 미치는 영향을 정량적 중합효소 반응으로 확인한 결과이다.
도 16은 젖산이 3% 포함된 고체배지에서 WT 균주와 ECM22 과발현 균주의 세포성장을 비교한 결과이다.
도 17은 ECM22 과발현 균주와 UPC2 과발현 균주 및 WT균주(pdc1::L-LpLDH)를 pH 조절하지 않은 조건에서 배양하면서 L-젖산 생산 및 에탄올 생성을 비교한 그래프이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 단, 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 내산성 유발 유전자의 탐색

내산성 효모 피키아 쿠드리압즈비(Pichia kudriavzevii) 균주를 이용하여 내산성에 관여하는 유전자를 선별하기 위해 다음과 같이 실험을 수행하였다.

본 발명자들이 선별한 내산성 효모 피키아 쿠드리압즈비 KCTC 12840BP 균주를 산성 및 중성 조건에서 각각 배양하고, 각 환경에서 발현되는 유전자군을 비교, 분석하였다.

구체적으로, pH 2.0의 산성조건 및 pH 6.0의 중성조건 하에서, 상기 균주의 전사체 분석을 통하여 산성조건에서 2배 이상의 발현 차이를 보이는 유전자군을 선별한 다음, 교토대학 유전자 데이터베이스(KEGG, http://www.genome.jp/kegg)를 활용하여, 세포 내 총 대사 회로에 맵핑하였다.

그 결과, 도 1과 같이 산성조건에서 발현이 증가한 유전자는 붉은색 선으로, 발현량이 감소한 유전자는 파란색 선으로 표시하였다.

예상한대로, 산성조건에서는 대부분 유전자의 발현이 감소하였으나, 세포막 지질을 구성하는 에르고스테롤(ergosterol) 합성에 관련된 유전자들의 발현이 증가되는 경향을 나타내는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 도 2에 도식한 에르고스테롤 생합성 유전자들의 발현을 총체적으로 조절하는 전사인자를 찾고자 하였다.

그 결과, 산성조건에서 발현이 증가한 유전자들 중, 스테롤 조절 요소 결합 단백질(Sterol Regulatory Element Binding Protein, SREBP)로 분류된 단백질이 존재하는 것을 확인하였다.

상기 유전자를 이용하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석을 통해, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 게놈에서 상동성을 보이는 유전자인 UPC2를 선별하였다. 또한 사카로마이세스 세레비지에는 UPC2와 동일한 유전자에서 유래된 파라로그(paralog)인 ECM22가 존재하는 것을 확인하였다.

상기 효모 균주의 내산성에 연관된 유전자로 선별된, 피키아 쿠드리압즈비의 SREBP의 아미노산 서열(PkUPC2)과 사카로마이세스 세레비지에 유래의 UPC2 아미노산 서열을 비교한 결과, 43%의 유사성을 나타내었으며(도 3) UPC2 아미노산 서열과 ECM22 아미노산 서열은 48% 유사성을 나타내었다(도 4).

실시예 2: UPC2 발현량이 증대된 균주의 제작

피키아 쿠드리압즈비 균주보다 균주 조작이 용이한 사카로마이세스 세레비지에 CENPK 2-1D 균주를 이용하여, 상기 선별한 UPC2 유전자와 효모 균주의 내산성 사이의 상관관계를 확인하고자 하였다.

사카로마이세스 세레비지에 게놈 유전자를 주형으로 하고 정방향 (5'-CGGAATTCATGAGCGAAGTC-3', 서열번호 1) 및 역방향 (5'-CCGCTCGAGTCATAACGAAAAATC-3', 서열번호 2) 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃ 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃ 7분간 1회)을 통하여 UPC2 유전자를 증폭하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물을 EcoRI과 XhoI으로 처리한 후 YEGaHIR525 벡터의 EcoRI/SalI 위치에 삽입함으로써 배지내 갈락토오스에 의하여 UPC2 유전자의 발현이 조절되는 발현벡터(YGaUPC2)를 구축하였다(도 5).

상기 UPC2 유전자 증폭 산물을 발현하기 위한 균주는 사카로마이세스 세레비지에 CENPK2-1DΔpdc1::LDH 균주로서 피루베이트 탈탄산 효소(Pyruvate Decarboxylase, PDC1)가 불활성화되어 에탄올 발효 경로가 일부 봉쇄된 반면, 피루브산으로부터 L-젖산 또는 D-젖산을 생성할 수 있는 L-젖산 탈수소 효소 또는 D-젖산 탈수소 효소를 발현시켜 L-젖산과 D-젖산을 각각 생산할 수 있는 균주이다.

UPC2 유전자를 과발현하는 균주는 YGaUPC2 발현벡터가 도입된 균주를 우라실(uracil)이 없는 선택배지에서 선별하였다. 선별된 균주는 KCTC 미생물 기탁번호 KCTC18477P 로 기탁하였다.

실시예 3: UPC2 과발현에 의한 에르고스테롤 생합성 유전자의 발현 증가 확인

상기 실시예 2의 형질전환된 재조합 균주에서 UPC2 발현 벡터에 의해 UPC2 전사 산물의 카피수가 증가하는지 여부를 확인하고자 하였다.

이에, Gal10 프로모터가 발현되도록 인듀서(inducer)로서 갈락토오스를 공급하였을 때의 UPC2 전사 산물의 카피수를 정량적 중합효소 반응(Quantitative PCR, qPCR)을 통해 확인하였다.

그 결과, 인듀서가 없는 조건(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 포도당, YPD)과 인듀서가 있는 조건(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 갈락토오스, YPG)에서 상기 변이주를 배양한 후 RNA를 추출하여 정량적 중합효소 반응을 하였을 때, YPD를 기준으로 YPG 배지에서 자란 세포에서 약 30배 많은 UPC2 의 전사 산물이 존재함을 확인하였다.

따라서 상기와 같은 결과로부터, UPC2 단백질이 세포 내 다량 존재함을 예상할 수 있었다.

또한, 상기 UPC2 단백질이 기능하고 있는지 검증하기 위하여 문헌상에서 UPC2 단백질에 의해 유전자 발현이 조절된다고 알려진 에르고스테롤 생합성 경로의 여러 유전자(ERG9, ERG1, ERG6, ERG11, ERG25, ERG27, ERG6, ERG3, ERG5, ERG4)들의 전사 산물들의 카피수를 정량적 중합효소 반응을 통해 확인하였다(도 6).

그 결과, 상기 경로상의 모든 유전자의 발현이 증가하였음을 확인하였다.

실시예 4: UPC2 과발현 균주의 지질 분포도 및 스테롤 함량 증가

실시예 4-1: UPC2 과발현 균주의 에르고르테롤 합성 저해제에 대한 내성 확인

상기 실시예 3의 배양조건에서 UPC2의 과발현으로 인하여 에르고스테롤 생합성 경로의 유전자들의 발현 또한 증가하였음을 확인하였다. 이러한 결과가 세포 내의 지질 함량의 증가와 직접적인 관련이 있는지 확인하고자 하였다.

우선 스테롤 합성경로의 중간 단계에 작용하여 최종산물인 에르고스테롤의 합성을 차단하는 2종의 저해제인 Terbinafine, Fluconazole의 세포성장에 대한 저해도를 테스트하였다. 그 결과, 모균주(WT)보다 UPC2 과발현 효모에서 위의 저해제에 대한 내성이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 또한 대조균주로서 UPC2 유전자의 결손 균주(Δupc2)는 모균주(WT)보다 더욱 민감하게 성장이 저해되었다(도 7).

이와 같은 결과는 UPC2가 과발현됨에 따라 세포내 에르고스테롤의 축적으로 상기 저해제에 내성을 보인 것으로 예상하였다. 따라서 UPC2 과발현 균주에서 세포내의 지질 및 스테롤의 함량의 확인 및 이를 통한 세포의 내산성을 확인하고자 하였다.

실시예 4-2: UPC2 과발현 균주의 에르고스테롤 함량 확인

모균주(WT)와 UPC2 과발현 효모를 인듀서가 없는 조건(control)과 인듀서와 저해제가 동시에 있는 조건 (Galactose, Terbinafine) 및 인듀서와 젖산이 동시에 있는 조건(Galactose, 3% L-lactic acid)에서 2 균주를 배양한 후 지질염색법으로 알려진 filipin 물질을 이용해 효모 세포질 및 세포막에 존재하는 총 지질을 염색하여 비교하였다.

자외선 영역의 빛을 광원으로 하여 형광현미경으로 상기의 효모 세포를 관찰한 결과, filipin과 결합된 지질이 파란색으로 염색이 되어 나타났고, 염색된 지질은 세포막 또는 세포질에 골고루 분포하여 존재하고 있는 것으로 나타났다. 모균주의 경우 terbinafine 저해제나 젖산이 있는 조건에서는 지질의 함량이 다소 감소한 반면에 UPC2 과발현 재조합 균주에서는 저해제나 젖산이 존재하는 조건에서도 지질이 세포 전체에 분포되어 유지되는 것을 확인할 수 있었다. (도 8).

상기에서 수행한 세포성장 저해도 결과와 종합하였을 때, UPC2 과발현에 의하여 세포내의 지질의 함량 및 분포량이 총체적으로 증가하였음을 확인하였다. 따라서 지질 중 총 에르고스테롤의 함량을 테스트하였다.

다양한 농도의 젖산(1% ~ 3%)이 함유된 배지에서 모균주와 UPC2 과발현 효모 및 UPC2 유전자의 결손 균주를 배양하여 얻은 시료를 바탕으로 UV scan 방법을 통하여 에르고스테롤의 함량을 측정하였다.

그 결과 젖산이 없는 조건(0%)과 모든 농도의 젖산(1%~3%)이 함유된 조건에서 UPC2 과발현 효모가 다른 2개의 대조군 보다 높은 함량의 에르고스테롤을 축적하고 있음을 확인하였다(도 9).

실시예 5: UPC2 발현 증가 변이주의 젖산 내산성 확인

상기 실시예 3에서 UPC2의 발현증가가 확인된 YPG 배지에서 상기 변이주의 내산성을 확인하였다. YPD 액체 배지에 분리된 균주를 3% 및 4% 젖산이 포함된 YPG 고체 배지에 세포수를 점진적으로 희석한 후 점적하여 30℃에서 3일 동안 정치 배양하였다. 또한, 0, 1, 2, 3 및 4% 젖산이 포함된 액체배지에서 30℃, 180rpm에서 30시간 동안 진탕 배양하여 성장 곡선을 분석하였다.

그 결과, UPC2 과발현 균주가 젖산이 첨가된 고체(도 10A) 및 액체 배지(도 10B)에서 1 카피의 UPC2를 염색체에 함유하고 있는 대조군(WT)보다 더 빠른 성장을 하며, 특히 대조군의 경우 4% 젖산이 포함된 배지에서는 거의 성장을 하지만 UPC2 과발현 균주는 성장이 가능함을 확인하였다.

실시예 6: UPC2 과발현 균주의 젖산 생산 확인

UPC2의 발현증가를 확인한 형질전환 균주 (CENPK2-1D△pdc1::LDH/YGa-UPC2)와 대조군 균주(CENPK2-1D△pdc1::LDH)를 비교하여, UPC2 과발현 균주의 젖산 생산능을 확인하였다.

상기 두 균주 모두 동일 조건으로 YPG(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 갈락토오스) 액체 배지에서 30℃, 180 rpm 조건으로 배양하여 GAL10 프로모터에 의한 UPC2의 발현을 유도한 후에 세포를 회수하였고, OD₆₀₀=10 이 되도록 10% 포도당이 포함된 YPD 액체 배지에 접종하여 30℃, 80 rpm 으로 60시간 이상 동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

HPLC를 통하여 두 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과, D-젖산은 UPC2 과발현 효모균주에서 최대 32 g/L의 D-젖산이 생산된 반면, 대조군 균주에서는 최대 22 g/L가 생산되는 것을 확인하였다. 즉, UPC2 유전자 과발현 효모의 D-젖산의 생산량이 50% 이상 증가한 것을 확인하였다(도 11).

또한, 동일한 배양조건 하에서, L-젖산 생산 균주에서 UPC2 유전자를 과발현 시켰을 때에도 최대 37 g/L의 L-젖산이 생산된 반면, 대조군 균주에서는 최대 30 g/L이 생산되는 것을 확인하여, D-젖산과 마찬가지로 L-젖산 생산에 있어서도 UPC2 유전자의 발현에 따라 내산성 증가가 유발되고 결과적으로 젖산의 생산 농도가 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 12).

상기 두 경우 모두 공통적으로 UPC2 과발현 균주의 내산성 증가에 따라 젖산 생산이 향상되었고 결과적으로 에탄올의 생성이 대폭 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

이는 UPC2를 과발현하면 내산성이 증가되어 pH를 조절하지 않는 산성조건에서도 피루베이트가 젖산으로 전환되는 효율이 증가하고 상대적으로 에탄올로 전환되는 효율은 감소하는 것을 의미한다.

실시예 7: 배지 최적화를 통한 UPC2 과발현 균주의 젖산 생산

상기 실시예 6의 배양조건에서 갈락토오스만을 인듀서 및 탄소원으로 첨가하는 경우, 효모 세포가 갈락토오스를 소비하게 되므로 갈락토오스의 인듀서로서의 기능을 점차 상실하게 된다.

이를 고려하여, 갈락토오스의 소비를 최소화하여 UPC2 유전자 과발현을 유도함과 동시에 별도의 탄소원을 제공하여 세포의 성장이 원활히 이뤄지도록 전배양시 배지 조건을 YPRG(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 라피노오스, 1% 갈락토오스)으로 바꾸어 젖산 생산량을 확인하였다.

상기와 같은 배지의 구성으로, 효모 균주가 삼당류인 라피노오스(raffinose)로부터 프럭토스(fructose)를 얻어 탄소원으로 활용하고, 인듀서인 갈락토오스가 세포내 유지됨에 따라, GAL 프로모터에 의한 UPC2의 발현을 지속적으로 유도할 수 있는지 확인하고자 하였다.

상기 최적화된 배지에서 수득한 세포를 OD₆₀₀=10 이 되도록 10% 포도당이 포함된 YPD 액체 배지에 접종하여 30℃, 80 rpm 으로 60시간 이상 동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

HPLC를 통하여 상기 배지에서 생산된 젖산의 양을 확인한 결과, UPC2 과발현 효모의 경우 최대 46 g/L의 L-젖산이 생산된 반면, 대조군 균주(pdc1::L-LDH)의 경우 최대 30 g/L의 L-젖산이 생산되어 생산량이 50% 이상 증가함을 확인하였다(도 13).

또한, 에탄올의 생산량을 분석한 결과, UPC2 과발현 효모에서 모균주 보다 약 20%가 감소된 결과를 얻었다.

상기와 같은 결과를 종합하면, 본 발명의 UPC2 과발현 재조합 균주는 에르고스테롤의 합성을 증진시켜 젖산에 대한 내성이 증대되어, 젖산이 생성되면서 야기되는 산성조건에서도 젖산 생산성이 증가하고 동시에 에탄올 발효능은 감소하는 특성을 가진다.

실시예 8: ECM22 발현량이 증대된 균주의 제작

UPC2의 파라로그인 ECM22 유전자도 UPC2 유전자와 유사하게 효모의 내산성에 관여하는지를 확인하기 위하여 ECM22 과발현 균주를 제작하였다

사카로마이세스 세레비지에 게놈 유전자를 주형으로 하고 정방향 (5'-TTGAAAATTCAAGGAATTCAGATCTATGACATCCGATGAT-3', 서열번호 5) 및 역방향 (5'-CAAGTTTCGTTCAAGTCGACTTACATAAAAGCTGAAAAG-3', 서열번호 6) 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃ 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 30초간 반응을 25회; 72℃ 7분간 1회)을 통하여 ECM22 유전자를 증폭하였다. 상기의 방법으로 얻어진 중합효소 연쇄산물을 In-Fusion방법을 통하여 EcoRI/SalI 처리한 YEGaHIR525 벡터의 클로닝하여 GAL10 promoter에 의하여 발현이 조절되는 ECM22 발현벡터(YGa-ECM22)를 구축하였다(도 14).

실시예 9: ECM22 과발현에 의한 에르고스테롤 생합성 유전자의 발현 증가 확인

상기 실시예 8의 형질전환된 재조합 균주에서 ECM22 발현 벡터에 의해 ECM22 및 에르고스테롤 생합성 경로의 여러 유전자(ERG1, ERG25, ERG2, ERG5, ERG4)들의 전사 산물의 카피수가 증가하는지 여부를 확인하기 위하여 각 유전자의 발현량을 ECM22를 과발현하지 않는 야생 균주와 정량적 중합효소 반응(Quantitative PCR, qPCR)을 통해 확인하였다.

인듀서가 있는 조건(1% 효모 추출물, 2% 펩톤 및 2% 갈락토오스, YPG)에서 두가지 균주를 배양한 후 RNA를 추출하여 정량적 중합효소 반응을 하였을 때, ECM22 과발현 균주에서 약 30배 많은 ECM22의 전사 산물이 존재함을 확인하였으며 UPC2 과발현 균주에 비하여 발현증가 정도가 적었지만 확인한 모든 에르고스테롤 생합성 유전자의 발현이 증가하였음을 확인하였다(도 15).

실시예 10: ECM22 발현 증가 변이주의 젖산 내산성 확인

상기 실시예 9에서 ECM22의 발현증가가 확인된 YPG 배지에서 상기 변이주의 내산성을 확인하였다. YPD 액체 배지에 분리된 균주를 3% 젖산이 포함된 YPG 고체 배지에 세포수를 점진적으로 희석한 후 점적하여 30℃에서 3일 동안 정치 배양하였다 (도 16).

그 결과, ECM22 과발현 균주가 1 카피의 ECM22를 염색체에 함유하고 있는 대조군(WT)보다 더 빠른 성장을 보였기 때문에 UPC2 과발현 균주와 유사하게 젖산에 대한 내성이 증가했음을 확인하였다.

실시예 11: ECM22 과발현 균주의 젖산 생산 확인

UPC2 과발현 균주 및 ECM22의 발현증가를 확인한 형질전환 균주 (CENPK2-1D△pdc1::LDH/YGa-ECM22)와 대조군 균주(CENPK2-1D△pdc1::LDH)를 비교하여, UPC2, ECM22 과발현 균주의 젖산 생산능을 비교하였다.

상기 두 균주 모두 동일 조건으로 YPRG(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 라피노오스, 1% 갈락토오스) 액체 배지에서 30℃, 180 rpm 조건으로 배양하여 GAL10 프로모터에 의한 ECM22의 발현을 유도한 후에 세포를 회수하였고, OD₆₀₀=2 이 되도록 10% 포도당이 포함된 YPD 액체 배지에 접종하여 30℃, 80 rpm 으로 76시간 동안 pH를 조절하지 않는 조건에서 배양하였다.

HPLC를 통하여 두 균주의 젖산 생산량을 확인한 결과, L-젖산은 UPC2 과발현 효모균주와 ECM22 과발현 균주에서 각각 최대 38 g/L 및 33 g/L의 L-젖산이 생산된 반면, 대조군 균주에서는 최대 29 g/L가 생산되는 것을 확인하였다. 따라서 ECM22 과발현으로도 효모의 L-젖산의 생산량이 20% 이상 증가되는 것을 확인하였다 (도 17).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC18477P

수탁일자 : 20160715

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A recombinant yeast strain expressing UPC2 and use thereof <130> KPA151391-KR-P1 <150> KR 10-2016-0098898 <151> 2016-08-03 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for UPC2 <400> 1 cgggatccat gagcgaagtc 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for UPC2 <400> 2 ccgctcgagt cataacgaaa aatc 24 <210> 3 <211> 2742 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 atgagcgaag tcggtataca gaatcacaag aaagcggtga caaaacccag aagaagagaa 60 aaagtcatcg agctaattga agtggacggc aaaaaggtga gtacgacttc aaccggtaaa 120 cgtaaattcc ataacaaatc aaagaatggg tgcgataact gtaaaagaag aagagttaag 180 tgtgatgaag ggaagccagc ctgtaggaag tgcacaaata tgaagttgga atgtcagtat 240 acaccaatcc atttaaggaa aggtagagga gcaacagtag tgaagtatgt cacgagaaag 300 gcagacggta gcgtggagtc tgattcatcg gtagatttac ctcctacgat caagaaggag 360 cagacaccgt tcaatgatat ccaatcagcg gtaaaagctt caggctcatc caatgattcc 420 tttccatcaa gcgcctctac aactaagagt gagagcgagg aaaagtcatc ggcccctata 480 gaggacaaaa acaatatgac tcctctaagt atgggcctcc agggtaccat caataagaaa 540 gatatgatga ataacttttt ctctcaaaat ggcactattg gttttggttc tcctgaaaga 600 ttgaattcag gtatcgatgg cttactatta ccgccattgc cttctggaaa tatgggtgcg 660 ttccaacttc agcaacagca gcaagtgcag cagcaatctc aaccacagac ccaagcgcag 720 caagcaagtg gaactccaaa cgagagatat ggttcattcg atcttgcggg tagtcctgca 780 ttgcaatcca cgggaatgag cttatcaaat agtctaagcg ggatgttact atgtaacagg 840 attccttccg gccaaaacta cactcaacaa caattacaat atcaattaca ccagcagctg 900 caattgcaac agcatcagca agttcagctg cagcagtatc aacaattacg tcaggaacaa 960 caccaacaag ttcagcaaca acaacaggaa caactccagc aataccaaca acattttttg 1020 caacagcagc aacaagtact gcttcagcaa gagcaacaac ctaacgatga ggaaggtggc 1080 gttcaggaag aaaacagcaa aaaggtaaag gaagggcctt tacaatcaca aacaagcgaa 1140 actactttaa acagcgatgc tgctacatta caagctgatg cattatctca gttaagtaag 1200 atggggctaa gcctaaagtc gttaagtacc tttccaacag ctggtattgg tggtgtttcc 1260 tatgactttc aggaactgtt aggtattaag tttccaataa ataacggcaa ttcaagagct 1320 actaaggcca gcaacgcaga ggaagctttg gccaatatgc aagagcatca tgaacgtgca 1380 gctgcttctg taaaggagaa tgatggtcag ctctctgata cgaagagtcc agcgccatcg 1440 aataacgccc aagggggaag tgctagtatt atggaacctc aggcggctga tgcggtttcg 1500 acaatggcgc ctatatcaat gattgaaaga aacatgaaca gaaacagcaa catttctcca 1560 tcaacgccct ctgcagtgtt gaatgatagg caagagatgc aagattctat aagttctcta 1620 ggaaatctga caaaagcagc cttggagaac aacgaaccaa cgataagttt acaaacatca 1680 cagacagaga atgaagacga tgcatcgcgg caagacatga cctcaaaaat taataacgaa 1740 gctgaccgaa gttctgtttc tgctggtacc agtaacatcg ctaagctttt agatctttct 1800 accaaaggca atctgaacct gatagacatg aaactgtttc atcattattg cacaaaggtc 1860 tggcctacga ttacagcggc caaagtttct gggcctgaaa tatggaggga ctacataccg 1920 gagttagcat ttgactatcc atttttaatg cacgctttgt tggcattcag tgccacccat 1980 ctttcgagga ctgaaactgg actggagcaa tacgtttcat ctcaccgcct agacgctctg 2040 agattattaa gagaagctgt tttagaaata tctgagaata acaccgatgc gctagttgcc 2100 agcgccctga tactaatcat ggactcgtta gcaaatgcta gtggtaacgg cactgtagga 2160 aaccaaagtt tgaatagcat gtcaccaagc gcttggatct ttcatgtcaa aggtgctgca 2220 acaattttaa ccgctgtgtg gcctttgagt gaaagatcta aatttcataa cattatatct 2280 gttgatctta gcgatttagg cgatgtcatt aaccctgatg ttggaacaat tactgaattg 2340 gtatgttttg atgaaagtat tgccgatttg tatcctgtcg gcttagattc gccatatttg 2400 ataacactag cttatttaga taaattgcac cgtgaaaaaa accagggtga ttttattctg 2460 cgggtattta catttccagc attgctagac aagacattcc tggcattact gatgacaggt 2520 gatttaggtg caatgagaat tatgagatca tattataaac tacttcgagg atttgccaca 2580 gaggtcaagg ataaagtctg gtttctcgaa ggagtcacgc aggtgctgcc tcaagatgtt 2640 gacgaataca gtggaggtgg tggtatgcat atgatgctag atttcctcgg tggcggatta 2700 ccatcgatga caacaacaaa tttctctgat ttttcgttat ga 2742 <210> 4 <211> 963 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 4 atgtcaagca tgccaaatca tcaaaaagtt gtgttagtcg gcgacggcgc tgttggttct 60 agttacgctt ttgccatggc acaacaagga attgctgaag aatttgtaat tgtcgatgtt 120 gttaaagatc ggacaaaggg tgacgccctt gatcttgaag acgcccaagc attcaccgct 180 cccaagaaga tttactcagg cgaatattca gattgtaagg acgctgactt agttgttatt 240 gataacttgg cgcctcaaaa gcctggtgaa tcacgtttag acttagttaa caagaattta 300 aatatcctat catccattgt caaaccagtt gttgactccg gctttgacgg catcttctta 360 gttgctgcta accctgttga catcttaact tacgctactt ggaaattctc aggtttccca 420 aaggatcgtg tcattggttc agggacttcc ttagactctt cacgtttacg cgttgcgtta 480 ggcaaacaat tcaatgttga tcctcgttcc gttgatgctt acatcatggg tgaacacggt 540 gattctgaat ttgctgctta ctcaactgca accatcggga cacgtccagt tcgcgatgtt 600 gctaaggaac aaggcgtttc tgacgaagat ttagccaagt tagaagacgg cgttcgtaac 660 aaagcttacg acatcatcaa cttgaagggt gccacgttct acggtattgg gactgcttta 720 atgcggattt ccaaagccat tttacgtgat gaaaatgccg ttttaccagt aggtgcctac 780 atggacggcc aatacggctt aaacgacatt tatatcggga ctccggctgt gattggtgga 840 actggtttga aacaaatcat cgaatcacca ctttcagctg acgaactcaa gaagatgcaa 900 gattccgccg caactttgaa aaaagtgctt aacgacggtt tagctgaatt agaaaataaa 960 taa 963 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for ECM22 <400> 5 ttgaaaattc aaggaattca gatctatgac atccgatgat 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for ECM22 <400> 6 caagtttcgt tcaagtcgac ttacataaaa gctgaaaag 39 <210> 7 <211> 2445 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 atgacatccg atgatgggaa tgctggacaa gaaagagaga aggatgctga actgattgag 60 gttgggggca agaaagtgag caagacttcg acagggaaac ggaagtttca taacaagtcc 120 aagaccggtt gcgacaattg taaaagaaga agagtaaaat gtgatgaagg caaaccattt 180 tgcaagaaat gtacaaacat gaaattggac tgtgtttaca gccctattca gccaagaaga 240 agaaaagatt cttcgtcgtc aaaatttgca tcagcggtcc acgatagggt aggcaagaaa 300 aatctgagtg acaatgccat catgttacaa caacaacaac agcaacttca tcatcaacaa 360 gaacagcaat ttcgtcaaca acagcaagtt cagttacagc agcaactgtt gccacatgtt 420 ggtactgatg aacaaagcaa ttcccctaat agcgttcctc catccgtatc caataatatg 480 gagaatcttt tgttaccgca cctattagcg agtttagtga ataacaccag taacagtacc 540 aacagcagtg caaatggagc tgaagcgcat aataatataa cacaaacagc tcccagttca 600 atgataaaca acaaccaccc aaacatggcc ctaccaggga attcgccatt gagtataccg 660 ataacaccta gttttcaatc aacggccatg aatttatcaa gtagccttaa cggcttactc 720 tcgcctggta ggctaaattc ggtgacgaat ggattgcagc agccacaact tcaacaacaa 780 aatcagcaaa ttccacaaca acaaggaaca cagtccccct tcagcaatat tcccttcgac 840 cagctagcgc aattgaacaa gatgggcttg aacttcaata tgaagagctt caatacatta 900 tttccatacg gtgctgcaaa tggaatggcc tctgagtttc aagagttatt tggcctcgga 960 aagtttgcta catctaataa cagagcaatc aaagttagca cagcagagga ggcactcgca 1020 aatatgcaac aggaacagga ggacaaaaac aagcaattta cgaagaaccc attggataat 1080 actaagacgg atgctgttaa ttcgggcaat aaccccctta acggaaacga aaataaagtt 1140 actgcttctg atatactatc tcataacaaa aacttgataa tcgacaatac cggtctcaca 1200 atcagtcccc cacacacgtt gtccaaacct tccatagatc aaaacattgc gtccccttca 1260 acgggagtat ccaatgtaac ctctacaaag tcattgttat ctataccgga caacaggacc 1320 gctttgggaa attctcctac tttgaagacg tccccaatgg gtgacctgtt atccaactcg 1380 gaggcattgt ctccacgttc atcaaattct cacactcaac aacaatcttc tccccattca 1440 aacgcttcat cagcctcacg actagtccct gaattagtcg ggctgtctag aaaatcaaat 1500 ttgaatttga tagatctaaa actttttcat cactattgta ctgacgtatg gcataccata 1560 accgaagcag gcatttctgg tcctgaagta tggagcactt atattccgga tttggctttt 1620 cattttccct tcttgatgca tacaattttg gcttttagcg ccactcattt gtccagaact 1680 gaagccggct tggataacta cgtgtctagt catcgtttag aagcgttgag actgttaaga 1740 gaggctgtgc tcgaaatttc agatgataac acagatgctt tggtggctag tgctctaata 1800 ttaatcctag attcattggc aaatgcttca agcagctcac caacggcatg gattttccat 1860 gttaaaggcg ccgtaactat actaactgct gtatggcccc tgtcggagac atccaagttt 1920 tataacttaa tttctgttga cttgagtgat ttgggtgaag ctgtaatcaa ccaaagtaat 1980 cataataatg ataatgacaa tagcaataat ggtgatggaa ataacaataa tacgatatcg 2040 gaactcgtat gctttgacga aagtatagca gatttatatc ccgtagaaat tgattcaccg 2100 tacttgataa ctttagcata tttggacaaa ctgcatcgcg aaaaaaatca attagatttt 2160 atgttgagag tcttctcatt tcctgctctt ttggatagga cttttttagc attattaatg 2220 acaggcgacc taggggccat gagaataatg aggtcttact atacattatt gagaggttat 2280 accacagaaa taaaggacaa agtgtggttc ttggatagcg tatcacaggt tttaccacag 2340 gatgttgatg agtatagtgg aggtggtggt atgcatatga tgctggattt cttaggaggt 2400 gggttacctt ctatgaccac tacaaacttt tcagctttta tgtaa 2445

Claims

UPC2 (Uptake Control protein 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 발현 카세트로서, 상기 UPC2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 구성되는 것인, 발현 카세트.
ECM22 (ExtraCellular Mutant 22)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 효모 균주의 내산성 증가용 ECM22 발현 카세트로서, 상기 ECM22를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 7의 서열로 구성되는 것인, 발현 카세트.
제1항에 있어서, 상기 UPC2는 에르고스테롤 생합성을 증진시킬 수 있는 것인, 발현 카세트.
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제1항의 발현 카세트를 포함하는, 효모 균주의 내산성 증가용 UPC2 (Uptake Control protein 2) 발현 벡터.
제7항의 발현 벡터가 도입된, UPC2 (Uptake Control protein 2) 유전자를 과발현하는 재조합 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 야생형 효모에 비해 UPC2 유전자의 발현량이 증가한 것인, 재조합 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 야생형 효모에 비하여 증가된 내산성을 가지는 것인, 재조합 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 PDC1 (Pyruvate Decarboxylase 1) 유전자가 추가로 결실된 것인, 재조합 균주.
제11항에 있어서, 상기 균주는 LDH (Lactate Dehydrogenase)가 추가적으로 도입된 것인, 재조합 균주.
제12항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC 18477P로 기탁된 것인, 재조합 균주.
제12항에 있어서, 상기 균주는 야생형 효모보다 에탄올 생산능은 감소하면서도 유기산 생산량이 증대된 것인, 재조합 균주.
제14항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인, 재조합 균주.
제8항에 있어서, 상기 균주는 캔디다 속(Candida sp.), 디베리오마이세스 속 (Debaryomyces sp.), 한세눌라 속(Hansenula sp.), 클루이베로마이세스 속 (Kluyveromyces sp.), 피키아 속(Pichia sp.), 스키조사카로마이세스 속 (Schizosaccharomyces sp.), 야로이야 속(Yarrowia sp.), 사카로마이시스 속 (Saccharomyces sp.), 슈완니오마이세스 속(Schwanniomyces sp.) 및 아르술라 속(Arxula sp.)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 재조합 균주.
제8항의 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
제17항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인, 유기산 생산 방법.
제18항에 있어서, 상기 젖산은 L-젖산 또는 D-젖산인, 유기산 생산 방법.
서열번호 3의 서열로 구성되는 UPC2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 내산성이 증가된 균주의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 ECM22는 에르고스테롤 생합성을 증진시킬 수 있는 것인, 발현 카세트.
제2항의 발현 카세트를 포함하는, 효모 균주의 내산성 증가용 ECM22 발현 벡터.
제22항의 발현 벡터가 도입된, ECM22 유전자를 과발현하는 재조합 균주.
제23항에 있어서, 상기 균주는 PDC1 (Pyruvate Decarboxylase 1) 유전자가 추가로 결실된 것인, 재조합 균주.
제24항에 있어서, 상기 균주는 LDH (Lactate Dehydrogenase)가 추가적으로 도입된 것인, 재조합 균주.
제23항의 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 유기산 생산 방법.
제26항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인, 유기산 생산 방법.
제27항에 있어서, 상기 젖산은 L-젖산 또는 D-젖산인, 유기산 생산 방법.
서열번호 7의 서열로 구성되는 ECM22 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, 내산성이 증가된 균주의 제조방법.