KR101704212B1 - 젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법 - Google Patents

젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 피루베이트 디카르복실라아제 (Pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되고, ATP-시트르산 분해효소 (ATP-citrate lyase, ACL) 활성이 도입되고, 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된, 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법에 관한 것이다.

Description

젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법{A microorganism producing lactic acid and method for producing lactic acid using the same}
본 발명은 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법에 관한 것이다.
젖산은 식품 분야, 의약분야, 화장품 분야 등 산업 분야에서 다양하게 이용되고 최근에는 폴리유산의 단량체로 활용되어 그 요구량이 크게 증가하고 있다. 젖산을 생산하는 방법으로는 전통적인 화학합성법과 탄수화물을 기질로 하는 생물학적 발효법이 있으며, 최근에는 후자의 방법이 선호되고 있다.
일반적으로, 효모 기반의 젖산 생산 미생물은 락테이트 디히드로게네이즈 (Lactate dehydrogenase, LDH) 및 피루베이트 디카르복실라아제(Pyruvate decarboxylase, PDC)가 경쟁적으로 피루베이트 (pyruvate)를 기질로 사용한다. 이에, 제조 수율을 극대화하기 위해서는 피루베이트가 LDH에 의해 젖산 (Lactic acid, LA)으로 많이 생산될 수 있도록, PDC의 기능을 최소화하는 것이 필요하다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae )에서 PDC는 PDC1, PDC5, 및 PDC6라는 세가지 아이소자임 (isozyme)으로 존재한다. 이에, 젖산 생산량을 극대화하기 위하여 PDC1, PDC5 및 PDC6를 동시 결손한 삼중 결손 균주를 제작하는 방법이 사용될 수 있다. 그러나, PDC의 활성이 불활성화되면, 젖산의 수율은 증가하지만, 생산성이 하락하고 균주의 원활한 생장이 불가능한 단점이 보고되고 있어 (유럽특허 제EP2041264호), 상기 방법으로는 목적하는 만큼의 젖산을 생산하기 어렵다. 또한, 사카로마이세스 속 같은 효모는 박테리아와 같은 원핵세포와 달리 다양한 세포 소기관 및 다양한 유기적 체계에 의해 단순 유전자 조작으로는 목적하는 양의 젖산을 생산할 수 있을 수 있는지를 명확히 예측할 수 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 젖산 생산 미생물에서 원활한 성장이 유지되며, 젖산 생산 수율 및 생산량을 모두 증가시킬 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 아세틸-CoA의 공급 경로, 및 옥살로아세테이트 (Oxaloacetate, OAA)로부터 피루베이트로의 공급 경로를 강화하였을 때, 젖산 생산량이 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 이용하여 젖산을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 피루베이트 디카르복실라아제 (Pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되고, ATP-시트르산 분해효소 (ATP-citrate lyase, ACL) 활성이 도입되고, 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된, 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물을 제공한다.
상기 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물은 ACL 활성이 도입되지 않고/또는 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이되지 않은 균주에 비해, 젖산 발효 수율이 증가하거나/하고, 사카로마이세스 속 균체의 성장이 증가 (생산 미생물의 생장 증가)하거나/하고, 젖산 생산능이 증가된, 미생물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "젖산 (lactic acid, LA)"은 C2H4OHCOOH로 표시되는 유기산을 의미한다. 이와 같은 젖산은 화학합성법을 이용하여 젖산을 생산할 경우, D형 젖산과 L형 젖산이 50%씩 섞여있는 라세믹(racemic) 혼합물 형태로 생성되고 조성비 조절이 불가능하여 폴리유산을 제조할 경우 용융점이 낮은 무정형의 고분자가 되어 용도 개발 시에도 제한이 많다. 반면, 미생물을 이용한 생물학적 발효법의 경우 사용하는 균주 또는 도입되는 락테이트 디히드로게네이즈 (Lactate dehydrogenase,LDH)에 따라서 D형 또는 L형의 젖산을 선택적으로 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어, "젖산 생산능을 갖는 미생물"은 본 발명의 목적상 젖산을 생산할 수 있는 미생물 균주로서, 당을 젖산으로 전환시킬 수 있는 균주를 의미하며, 그 예로 효모 미생물로, 본 발명의 젖산 생산 경로, 아세틸-CoA의 생산 경로를 포함하는 이상 제한되지 않는다.
효모 미생물은 형태에 의해 "사카로마이세스 속", "피치아속", "캔디다 속" 및 "사이카로마이코프시스 속" 등으로 나뉘며, 구체적으로 본 발명에서는 젖산을 생산할 수 있다면 다양한 종을 포함하는 "사카로마이세스 속" 미생물을 활용할 수 있다. 구체적으로 상기 사카로마이세스 속 미생물은 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오커스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 시바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이더스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 마르티니에(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누그(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로럼(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 츄리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 유니스포러스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바럼(Saccharomyces uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에일 수 있다.
본 발명의 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물은 피루베이트 디카르복실라아제의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되고, ATP-시트르산 분해효소 활성이 도입되고, 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된, 미생물일 수 있다.
상기 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물은 구체적으로, (i) 피루베이트 디카르복실라아제의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이되고, (ii) ATP-시트르산 분해효소 활성이 도입되고, (iii) 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된 것뿐 아니라, 추가적으로 (iv) 락테이트 디히드로게네이즈 (Lactate dehydrogenase, LDH) 활성이 도입되고; (v) 알코올 디히드로게네이즈 1의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화; (vi) 피루베이트 디카르복실라아제 1의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화; 및/또는 (vii) D-락테이트 디히드로게네이즈 1의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화되도록 변이된, 미생물일 수 있다.
또한 본 발명의 상기 미생물은 추가적으로, (i) 알코올 디히드로게네이즈 1 (Alcohol dehydrogenase 1, ADH1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이됨; (ii) 피루베이트 디카르복실라아제 1 (Pyruvate decarboxylase 1, PDC1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이됨; 및 (iii) D-락테이트 디히드로게네이즈 1 (D-lactate dehydrogenase 1, DLD1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된 것인, 미생물일 수 있다.
본 발명에서 용어, "피루베이트 디카르복실라아제 (Pyruvate decarboxylase, PDC)"는 "피루베이트 탈탄산효소"와 혼용될 수 있으며, 피루베이트를 아세트알데하이드 (Acetaldehyde) 및 이산화탄소 (CO2)로 전환시키는 효소를 의미한다. 상기 효소는 무산소 조건에서 효모, 특히 사카로마이세스 속 내에서 발생되는 발효 과정에 작용하는 효소로, 발효에 의해 에탄올을 생성하는 효소이다. 일반적으로 사카로마이세스 속 미생물의 PDC는 PDC1, PDC5 및 PDC6의 3가지 아이소자임 (isozyme) 형태로 존재한다. 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 효소는 구체적으로 PDC1은 서열번호 39, PDC5는 서열번호 41, PDC6는 서열번호 43의 아미노산으로 이루어진 단백질일 수 있으나, 상기 효소의 활성을 갖는 서열이라면 제한 없이 포함된다. 또한 상기 PDC1, PDC5 및 PDC6을 코딩하는 유전자는 각각 구체적인 예로 서열번호 40, 42, 및 44의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "ATP-시트르산 분해효소 (ATP-citrate lyase, ACL, EC 2.3.3.8)"는 시트르산 (citrate)을 옥살로아세테이트 (oxaloacetate, OAA)와 아세틸-CoA로 변환시키는 효소로, 고등생물 및 일부 효모에 존재한다고 알려져 있다 (ATP-citrate lyase: A mini-review, Biochemical and Biophysical Research Communications 422 (2012) 1-2).
이의 반응식은 다음과 같다.
시트르산 + ATP + CoA + H2O → OAA + Acetyl-CoA + A + Pi
아세틸-CoA (acetyl-CoA)는 균주의 생장에 필수적인 효소로, 이의 중요성은 최근 다양한 문헌에서 크게 대두되고 있다. 대표적인 예로 1,3-BDO (1,3-butanediol)를 생산하는 진핵세포 생물체 (eukaryotic organism)에서 비-자연적인 경로 (non-natural pathway)를 이용해 세포 기질 아세틸-CoA (cytosol acetyl-coA)를 공급하여 생산성을 높이려는 연구가 보고되고 있다 (국제공개 특허 제WO2013/036764호).
이에, 외래 ACL 도입을 통해 PDC의 활성이 약화 혹은 제거된 균주에서 생장에 필수적인 아세틸-CoA의 공급을 가능하게 하여, 이를 통해 PDC의 활성에 비의존적으로 미생물이 생장할 수 있도록 하는 것이다. 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 ATP-시트르산 분해효소는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한 상기 ACL을 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 30의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "피루베이트 생합성 경로"는 효모, 즉 사카로마이세스 속 미생물 내의 피루베이트를 공급할 수 있는 생합성 경로로, OAA로부터 피루베이트로의 공급 경로일 수 있다. 구체적인 예는 도 1 및 2에 나타낸 바와 같다.
일례로서 상기 피루베이트 생합성 경로의 강화는 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 1 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1) 또는 피루베이트 키나아제 2 (Pyruvate kinase 2, PYK2) 또는 상기 효소 모두의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되도록 변이시켜 수행될 수 있다.
또는 상기 피루베이트 생합성 경로의 강화는 말레이트 디히드로게네이즈 2 (Malate dehydrogenase 2, MDH2) 또는 세포 기질 말릭 효소 1 (cytosolic Malic enzyme 1, cytosolic MAE1) 또는 상기 효소 모두의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되도록 변이시켜 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어, "포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 1 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1)"는 OAA로부터 PEP (Phosphoenolpyruvate)로 전환을 촉매하는 효소를 의미한다. PCK1은 효모 미생물에서 OAA를 PEP로 전환하는 포도당신생과정 (gluconeogenesis)에서 필요한 효소로 포도당이 존재하는 조건에서 발현의 저해를 받는 효소로 알려져 있다 (Differential post-transcriptional regulation of yeast mRNAs in response to high and low glucose concentrations. Mol Microbiol 35(3):553-65 (2000)).
본 발명에서, 용어, "피루베이트 키나아제 2 (Pyruvate kinase 2, PYK2)"는 PEP로부터 ADP로 인산기 (Phosphate group)을 전달하여, 피루베이트 및 ATP 생산을 촉매하는 효소를 의미한다. PYK2는 효모 미생물에서 PEP를 피루베이트로 전환하는 해당과정 (glycolysis)의 마지막 단계 효소로, PYK2 역시 포도당이 존재하는 조건에서 발현의 저해를 받는 효소로 알려져 있다 (Characterization of a glucose-repressed pyruvate kinase (Pyk2p) in Saccharomyces cerevisiae that is catalytically insensitive to fructose-1,6-bisphosphate, J Bacteriol. 1997 May;179(9):2987-93).
상기 각 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 PCK1은 서열번호 31의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한 상기 PCK1을 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 32의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다. 상기 PYK2은 서열번호 33의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한 상기 PYK2를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 34의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "MDH2 (Malate dehydrogenase 2)"는 OAA를 말레이트 (Malate)로 바꾸는 가역적인 효소를 의미한다. 상기 MDH2는 본래 세포 기질 (cytosol)에 위치하는 효소이다.
본 발명에서 용어, "세포 기질 MAE1 (Cytosolic Malic Enzyme 1)"는 말레이트를 피루베이트로 치환하는 효소인 MAE1 중 미토콘드리아 표적 서열 (mitochondrial targeting sequence)이 제거되어 세포 기질에 위치하도록 변경된 효소이다. 상기 MAE1 효소의 경우, 본래 미토콘드리아에 위치하는 단백질로, 미토콘드리아 내에서 TCA 회로 (tricarboxylic acid)의 중간물질인 말레이트를 피루베이트로 치환하는 효소이다 (Metabolic Engineering, 6 (2004) 352-363). 상기 각 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 MDH2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한 상기 MDH2를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 36의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다. 상기 MAE1은 서열번호 37의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 아울러, MAE1이 세포 기질에 존재하기 위해서는 서열번호 37의 아미노산 중 30번째까지의 아미노산이 제거된 서열 (즉, 미토콘드리아 표적 서열인 서열번호 51의 아미노산 서열이 제거된 서열)일 수 있으며, 이와 같은 서열을 서열번호 52로 표시하였다. 또한 상기 MAE1을 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 38의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어 "락테이트 디히드로게네이즈 (Lactate dehydrogenase, LDH)"는 피루베이트 및 락테이트를 상호 전환할 수 있는 효소로, 상기 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 LDH는 서열번호 49의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 효소 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한 상기 LDH를 코딩하는 유전자는 구체적인 예로 서열번호 50의 염기서열로 나타낼 수 있으나, 상기 효소를 코딩할 수 있는 서열이라면 제한 없이 포함된다.
상기 각 효소들은 상기 서열번호로 기재한 아미노산 서열들뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더 구체적으로는 98% 이상, 더욱 더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖으며 각 효소에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 효소 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 각 효소들을 코딩하는 유전자는 상기 서열번호들로 기재한 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 효소와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 효소를 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보, 예로는 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)를 직접 정렬하여 결정될 수 있다(예: BLAST 2.0). 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태 또는 해당 효소의 변형 전에 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미한다.
상기 "효소의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된"은 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다.
상기 감소는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.
이러한 효소 활성의 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 균주 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.
상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 구체적으로는 1 내지 100개, 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.
구체적으로, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 감소하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어, "활성이 내재적 활성에 비하여 강화"한다는 것은, 미생물이 그 단백질의 활성을 보유하고 있는 상태에 비하여 세포 내 활성을 향상시키도록 변형시킴으로써 상기 단백질 (또는 효소)의 세포 내 활성을 증가시키는 것을 의미한다. 이와 같은 "강화"는 단백질 (또는 효소) 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐 아니라, 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염색체상의 유전자 조절 서열에 변이를 도입하는 방법, 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염색체상의 유전자의 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법, 상기 단백질 (또는 효소)의 활성이 증가하도록 돌연변이된 유전자로 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 유전자를 대체하는 방법 및 상기 단백질 (또는 효소)의 활성이 강화되도록 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염색체상의 유전자에 변이를 도입시키는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있으나, 단백질 (또는 효소) 활성이 내재적 활성에 비하여 강화시킬 수 있거나, 도입된 활성을 강화시킬 수 있는 공지의 방법은 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "단백질 (또는 효소) 활성을 도입 "한다는 것은, 특정 단백질 (또는 효소) 활성을 가지고 있지 않은 미생물에 그 단백질의 활성을 부여하거나, 특정 단백질 (또는 효소) 활성을 가지고 있지 않은 미생물에 그 단백질 (또는 효소) 활성이 부여된 후, 이의 세포 내 활성을 더욱 향상시키도록 변형시킴으로써, 상기 단백질 (또는 효소)의 세포 내 활성을 증가시키는 것을 의미한다.
이러한 "단백질 (또는 효소) 활성을 도입"한다는 것은, 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있는데, 예를 들어 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 염색체에 삽입하는 방법, 상기 폴리뉴클레오티드를 벡터 시스템에 도입하여 미생물에 도입하는 방법 등으로 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가 방법, 상기 단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나, 프로모터에 변이를 준 상기 단백질 (또는 효소)을 도입하는 방법, 상기 단백질 (또는 효소)단백질 (또는 효소)을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법 등을 사용할 수 있으나, 단백질 (또는 효소) 활성을 도입시킬 수 있는 공지의 방법은 제한 없이 포함된다.
상기에서 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
상기 효모 발현 벡터는 조합 효모 플라스미드(YIp: integrative yeast plasmid) 및 염색체 외 플라스미드 벡터(extrachromosomal plasmid vector)가 모두 가능하다. 상기 염색체 외 플라스미드 벡터는 에피솜 효모 플라스미드(YEp: episomal yeast plasmid), 복제 효모 플라스미드(YRp: replicative yeast plasmid) 및 효모 중심체 플라스미드(YCp: yeast centromer plasmid)를 포함할 수 있다. 또한, 인위적 효모 염색체들(YACs: artificial yeast chromosomes)도 본 발명에 따른 발현 벡터로서 가능하다. 구체적인 예로서, 이용 가능한 벡터는 pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPinkTM, p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 및 pYJ406를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적인 효모 벡터는 복제 원점 ori 및 항생물질 저항성 카세트(antibiotic resistance cassette)를 함유하여 대장균(E. coli)에서 증식되고 선택될 수 있는 효모 복제 플라스미드(yeast replication plasmid)일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 프로모터-유전자-전사 종결서열의 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있다.
예를 들어, 숙주 세포가 효모인 경우, 상기 발현 컨스트럭트에서 이용가능한 프로모터는 TEF1 프로모터, TEF2 프로모터, GAL10 프로모터, GAL1 프로모터, ADH1 프로모터, ADH2 프로모터, PHO5 프로모터, GAL1-10 프로모터, TDH3 프로모터(GPD 프로모터), TDH2 프로모터, TDH1 프로모터, PGK1 프로모터, PYK2 프로모터, ENO1 프로모터, ENO2 프로모터 및 TPI1 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 발현 컨스트럭트에서 이용가능한 전사 종결서열은 ADH1 터미네이터, CYC1 터미네이터, GAL10 터미네이터, PGK1 터미네이터, PHO5 터미네이터, ENO1 터미네이터, ENO2 터미네이터 및 TPI1 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 또는 염색체 내에 도입시키고자 하는 외래 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 본 발명의 목적상 사카로마이세스 속 미생물일 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열에 변이를 도입하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상류에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 또는 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, (i) 상기 신규한 피루베이트 디카르복실라아제의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되고, ATP-시트르산 분해효소 활성이 도입되고, 피루베이트 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된, 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, 젖산 제조 방법을 제공한다.
상기 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 미생물은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 사카로마이세스 속 미생물을 이용하여 젖산을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 사카로마이세스 속 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 구체적으로는 본 발명의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
사용될 수 있는 탄소원의 예는 수쿠로오스 또는 글루코오스를 이용할 수 있으며, 수쿠로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적적량의 탄소원이 다양하게 이용될 수 있다.
질소원의 예로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리클리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 25℃ 내지 35℃, 더욱 구체적으로는 30℃일 수 있으나, 목적하는 목적에 따라 제한 없이 변경될 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 젖산을 생산하는 방법은, 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물 또는 배지로부터 젖산을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
본 발명의 PDC 활성이 불활성화되고, 외래 ACL 활성이 도입 및 피루베이트 생합성 경로가 강화되도록 변이된, 젖산 생산 균주는 기존 균주에 비해 알코올 활성 경로의 피루베이트 이탈 최소화 및 젖산 분해 경로의 차단을 통해 젖산 발효 수율 및 생산성이 우수하며 생산 균주의 생장이 증가하므로, 젖산을 원료로 사용하는 각종 제품의 생산성을 향상시키는데 널리 활용될 수 있을 것이다. 이를 통해 생산된 젖산은 다양한 제품의 원료로서 제공될 수 있다.
도 1은 효모 미생물 내 존재하는 PCK1 (PEP carboxykinase, EC 4.1.1.49)과 PYK2 (Pyruvate kinase, EC 2.7.1.40) 효소의 과발현을 이용한 피루베이트 생합성 강화 경로로, 본 발명의 외래 ACL 도입, 및 PCK 및 PYK 경로 강화를 통한 젖산 생산성 증가 전략을 도식화한 도이다.
도 2는 효모 미생물 내 존재하는 MDH2 (Malate dehydrogenase 2, EC 1.1.1.37) 및 cytosolic MAE1 (Malic enzyme 1, EC 1.1.1.38) 효소 강화를 이용한 피루베이트 생합성 강화 경로로, 본 발명의 외래 ACL 도입, 및 MDH, cytosolic MAE 경로를 통한 젖산 생산성 증가 전략을 도식화한 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 젖산 생산 균주 제작
본 발명에서 사용할 대표적인 젖산 생산 균주를 제작하기 위하여, Euroscarf에서 분양받은 야생형 효모 중 대표적인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae ) CEN.PK2-1D에 일련의 유전자 조작을 가하였다.
구체적으로는, 알코올 합성 경로로의 피루베이트의 이탈을 최소화하기 위하여 알코올 탈수소효소 1 (alcohol dehydrogenase 1; ADH1) 및 피루베이트 탈탄산효소 1 (pyruvate decarboxylase 1; PDC1)을 결손시키고, D형 젖산 분해 경로의 차단을 위해 D-젖산 탈수소효소 1 (d-lactate dehydrogenase 1; DLD1)을 결손한 균주를 본 발명의 기반 균주로 사용하였다.
DLD1은 생장 개선에 직접적인 영향을 미치는 요소는 아니나, D형 젖산의 탈수소효소로 NAD+를 이용하여 피루베이트로 전환시키는 주된 효소로 알려져 있다. 따라서, 젖산을 소모하는 효소인 DLD1 유전자를 결손한 균주를 기반으로 후속 균주를 제작하여, 젖산 발효 생산성을 비교하였다.
본 발명의 유전자 조작은 일반적인 molecular cloning 방법을 이용하였다. 먼저, 효모의 ADH1 및 PDC1 유전자 결손에 관한 실험은 Lee TH, et al.(J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16(6), 979-982) 논문에 개시된 내용을 참고로 하여 pWAL100 및 pWBR100 플라스미드를 이용하였다. 벡터에 삽입한 각 insert는 각각에 해당하는 프라이머 (서열번호 1 내지 서열번호 8)를 이용하여 PCR(중합효소연쇄반응, Polymerase chain reaction)을 통해 제조하였다.
PCR은 야생형 효모의 genomic DNA를 주형으로 사용하였다. ADH1 결손을 위하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWAL100에 클로닝하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWBR100에 클로닝하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다.
PDC1 결손을 위하여 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWAL100에 클로닝하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWBR100에 클로닝하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다.
또한, DLD1의 유전자 결손을 위하여 HIS3 마커 유전자를 double crossover로 도입하여 결손시켰다. 이에 사용된 DNA 단편은 야생형 효모의 genomic DNA를 주형으로 하는 PCR을 통해 수득하였으며 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 제조하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다.
상기 유전자 조작에 사용한 프라이머를 정리하면 하기 표 1과 같다.
젖산 생산 기반균주 제작을 위한 프라이머 서열
프라이머 5'-> 3' 서열
ADH1 upstream forward primer
(서열번호 1)		 CGGGATCCACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCC
ADH1 upstream reverse primer
(서열번호 2)		 ATAAGAATGCGGCCGCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGCTT
ADH1 downstream forward primer
(서열번호 3)		 GACTAGTGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATT
ADH1 downstream reverse primer
(서열번호 4)		 ACATGCCATGgAAGCATGCACGTATACACTTGAGTAA
PDC1 upstream forward primer
(서열번호 5)		 CGGGATCCATTATGTATGCTCTTCTGACTTTTCGT
PDC1 upstream reverse primer
(서열번호 6)		 ATAAGAATGCGGCCGCTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC
PDC1 downstream forward primer
(서열번호 7)		 CGGGATCCGCGATTTAATCTCTAATTATTAGTTAAAG
PDC1 downstream reverse primer
(서열번호 8)		 ATAAGAATGCGGCCGCTTTCAATCATTGGAGCAATCATTTTACA
DLD1-HIS3 upstream linking primer
(서열번호 9)		 GCGTAGTTGGCCCCAACTGGTGCAGTAATACGTTTTAAGAGCTTGGTGAG
DLD1-HIS3 downstream linking primer
(서열번호 10)		 CGTGAAGGGTGAAAAAGGAAAATCAGATACCTACATAAGAACACCTTTGG
상기와 같이 3개의 유전자 (ADH1, PDC1, 및 DLD1)를 결손시킨 균주를 바탕으로, 젖산 생산을 위한 유전자인 D-젖산 탈수소효소(d-lactate dehydrogenase, D-LDH)를 도입하였다. S. cerevisiae 유래의 TEF1 프로모터와 CYC1 터미네이터 사이에 락토바실러스 플란타럼(Lb . plantarum) 유래 ldhD 유전자를 함유하도록 각각 5' 및 3' 말단에 p413TEF1 벡터에 클로닝하였으며, 여기서 SaxⅠ/PvuⅡ의 이중 절단으로 insert를 준비하였다. 그리고 벡터는 p-δ-neo에서 BamHⅠ/NotⅠ으로 이중 절단된 DNA 절편에서 Mungbean nuclease로 blunt end를 만든 다음, 다시 SacⅠ로 처리하여 SacⅠ stick end와 BamHⅠ blunt end를 갖는 벡터 부분을 만들었다.
상기의 과정으로 수득한 벡터와 insert를 라이게이션하여, pTL573 벡터를 완성하였다. 이 완성 벡터를 pTL573으로 명명하였다. pTL573 플라스미드는 Lb . plantarum 유래 ldhD 유전자를 포함하고 있으며, S. cerevisiae CEN.PK2-1D pdc1 adh1 dld1 균주의 retrotransposable element 중 일부 영역인 δ-sequence에 무작위적으로 다수의 카피가 삽입되도록 설계되었다. 해당 유전자의 다중 삽입을 위하여 플라스미드 pTL573을 SalⅠ 제한효소로 절단하여, δ-sequence 상에 single crossover를 유도하는 DNA 단편을 제작하였다. 이를 형질전환으로 모균주 내에 도입하여 최대 5 ㎎/㎖ G418 농도의 YPD (1 % yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 배지에서 다수의 콜로니들을 얻었다. 이렇게 얻어진 균주는 최종적으로 D형 젖산 생산능 부여를 위해 락토바실러스 플란타럼(Lb . plantarum) 유래의 D-LDH가 복수로 삽입되어 있는 것을 확인하였으며, 이를 CC02-0064 균주라 명명하였다.
실시예 2: PDC 역가 감소 혹은 불활성화 균주의 제작
기반 균주인 상기 실시예 1에서 제조된 CC02-0064 균주에 PDC isozyme인 PDC5를 결손한 균주 및 PDC5와 PDC6를 모두 결손한 균주를 제작함으로써 PDC의 역가를 감소 혹은 불활성화한 균주를 제작하였다.
구체적으로, 효모의 상기 유전자 결손을 위하여, pWAL100 및 pWBR100 플라스미드 (J. Microbiol. Biotechnol., (2006) 16(6), 979-982)를 이용하였다.
PDC5 결손을 위하여 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NotI 제한효소를 이용하여 pWAL100에 클로닝하고, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 SpeI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWBR100에 클로닝하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다.
PDC6 결손을 위하여 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWAL100에 클로닝하고, 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 뒤 BamHI, NcoI 제한효소를 이용하여 pWBR100에 클로닝하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다.
PDC isozyme 결손을 위한 프라이머 서열
프라이머 5'-> 3' 서열
F-ALPDC5-BamHI
(서열번호 11)		 GAGCTCGGATCCAAGGAAATAAAGCAAATAACAATAACACC
R-ALPDC5-NotI
(서열번호 12)		 ACCATGGCGGCCGCTTTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTGTTG
F-BRPDC5-SpeI
(서열번호 13)		 GGATCCACTAGTGCTAATTAACATAAAACTCATGATTCAACG
R-BRPDC5-NcoI
(서열번호 14)		 CAGCTGCCATGGTATTCTAAATAAGATGTAAGGCCTTGTAAT
F-ALPDC6-BamHI
(서열번호 15)		 GAGCTCGGATCCATTAAAATCATGGAAATTAAGTATTACAG
R-ALPDC6-NcoI
(서열번호 16)		 CAGCTGCCATGGTTTGTTGGCAATATGTTTTTGCTATATTA
F-BRPDC6-BamHI
(서열번호 17)		 GAGCTCGGATCCGCCATTAGTAGTGTACTCAAACGAATTA
R-BRPDC6-NcoI
(서열번호 18)		 CAGCTGCCATGGACCTCAAAACATTCTTTTCAATCTTAACC
상기와 같이 제작한 신규 균주를 각각 CC02-0256 및 CC02-0553으로 명명하였고, 상기 신규 균주의 유전 형질을 정리하면 하기의 표 3과 같다.
PDC 활성이 감소 혹은 불활성화된 균주
균주명 유전형질
CC02-0256 Saccharomyces cerevisiae δ:: ldhD adh1 Δ dld1 Δ pdc1 Δ pdc5 Δ
CC02-0553 Saccharomyces cerevisiae δ:: ldhD adh1 Δ dld1 Δ pdc1 Δ pdc5 Δpdc6Δ
실시예 3: PDC 활성 감소 및 불활성화 균주의 젖산 발효 평가
균주의 평가를 위하여 사용된 배지는 효모용 제한 배지인 SC 배지 (Synthetic Complex media)이다. 해당 배지를 제작하기 위하여 0.67 % yeast nitrogen base without amino acid를 기반으로 여기에 아미노산 dropout mix (Sigma)를 제조사의 프로토콜에 따라 혼합하고 필요에 따라, 제외된 아미노산을 첨가하였다. 류신 (leucine)은 380 ㎎/L, 우라실(Uracil), 트립토판(Tryptophan) 및 히스티딘(Histidine)은 76 ㎎/L가 되게 첨가하였고, 탄소원으로서 포도당 8%와 중화제로서 1% CaCO3를 첨가하였다. 이렇게 제조한 배지를 효모 균주 젖산 발효 평가에 이용하였다.
균주의 젖산 발효능 평가를 위한 조건은 제작된 젖산 발효평가용 배지를 한 플라스크당 25 ㎖로 분주하여 효모균을 접종하고 30 ℃에서 48 시간 동안 호기배양한 뒤 발효액에 존재하는 젖산의 양을 HPLC 분석하였다.
상기 실험의 결과를 정리하면 하기 표 4와 같다.
PDC 활성 감소 및 불활성화 균주의 발효 결과 비교
균주 OD(600nm) 소모당(g/L) 젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/L/h)
CC02-0064 10.5 75.5 36.5 48.4 0.76
CC02-0256 3.6 49.5 29.1 58.7 0.61
CC02-0553 2.6 34.5 20.8 60.2 0.43
그 결과, 상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, PDC의 활성이 감소함에 따라 그 수율이 증가하였으나, 생산성은 감소하는 결과를 보였다.
실시예 4: PDC 불활성화 균주 기반의 ACL ( ATP - Citrate Lyase ) 도입, 및 PCK1 ( Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1) 및 PYK2 ( Pyruvate kinase 2)가 강화된 균주의 제작
(1) 외래 ACL 을 젖산 생산 균주에 도입하기 위한 벡터 제작
외래의 ACL 효소를 도입하고 피루베이트 생합성 경로 중 하나인 PCK1과 PYK2를 동시에 과발현하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
외래의 ACL은 포유류 Mus musculus 유래의 유전자를 사용하였으며, 해당 유전자는 NCBI (Accession no. NP_001186225)에서 확인하였다.
구체적으로 서열번호 29의 아미노산 서열 (서열번호 30의 염기서열)로 합성하였으며, 효모용 유전자 발현벡터인 pRS415를 기반으로 GPD 프로모터를 사용하여 벡터를 제작하여, 상기 유전자가 삽입된 벡터를 p415GPDpro-ACL이라 명명하였다.
(2) pyruvate 생합성 경로 강화를 위한 PCK1 및 PYK2 강화 벡터 제작
피루베이트 생합성 경로 강화를 위한 PCK1 및 PYK2의 동시 과발현을 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
PYK2는 효모 미생물 내 존재하는 유전자로 서열번호 33으로 표시될 수 있다. 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여, S. cerevisiae genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였으며, PYK2유전자 절편을 수득하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다. 상기 유전자 절편과 pRS416 유래의 효모 발현벡터 내 제한효소 SpeI, XhoI을 이용하여 클로닝하였고, TEF1 프로모터를 이용하여 과발현되도록 하였다. 해당 재조합 벡터는 pRS416-TEF1pro-PYK2라 명명하였다.
PCK1 역시 효모 미생물 내 존재하는 유전자로 서열번호 31로 표시될 수 있다. 서열번호 23 및 24의 프라이머를 이용하여 S. cerevisiae genomic DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하여 PCK1 유전자 절편을 수득하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분 30초의 조건으로 수행하였다. PCK1이 TEF2 프로모터를 이용하여 발현될 수 있도록 서열번호 21 및 22의 프라이머로 S. cerevisiae genomic DNA를 주형으로 하여 PCK1 절편을 수득한 조건과 동일한 조건으로 PCR을 수행하였고, TEF2 프로모터 절편을 수득하였다. 이후 PCK1과 PYK2가 한 개의 재조합 벡터에서 동시에 발현될 수 있도록 하기 위해, 상기에서 제조한 pRS416-TEF1pro-PYK2 재조합 벡터를 XhoI으로 절단한 후, 그 사이에 수득한 TEF2 프로모터 절편과 PCK1 절편을 Clontech 사의 In-Fusion cloning kit를 이용하여 클로닝하였다. 최종적으로는 PCK1과 PYK2를 각각 TEF2, TEF1 프로모터로 과발현할 수 있는 한 개의 재조합 벡터를 제작하였고, 이를 pRS416-TEF1pro-PYK2-TEF2pro-PCK1이라 명명하였다. 본 실시예의 PCK1과 PYK2 과발현 벡터 제작에 사용된 프라이머를 정리하면 하기 표 5과 같다.
PCK1과 PYK2 과발현 벡터 제작에 사용된 프라이머
프라이머 5'-> 3' 서열
F-PYK2-SpeI
(서열번호 19)		 AAAACTAGTATGCCAGAGTCCAGATTGCAGAGA
R-PYK2-XhoI
(서열번호 20)		 AAAACTCGAGCTAGAATTCTTGACCAACAGTAGAAAT
F-PYK2-ADH1t-infusion
(서열번호 21)		 TGTTGGTCAAGAATTCTAGGCGAATTTCTTATGATTTATGAT
R-TEF2p-PCK1-infusion
(서열번호 22)		 TTCATTTTAGAAGGGGACATGTTTAGTTAATTATAGTTCGTTGAC
F-PCK1-TEF2-infusion
(서열번호 23)		 AACGAACTATAATTAACTAAACATGTCCCCTTCTAAAATGAATGCT
R-PCK1-infusion
(서열번호 24)		 ATAACTAATTACATGACTCGAGTTACTCGAATTGAGGACCAGCGGC
(3) PDC 가 불활성화된 젖산 균주에 외래 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2 강화된 균주 제작
상기 실시예 2에서 제조한 CC02-0553 균주를 기반으로, 실시예 4-(1)에서 제작된 외래 ACL 도입, 및 실시예 4-(2)에서 제작된 PCK1/PYK2 동시 과발현 벡터를 형질전환을 통하여 삽입하였다.
형질 전환은 YPD (1 % yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 배지에서 18시간 키운 CC02-0553 균주를 0.1M Lithum Acetate, 0.01M Tris-HCl, 0.001M EDTA가 첨가된 용액 (이하 LiAc/TE 버퍼)을 처리한 후, 40% PEG가 첨가된 LiAc/TE 버퍼와 함께 42℃에서 15분간 열처리하여 재조합 벡터가 삽입될 수 있도록 하는 방법을 사용하였다. 이를 통해 제작된 균주를 각각 CC02-0652, CC02-0765로 명명하였고, 이의 유전 형질을 정리하면 하기의 표 6과 같다.
PDC 역가 불활성화 균주 기반의 ACL도입 및 PCK1 및 PYK2 강화된 균주
균주명 유전형질
CC02-0652 CC02-0553 pRS415-GPDpro-ACL
CC02-0765 CC02-0553 pRS415-GPDpro-ACL, pRS416-TEF1p-PYK2-TEF2p-PCK1
실시예 5: PDC 불활성화 균주 기반의 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2 강화된 균주의 발효 평가
상기 실시예 4-(3)에서 제조한 PDC 역가 불활성화 균주에서의 ACL-PCK1-PYK2 강화 균주 평가를, 상기 실시예 3에서 사용한 방법과 동일하게 적용하여, 젖산 발효능을 평가하였다. 상기 실험의 결과를 정리하면 하기 표 7과 같다.
PDC 역가 불활성화 균주 기반의 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2 강화된 균주 평가
균주 OD(600nm) 소모당(g/L) 젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/L/h)
CC02-0553 2.6 34.5 20.8 60.2 0.43
CC02-0652 5.0 56.0 31.6 62.5 0.66
CC02-0765 6.1 69.1 45.6 66.0 0.95
그 결과, 상기 표 7에서 확인할 수 있듯이, PDC불활성화 균주에 외래 ACL을 도입하고 PCK1 및 PYK2를 강화한 결과, PDC 불활성화 균주 대비 균체 생장인 OD600 값이 130% 증가하고, 동시간 소모한 포도당의 양은 100% 증가하였으며, 젖산의 발효 수율도 10% 향상되었다. 또한, 젖산의 생산성은 최종적으로 120% 향상하였다. CC02-0652 균주의 젖산 발효 결과를 통해, 외래의 ACL 도입시 새로운 경로의 아세틸-CoA 생산으로 인한 효모 미생물의 생장 강화 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 생장 강화뿐 아니라 생산성도 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
아울러, CC02-0765 균주의 젖산 발효 결과를 통해, 피루베이트 생합성 강화를 통해 추가적으로 젖산 발효의 생산성을 높일 수 있음을 확인하여, 본 발명의 새로운 경로의 아세틸-CoA 생산 및 피루베이트 생합성 강화 전략을 통한 젖산 생산 방법은 기존 기술과 달리, 젖산 발효 수율 증가, 생산 미생물의 생장 강화뿐 아니라 젖산 발효 생산성까지 증가시키는 방법임을 확인하였다.
이에, CC02-0765 균주를 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관인 한국미생물보존센터 (KCCM)에 2014년 11월 28일자에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11616P를 부여받았다.
실시예 6: PDC 불활성화 균주 기반의 ACL 도입, 및 MDH2 ( Malate dehydrogenase2) 및 cytosolic MAE1 ( Malic emzyme 1)이 강화된 균주의 제작
상기 실시예 5의 결과를 통해, 외래 ACL 도입을 통한 새로운 경로의 아세틸-CoA 생산 및 피루베이트 생합성 강화 전략이 효과적인 젖산 발효 수율 증가, 생산 미생물의 생장 강화 및 젖산 발효 생산성 증가 방법임을 확인하여, 다른 유전자들을 이용한 피루베이트 생합성 강화 시에도 이와 같은 결과가 있는지 확인하고자 하였다.
(1) MDH2 및 cytosolic MAE1 강화된 벡터 제작
외래 ACL 도입에 의해 생성된 OAA는 또 다른 경로를 이용하여 피루베이트로 생합성 될 수 있는데, 본래 세포 기질 (cytosol)에 위치하는 MDH2를 과발현하고, 미토콘드리아 내에 위치하는 효소인 MAE1을 cytosol로 위치를 변경하여 과발현하고자 하였다. 이를 위해 재조합 벡터를 제작하였다.
MDH2는 효모 미생물 내 존재하는 유전자로 서열번호 35의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. 서열번호 25 및 26의 프라이머를 이용하여 S. cerevisiae genomic DNA를 주형으로 하는 PCR을 수행하여 MDH2 유전자 절편을 수득하였다. PCR은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 1분의 조건으로 수행하였다. 수득한 MDH2 유전자 절편을 SpeI, XhoI 제한효소를 이용하여 pRS414 벡터를 기반으로 클로닝하고, 이때 TEF1 프로모터를 이용하여 과발현 되도록 하였다. 이를 통해 제작된 재조합 벡터는 pRS414-TEF1pro-MDH2로 명명하였다.
MAE1은 효모 미생물 내에서 본래 미토콘드리아에 위치하는 효소로 서열번호 37의 아미노산 서열로 표시될 수 있다. MAE1을 cytosol에서 발현하기 위하여, 상기 유전자의 시작 코돈으로부터 90개 염기서열로 구성된 mitochondrial target sequence (아미노산 서열은 서열번호 51임)를 제외하고 클로닝하였다. 서열번호 27 및 28의 프라이머를 이용하여 S. cerevisiae genomic DNA를 주형으로 PCR을 수행하였으며 그 조건은 95°C에서 열변성 과정 5분, 53°C에서 결합과정 1분, 72°C에서 중합과정 2분과 같다. 얻어진 PCR 절편을 SpeI, XmaI 제한효소를 이용하여 pRS416 벡터를 기반으로 클로닝 하였다. 서열번호 27의 프라이머의 제작방법은 MAE1 ORF 시작코돈부터 90개의 염기서열을 제거하기 위해 91번째 염기서열부터 수득될 수 있도록 하였다. 또한 상기 cytosolic MAE1이 TEF1 프로모터를 이용하여 과발현 되도록 하였다. 이를 통해 제작된 재조합 벡터는 pRS416-TEF1pro-cytosolic MAE1로 명명하였다. pRS414-TEF1pro-MDH2 및 pRS416-TEF1pro-cytosolic MAE1재조합 벡터 제작에 사용된 프라이머를 정리하면 하기 표 8과 같다.
MDH2와 cytosolic MAE1을 과발현하기 위한 프라이머
프라이머 5'-> 3' 서열
F-MDH2-SpeI
(서열번호 25)		 CTAGAACTAGTATGCCTCACTCAGTTACACCATCCATA
R-MDH2-XhoI
(서열번호26)		 GGGGGCCCGGGTTAAGATGATGCAGATCTCGATGCAAC
F-cytMAE1-SpeI
(서열번호 27)		 TTTCTAGAACTAGTATGTGGCCTATTCAGCAATCGCGTT
R-cytMAE1-XmaI
(서열번호 28)		 AGAGACCCGGGCTACAATTGGTTGGTGTGCACCGAT
(2) PDC 가 불활성화된 젖산 균주에 MDH2 및 cytosolic MAE1 강화된 균주 제작
상기 실시예 2에서 제조한 CC02-0553 균주를 기반으로, 실시예 4-(1)에서 제작된 외래 ACL 도입 벡터 및 실시예 6-(1)에서 제작된 MDH2 과발현 벡터와 cytosolic MAE1 과발현 벡터를 형질전환을 통하여 삽입하였다. 형질전환은 상기 실시예 4-(3)에서 설명된 방법을 사용하였다. 상기 제조된 균주를 CC02-0821로 명명하였고, 이의 유전 형질을 정리하면 하기의 표 9와 같다.
PDC 불활성화 균주 ACL도입 및 MDH2 및 cytosolic MAE1 강화균주
균주명 유전형질
CC02-0821 CC02-0553 pRS415-GPDpro-ACL, pRS414-TEF1pro-MDH2, pRS416-TEF1pro-cytosolic MAE1
실시예 7. PDC 불활성화 균주 기반의 ACL 도입, 및 MDH2 및 cytosolic MAE1 이 강화된 균주의 발효 평가
상기 실시예 6에서 제조된 PDC 불활성화 균주에서의 ACL-MDH2-cytosolic MAE1 강화를 통한 젖산 생산성 강화주 평가를 상기 실시예 2에서 사용한 방법으로 젖산 발효능을 평가하였다. 상기 실험의 결과를 정리하면 표 10과 같다.
PDC 불활성화 균주 기반의 ACL-MDH2-cytosolic MAE1 강화균주 발효 평가
균주 OD(600nm) 소모당(g/L) 젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/L/h)
CC02-0553 2.6 34.5 20.8 60.2 0.43
CC02-0652 5.0 56.0 31.6 62.5 0.66
CC02-0821 5.4 62.1 39.7 64.0 0.82
그 결과, 상기 표 10에서 나타낸 바와 같이, MDH2 및 cytosolic MAE1의 과발현을 통하여 피루베이트의 생합성을 강화한 CC02-0821 균주의 발효평가 결과 역시, CC02-0765와 마찬가지로 PDC 활성이 제거된 균주 대비 균체 생장인 OD600 값이 110% 증가하고, 동시간 소모한 포도당의 양은 80% 증가하였으며, 젖산의 발효 수율도 6% 향상되었다. 또한, 젖산의 생산성은 최종적으로 90% 향상된 효과를 나타내었다. 본 결과를 통하여 효모 미생물에서 젖산 생산성의 향상을 위해 외래 ACL의 도입뿐 아니라 다양한 경로를 통하여 피루베이트 생합성 경로를 강화하는 것이 추가적인 젖산 생산성 향상에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 8: PDC 활성이 감소된 균주에서의 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2 강화 균주 및 MDH2 및 cytosolic MAE1 이 강화된 균주의 제작
상기 실시예들의 결과를 종합하여 PDC의 역가가 제거된 균주에서 외래 ACL 도입 및 피루베이트 생합성 경로의 강화를 통해 효모 미생물에서 젖산 발효 생산성을 높일 수 있음을 확인하였다. 이에 PDC 역가가 제거된 균주 뿐 아니라 PDC의 역가가 감소된 균주에서도 동일한 결과를 얻을 수 있는지에 대한 검증을 진행하였다.
상기 실시예 2에서 제조된 PDC 활성 감소 균주인 CC02-0256을 기반으로 상기 실시예 4에서 제작한 재조합 벡터인 pRS415-GPDpro-ACL, pRS416-TEF1pro-PYK2-TEF2p-PCK1를 실시예 4-(3)과 동일한 방법으로 삽입하였고, 제작된 균주를 각각 CC02-0819, CC02-0820로 명명하였다. 아울러, 상기 실시예 2에 제조된 PDC 활성 감소 균주인 CC02-0256을 기반으로 상기 실시예 4에서 제작한 재조합 벡터인 pRS415-GPDpro-ACL과 상기 실시예 6-(1)에서 제작한 재조합 벡터인 pRS414-TEF1pro-MDH2, pRS416-TEF1pro-cytosolic MAE1를 상기 실시예 4-(3)과 같은 방법으로 삽입하였다. 제작된 균주를 CC02-0831로 명명하였다. 이의 형질은 하기 표 11에 정리하였다.
PDC 활성이 감소된 CC02-0256 균주 기반의 ACL 도입, 및 피루베이트 생합성 경로 강화 균주
균주명 유전형질
CC02-0819 CC02-0256 pRS415-GPDpro-ACL
CC02-0820 CC02-0256 pRS415-GPDpro-ACL, pRS416-TEF1p-PYK2-TEF2p-PCK1
CC02-0831 CC02-0256 pRS415-GPDpro-ACL, pRS414-TEF1pro-MDH2, pRS416-TEF1pro-cytosolic MAE1
실시예 9: PDC 활성이 감소된 균주에서의 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2 강화 균주 발효 평가
상기 실시예 8에서 제조한 CC02-0819, CC02-0820 균주를 대조군인 CC02-0256과 함께 상기 실시예 3에서 사용한 방법으로 젖산 발효능을 평가하였다. 상기 실험의 결과를 정리하면 표 12와 같다.
PDC 역가가 감소된 균주 기반의 ACL 도입 및 PCK1 및 PYK2 강화 균주 발효 평가
균주 OD(600nm) 소모당(g/L) 젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/L/h)
CC02-0256 3.6 49.5 29.1 58.7 0.61
CC02-0819 5.9 60.1 35.7 59.4 0.74
CC02-0820 6.6 69.8 41.9 60.1 0.87
그 결과, 상기 표 12에 나타낸 바와 같이, CC02-0256은 외래 ACL 도입 및 피루베이트 생합성 경로의 강화 효과가 CC02-0553에서처럼 큰 폭으로 생산성이 증가하지는 않았으나, 역시 젖산 발효 수율 향상, 생산 미생물의 균체 생장 증가 및 젖산 발효 생산성이 증가하였다.
외래 ACL 도입, 및 PCK1 및 PYK2가 강화된 CC02-0820의 경우, PDC 역가가 감소된 균주 대비 균체 생장인 OD600 값이 80% 증가하고, 동시간 소모한 포도당의 양은 40% 증가하였으며, 젖산의 발효 수율도 2% 향상되었다. 또한, 젖산의 생산성은 최종적으로 40% 향상된 효과를 나타내었다. 상기 CC02-0820은 외래 ACL만이 도입된 균주 CC02-0819에 대비하여서도 OD, 동시간 소모한 포도당, 젖산 발효 수율 모두 향상되었으며, 생산성은 20% 증가하였다.
실시예 10: PDC 활성이 감소된 균주에서의 ACL 도입, 및 MDH2 및 cytosolic MAE1이 강화된 균주의 발효 평가 비교
상기 실시예 8에서 제조한 CC02-0831 균주는 대조군인 CC02-0256, CC02-0819과 함께 상기 실시예 3에서 사용한 방법으로 젖산 발효능을 평가하였다. 상기 실험의 결과를 정리하면 표 13과 같다.
PDC 역가가 감소된 균주 기반의 ACL 도입, 및 MDH2 및 cytosolic MAE1 강화균주 발효 평가
균주 OD(600nm) 소모당(g/L) 젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/L/h)
CC02-0256 3.6 49.5 29.1 58.7 0.61
CC02-0819 5.9 60.1 35.7 59.4 0.74
CC02-0831 6.3 66.2 39.8 60.1 0.82
그 결과, 상기 표 13에 나타낸 바와 같이, 외래 ACL 도입, 및 MDH2, cytosolic MAE1이 강화된 CC02-0831의 경우, 모균주인 CC02-0256 대비 OD600 값이 80% 증가하고, 동시간 소모한 포도당의 양은 30% 증가하였으며, 젖산의 발효 수율도 2% 향상되었다. 또한, 젖산의 생산성은 최종적으로 30% 향상된 효과를 나타내었다. 상기 CC02-0831은 외래 ACL만이 도입된 균주 CC02-0819에 대비하여서도 OD, 동시간 소모한 포도당, 젖산 발효수율 모두 향상되었으며, 생산성은 20% 증가 하였다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 새로운 경로의 아세틸-CoA 생산 및 피루베이트 생합성 강화 전략을 통한 젖산 생산 방법은 기존 기술과 달리, 젖산 발효 수율 증가, 생산 미생물의 생장 강화뿐 아니라 젖산 발효 생산성까지 증가시키는 방법임을 뒷받침하는 것이다. 특히, PDC 활성이 감소 또는 불활성화된 상태에서 외래 ACL 도입에 의한 새로운 경로의 아세틸-CoA 생산 및 피루베이트 생합성 강화 전략을 통하여 제조된 미생물이, 젖산 발효 수율 증가, 생산 미생물의 생장 강화뿐 아니라 젖산 발효 생산성까지 증가시켜, 우수한 젖산 생산 미생물로 제공될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11616P 20141128
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism producing lactic acid and method for producing lactic acid using the same <130> KPA141342-KR <160> 52 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1 upstream forward primer <400> 1 cgggatccac tgtagcccta gacttgatag cc 32 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1 upstream reverse primer <400> 2 ataagaatgc ggccgctgta tatgagatag ttgattgtat gctt 44 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1 downstream forward primer <400> 3 gactagtgcg aatttcttat gatttatgat ttttatt 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADH1 downstream reverse primer <400> 4 acatgccatg gaagcatgca cgtatacact tgagtaa 37 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDC1 upstream forward primer <400> 5 cgggatccat tatgtatgct cttctgactt ttcgt 35 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDC1 upstream reverse primer <400> 6 ataagaatgc ggccgctttg attgatttga ctgtgttatt ttgc 44 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDC1 downstream forward primer <400> 7 cgggatccgc gatttaatct ctaattatta gttaaag 37 <210> 8 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDC1 downstream reverse primer <400> 8 ataagaatgc ggccgctttc aatcattgga gcaatcattt taca 44 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLD1-HIS3 upstream linking primer <400> 9 gcgtagttgg ccccaactgg tgcagtaata cgttttaaga gcttggtgag 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLD1-HIS3 downstream linking primer <400> 10 cgtgaagggt gaaaaaggaa aatcagatac ctacataaga acacctttgg 50 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-ALPDC5-BamHI primer <400> 11 gagctcggat ccaaggaaat aaagcaaata acaataacac c 41 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-ALPDC5-NotI primer <400> 12 accatggcgg ccgctttgtt cttcttgtta ttgtattgtg ttg 43 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-BRPDC5-SpeI primer <400> 13 ggatccacta gtgctaatta acataaaact catgattcaa cg 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-BRPDC5-NcoI primer <400> 14 cagctgccat ggtattctaa ataagatgta aggccttgta at 42 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-ALPDC6-BamHI primer <400> 15 gagctcggat ccattaaaat catggaaatt aagtattaca g 41 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-ALPDC6-NcoI primer <400> 16 cagctgccat ggtttgttgg caatatgttt ttgctatatt a 41 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-BRPDC6-BamHI primer <400> 17 gagctcggat ccgccattag tagtgtactc aaacgaatta 40 <210> 18 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-BRPDC6-NcoI primer <400> 18 cagctgccat ggacctcaaa acattctttt caatcttaac c 41 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-PYK2-SpeI primer <400> 19 aaaactagta tgccagagtc cagattgcag aga 33 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-PYK2-XhoI primer <400> 20 aaaactcgag ctagaattct tgaccaacag tagaaat 37 <210> 21 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-PYK2-ADH1t-infusion primer <400> 21 tgttggtcaa gaattctagg cgaatttctt atgatttatg at 42 <210> 22 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-TEF2p-PCK1-infusion primer <400> 22 ttcattttag aaggggacat gtttagttaa ttatagttcg ttgac 45 <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-PCK1-TEF2-infusion primer <400> 23 aacgaactat aattaactaa acatgtcccc ttctaaaatg aatgct 46 <210> 24 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-PCK1-infusion primer <400> 24 ataactaatt acatgactcg agttactcga attgaggacc agcggc 46 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-MDH2-SpeI primer <400> 25 ctagaactag tatgcctcac tcagttacac catccata 38 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-MDH2-XhoI primer <400> 26 gggggcccgg gttaagatga tgcagatctc gatgcaac 38 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F-cytMAE1-SpeI primer <400> 27 tttctagaac tagtatgtgg cctattcagc aatcgcgtt 39 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R-cytMAE1-XmaI primer <400> 28 agagacccgg gctacaattg gttggtgtgc accgat 36 <210> 29 <211> 1091 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Ser Ala Lys Ala Ile Ser Glu Gln Thr Gly Lys Glu Leu Leu Tyr 1 5 10 15 Lys Tyr Ile Cys Thr Thr Ser Ala Ile Gln Asn Arg Phe Lys Tyr Ala 20 25 30 Arg Val Thr Pro Asp Thr Asp Trp Ala His Leu Leu Gln Asp His Pro 35 40 45 Trp Leu Leu Ser Gln Ser Leu Val Val Lys Pro Asp Gln Leu Ile Lys 50 55 60 Arg Arg Gly Lys Leu Gly Leu Val Gly Val Asn Leu Ser Leu Asp Gly 65 70 75 80 Val Lys Ser Trp Leu Lys Pro Arg Leu Gly His Glu Ala Thr Val Gly 85 90 95 Lys Ala Lys Gly Phe Leu Lys Asn Phe Leu Ile Glu Pro Phe Val Pro 100 105 110 His Ser Gln Ala Glu Glu Phe Tyr Val Cys Ile Tyr Ala Thr Arg Glu 115 120 125 Gly Asp Tyr Val Leu Phe His His Glu Gly Gly Val Asp Val Gly Asp 130 135 140 Val Asp Ala Lys Ala Gln Lys Leu Leu Val Gly Val Asp Glu Lys Leu 145 150 155 160 Asn Thr Glu Asp Ile Lys Arg His Leu Leu Val His Ala Pro Glu Asp 165 170 175 Lys Lys Glu Val Leu Ala Ser Phe Ile Ser Gly Leu Phe Asn Phe Tyr 180 185 190 Glu Asp Leu Tyr Phe Thr Tyr Leu Glu Ile Asn Pro Leu Val Val Thr 195 200 205 Lys Asp Gly Val Tyr Ile Leu Asp Leu Ala Ala Lys Val Asp Ala Thr 210 215 220 Ala Asp Tyr Ile Cys Lys Val Lys Trp Gly Asp Ile Glu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Pro Phe Gly Arg Glu Ala Tyr Pro Glu Glu Ala Tyr Ile Ala Asp Leu 245 250 255 Asp Ala Lys Ser Gly Ala Ser Leu Lys Leu Thr Leu Leu Asn Pro Lys 260 265 270 Gly Arg Ile Trp Thr Met Val Ala Gly Gly Gly Ala Ser Val Val Tyr 275 280 285 Ser Asp Thr Ile Cys Asp Leu Gly Gly Val Asn Glu Leu Ala Asn Tyr 290 295 300 Gly Glu Tyr Ser Gly Ala Pro Ser Glu Gln Gln Thr Tyr Asp Tyr Ala 305 310 315 320 Lys Thr Ile Leu Ser Leu Met Thr Arg Glu Lys His Pro Glu Gly Lys 325 330 335 Ile Leu Ile Ile Gly Gly Ser Ile Ala Asn Phe Thr Asn Val Ala Ala 340 345 350 Thr Phe Lys Gly Ile Val Arg Ala Ile Arg Asp Tyr Gln Gly Pro Leu 355 360 365 Lys Glu His Glu Val Thr Ile Phe Val Arg Arg Gly Gly Pro Asn Tyr 370 375 380 Gln Glu Gly Leu Arg Val Met Gly Glu Val Gly Lys Thr Thr Gly Ile 385 390 395 400 Pro Ile His Val Phe Gly Thr Glu Thr His Met Thr Ala Ile Val Gly 405 410 415 Met Ala Leu Gly His Arg Pro Ile Pro Asn Gln Pro Pro Thr Ala Ala 420 425 430 His Thr Ala Asn Phe Leu Leu Asn Ala Ser Gly Ser Thr Ser Thr Pro 435 440 445 Ala Pro Ser Arg Thr Ala Ser Phe Ser Glu Ser Arg Ala Asp Glu Val 450 455 460 Ala Pro Ala Lys Lys Ala Lys Pro Ala Met Pro Gln Gly Lys Ser Ala 465 470 475 480 Thr Leu Phe Ser Arg His Thr Lys Ala Ile Val Trp Gly Met Gln Thr 485 490 495 Arg Ala Val Gln Gly Met Leu Asp Phe Asp Tyr Val Cys Ser Arg Asp 500 505 510 Glu Pro Ser Val Ala Ala Met Val Tyr Pro Phe Thr Gly Asp His Lys 515 520 525 Gln Lys Phe Tyr Trp Gly His Lys Glu Ile Leu Ile Pro Val Phe Lys 530 535 540 Asn Met Ala Asp Ala Met 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attcaatgac acacaatccg agaccgacaa gggctgaagt atcggatgtg 960 ggtaacgctg tgttggatgg tgctgattgt gttatgcttt ctggagaaac ggcgaagggt 1020 gattatccgg tgaatgcagt taatattatg gcggcgaccg ctctgattgc tgaaagtact 1080 atcgctcatt tggctcttta tgacgatctc agagacgcca ctcccaaacc tacttccact 1140 acggaaactg tagcagctgc agctaccgca gcaatcttgg agcaagatgg taaggccatc 1200 gttgtattat ctactacagg gaacacggca aggctactgt cgaagtatag accaagctgc 1260 cctatcatat tagtaacaag acacgcaaga acggcaagaa ttgcgcattt gtatagaggt 1320 gttttcccat ttctgtatga accgaaacgc ctagacgact ggggtgagga tgttcatagg 1380 cgcctaaagt ttggtgttga aatggcgagg tctttcggaa tggtggacaa cggtgatact 1440 gttgtttcca ttcaaggatt caaaggagga gtcggccatt ccaatacctt acgcatttct 1500 actgttggtc aagaattcta g 1521 <210> 35 <211> 377 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 35 Met Pro His Ser Val Thr Pro Ser Ile Glu Gln Asp Ser Leu Lys Ile 1 5 10 15 Ala Ile Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Ser Leu Ser Leu Leu 20 25 30 Leu Lys Ala Gln Leu Gln Tyr Gln Leu Lys Glu Ser Asn Arg Ser Val 35 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gcatcgagat ctgcatcatc ttaa 1134 <210> 37 <211> 669 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 37 Met Leu Arg Thr Arg Leu Ser Val Ser Val Ala Ala Arg Ser Gln Leu 1 5 10 15 Thr Arg Ser Leu Thr Ala Ser Arg Thr Ala Pro Leu Arg Arg Trp Pro 20 25 30 Ile Gln Gln Ser Arg Leu Tyr Ser Ser Asn Thr Arg Ser His Lys Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Arg Glu Asn Thr Phe Gln Lys Pro Tyr Ser Asp Glu Glu 50 55 60 Val Thr Lys Thr Pro Val Gly Ser Arg Ala Arg Lys Ile Phe Glu Ala 65 70 75 80 Pro His Pro His Ala Thr Arg Leu Thr Val Glu Gly Ala Ile Glu Cys 85 90 95 Pro Leu Glu Ser Phe Gln Leu Leu Asn Ser Pro Leu Phe Asn Lys Gly 100 105 110 Ser Ala Phe Thr Gln Glu Glu Arg Glu Ala Phe Asn Leu Glu Ala Leu 115 120 125 Leu Pro Pro Gln Val Asn Thr Leu Asp Glu Gln Leu Glu Arg Ser Tyr 130 135 140 Lys Gln Leu Cys Tyr Leu Lys Thr Pro Leu Ala Lys Asn Asp Phe Met 145 150 155 160 Thr Ser Leu Arg Val Gln Asn Lys Val Leu Tyr Phe Ala Leu Ile Arg 165 170 175 Arg His Ile Lys Glu Leu Val Pro Ile Ile Tyr Thr Pro Thr Glu Gly 180 185 190 Asp Ala 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tattttgcat taataaggag acatatcaag 540 gaattagttc ctatcattta caccccaacc gaaggtgatg ctattgctgc ctattcccac 600 aggttcagaa agccagaagg tgtgttttta gacattaccg aacctgattc catcgaatgt 660 agattggcta catacggtgg agacaaagat gtagactaca tcgttgtgtc ggattcggaa 720 ggtattctgg gaattggtga ccaaggtatc ggtggtgtac gtattgctat ctccaaattg 780 gcattgatga cgctgtgcgg tggtattcat cccggccgtg tgctacctgt gtgtttggac 840 gtcggtacta acaacaagaa actagcccgt gacgaattgt acatgggtaa caagttctcc 900 agaatcaggg gtaagcaata tgacgacttc ttggaaaaat tcatcaaggc cgttaagaaa 960 gtgtatccaa gcgccgttct gcatttcgaa gatttcggtg ttaagaacgc tagaagatta 1020 ctagaaaagt acaggtacga attgccatca ttcaacgatg acattcaggg caccggtgcc 1080 gtcgtgatgg cctcgttgat tgctgctttg aaacatacca acagagactt gaaagacacc 1140 agagtgctta tttacggtgc cgggtctgcg ggcctcggta tcgcagatca aattgtgaat 1200 catatggtca cgcacggcgt tgacaaggaa gaagcgcgca agaaaatctt cttgatggac 1260 agacgtgggt taattctaca atcttacgag gctaactcca ctcccgccca acacgtatac 1320 gctaagagtg atgcggaatg ggctggtatc aacacccgct ctttacatga tgtggtggag 1380 aacgtcaaac caacgtgttt ggttggctgc tccacacaag caggcgcatt cactcaagat 1440 gtcgtagaag aaatgcacaa gcacaatcct agaccgatca ttttcccatt atccaaccct 1500 actagactac acgaagccgt tcctgccgat ttaatgaagt ggaccaacaa caacgctctt 1560 gtagctaccg gatctccttt cccacctgtt gatggttacc gtatctcgga gaacaacaat 1620 tgttactctt tcccaggtat cggtttaggt gccgtactat cgcgtgccac caccatcaca 1680 gacaagatga tctccgctgc agtggaccaa ctagccgaat tgtcgccact aagagagggc 1740 gactcgagac ctgggttgct acccggcctg gacaccatca ccaacacttc tgcgcgtcta 1800 gctaccgctg tgatcttgca agcactcgag gagggaaccg cccgtatcga gcaagaacaa 1860 gtaccgggag gagctcccgg cgaaactgtc aaggttcctc gtgactttga cgaatgttta 1920 cagtgggtca aagcccaaat gtgggagcct gtgtacagac ctatgatcaa ggtccaacat 1980 gacccatcgg tgcacaccaa ccaattgtag 2010 <210> 39 <211> 563 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 39 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile 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aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta tgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga aatcatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 41 <211> 563 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 41 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Ser Gln 1 5 10 15 Val Asn Cys Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Leu Tyr Glu Val Lys Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met 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acgctccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccaccta cactacccaa 480 agaccagtct acttgggttt gccagctaac ttggttgact tgaacgtccc agccaagtta 540 ttggaaactc caattgactt gtctttgaag ccaaacgacg ctgaagctga agctgaagtt 600 gttagaactg ttgttgaatt gatcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgtgcttcta gacatgatgt caaggctgaa actaagaagt tgatggactt gactcaattc 720 ccagtttacg tcaccccaat gggtaagggt gctattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg ttggtacctt gtctagacca gaagttaaga aggctgtaga atctgctgat 840 ttgatattgt ctatcggtgc tttgttgtct gatttcaata ccggttcttt ctcttactcc 900 tacaagacca aaaatatcgt tgaattccac tctgaccaca tcaagatcag aaacgccacc 960 ttcccaggtg ttcaaatgaa atttgccttg caaaaattgt tggatgctat tccagaagtc 1020 gtcaaggact acaaacctgt tgctgtccca gctagagttc caattaccaa gtctactcca 1080 gctaacactc caatgaagca agaatggatg tggaaccatt tgggtaactt cttgagagaa 1140 ggtgatattg ttattgctga aaccggtact tccgccttcg gtattaacca aactactttc 1200 ccaacagatg tatacgctat cgtccaagtc ttgtggggtt ccattggttt cacagtcggc 1260 gctctattgg gtgctactat ggccgctgaa gaacttgatc caaagaagag agttatttta 1320 ttcattggtg acggttctct acaattgact gttcaagaaa tctctaccat gattagatgg 1380 ggtttgaagc catacatttt tgtcttgaat aacaacggtt acaccattga aaaattgatt 1440 cacggtcctc atgccgaata taatgaaatt caaggttggg accacttggc cttattgcca 1500 acttttggtg ctagaaacta cgaaacccac agagttgcta ccactggtga atgggaaaag 1560 ttgactcaag acaaggactt ccaagacaac tctaagatta gaatgattga agttatgttg 1620 ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680 gctaaacaat aa 1692 <210> 43 <211> 563 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 43 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Ile Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Asp Gly Leu Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Leu Ser Val Leu Val Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ala Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ser Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ser Glu Ile Asp Arg Leu Ile Arg Thr Thr Phe Ile Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Ser Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Lys Val 165 170 175 Pro Gly Ser Leu Leu Glu Lys Pro Ile Asp Leu Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Pro Glu Ala Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Val Leu Glu Leu Ile 195 200 205 Gln Asn Ser Lys Asn Pro Val Ile Leu Ser Asp Ala Cys Ala Ser Arg 210 215 220 His Asn Val Lys Lys Glu Thr Gln Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Leu Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Gln Asp Val 260 265 270 Lys Gln Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Val 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Thr Gly Glu Trp Asp Ala Leu Thr Thr Asp Ser Glu Phe Gln 515 520 525 Lys Asn Ser Val Ile Arg Leu Ile Glu Leu Lys Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Glu Ser Leu Ile Lys Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 44 <211> 1692 <212> DNA <213> S. cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1692) <223> PDC6 (SGD YGR087C) <400> 44 atgtctgaaa ttactcttgg aaaatactta tttgaaagat tgaagcaagt taatgttaac 60 accatttttg ggctaccagg cgacttcaac ttgtccctat tggacaagat ttacgaggta 120 gatggattga gatgggctgg taatgcaaat gagctgaacg ccgcctatgc cgccgatggt 180 tacgcacgca tcaagggttt atctgtgctg gtaactactt ttggcgtagg tgaattatcc 240 gccttgaatg gtattgcagg atcgtatgca gaacacgtcg gtgtactgca tgttgttggt 300 gtcccctcta tctccgctca ggctaagcaa ttgttgttgc atcatacctt gggtaacggt 360 gattttaccg tttttcacag aatgtccgcc aatatctcag aaactacatc aatgattaca 420 gacattgcta cagccccttc agaaatcgat aggttgatca ggacaacatt tataacacaa 480 aggcctagct acttggggtt gccagcgaat ttggtagatc taaaggttcc tggttctctt 540 ttggaaaaac cgattgatct atcattaaaa cctaacgatc ccgaagctga aaaggaagtt 600 attgataccg tactagaatt gatccagaat tcgaaaaacc ctgttatact atcggatgcc 660 tgtgcttcta ggcacaacgt taaaaaagaa acccagaagt taattgattt gacgcaattc 720 ccagcttttg tgacacctct aggtaaaggg tcaatagatg aacagcatcc cagatatggc 780 ggtgtttatg tgggaacgct gtccaaacaa gacgtgaaac aggccgttga gtcggctgat 840 ttgatccttt cggtcggtgc tttgctctct gattttaaca caggttcgtt ttcctactcc 900 tacaagacta aaaatgtagt ggagtttcat tccgattacg taaaggtgaa gaacgctacg 960 ttcctcggtg tacaaatgaa atttgcacta caaaacttac tgaaggttat tcccgatgtt 1020 gttaagggct acaagagcgt tcccgtacca accaaaactc ccgcaaacaa aggtgtacct 1080 gctagcacgc ccttgaaaca agagtggttg tggaacgaat tgtccaaatt cttgcaagaa 1140 ggtgatgtta tcatttccga gaccggcacg tctgccttcg gtatcaatca aactatcttt 1200 cctaaggacg cctacggtat ctcgcaggtg ttgtgggggt ccatcggttt tacaacagga 1260 gcaactttag gtgctgcctt tgccgctgag gagattgacc ccaacaagag agtcatctta 1320 ttcataggtg acgggtcttt gcagttaacc gtccaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 gggttaaagc cgtatctttt tgtccttaac aacgacggct acactatcga aaagctgatt 1440 catgggcctc acgcagagta caacgaaatc cagacctggg atcacctcgc cctgttgccc 1500 gcatttggtg cgaaaaagta cgaaaatcac aagatcgcca ctacgggtga gtgggatgcc 1560 ttaaccactg attcagagtt ccagaaaaac tcggtgatca gactaattga actgaaactg 1620 cccgtctttg atgctccgga aagtttgatc aaacaagcgc aattgactgc cgctacaaat 1680 gccaaacaat aa 1692 <210> 45 <211> 348 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 45 Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His 1 5 10 15 Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val 65 70 75 80 Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys 100 105 110 Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln 115 120 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335 Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 46 <211> 1047 <212> DNA <213> S. cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1047) <223> ADH1 (SGD YOL086C) <400> 46 atgtctatcc cagaaactca aaaaggtgtt atcttctacg aatcccacgg taagttggaa 60 tacaaagata ttccagttcc aaagccaaag gccaacgaat tgttgatcaa cgttaaatac 120 tctggtgtct gtcacactga cttgcacgct tggcacggtg actggccatt gccagttaag 180 ctaccattag tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgttg tcggcatggg tgaaaacgtt 240 aagggctgga agatcggtga ctacgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatggcc 300 tgtgaatact gtgaattggg taacgaatcc aactgtcctc acgctgactt gtctggttac 360 acccacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgttcaagc cgctcacatt 420 cctcaaggta ccgacttggc ccaagtcgcc cccatcttgt gtgctggtat caccgtctac 480 aaggctttga agtctgctaa cttgatggcc ggtcactggg ttgctatctc cggtgctgct 540 ggtggtctag gttctttggc tgttcaatac gccaaggcta tgggttacag agtcttgggt 600 attgacggtg gtgaaggtaa ggaagaatta ttcagatcca tcggtggtga agtcttcatt 660 gacttcacta aggaaaagga cattgtcggt gctgttctaa aggccactga cggtggtgct 720 cacggtgtca tcaacgtttc cgtttccgaa gccgctattg aagcttctac cagatacgtt 780 agagctaacg gtaccaccgt tttggtcggt atgccagctg gtgccaagtg ttgttctgat 840 gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctct attgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900 gacaccagag aagctttgga cttcttcgcc agaggtttgg tcaagtctcc aatcaaggtt 960 gtcggcttgt ctaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aaaagggtca aatcgttggt 1020 agatacgttg ttgacacttc taaataa 1047 <210> 47 <211> 587 <212> PRT <213> S. cerevisiae <400> 47 Met Leu Trp Lys Arg Thr Cys Thr Arg Leu Ile Lys Pro Ile Ala Gln 1 5 10 15 Pro Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg Ser Cys Tyr Arg Tyr Ala Ser Thr 20 25 30 Gly Thr Gly Ser Thr Asp Ser Ser Ser Gln Trp Leu Lys Tyr Ser Val 35 40 45 Ile Ala Ser Ser Ala Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Phe Ala Lys Asn Leu 50 55 60 Tyr Ser Arg Glu Thr Lys Glu Asp Leu Ile Glu Lys Leu Glu Met Val 65 70 75 80 Lys Lys Ile Asp Pro Val Asn Ser Thr Leu Lys Leu Ser Ser Leu Asp 85 90 95 Ser Pro Asp Tyr Leu His Asp Pro Val Lys Ile Asp Lys Val Val Glu 100 105 110 Asp Leu Lys Gln Val Leu Gly Asn Lys Pro Glu Asn Tyr Ser Asp Ala 115 120 125 Lys Ser Asp Leu Asp Ala His Ser Asp Thr Tyr Phe Asn Thr His His 130 135 140 Pro Ser Pro Glu Gln Arg Pro Arg Ile Ile Leu Phe Pro His Thr Thr 145 150 155 160 Glu Glu Val Ser Lys Ile Leu Lys Ile Cys His Asp Asn Asn Met Pro 165 170 175 Val Val Pro Phe Ser Gly Gly Thr Ser Leu Glu Gly His Phe Leu Pro 180 185 190 Thr Arg Ile Gly Asp Thr Ile Thr Val Asp Leu Ser Lys Phe Met Asn 195 200 205 Asn Val Val Lys Phe Asp Lys Leu Asp Leu Asp Ile Thr Val Gln Ala 210 215 220 Gly Leu Pro Trp Glu Asp Leu Asn Asp Tyr Leu Ser Asp His Gly Leu 225 230 235 240 Met Phe Gly Cys Asp Pro Gly Pro Gly Ala Gln Ile Gly Gly Cys Ile 245 250 255 Ala Asn Ser Cys Ser Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Tyr Gly Thr Met Lys 260 265 270 Glu Asn Ile Ile Asn Met Thr Ile Val Leu Pro Asp Gly Thr Ile Val 275 280 285 Lys Thr Lys Lys Arg Pro Arg Lys Ser Ser Ala Gly Tyr Asn Leu Asn 290 295 300 Gly Leu Phe Val Gly Ser Glu Gly Thr Leu Gly Ile Val Thr Glu Ala 305 310 315 320 Thr Val Lys Cys His Val Lys Pro Lys Ala Glu Thr Val Ala Val Val 325 330 335 Ser Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ala Ala Ala Cys Ala Ser Asn Leu Thr 340 345 350 Gln Ser Gly Ile His Leu Asn Ala Met Glu Leu Leu Asp Glu Asn Met 355 360 365 Met Lys Leu Ile Asn Ala Ser Glu Ser Thr Asp Arg Cys Asp Trp Val 370 375 380 Glu Lys Pro Thr Met Phe Phe Lys Ile Gly Gly Arg Ser Pro Asn Ile 385 390 395 400 Val Asn Ala Leu Val Asp Glu Val Lys Ala Val Ala Gln Leu Asn His 405 410 415 Cys Asn Ser Phe Gln Phe Ala Lys Asp Asp Asp Glu Lys Leu Glu Leu 420 425 430 Trp Glu Ala Arg Lys Val Ala Leu Trp Ser Val Leu Asp Ala Asp Lys 435 440 445 Ser Lys Asp Lys Ser Ala Lys Ile Trp Thr Thr Asp Val Ala Val Pro 450 455 460 Val Ser Gln Phe Asp Lys Val Ile His Glu Thr Lys Lys Asp Met Gln 465 470 475 480 Ala Ser Lys Leu Ile Asn Ala Ile Val Gly His Ala Gly Asp Gly Asn 485 490 495 Phe His Ala Phe Ile Val Tyr Arg Thr Pro Glu Glu His Glu Thr Cys 500 505 510 Ser Gln Leu Val Asp Arg Met Val Lys Arg Ala Leu Asn Ala Glu Gly 515 520 525 Thr Cys Thr Gly Glu His Gly Val Gly Ile Gly Lys Arg Glu Tyr Leu 530 535 540 Leu Glu Glu Leu Gly Glu Ala Pro Val Asp Leu Met Arg Lys Ile Lys 545 550 555 560 Leu Ala Ile Asp Pro Lys Arg Ile Met Asn Pro Asp Lys Ile Phe Lys 565 570 575 Thr Asp Pro Asn Glu Pro Ala Asn Asp Tyr Arg 580 585 <210> 48 <211> 1764 <212> DNA <213> S. cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(1764) <223> DLD1 (SGD) <400> 48 atgttgtgga agcgtacttg cacaaggcta ataaagccta ttgcacaacc tagaggaagg 60 ctggtgagaa gatcatgcta cagatacgcc tcaacaggca caggcagcac cgacagcagc 120 agccagtggt taaaatactc tgtcatcgcc tcttcagcta ctctattcgg ttatttgttc 180 gctaagaacc tctattctag ggagactaag gaagatttga tagagaagct ggaaatggtc 240 aaaaagatcg acccagtaaa ttctacgtta aagctgtcct cattggactc accagactat 300 ttgcacgacc cggttaagat cgataaggtt gttgaggacc tgaagcaggt gctgggaaac 360 aagcctgaaa actactctga tgcgaaatcc gatttggacg cccattcaga tacctacttc 420 aacacgcatc acccctctcc cgagcaaaga cctaggatta tattattccc tcatactacc 480 gaagaagttt ccaaaatttt gaaaatatgt cacgataaca acatgccagt tgtacccttc 540 tcgggcggaa cgtccttgga ggggcacttc ctgcctacaa gaattggaga taccataacc 600 gtagacctgt ccaagtttat gaataacgtc gtaaaatttg acaagctgga cctggacatc 660 accgtgcagg ccggtctacc ctgggaggat ttgaatgact atttgagcga ccacggtttg 720 atgtttggct gtgaccctgg tccaggtgca cagattggtg gttgcattgc taattcttgt 780 tcaggaacca acgcctaccg ttacggtacc atgaaggaga atattataaa catgactata 840 gtgttgccgg acgggaccat tgtcaagacg aagaaaagac ccagaaagtc gagcgctggc 900 tataacttaa atggtttatt tgtgggaagt gaaggtacct taggtattgt tactgaagct 960 actgtcaagt gtcatgtcaa gcccaaagct gaaactgttg cggtggtatc ctttgatact 1020 atcaaggatg cggccgcatg tgcttctaat ctgactcaga gtggtattca tttgaacgcc 1080 atggagttac tggatgaaaa tatgatgaag ttgatcaacg catctgaatc cacggacaga 1140 tgtgattggg tagagaaacc aactatgttt ttcaagattg gtgggagatc tcccaacatt 1200 gtcaatgctc ttgtggatga agttaaggct gtcgcccagt taaatcactg caacagtttt 1260 cagtttgcta aagatgatga cgaaaaattg gaattatggg aagctagaaa ggtcgcgcta 1320 tggtctgtgc tagacgctga taagagcaaa gacaaatcag ctaaaatttg gacaactgat 1380 gtagctgttc ctgtgtcgca gttcgacaag gttattcacg aaactaaaaa ggacatgcaa 1440 gctagtaagc tgatcaacgc cattgttggt catgcaggtg atggtaactt ccatgcattc 1500 atcgtctaca gaacccctga agaacacgaa acctgtagcc aacttgttga cagaatggtc 1560 aagagagcac tgaacgcaga aggcacttgc acgggtgaac acggtgttgg tattggtaaa 1620 agagagtact tgctcgaaga attaggtgaa gcacccgtcg atttgatgag aaagattaag 1680 ctagctattg acccaaagag aatcatgaac ccggacaaaa tctttaaaac tgatccaaac 1740 gagcccgcta atgattacag gtga 1764 <210> 49 <211> 332 <212> PRT <213> L. plantarum <400> 49 Met Lys Ile Ile Ala Tyr Ala Val Arg Asp Asp Glu Arg Pro Phe Phe 1 5 10 15 Asp Thr Trp Met Lys Glu Asn Pro Asp Val Glu Val Lys Leu Val Pro 20 25 30 Glu Leu Leu Thr Glu Asp Asn Val Asp Leu Ala Lys Gly Phe Asp Gly 35 40 45 Ala Asp Val Tyr Gln Gln Lys Asp Tyr Thr Ala Glu Val Leu Asn Lys 50 55 60 Leu Ala Asp Glu Gly Val Lys Asn Ile Ser Leu Arg Asn Val Gly Val 65 70 75 80 Asp Asn Leu Asp Val Pro Thr Val Lys Ala Arg Gly Leu Asn Ile Ser 85 90 95 Asn Val Pro Ala Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr 100 105 110 Gln Leu Met Gln Leu Leu Arg Gln Thr Pro Leu Phe Asn Lys Lys Leu 115 120 125 Ala Lys Gln Asp Phe Arg Trp Ala Pro Asp Ile Ala Lys Glu Leu Asn 130 135 140 Thr Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala 145 150 155 160 Ile Asp Ile Phe Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Gly Tyr Asp Val 165 170 175 Tyr Arg Asn Ala Glu Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu 180 185 190 Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala 195 200 205 Leu Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asn Ala Asp Ala Phe Ser Lys Met 210 215 220 Lys Asp Gly Ala Tyr Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Ile Asp 225 230 235 240 Ser Glu Asp Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala 245 250 255 Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Thr Lys Ile Phe Asn Lys Asp Leu 260 265 270 Glu Gly Gln Thr Ile Asp Asp Lys Val Phe Met Asn Leu Phe Asn Arg 275 280 285 Asp Asn Val Leu Ile Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Glu Thr Ala 290 295 300 Val His Asn Met Val His Val Ser Met Asn Ser Asn Lys Gln Phe Ile 305 310 315 320 Glu Thr Gly Lys Ala Asp Thr Gln Val Lys Phe Asp 325 330 <210> 50 <211> 999 <212> DNA <213> L. plantarum <220> <221> gene <222> (1)..(999) <223> ldhD (Accession no. NC_004567) <400> 50 atgaaaatta ttgcatatgc tgtacgtgat gacgaacgtc cattcttcga tacttggatg 60 aaagaaaacc cagatgttga agttaaatta gttccagaat tacttactga agacaacgtt 120 gacttagcta aaggcttcga cggtgccgat gtataccaac aaaaggacta tactgctgaa 180 gtattgaaca agttagccga cgaaggggtt aagaacatct ctcttcgtaa cgttggtgtt 240 gataacttgg acgttcctac tgttaaagca cgtggcttaa acatttctaa cgtacctgca 300 tactcaccaa atgcgattgc tgaattatca gtaacgcaat tgatgcaatt attacgtcaa 360 accccattgt tcaataagaa gttagctaag caagacttcc gttgggcacc agatattgcc 420 aaggaattaa acaccatgac tgttggtgtt atcggtactg gtcggattgg ccgtgctgcc 480 atcgatattt tcaaaggctt cggcgctaag gttatcggtt acgatgttta ccggaatgct 540 gaacttgaaa aggaaggcat gtacgttgac accttggacg aattatacgc ccaagctgat 600 gttatcacgt tacacgttcc tgcattgaag gataactacc acatgttgaa tgcggatgcc 660 ttcagcaaga tgaaagatgg cgcctacatc ttgaactttg ctcgtgggac actcatcgat 720 tcagaagact tgatcaaagc cttagacagt ggcaaagttg ccggtgccgc tcttgatacg 780 tatgaatacg aaactaagat cttcaacaaa gaccttgaag gtcaaacgat tgatgacaag 840 gtcttcatga acttgttcaa ccgcgacaat gttttgatta caccacatac ggctttctac 900 actgaaactg ccgttcacaa catggtgcac gtttcaatga acagtaacaa acaattcatc 960 gaaactggta aagctgatac gcaagttaag tttgactaa 999 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mitochondria target sequence of MAE1 <400> 51 Met Leu Arg Thr Arg Leu Ser Val Ser Val Ala Ala Arg Ser Gln Leu 1 5 10 15 Thr Arg Ser Leu Thr Ala Ser Arg Thr Ala Pro Leu Arg Arg 20 25 30 <210> 52 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified MAE1 <400> 52 Trp Pro Ile Gln Gln Ser Arg Leu Tyr Ser Ser Asn Thr Arg Ser His 1 5 10 15 Lys Ala Thr Thr Thr Arg Glu Asn Thr Phe Gln Lys Pro Tyr Ser Asp 20 25 30 Glu Glu Val Thr Lys Thr Pro Val Gly Ser Arg Ala Arg Lys Ile Phe 35 40 45 Glu Ala Pro His Pro His Ala Thr Arg Leu Thr Val Glu Gly Ala Ile 50 55 60 Glu Cys Pro Leu Glu Ser Phe Gln Leu Leu Asn Ser Pro Leu Phe Asn 65 70 75 80 Lys Gly Ser Ala Phe Thr Gln Glu Glu Arg Glu Ala Phe Asn Leu Glu 85 90 95 Ala Leu Leu Pro Pro Gln Val Asn Thr Leu Asp Glu Gln Leu Glu Arg 100 105 110 Ser Tyr Lys Gln Leu Cys Tyr Leu Lys Thr Pro Leu Ala Lys Asn Asp 115 120 125 Phe Met Thr Ser Leu Arg Val Gln Asn Lys Val Leu Tyr Phe Ala Leu 130 135 140 Ile Arg Arg His Ile Lys Glu Leu Val Pro Ile Ile Tyr Thr Pro Thr 145 150 155 160 Glu Gly Asp Ala Ile Ala Ala Tyr Ser His Arg Phe Arg Lys Pro Glu 165 170 175 Gly Val Phe Leu Asp Ile Thr Glu Pro Asp Ser Ile Glu Cys Arg Leu 180 185 190 Ala Thr Tyr Gly Gly Asp Lys Asp Val Asp Tyr Ile Val Val Ser Asp 195 200 205 Ser Glu Gly Ile Leu Gly Ile Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Val Arg 210 215 220 Ile Ala Ile Ser Lys Leu Ala Leu Met Thr Leu Cys Gly Gly Ile His 225 230 235 240 Pro Gly Arg Val Leu Pro Val Cys Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Lys 245 250 255 Lys Leu Ala Arg Asp Glu Leu Tyr Met Gly Asn Lys Phe Ser Arg Ile 260 265 270 Arg Gly Lys Gln Tyr Asp Asp Phe Leu Glu Lys Phe Ile Lys Ala Val 275 280 285 Lys Lys Val Tyr Pro Ser Ala Val Leu His Phe Glu Asp Phe Gly Val 290 295 300 Lys Asn Ala Arg Arg Leu Leu Glu Lys Tyr Arg Tyr Glu Leu Pro Ser 305 310 315 320 Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Gly Ala Val Val Met Ala Ser Leu 325 330 335 Ile Ala Ala Leu Lys His Thr Asn Arg Asp Leu Lys Asp Thr Arg Val 340 345 350 Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Ser Ala Gly Leu Gly Ile Ala Asp Gln Ile 355 360 365 Val Asn His Met Val Thr His Gly Val Asp Lys Glu Glu Ala Arg Lys 370 375 380 Lys Ile Phe Leu Met Asp Arg Arg Gly Leu Ile Leu Gln Ser Tyr Glu 385 390 395 400 Ala Asn Ser Thr Pro Ala Gln His Val Tyr Ala Lys Ser Asp Ala Glu 405 410 415 Trp Ala Gly Ile Asn Thr Arg Ser Leu His Asp Val Val Glu Asn Val 420 425 430 Lys Pro Thr Cys Leu Val Gly Cys Ser Thr Gln Ala Gly Ala Phe Thr 435 440 445 Gln Asp Val Val Glu Glu Met His Lys His Asn Pro Arg Pro Ile Ile 450 455 460 Phe Pro Leu Ser Asn Pro Thr Arg Leu His Glu Ala Val Pro Ala Asp 465 470 475 480 Leu Met Lys Trp Thr Asn Asn Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro 485 490 495 Phe Pro Pro Val Asp Gly Tyr Arg Ile Ser Glu Asn Asn Asn Cys Tyr 500 505 510 Ser Phe Pro Gly Ile Gly Leu Gly Ala Val Leu Ser Arg Ala Thr Thr 515 520 525 Ile Thr Asp Lys Met Ile Ser Ala Ala Val Asp Gln Leu Ala Glu Leu 530 535 540 Ser Pro Leu Arg Glu Gly Asp Ser Arg Pro Gly Leu Leu Pro Gly Leu 545 550 555 560 Asp Thr Ile Thr Asn Thr Ser Ala Arg Leu Ala Thr Ala Val Ile Leu 565 570 575 Gln Ala Leu Glu Glu Gly Thr Ala Arg Ile Glu Gln Glu Gln Val Pro 580 585 590 Gly Gly Ala Pro Gly Glu Thr Val Lys Val Pro Arg Asp Phe Asp Glu 595 600 605 Cys Leu Gln Trp Val Lys Ala Gln Met Trp Glu Pro Val Tyr Arg Pro 610 615 620 Met Ile Lys Val Gln His Asp Pro Ser Val His Thr Asn Gln Leu 625 630 635

Claims (12)

  1. 피루베이트 디카르복실라아제 (Pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되고, ATP-시트르산 분해효소 (ATP-citrate lyase, ACL) 활성이 도입되고, 옥살로아세테이트로부터 피루베이트로의 생합성 경로가 내재적 생합성 경로에 비하여 강화되도록 변이된, 젖산 생산능을 갖는 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 옥살로아세테이트로부터 피루베이트로의 생합성 경로의 강화는 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 1 (Phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, PCK1) 또는 피루베이트 키나아제 2 (Pyruvate kinase 2, PYK2), 또는 모두의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되도록 변이시킨, 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 옥살로아세테이트로부터 피루베이트로의 생합성 경로의 강화는 말레이트 디히드로게네이즈 2 (Malate dehydrogenase 2, MDH2) 또는 세포 기질 말릭 효소 1 (cytosolic Malic enzyme 1, cytosolic MAE1), 또는 모두의 활성이 내재적 활성에 비하여 강화되도록 변이시킨, 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 디카르복실라아제는 서열번호 39, 41, 및 43의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산 서열로 기재되는 효소인, 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 ATP-시트르산 분해효소는 서열번호 29의 아미노산 서열로 기재되는 효소인, 미생물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제 1은 서열번호 31의 아미노산의 서열로 기재되는 효소이며, 피루베이트 키나아제 2는 서열번호 33의 서열로 기재되는 효소인, 미생물.
  7. 제3항에 있어서, 상기 말레이트 디히드로게네이즈 2는 서열번호 35의 아미노산 서열로 기재되는 효소이며, 세포 기질 말릭 효소 1은 서열번호 37의 아미노산 서열 또는 서열번호 52의 아미노산 서열로 기재되는 효소인, 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로 락테이트 디히드로게네이즈 (Lactate dehydrogenase, LDH) 활성이 도입된, 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 락테이트 디히드로게네이즈는 서열번호 49의 아미노산 서열로 기재되는 효소인, 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가적으로
    (i) 알코올 디히드로게네이즈 1 (Alcohol dehydrogenase 1, ADH1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이됨;
    (ii) 피루베이트 디카르복실라아제 1 (Pyruvate decarboxylase 1, PDC1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이됨; 및
    (iii) D-락테이트 디히드로게네이즈 1 (D-lactate dehydrogenase 1, DLD1)의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된 것인, 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 사카로마이세스 속 미생물은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiase)인 미생물.
  12. (i) 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 사카로마이세스 속 (Saccharomyces) 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    (ii) 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함하는, 젖산 제조 방법.
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