TW201712116A

TW201712116A - 用於製造乳酸之微生物及使用該微生物製造乳酸的方法

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Publication number: TW201712116A
Application number: TW105118322A
Authority: TW
Inventors: 金善慧; 李泰熙; 梁榮烈; 梁殷彬; 羅景洙; 河哲雄
Original assignee: Ｃｊ第一製糖股份有限公司
Priority date: 2015-06-12
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2017-04-01
Also published as: RU2017145858A; JP2020043867A; US20180320206A1; US10227618B2; CN108138193A; RU2017145858A3; AU2016277014A1; KR20160147193A; EP3309254A1; BR112017026596A2; JP2018518175A; JP6892395B2; AU2016277014B2; WO2016200207A1; EP3309254A4; RU2711983C2; MY193411A; PL3309254T3; EP3309254B1; TWI608097B

Abstract

本申請係關於一種製造乳酸之酵母菌屬的微生物以及使用該微生物製造乳酸之方法。更具體而言，本申請係關於一種製造乳酸之酵母菌屬的微生物，其中該微生物係經修飾，使其去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶(PDC)活性、使其引入ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)活性且增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑，以及使用該微生物製造乳酸之方法。

Description

用於製造乳酸之微生物及使用該微生物製造乳酸的方法

本申請係關於一種製造乳酸之酵母菌屬的微生物以及使用該微生物製造乳酸之方法。

乳酸有廣範圍應用於工業，包括食品、醫藥、化妝品等等。最近，由於乳酸作為聚乳酸的單體的用途，需求已顯著地增加。製備乳酸的方法包含傳統化學合成方法以及生物醱酵方法，該生物醱酵方法係有碳水化合物作為受質，且近期後者較受喜愛。

一般而言，以酵母菌為基礎的乳酸製造的微生物中，乳酸脫氫酶(LDH)及丙酮酸脫羧酶(PDC)競爭以利用丙酮酸作為受質。就這點而言，有必要最小化PDC功能，以藉由LDH提高乳酸製造，用以最大化丙酮酸製造產率。釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae中，PDC存在有三種不同形式的同功異構酶，即，PDC1、PDC5及PDC6。因此，為了最大化乳酸製造，可使用製備同時將三個 PDC1、PDC5及PDC6基因刪除的菌株之方法。然而，雖然去活化PDC活性可能增加乳酸的產量，但也有其降低製造性且該菌株並無法穩定生長的缺點(歐洲專利第EP2041264號)，因此造成其難以製造所欲量的乳酸。此外，酵母菌，諸如酵母菌(Saccharomyces)屬，不類似於如細菌之原核生物，並無法藉由各種的細胞胞器以及各種的器官系統之簡單基因操作而確切地預測是否可製造所欲量的乳酸。

本申請的發明人努力發展一種當維持乳酸製造微生物的穩定生長，同時增加乳酸的製造產率及製造量之方法，且結果證實增強乙醯輔酶A之供給途徑以及自草醯乙酸(OAA)成為丙酮酸之供給途徑改善了乳酸製造的量，從而完成本申請。

本申請之目的係在於提供製造乳酸之Saccharomyces屬的微生物。

本申請之另一個目的係使用該微生物製造乳酸之方法。

本申請之經修飾的乳酸製造菌株，其中PDC活性經去活化，外來ADL活性經引入以及丙酮酸之生合成途徑經增強，藉由最小化製造醇的醱酵與乳酸降解途徑的阻斷，相較於傳統的菌株，其具有優異的乳酸醱酵產率以及生產率。因此，該乳酸製造菌株的生長經增加，且本申請之經修飾的乳酸製造菌株可被廣泛地用於改善使用乳酸作為原料所製備的各種產品之生產率。由此製造的乳酸可作為各種類之產品的原料。

第1圖為用於經由存在於酵母菌微生物中之PEP羧化激酶(PCK 1,EC 4.1.1.49)及丙酮酸激酶(PYK 2,EC 2.7.1.40)的過度表現以增強丙酮酸的生合成的途徑圖，且顯示圖解方式說明藉由引入外來ACL以及增強本發明之PCK及PYK途徑以改善乳酸生產率。

第2圖為用於經由存在於酵母菌微生物中之蘋果酸脫氫酶(MDH2,EC 1.1.1.37)及細胞溶質蘋果酸酵素1(MAE1,EC 1.1.1.38)的過度表現以增強丙酮酸的生合成的途徑圖，且顯示圖解方式說明藉由引入外來ACL以及經由本發明之MDH及細胞溶質MAE途徑以改善乳酸生產率。

為達到上述之目的，在一態樣中，本申請提供一種製造乳酸之Saccharomyces屬的微生物，其中該微生物係經修飾為去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶(PDC)之活性、為引入ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)之活性以及增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑。

製造乳酸之Saccharomyces屬的微生物可為微生物，其中相較於未經修飾的菌株(其中未引入ACL活性及/或未增強相對於內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑)，乳酸醱酵產率係增加的及/或Saccharomyces屬之微生物菌體的生長係增加的(具有生產率的微生物的生長增加)及/或乳酸的生產率係增加的。

如本文中所使用，術語「乳酸」(LA)意謂由C₂H₄OHCOOH所表示的有機酸。當該乳酸係經由化學合成製造時，乳酸係以外消旋混合物的形式製造，其中D-型乳酸及L-型乳酸以50/50比例混合，且不可能調控該組合比例。因此，當製備聚乳酸時，乳酸成為具有低熔點的非晶型聚合物，也因此其在發展使用方面有許多限制。相反地，當乳酸係藉由使用微生物的生物醱酵方法製造時，可依據所使用的菌株或將被引入至該菌株內的乳酸脫氫酶(LDH)而可選擇性地製造D-型乳酸及L-型乳酸。

如本文中所使用，本申請中術語「製造乳酸之微生物」意謂製造乳酸生產率之微生物菌株，其可將糖轉換成乳酸，以及例如可包含任何酵母菌微生物而無任何限制，只要其包含本申請的乳酸合成途徑以及乙醯輔酶A合成途徑。

依據它們的型態，酵母菌微生物可分類為Saccharomyces屬、Pichia屬、Candida屬，以及Saccharomycopsis屬，且具體地，包含各種的Saccharomyces屬的微生物，只要該各品種的微生物能夠生產乳酸，皆可為本申請所使用。具體地，Saccharomyces sp.微生物可選自由貝納酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉迪酵母(Saccharomyces boulardii)、博伊丁酵母(Saccharomyces bulderi)、卡里歐卡納酵母(Saccharomyces cariocanus)、卡里歐卡酵母(Saccharomyces cariocus)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、達連酵母(Saccharomyces dairenensis)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、尤貝納酵母(Saccharomyces eubayanus)、少孢酵母(Saccharomyces exiguus)、弗羅凌酵母(Saccharomyces florentinus)、克魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、瑪丁尼酵母(Saccharomyces martiniae)、摩納酵母(Saccharomyces monacensis)、Saccharomyces norbensis、奇異酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、斯班斯羅姆酵母(Saccharomyces spencerorum)、圖列茲酵母(Saccharomyces turicensis)、單孢酵母(Saccharomyces unisporus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)以及容納圖酵母(Saccharomyces zonatus)所組成之群組，且更具體地，Saccharomyces sp.微生物可選自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本申請之製造乳酸之Saccharomyces屬的微生物可為微生物，其中該微生物係經修飾以去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶(PDC)之活性、引入ATP-檸檬酸裂解酶之活性以及增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑。

具體地，製造乳酸之Saccharomyces sp.微生物可為微生物，其中該微生物係經以下方式修飾(i)去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶(PDC)之活性，(ii)引入ATP-檸檬酸裂解酶之活性，以及(iii)增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑，且可進一步經由以下方式修飾(iv)引入乳酸脫氫酶(LDH)之活性，(v)減弱或去活化相較於其內生性活性之乙醇脫氫酶1之活性，(vi)減弱或去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶1之活性，及/或(vii)減弱或去活化其內生性活性之D-乳酸脫氫酶1之活性。

此外，本申請之微生物可進一步經以下方式修飾(i)去活化相較於其內生性活性之乙醇脫氫酶1(ADH1)之活性；(ii)相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶1(PDC1)之活性；以及(iii)去活化相較於其內生性活性之D-乳酸脫氫酶1(DLD1)之活性。

如本文中所使用，術語「丙酮酸脫羧酶(PDC)」，其與催化丙酮酸之脫羧反應的酵素可互換使用，意謂將丙酮酸轉換成乙醛以及二氧化碳(CO₂)之酵素。丙酮酸脫羧酶係在厭氧條件下發生於酵母菌之參與醱酵作用之酵素，尤其在Saccharomyces sp.，且其為經由醱酵作用製造酒精的酵素。一般而言，在Saccharomyces sp.的PDC存在有三種不同形式的同功異構酶，即，PDC1、PDC5及PDC6。PDC的蛋白質及基因序列可從已知的資料庫諸如但不限於NCBI的GenBank取得。具體地，就酵素而言，PDC1可為由SEQ ID NO：39之胺基酸序列所表示之蛋白質、PDC5可為由SEQ ID NO：41之胺基酸序列所表示之蛋白質，以及PDC6可為由SEQ ID NO：43之胺基酸序列所表示之蛋白質，但是可無受限制地包含具有PDC活性之任何胺基酸序列。此外，編碼PDC1、PDC5及PDC6之基因可具體地分別由諸如SEQ ID NO：40、42及44之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含可編碼該酵素之任何核苷酸序列。

如本文中所使用，術語「ATP-檸檬酸裂解酶(ACL,EC 2.3.3.8)」意謂將檸檬酸轉換成草醯乙酸(oxaloacetate,OAA)以及乙醯輔酶A之酵素，且已知其存在於高等生物體以及一些酵母菌(ATP-citrate lyase：A mini-review,Biochemical and Biophysical Research Communications,422,(2012),1-2)。

反應式如下所示：檸檬酸+ATP+輔酶A+H₂O→草醯乙酸+乙醯輔酶A+A+Pi

乙醯輔酶A對於微生物生長係必要的酵素，且其重要性最近已被不同的參考文獻強調。作為代表性實例，有報導為研究在真核生物體內可經由非自然途徑來提供細胞溶質乙醯輔酶A而藉以製造1,3丁二醇(1,3-BOD)而改善生產率(國際專利公開案WO 2013/036764)。

就這點而言，可藉由引入外來的ACL以提供其中PDC活性經減弱或移除的菌株生長所必需的乙醯輔酶A，從而可使微生物以非依賴於PDC活性的方式生長。蛋白質序列及基因序列可從已知的資料庫諸如但不限於NCBI的GenBank取得。具體地，ATP-檸檬酸裂解酶可具有SEQ ID NO：29之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何胺基酸序列。此外，編碼ACL之基因可具體地由SEQ ID NO：30之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。

如本文中所使用，術語「丙酮酸生合成途徑」，其意謂在Saccharomyces屬之微生物可提供丙酮酸之生合成途徑，可為從OAA到丙酮酸之供應途徑。具體的實例顯示於第1圖及第2圖。

在例示性實施例中，丙酮酸生合成途徑可藉由修飾磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶1(PCK1)或丙酮酸激酶2(PYK2)或兩者酵素之活性而實施，以增強相較於其等之內生性活性之其等之活性。

或者，丙酮酸生合成途徑可藉由修飾蘋果酸脫氫酶2(MDH2)或細胞溶質的蘋果酸酶1(cytosolic MAE1)或兩者酵素之活性而實施，以增強相較於其等之內生性活性之其等之活性。

如本文中所使用，術語「磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶1(PCK1)」意謂催化OAA轉換成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)之酵素。在酵母菌微生物內，PCK1為酵母菌微生物中葡萄糖生成作用將OAA轉換成PEP之所需酵素，且已知在葡萄糖存在下，其表現受到抑制(Differential post-transcriptional regulation of yeast mRNAs in response to high and low glucose concentratons.Mol Microbiol 35(3)：553-65(2000))。

如本文中所使用，術語「丙酮酸激酶2(PYK2)」意謂藉由從PEP遞送磷酸根至ADP以催化丙酮酸及ATP之製造的酵素。在酵母菌微生物內，PYK2係酵母菌微生物中糖解作用之最後一個步驟的酵素，且亦已知在葡萄糖存在下，其表現受到抑制(Characterization of a glucose-repressed pyruvate kinase(Pyk2p)in Saccharomyces cerevisiae that is catalytically insensitive to fructorse-1,6-bisphosphate,J Bacteriol.1997 May；179(9)：2987-93)。

各蛋白質序列及基因序列可從已知的資料庫諸如但不限於NCBI的GenBank取得。PCK1可具有SEQ ID NO：31之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何蛋白質序列。此外，編碼PCK1之基因可具體地由SEQ ID NO：32之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。PYK2可具有SEQ ID NO：33之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何蛋白質序列。此外，作為具體的實例，編碼PYK2之基因可由SEQ ID NO：34之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。

如本文中所使用，術語「蘋果酸脫氫酶2(MDH2)」意謂將OAA轉換成蘋果酸之可逆性的酵素。MDH2係原本位於細胞溶質之酵素。

如本文中所使用，術語「細胞溶質的蘋果酸酶1(MAE1)」意謂藉由將粒線體標的序列從可令丙酮酸取代蘋果酸之MAE1酵素移除之修飾而位於細胞溶質內之酵素。MAE1酵素為原本位於粒線體之蛋白質，且其在粒線體中將三羧酸(TCA)循環的中間產物蘋果酸轉換成丙酮酸(Metabolic Engineering,6(2004),352-363)。各蛋白質序列及基因序列可從已知的資料庫諸如但不限於NCBI的GenBank取得。MDH2可具有SEQ ID NO：35之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何蛋白質序列。此外，作為具體實例，編碼MDH2之基因可由SEQ ID NO：36之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。MAE1可具有SEQ ID NO：37之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何蛋白質序列。此外，對於存在於細胞溶質的MAE1，該MAE1可具有其中從起始點位置至位置30之胺基酸殘基經刪除之SEQ ID NO：37之胺基酸序列的序列(即，來自SEQ ID NO：51之胺基酸序列之序列(粒線體標的序列)係經刪除)，且該序列係由SEQ ID NO：52所表示。此外，在具體實例中，編碼MAE1之基因可由SEQ ID NO：38之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。

如本文中所使用，術語「乳酸脫氫酶(LDH)」意謂可催化乳酸轉換成丙酮酸以及反向之酵素，且蛋白質序列及基因序列可從已知的資料庫諸如但不限於NCBI的GenBank取得。LDH可具有SEQ ID NO：49之胺基酸序列，但是可無受限制地包含具有該酵素活性之任何蛋白質序列。此外，編碼LDH之基因可由SEQ ID NO：50之核苷酸序列所表示，但是可無受限制地包含編碼該酵素之任何序列。

以上所描述的各酵素可無受限制地包含在內，除了由SEQ ID NOS所表示的胺基酸序列之外，還包含與以上所列之各胺基酸序列具有70%同源性或更高、具體地80%或更高、更具體地90%或更高、甚至更具體地95%或更高、甚至還更具體地98%或更高、甚至還再更具體地99%或更高之任何胺基酸序列，只要酵素呈現與各酵素實際上相同或相當之功效。此外，儘管該酵素可具有部分刪除、修飾、取代或添加之胺基酸序列，任何具有上述之同源性以及具有對各酵素相當之功效的任何經修飾的酵素，很明顯地可屬於本申請之範圍。

此外，編碼各酵素的基因亦可無受限制地包含在內，除了由SEQ ID NOS所表示的核苷酸序列之外，還包含與以上所列之各核苷酸序列具有80%同源性或更高、具體地90%或更高、更具體地95%或更高、甚至更具體地98%或更高、以及甚至還更具體地99%或更高之任何核苷酸序列，只要編碼該酵素之序列具有與各酵素實質上相同或相當之功效。此外，儘管該序列可具有其中部分刪除、修飾、取代或添加，具有上述之同源性之任何核苷酸序列，很明顯地可屬於本申請之範圍。

如本文中所使用，術語「同源性」意謂兩個多核苷酸或多肽部分之間之一致性的百分比。從一部分至另一部分之序列對應性可利用本領域之已知的技術來測定。舉例而言，兩個多核苷酸分子或兩個多肽分子之間的同源性，可藉由利用輕易可得且能夠排比序列資料之電腦軟體(例如，BLAST 2.0)直接地排比序列資料(例如，參數諸如計分、一致性及相似性)而測定。此外，可在同源區域形成穩定雙股的條件下藉由雜合多核苷酸以及藉由單股專一性的核酸酶水解該雜合股以測定水解片段的大小，以測定同源性。

如本文中所使用，術語「內生性活性」意謂微生物具有酵素的自然狀態或在該相對應之酵素修飾之前具有酵素之激活位準之情況。

如本文中所使用，術語「相較於其內生性活性之酵素的活性係經修飾為去活化」意謂相較於天然菌株或修飾前菌株者之編碼酵素之基因完全不表現，或者甚至當該基因表現，但無活性或活性降低。

上述之降低係一概念，其包含相較於微生物原本擁有之內生性活性者，由於編碼酵素之基因之修飾等等，酵素本身之活性降低的情形，相較於野生型菌株或修飾前菌株者之細胞內酵素活性的整體位準較低的情形，以及亦包含其組合。

酵素之去活化可藉由本領域之各種不同的已知方法來完成。方法的實例包含利用降低酵素活性之突變的基因，取代染色體上編碼該酵素之基因的方法，其包含該酵素活性被去除之情形；在染色體之編碼該酵素之基因之表現調控序列中引入修飾之方法；利用具有弱或無活性之序列，取代編碼該酵素之基因的表現調控序列之方法；在染色體全部或部分刪除編碼該酵素之基因之方法；在染色體引入互補結合至基因的轉錄本之反義寡核苷酸(例如，反義RNA)，從而抑制自mRNA轉譯成該酵素之方法；將SD序列之互補序列人工地插入編碼該酵素之基因之SD序列的上游，以形成二級結構，從而使核糖體無法附著於其之方法；將啟動子插入開讀框(open reading frame,ORF)之3’端，以誘導反轉錄工程(reverse transcription engineering,RTE)之方法等等，以及也可以係上述的組合，但不限於此。

具體地，全部或部分刪除編碼該酵素之基因之方法可藉由在菌株內使用插入染色體之載體，並利用多核苷酸或核酸序列中部份刪除之標識基因取代染色體中編碼內生性標的蛋白質之多核苷酸而實施。在刪除部分或全部之基因之方法的例示性實施例中，刪除基因的方法可藉由使用同源重組。

如本文中所使用，術語「部分」可取決於多核苷酸的種類而多樣化，且其可具體地意謂1至300，更具體地1至100，以及甚至更具體地1至50，但特別不限於此。

如本文中所使用，術語「同源重組」意謂在具有相互同源之遺傳鏈位置上，經由互換而發生的基因重組。

具體地，該表現調控序列可藉由在表現調控序列之核酸序列中經由刪除、插入、非保守型或保守型取代、或其組合而引入表現調控序列之修飾；或經由利用較弱的啟動子取代等等而經修飾。該表現調控序列可包含啟動子、操作子序列、編碼核糖體結合區域之序列，以及控制轉錄及轉譯之終止的序列。

再者，染色體上的基因序列可藉由在用以降低酵素活性的基因序列中經由經由刪除、插入、非保守型或保守型取代、或其組合而於該序列中引入修飾；或經由利用已經改良為具有較弱活性之基因序列或已經改良為不具活性之基因序列取代而經修飾。

如本文中所使用，術語「相較於其內生性活性之活性增強」意謂相較於其自然狀態下所擁有之蛋白質活性，藉由修飾蛋白質以改良細胞內的活性而於微生物中增加蛋白質(或酵素)的細胞內活性。由於蛋白質(或酵素)本身的活性增加，因此「增強」可包含起因於蛋白質(或酵素)本身活性的增加而較原本功能引出更高功效，且其可藉由選自下列所成群組的至少一種方法而實施：增加編碼蛋白質(或酵素)之多核苷酸的複本數之方法、於編碼蛋白質(或酵素)之基因之調控序列中引入修飾作用之方法、以具有強活性之序列取代染色體之編碼蛋白質(或酵素)之基因之調控序列之方法、以突變的基因取代編碼蛋白質(或酵素)之基因以增加蛋白質(或酵素)之活性之方法，以及在染色體之編碼蛋白質(或酵素)之基因引入修飾以增強蛋白質(或酵素)之活性之方法，但可無受限制地包含相較於其內生性活性，能夠增強蛋白質(或酵素)之活性或增強經引入的活性的任何已知方法。

如本文中所使用，術語「引入蛋白質(或酵素)之活性」意謂對微生物提供特定蛋白質(或酵素)之活性，該微生物不具該特定蛋白質(或酵素)之活性；或在微生物內增加特定蛋白質(或酵素)之細胞內活性，該微生物不具該特定蛋白質(或酵素)之活性而在對該微生物提供該特定蛋白質(或酵素)之活性後，藉由修飾該微生物以進一步改良該蛋白質(或酵素)之細胞內的活性。

「引入蛋白質(或酵素)之活性」可藉由本領域之各種不同的已知方法實施，例如：將包含編碼蛋白質(或酵素)之核苷酸序列的多核苷酸插入染色體中之方法；藉由諸如經由引入載體系統而將多核苷酸引入微生物之方法而增加多核苷酸之複本數之方法；將能夠呈現改良活性之啟動子或將啟動子具有修飾之蛋白質(或酵素)引入至編碼該蛋白質(或酵素)之核苷酸序列的上游區域之方法；引入編碼蛋白質(或酵素)之核苷酸變異序列之方法等等，但是可無受限制地包含能夠引入蛋白質(或酵素)之活性的任何已知方法。

上述中，多核苷酸之複本數的增加可在多核苷酸被可操作地連接於載體之形式中，或藉由將多核苷酸插入宿主細胞之染色體實施，然而方法並不特別地限定於其等。具體地，多核苷酸之複本數的增加可藉由引入其無關於宿主細胞而能夠複製及作用且本申請之編碼蛋白質之多核苷酸被可操作地連接於其等之載體而實施；或可藉由引入能夠將多核苷酸插入宿主細胞之染色體且該多核苷酸被可操作地連接於其等之載體而實施。

載體為包含編碼標的胜肽之多核苷酸之序列的DNA建構體，該序列係被可操作地連接於適當的調控序列，使在宿主細胞內能夠表現該標的胜肽。調控序列包含能啟始轉錄的啟動子、可調控轉錄之任何操作子序列、編碼適當的mRNA核糖體結合域之序列，以及調控轉錄及轉譯之終止之序列。該載體經轉形至適當的宿主細胞之後，可無關於宿主基因體而複製及作用，或者可併入宿主本身的基因體。

至於酵母菌表現載體，可使用整合型酵母質體(integrative yeast plasmid,YIp)以及染色體外質體。染色體外質體可包含附加型酵母質體(episomal yeast plasmid,YEp)、複製型酵母質體(replicative yeast plasmid,YRp)，以及酵母中節質體(yeast centromere plasmid,YCp)。此外，人工酵母染色體(artificial yeast chromosomes,YACs)也可以依據本申請使用作為表現載體。舉例而言，用於本申請之載體可包含pESC-HIS、pESC-LEU、pESC-TRP、pESC-URA、Gateway pYES-DEST52、pAO815、pGAPZ A、pGAPZ B、pGAPZ C、pGAP α A、pGAP α B、pGAP α C、pPIC3.5K、pPIC6 A、pPIC6 B、pPIC6 C、pPIC6 α A、pPIC6 α B、pPIC6 α C、pPIC9K、pYC2/CT、pYD1 Yeast Display Vector、pYES2、pYES2/CT、pYES2/NT A、pYES2/NT B、pYES2/NT C、pYES2/CT、pYES2.1、pYES-DEST52、pTEF1/Zeo、pFLD1、PichiaPink ^TM 、p427-TEF、p417-CYC、pGAL-MF、p427-TEF、 p417-CYC、PTEF-MF、pBY011、pSGP47、pSGP46、pSGP36、pSGP40、ZM552、pAG303GAL-ccdB、pAG414GAL-ccdB、pAS404、pBridge、pGAD-GH、pGAD T7、pGBK T7、pHIS-2、pOBD2、pRS408、pRS410、pRS418、pRS420、pRS428、yeast micron A form、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pYJ403、pYJ404、pYJ405，以及pYJ406，但不限於其等。

更具體地，酵母菌載體可為包含複製起點(origin,ori)以及抗生素抗性卡匣之酵母複製型質體，其可增殖且在E.coli中進行篩選。一般而言，表現載體可包含啟動子-基因-轉錄終止序列之表現建構體。

舉例而言，當宿主細胞為酵母菌時，可使用於表現建構體之啟動子可包含TEF1啟動子、TEF2啟動子、GAL10啟動子、GAL1啟動子、ADH1啟動子、ADH2啟動子、PHO5啟動子、GAL1-10啟動子、TDH3啟動子(GPD啟動子)、TDH2啟動子、TDH1啟動子、PGK1啟動子、PYK2啟動子、ENO1啟動子、ENO2啟動子，以及TPI1啟動子，但不限於其等。

可使用於表現建構體之轉錄終止序列可包含ADH1終止子、CYC1終止子、GAL10終止子、PGK1終止子、PHO5終止子、ENO1終止子、ENO2終止子，以及TPI1終止子，但不限於其等。

此外，編碼內生性標的蛋白質之多核苷酸可在宿主細胞內藉由用以插入染色體之載體，在染色體內被經修飾的多核苷酸置換。或者，欲引入至染色體之編碼外源標的蛋白質之多核苷酸可被經修飾的多核苷酸置換。將多核苷酸插入染色體可利用本領域之已知的任何方法實施，例如，藉由同源重組。由於本申請之載體可經由同源重組插入染色體中，因此可進一步包含篩選標識以確認載體插入至染色體。該篩選標識係用於經轉形細胞之篩選，即，確認標的多核苷酸是否已經被插入，且可使用能夠提供篩選表型之標識，諸如抗藥性、營養需求、抗細胞抑制劑，以及表面蛋白質之表現。在以篩選試劑處理的情況下，只有能夠表現篩選標識之細胞可以存活或表現其他的表型性狀，而因此可以篩選經轉形的細胞。

如本文中所使用，術語「轉形」意謂引入包含編碼標的蛋白之多核苷酸之載體至宿主細胞內，從而能夠在宿主細胞內表現由該多核苷酸編碼之蛋白質的過程。至於轉形多核苷酸，只要其可在宿主細胞內表現，不管其係插入至宿主細胞之染色體並座落於其內，或者座落於染色體外皆可。此外，多核苷酸包含編碼標的蛋白之DNA及RNA。只要多核苷酸可被引入至宿主細胞內並在其內表現，多核苷酸可利用任何形式插入。舉例而言，多核苷酸可利用表現卡匣之形式引入至宿主細胞內，表現卡匣係一基因建構體，其包含自我表現所需的所有必要元件。表現卡匣傳統地可包含可操作地連接於多核苷酸之啟動子、轉錄終止訊號、核糖體結合區域以及轉譯終止訊號。表現卡匣可為能夠自我複製之表現載體的形式。此外，多核苷酸可直接引入至宿主細胞內且可操作地連接於對其在宿主細胞內表現之必要的序列。

此外，如本文中所使用，術語「可操作地連接」意謂在啟動子與上述標的基因序列之間的功能性連接，該啟動子可啟動並調控本申請之編碼標的蛋白之多核苷酸的轉錄。

轉形本申請之載體之方法可包含其可將核酸引入至細胞之任何方法，且該轉形可藉由依據宿主細胞而選擇本領域已知的合適之技術來實施。舉例而言，該方法可包含電穿孔法、磷酸鈣(CaPO₄)沉澱法、氯化鈣(CaCl₂)沉澱法、顯微注射法、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)方法、DEAE-右旋糖方法、陽離子脂質體鈣及醋酸鋰/DMSO方法等等，但不限於此。

具體地，所使用的宿主細胞應具有高效率的DNA引入以及所引入DNA的高表現效率，依據本申請之目的，宿主細胞可為Saccharomyces屬之微生物。

然後，為了增加多核苷酸之表現而在表現調控序列中之修飾的引入，雖然不特別限定於此等，可藉由經由刪除、插入、保守型取代或非保守型取代、或其組合以引入核酸序列之修飾而實施，以進一步增強表現調控序列之活性；或者藉由以具有增強活性之核酸序列置換多核苷酸序列。該表現調控序列，雖然不特別限定於其等，可包含啟動子、操作子序列、編碼核糖體結合區域之序列以及用以調控轉錄與轉譯之終止的序列等等。

取代原始啟動子，強的外源啟動子可連接於多核苷酸之表現單元的上游區域。

一般而言，相較於野生型蛋白質之活性或濃度，蛋白質活性的引入或增強可增加該對應之蛋白質的活性或濃度或在微生物菌株內從至少10%、25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%或500%，至1000%或2000%之最大量。

在另一態樣中，本申請提供製造乳酸之方法，其包含a)培養製造乳酸之Saccharomyces屬的新穎微生物，其中該微生物係經修飾以於培養基中去活化相較於其內生性活性之丙酮酸脫羧酶(PDC)活性、引入ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)之活性，以及增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑；以及b)從經培養的微生物及培養物回收乳酸。

製造乳酸之Saccharomyces屬的微生物與上述之微生物相同。

如本文中所使用，術語「培養」意謂在合適的人工調節環境下使微生物生長。在本申請中，培養使用的Saccharomyces屬的微生物可藉由本領域熟知的合適方法來實施。具體地，該培養可在連續地批式製程、饋料批式，或重複的饋料批式製程中實施，但不限於此。

本申請用於培養微生物之培養基以及其他培養條件並不特別地限定，用於傳統培養Saccharomyces屬之微生物的任何培養基皆可使用。具體地，本申請之微生物可在含有合適的碳源、氮源、磷來源、無機化合物、胺基酸及/或維生素等等之傳統培養基內，在好氧環境下調節溫度、pH等條件培養。

作為碳源之實例可使用蔗糖或葡萄糖，而包含大量蔗糖的糖蜜也可以作為碳源，且亦可使用其他適量之各種不同的碳源。

氮源之實例可包含有機氮源，諸如蛋白腖、酵母萃取物、濃稠肉汁、麥芽萃取物、玉米浸液，以及大豆粉；而無機氮源諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨，以及硝酸銨。這些氮源可單獨使用或組合使用。在上述培養基中，可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀，以及相對應的含鈉鹽類作為磷來源。此外，可含有金屬鹽，諸如硫酸鎂或硫酸鐵。再者，可含有胺基酸、維生素，以及合適的前驅物。這些培養基或前驅物可在批式培養製程或連續培養製程中添加至培養物。

在培養過程中，可藉由以合適的方式添加諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸，以及硫酸之化合物至培養物，以調節培養物之pH。此外，在培養過程中，可添加諸如脂肪酸聚二醇酯之消泡劑，來避免產生泡沫。此外，為了維持培養物之有氧狀態，可將氧氣或含氧氣體注入培養物中，且為了維持培養物之缺氧以及微需氧狀態，可將氮氣、氫氣，或二氧化碳氣體注入培養物，而不注入空氣。

正常的培養溫度可從20℃至40℃，具體地，從25℃至35℃，且更具體地為30℃，但依據所需之目的而可不受限制的變化溫度。此外，培養物可連續培養至獲得所需的產物為止，且具體地從10小時至100小時，但不限於此。

本申請之製造乳酸之方法可包含從經培養的微生物或培養物回收乳酸。從經培養的微生物或培養物回收乳酸可利用本領域已知且合適的方法來完成，例如，離心、過濾、陰離子交換層析法、結晶、HPLC等等，但不限於此。

該回收可包含純化過程。

【實施例】

於下文中，將伴隨例示性實施例以詳細描述本申請。然而，本文中所揭示之例示性實施例僅出於說明之目的，而不應被視為限制本申請之範圍。

實施例1：乳酸製造菌株之製備

為了製備本申請所使用之代表性的乳酸製造菌株，Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D，其為取自於Euroscarf之野生型酵母菌株中的代表性酵母菌株，接受一系列的遺傳操作。

具體地，使用已刪除D-乳酸脫氫酶1(DLD1)之菌株作為本申請之基礎菌株，並刪除乙醇脫氫酶1(ADH1)及丙酮酸脫羧酶1(PDC1)，以最小化製造醇之醱酵，而阻斷乳酸分解的途徑。

DLD1並非直接影響菌株生長改善之因子，但是作為D-型乳酸之脫氫酶，目前已知DLD1係可使用NAD⁺ 將乳酸轉為丙酮酸之主要酵素。據此，隨後的菌株係基於刪除其為乳酸消耗酵素之DLD1基因之菌株來製備，並比較乳酸之生產率。

在本申請中，基因操作係利用一般的分子選殖方法來實施。首先，依據參考文獻(Lee TH,et al.,J Microbiol.Biotechnol.(2006),16(6),979-982)之內容，利用pWAL100及pWBR100質體來實施刪除酵素之ADH1及PDC1基因的實驗。每一個併入各質體之插入物係使用對應於各插入物之引子(SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：8)藉由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)來製備。

PCR係使用野生型酵母菌株之基因體DNA作為模板而實施。針對刪除ADH1，其係使用SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2引子來實施PCR，且所得物係使用限制酶BamHI及NcoI選殖至pWAL100。其他的PCR係使用SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4引子來實施且所得物係使用限制酶BamHI及NcoI選殖至pWBR100。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。

針對刪除PDC1，其係使用SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6引子來實施PCR，且所得物係使用限制酶BamHI及NcoI選殖至pWAL100。其他的PCR係使用SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8引子來實施且所得物係使用限制酶BamHI及NcoI選殖至pWBR100。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。

此外，針對刪除DLD1基因，HIS3標識基因係藉由經由雙交換而引入並刪除。本文所使用之DNA片段係藉由使用野生型酵母菌株之基因體DNA以及SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10引子實施PCR而獲得。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。

在基因操作中所使用之引子總結於下列表1。

基於具有刪除三個基因(ADH1、PDC1及DLD1)之菌株，引入用於乳酸製造之D-乳酸脫氫酶(D-LDH)。衍生自於胚芽乳酸桿菌(Lb.plantarum)之1dhD基因之5’端及3’端分別插入至p413TEF1載體使1dhD基因可被包含介於TEF1啟動子及衍生自釀酒酵母(S.cerevisiae)之CYC1終止子之間，其中該插入物係藉由SaxI/PvuII雙分解而製備。該載體係在經BamHI/NotI雙分解之p-δ-neo載體之DNA片段內，使用綠豆核酸酶製備為鈍端，且再以SacI處理，從而產生具有SacI黏端及BamHI鈍端之載體部分。

由此獲得的載體及該插入物接合至完整的pTL573載體，並命名為pTL537質體。該pTL537質體包含衍生自Lb.plantarum之1dhD基因並經分解，以使複數的複本可隨機地插入δ-序列，該δ序列係S.cerevisiae CEN. PK2-1D pdc1 adh1 d1d1菌株之反轉錄轉座子之部分區域。針對相對應基因之多個插入，利用SacI分解pTL537質體以製備可於δ-序列內誘發單交換之DNA片段。該所得物藉由轉染技術引入至母株，並在YPD(1%酵母萃取物、2%細菌用-蛋白腖以及2%葡萄糖)培養基內且在5mg/mL G418之最大濃度，獲得眾多菌落。已證實由此獲得的菌株最後經插入複數的Lb.plantarum-衍生之D-LDH，以提供D-型乳酸生產率且該菌株命名為CC02-0064。

實施例2：具減低效價或經去活化的PDC之菌株之製備

具減低效價或經去活化的PDC之菌株係藉由準備於實施例1所製備之基礎菌株，CC02-0064菌株中，具有刪除PDC5，即PDC同功異構酶，以及於CC02-0064菌株中具有刪除PDC5及PDC6之菌株來製備。

具體地，使用為了刪除基因之酵母菌、pWAL100及pWBR100質體(J.Microbiol.Biotechnol.,(2006)16(6),979-982)。

針對刪除PDC5，PCR係使用引子SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12來實施，且所得物使用限制酶BamHI及NotI選殖入pWAL100。額外的PCR係使用引子SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14來實施，且所得物使用限制酶SpeI及NcoI選殖入pWBR100。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。

針對刪除PDC6，PCR係使用引子SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：16來實施，且所得物使用限制酶BamHI及NotI選殖入pWAL100。額外的PCR係使用引子SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18來實施，且所得物使用限制酶SpeI及NcoI選殖入pWBR100。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。

以上製備之新菌株分別命名為CC02-0256及CC02-0553，且該新菌種之基因特質總結於下表3。

實施例3：具減低或經去活化的PDC活性之菌株之乳酸生產率之評估

使用於評估菌株之培養基為合成的複合(synthetic complex,SC)培養基。針對培養基之製備，依據製造商之議定書，將胺基酸缺陷型混合物(Sigma)與作為鹼基之不含胺基酸之0.67%酵母氮基質混合，且依需求加入不含於其中的胺基酸。加入濃度為380mg/L之白胺酸，且分別加入濃度為76mg/L之尿嘧啶、色胺酸及組胺酸，以及將作為碳源之葡萄糖(8%)及作為中和劑之1% CaCO₃加入其中。由此製備之培養基用來作為酵母菌株之乳酸醱酵之評估。

作為評估菌株之乳酸醱酵能力之條件，製備評估乳酸醱酵之培養基可在各燒瓶內分量為25mL且與各個燒瓶接種酵母菌株，於30℃好氧性地培養48小時，且藉由HPLC分析存在於醱酵液內之乳酸量。

實施例之結果總結於下表4。

如同結果所示，可由以上表4證實當PDC活性降低時，產率提升，但生產率下降。

實施例4：基於經PDC去活化之菌株，引入ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)以及製備具增強之磷酸烯醇丙酮 酸羧化激酶1(PCK1)及丙酮酸激酶2(PYK2)活性之菌株

(1)用於引入外來的ACL至乳酸製造菌株之載體之製備

製備用於引入外來的ACL酵素以及同時過度表現PCK1及PYK2(丙酮酸生合成之途徑之一)之重組載體。

使用衍生自哺乳動物小鼠(Mus musculus)之外來的ACL基因，且該對應基因係經由NCBI(登錄號NP_001186225)確認。

具體地，該基因係使用SEQ ID NO：29之胺基酸序列(或SEQ ID NO：30之胺基酸序列)合成，該載體係使用基於酵母菌之基因表現載體pRS415之GPD啟動子製備，且製備插入有該基因之載體，並命名為p415GPDpro-ACL。

(2)具增強PCK1及PYK2以提高丙酮酸生合成途徑之載體之製備

製備用於同時過度表現PCK1及PYK2以提高丙酮酸生合成途徑之重組載體。

PYK2係存在於酵母菌微生物內之基因且可由SEQ ID NO：33表示。PCR係使用S.cerevisiae之基因體DNA作為模板以及引子SEQ ID NO：19及20而實施，且從此獲得PYK2基因之片段。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。選殖係使用該基因片段以及在衍生自pRS416之酵母菌表現載體內的限制酶，即SpeI、XhoI而實施，且過度表現係使用TEF1啟動子來實施。

相對應之重組載體命名為pRS416-TEF1pro-PYK2。

PYK1亦是存在於酵母菌微生物之基因且可由SEQ ID NO：31表示。PCR係使用S.cerevisiae之基因體DNA作為模板以及引子SEQ ID NO：23及24而實施，且從此獲得PYK1基因之片段。PCR係以95℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘30秒而實施。PCR係在相同的條件下，使用S.cerevisiae之基因體DNA作為模板以及引子SEQ ID NO：21及22以獲得PCK1片段，以可使用TEF2啟動子表現PYK1，且獲得TEF2啟動子之片段。之後，針對在單一重組載體內同時表現PCK1及PYK2，使用XhoI分解上述所製備之pRS416-TEF1pro-PYK2重組載體，且同時，使用In-Fusion cloning kit(Clontech)選殖TEF2啟動子之片段及PCK1片段。最後，製備可分別以TEF2啟動子及TEF1啟動子之過度表現PCK1及PYK2之單一重組載體，且該載體命名為pRS416-TEF1pro-PYK2-TEF2pro-PCK1。

使用於製備過度表現PCK1及PYK2之載體之引子總結於下表5。

(3)引入外來的ACL至具經去活化的PDC之乳酸製造菌株，以及製備具PCK1及PYK2增強活性之菌株

引入在實施例4-(1)中，基於實施例2所製備之CC02-0553菌株所製備之外來的ACL，且藉由轉染而插入由實施例4-(2)所製備之同時過度表現PCK1/PYK2之載體。

轉染係使用經培養於YPD(1%酵母萃取物、2%細菌用-蛋白腖以及2%葡萄糖)培養基之CC02-0553以含有0.1M醋酸鋰、0.01M Tris-HCl以及0.001M EDTA之溶液(以下稱為醋酸鋰/TE緩衝液)處理18小時，並與含有40% PEG之醋酸鋰/TE緩衝液於42℃熱處理15分鐘，以插入重組載體之方法來實施。由此製備的菌株分別命名為CC02-0652及CC02-0765，且其基因特質總結於下表6。

實施例5：基於經去活化的PDC之引入ACL，以及評估具PCK1及PYK2增強活性之菌株之醱酵

針對ACL-PCK1-PYK2-增強菌株之評估，乳酸醱酵能力係與實施例3相同之方式評估實施例4-(3)中所製備之具PDC去活化潛勢之菌株。結果總結於下表7。

結果為如上表7可證實，引入外來的ACL且在內增強PCK1及PYK2活性之菌株，顯示OD₆₀₀數值增加，其代表相較於經PDC去活化之菌株，細菌生長增加130%；在同一期間內，葡萄糖消耗量增加了100%；以及乳酸醱酵之產率10%的改善。此外，該菌株最後顯示乳酸生產率120%的改善。依據CC02-0652菌株之醱酵結果，證實由於藉由新的製造途徑而生成乙醯輔酶A，使引入外來的ACL可增加酵母菌微生物之生長。此外，證實引入外來的ACL不僅能夠增加生長，亦能增加生產率。

再者，由CC02-0765菌株之醱酵結果，其證實乳酸醱酵之生產率可進一步藉由增強丙酮酸生合成而增加，因此證實藉由本申請採用新的途徑以生成乙醯輔酶A以及增強丙酮酸生合成之策略以製造乳酸之方法，不僅能增加乳酸醱酵產率以及增加特定微生物之生長，也能增加乳酸醱酵生產率，與現存技術不相類似。

據此，依布達佩斯條約，CC02-0765菌株在2014年11月28日寄存於韓國微生物保存中心(Korea Culture Center of Microorganisms,KCCM)，寄存編號為KCCM1161P。

實施例6：基於經PDC去活化之菌株之引入ACL以及製備具蘋果酸脫氫酶2(MDH2)及細胞溶質的蘋果酸酶1(MAE1)增強活性之菌株

依據實施例5之結果，證實藉由新的途徑以生成乙醯輔酶A以及增強丙酮酸生合成之策略以增加乳酸醱酵產率、增強具生產率之微生物生長，以及增加乳酸酸醱酵生產率之有效的方法，正因為如此，本申請嘗試證實使用其他的基因來增強丙酮酸生合成是否具有相似的效果。

(1)具MDH2及細胞溶質的MAE1增強活性之載體之製備

由於藉由引入外來的ACL所產生的OAA可藉由不同的途徑生合成丙酮酸，本申請之發明人嘗試過度表現原本就位於細胞溶質之MDH2，以及過度表現位於粒線體之酵素，藉由改變其位置至細胞溶質之MAE1。為此，製備重組載體。

MDH2係存在於酵母菌微生物內之基因且可由SEQ ID NO：35之胺基酸序列表示。MHD2基因之片段係藉由使用S.cerevisiae之基因體DNA作為模板以及引子SEQ ID NO：25及26進行PCR而實施。PCR係以95 ℃變性5分鐘，53℃降溫黏合1分鐘，以及72℃聚合1分鐘而實施。由此獲得之MDH2基因片段選殖至經限制酶SpeI及NcoI消化之pRS414載體，其中MDH2基因係設置使用TEF1啟動子過度表現。由此獲得的重組載體命名為pRS414-TEF1pro-MDH2。

MAE1係原本存在於酵母菌微生物之粒線體之基因且可由SEQ ID NO：37之胺基酸序列表示。針對在細胞溶質內表現MAE1基因，不包括粒線體標的序列(由SEQ ID NO：51之胺基酸序列表示)，將由從MAE1基因之起始密碼子所組成之90個核苷酸序列進行選殖。PCR係利用S.cerevisiae之基因體DNA作為模板以及引子SEQ ID NO：27及28而實施。PCR係以95℃變性5分鐘進行變性作用，53℃降溫黏合1分鐘進行，以及72℃聚合2分鐘而實施。從此獲得之PCR片段選殖至經限制酶SpeI及XmaI消化之pRS416載體。為了移除從MAE1 ORF起始密碼子開始之90個核苷酸序列，以此方式製備SEQ ID NO：27之引子，以獲得從位置91開始之核苷酸序列。此外，嘗試使用TEF1啟動子過度表現細胞溶質的MAE1。此外，由此製備之重組載體命名為pRS414-TEF1pro-MDH2及pRS416-TEF1pro-細胞溶質的MAE1。使用於製備重組載體，即，pRS414-TEF1pro-MDH2及pRS416-TEF1pro-細胞溶質的MAE1之引子總結於下表8。

(2)在具經去活化的PDC之乳酸製造菌株中製備具增強活性的MDH2及細胞溶質的MAE1之菌株

將由實施例4-(1)所製備之經引入外來的ACL之載體，以及由實施例6-(1)所製備之MDH2過度表現載體及MAE1過度表現載體，藉由轉染方式選殖基於實施例2所製備之CC02-0553菌株。轉染係使用說明於實施例4-(3)之方法來實施。由此製備之菌株命名為CC02-0821，且該菌株之基因特質總結於下表9。

基於具經去活化的PDC之菌株之引入ACL以及評估具MDH2及細胞溶質的MAE1增強活性之菌株之醱酵

針對ACL-MDH2-細胞溶質的MAE1-增強菌株之評估，乳酸醱酵能力係利用與實施例2相同之方式評估實施例6所製備之具經去活化的PDC之菌株。結果總結於下表10。

結果為如上表10可證實，藉由過度表現MDH2及細胞溶質的MAE1以增強丙酮酸生合成，如同 CC02-0821菌株之醱酵能力評估結果亦顯示代表相較於PDC活性經移除之菌株之細菌生長之OD₆₀₀數值增加110%；在同一期間內，葡萄糖消耗量增加80%；以及乳酸醱酵之產率改善6%，如同CC02-0765菌株。此外，該菌株最後顯示乳酸生產率90%的改善。依據以上結果，證實不僅在酵母菌微生物內引入外來的ACL改善乳酸的生產率，而且經由不同路徑以增強丙酮酸生合成途徑亦有效於進一步改善乳酸生產率。

實施例8：具減低PDC活性之菌株之引入ACL以及製備具PCK1及PYK2增強活性之菌株，以及具MDH2及細胞溶質MAE1增強活性之菌株

決定性地從實施例之結果證實，移除PDC效價之菌株可藉由引入外來的ACL以及增強丙酮酸生合成途徑來增加乳酸醱酵之生產率。因此，本申請之發明人嘗試證實來自PDC效價減低之菌株，以及PDC效價經移除之菌株是否能獲得相同的結果。

以相同於實施例4-(3)之方式，基於由實施例2所製備之具減低PDC活性之CC02-0256菌株，引入由實施例4所製備之重組載體，即pRS415-GPDpro-ACL以及pRS416-TEF1pro-PYK2-TEF2p-PCK1。由此製備之菌株分別命名為CC02-0819以及CC02-0820。再者，以相同於實施例4-(3)之方式，基於由實施例2所製備之具減低PDC活性之CC02-0256菌株，插入由實施例4所製備之重組載體，即pRS415-GPDpro-ACL以及由實施例6-(1)所製備之 pRS414-TEF1pro-MDH2及pRS416-TEFpro-細胞溶質的MAE1。由此製備之菌株命名為CC02-0831，且該菌株之基因特質總結於下表11。

實施例9：在具減低PDC活性之菌株之引入ACL以及評估具PCK1及PYK2增強活性之菌株之醱酵作用

以相同於實施例3之方式，評估實施例8所製備之CC02-0819及CC02-0820菌株之乳酸醱酵能力，並以CC02-0256菌株作為對照組。實施例結果總結於下表12。

結果為如上表12可證實，不同於CC02-0553菌株，CC02-0256菌株藉由增加引入外來的ACL以及增強丙酮酸生合成途徑並未呈現顯著增加之效果，但是乳酸醱酵產率有改善、具生產率之微生物之細菌生長有增加，以及乳酸醱酵生產率亦有增加。

其中引入外來的ACL且PCK1及PYK2活性增強之CC02-0820菌株，顯示OD₆₀₀數值增加，其代表相較於具減低PDC效價之菌株，細菌生長增加80%；在同一期間內，葡萄糖消耗量增加40%；以及乳酸醱酵之產率改善2%。此外，乳酸生產率最終改善40%。相較於僅引入外來的ACL之CC02-0819菌株，CC02-0820菌株顯示OD數值、在同一期間內之葡萄糖消耗量，以及乳酸醱酵之產率皆增加，且顯示生產率20%增加。

實施例10：在具減低PDC活性之菌株之引入ACL以及比較評估具MDH2及細胞溶質的MAE1增強活 性之菌株之醱酵作用

以相同於實施例3之方式，評估實施例8所製備之CC02-0831菌株之乳酸酸醱酵能力，並以CC02-0256以及CC02-0819菌株作為對照組。實施例結果總結於下表13。

其結果，如同上述表13所證實，其中經引入外的ACL以及MDH2及細胞溶質的MAE1經增強的菌株CC02-0831，相較於母株CC02-0256，顯示OD₆₀₀數值y/ru880%，在同一期間內，葡萄糖消耗量增加30%；以及乳酸醱酵之產率改善2%。此外，乳酸生產率最終改善30%。相較於其中僅引入外來ACL之CC02-0819菌株，CC02-0831菌株顯示於OD數值、在同一期間內的葡萄糖消耗量、以及乳酸醱酵的產率皆增加，且顯示生產率增加20%。

以上結果支持，與現有技術不同，藉由採用利用新的途徑以生成乙醯輔酶A以及增強丙酮酸生合成之策略以製造乳酸之方法，不僅能增加乳酸醱酵之產率及增強具生產率之微生物生長，而且能增加乳酸醱酵之生產率。尤其，該結果建議，由採用利用引入外來的ACL及增強丙酮酸生合成之新的途徑以生成乙醯輔酶A之策略所製備之微生物，不僅能增加乳酸醱酵之產率及增強具生產率之微生物生長，而且能增加乳酸醱酵之生產率，因此能提供作為極佳的乳酸製造微生物。

由上述，本領域技術人員對本申請所屬能夠瞭解在不修改本申請技術概念或必要特徵下，本申請可體現於其他形式。在這方面，本文所揭示之例示性實施例僅用於說明用途且不應被詮釋為限制本申請之範圍。相反地，本申請意謂涵蓋不只例示性具體例，還有各種不同的選擇、修飾、同等以及可包含被所附申請專利範圍所限制之本申請之本質及範圍之其他具體例。

寄存證明書(中譯本)

布達佩斯條約締約國所承認之專利手續上的微生物寄存的國際寄存機構根據布達佩斯條約第7.1條出具此證明

寄存者：CJ第一製糖股份有限公司

地址：大韓民國100-400首爾市中區東湖路330 CJ第一製糖中心

I.微生物身分

寄存者給予之編號：Saccharomyces cerevisiae CC02-0765

國際寄存機構給予之登錄號：KCCM11616P

II.科學描述及/或建議的分類名稱

上述I.所定義之微生物附帶有：

□科學描述

□建議的分類名稱

(請以■註記)

III.受領及收存

本國際寄存機構收存於2014年11月28日(原始寄存日)受領之上述I.所定義之微生物。

IV.國際寄存機構

韓國微生物培養中心

地址：大韓民國120-861首爾市西大門區弘濟洞-2-1 45儒林大樓

國際寄存機構授權人簽署：

日期：2014年11月28日

<110> CJ第一製糖股份有限公司

<120> 用於製造乳酸之微生物及使用該微生物製造乳酸的方法

<130> OPA16043-TW

<150> KR 10-2015-0083658

<151> 2015-06-12

<160> 52

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH1上游前置引子

<400> 1

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH1上游反置引子

<400> 2

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH1下游前置引子

<400> 3

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ADH1下游反置引子

<400> 4

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDC1上游前置引子

<400> 5

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDC1上游反置引子

<400> 6

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDC1下游前置引子

<400> 7

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PDC1下游前置引子1

<400> 8

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DLD1-HIS3上游聯結引子

<400> 9

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DLD1-HIS3下游聯結引子

<400> 10

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-ALPDC5-BamHI引子

<400> 11

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-ALPDC5-NotI引子

<400> 12

<210> 13

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-BRPDC5-SpeI引子

<400> 13

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-BRPDC5-NcoI引子

<400> 14

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-ALPDC6-BamHI引子

<400> 15

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-ALPDC6-NcoI引子

<400> 16

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-BRPDC6-BamHI引子

<400> 17

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-BRPDC6-NcoI引子

<400> 18

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-PYK2-SpeI引子

<400> 19

<210> 20

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-PYK2-XhoI引子

<400> 20

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-PYK2-ADH1t-infusion引子

<400> 21

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-TEF2p-PCK1-infusion引子

<400> 22

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-PCK1-TEF2-infusion引子

<400> 23

<210> 24

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-PCK1-infusion引子

<400> 24

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-MDH2-SpeI引子

<400> 25

<210> 26

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-MDH2-XhoI引子

<400> 26

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-cytMAE1-SpeI引子

<400> 27

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> R-cytMAE1-XmaI引子

<400> 28

<210> 29

<211> 1091

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 29

<210> 30

<211> 3276

<212> DNA

<213> 小鼠

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1091)

<223> ACL

<400> 30

<210> 31

<211> 549

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 31

<210> 32

<211> 1650

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1650)

<223> PCK1(SGD,YKR097W)

<400> 32

<210> 33

<211> 506

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 33

<210> 34

<211> 1521

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1521)

<223> PYK2(SGD,YOR347C)

<400> 34

<210> 35

<211> 377

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 35

<210> 36

<211> 1134

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1134)

<223> MDH2(SGD YOL126C)

<400> 36

<210> 37

<211> 669

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 37

<210> 38

<211> 2010

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(2010)

<223> MAE1(SGD YKL029C)

<400> 38

<210> 39

<211> 563

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 39

<210> 40

<211> 1692

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1692)

<223> PDC1(SGD YLR044C)

<400> 40

<210> 41

<211> 563

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 41

<210> 42

<211> 1692

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1692)

<223> PDC5(SGD YLR134W)

<400> 42

<210> 43

<211> 563

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 43

<210> 44

<211> 1692

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1692)

<223> PDC6(SGD YGR087C)

<400> 44

<210> 45

<211> 348

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 45

<210> 46

<211> 1047

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1047)

<223> ADH1(SGD YOL086C)

<400> 46

<210> 47

<211> 587

<212> PRT

<213> 釀酒酵母

<400> 47

<210> 48

<211> 1764

<212> DNA

<213> 釀酒酵母

<220>

<221> gene

<222> (1).(1764)

<223> DLD1(SGD)

<400> 48

<210> 49

<211> 332

<212> PRT

<213> 胚芽乳酸桿菌

<400> 49

<210> 50

<211> 999

<212> DNA

<213> 胚芽乳酸桿菌

<220>

<221> gene

<222> (1)..(999)

<223> 1dhD(登錄號NC_004567)

<400> 50

<210> 51

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MAE1之粒線體標的序列

<400> 51

<210> 52

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 經修飾的MAE1

<400> 52

Claims

一種用於製造乳酸之Saccharomyces屬微生物，其中，該微生物係經修飾為具有相較於其內生性活性為去活化的丙酮酸脫羧酶(PDC)之活性、引入ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)之活性，以及增強相較於其內生性生合成途徑之丙酮酸生合成途徑。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，相較於其內生性活性，該增強丙酮酸生合成途徑係藉由增強磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶1(PCK1)、丙酮酸激酶2(PYK2之活性或兩者之活性而達成。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，相較於其內生性活性，該增強丙酮酸生合成途徑係藉由增強蘋果酸脫氫酶2(MDH2)、細胞溶質的蘋果酸酶1(細胞溶質MAE1)之活性或兩者之活性而達成。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，丙酮酸脫羧酶係由選自由SEQ ID NO：39、41及43之胺基酸序列所組成之群組之至少一胺基酸序列所表示之酵素。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，ATP-檸檬酸裂解酶係由SEQ ID NO：29之胺基酸序列所表示之酵素。
如申請專利範圍第2項之微生物，其中，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶1係由SEQ ID NO：31之胺基酸序列所表示之酵素以及丙酮酸激酶2係由SEQ ID NO：33之胺基酸序列所表示之酵素。
如申請專利範圍第3項之微生物，其中，蘋果酸脫氫酶2係由SEQ ID NO：35之胺基酸序列所表示之酵素以及細胞溶質的蘋果酸酶1係由SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：52之胺基酸序列所表示之酵素。
如申請專利範圍第1項之微生物，其中，該微生物進一步經修飾為引入乳酸脫氫酶(LDH)之活性。
如申請專利範圍第8項之微生物，其中，該乳酸脫氫酶係由SEQ ID NO：49之胺基酸序列所表示之酵素。
如申請專利範圍第1項之微生物，其中，該微生物進一步經修飾為：(i)去活化相較於其內生性活性的乙醇脫氫酶1(ADH1)之活性；(ii)去活化相較於其內生性活性的丙酮酸脫羧酶1(PDC1)之活性；以及(iii)去活化相較於其內生性活性的D-乳酸脫氫酶1(DLD1)之活性。
如申請專利範圍第1項所述之微生物，其中，該Saccharomyces屬微生物係釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)。
一種製造乳酸之方法，其包含：(a)在培養基內培養如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之Saccharomyces屬微生物；以及(b)從經培養的微生物或培養基回收乳酸。