KR20150078989A

KR20150078989A - 숙신산 생산용 재조합 효모균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법

Info

Publication number: KR20150078989A
Application number: KR1020130168914A
Authority: KR
Inventors: 김재영; 최원재
Original assignee: 한화종합화학 주식회사
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2015-07-08

Abstract

본 발명은 ATP-시트레이트 리아제 유전자를 도입하여 숙신산의 생산이 가능한 효모 균주를 제공하며, 알코올 생합성 경로의 유전자 발현을 차단함으로써 숙신산 생산 효율을 향상시킬 수 있는 효모균주 및 이를 이용한 숙신산 생성 공정에 관한 것으로서, 탄산염과 같은 중화제 사용하지 않고, 분리 및 정제공정이 간편하며, 숙신산을 고농도 및 대량으로 생산할 수 있다.

Description

숙신산 생산용 재조합 효모균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법 {RECOMBINANT YEAST FOR PRODUCING SUCCINIC ACID AND PRODUCTION METHOD OF SUCCINIC ACID USING THE SAME}

본 발명은 숙신산 생산용 효모균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 야생형에서보다 ATP-시트레이트 리아제(ATP-citrate lyase) 효소의 활성이 증가된, 숙신산 생산용 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 관한 것이다. 또한 중화제를 사용하지 않아 gypsum이 형성되지 않으므로 간편하게 숙신산을 분리 및 정제할 수 있다.

숙신산(succinic acid)은 디카르복시산의 일종으로서 식품첨가제(food additive), 방빙제(de-icer), 가소제(plasticizer) 등에 사용되고 있으며, 화학 반응을 통해 세정제, 폴리에스터 전구체(PBS, polybutylene succinate) 등에 사용되는 1,4-BDO(1,4-butanediol), GBL(gamma-butylolactone), THF(tetrahydrofuran) 등의 유도체 제조가 가능한 물질이다. 따라서, 숙신산은 C4 플랫폼 화합물로서 숙신산, 숙신산 유도체, 그리고 중합체로서 제조되어 다양한 응용 분야에서 사용되기 때문에 향후 응용 가치 및 파급 효과가 뛰어나 바이오매스 유래의 고부가가치 화합물로 알려져 있다.

숙신산을 제조하는 방법중 하나는 원유(petroleum)의 크랙킹(cracking)으로 얻어진 C4 분획으로부터 석유화학계 무수 말레인산으로부터 제조되어 왔다. 하지만, 석유 의존적이며, 유가 상승으로 인한 가격 경제성과 수급 불안정성, 그리고 지구온난화와 환경 파괴와 같은 범지구적인 문제들을 초래하기 때문에, 이러한 문제점들을 극복하기 위한 대안으로서 재생 가능한 바이오매스 원료로부터 생물학적 기술을 이용한 친환경적이며 지속가능한 바이오-숙신산의 직접적 제조 기술이 요구되고 있다.

숙신산을 생물학적 방법으로 생산하는 방법 및 이를 상업적으로 활용하기 위한 시도가 있다. WO2010/092304에는 대장균을 이용하여 호기조건에서 유가식으로 배양한 후 혐기적 조건에서 배양하여 숙신산 이온을 생산하는 방법이 개시되어 있다. US2011/0300589A에서는 피루베이트-포르메이트-리아제 활성이 감소된 박테리아에서 글리세롤를 탄소원으로 하여 숙신산을 배양하였다. WO2007/061590에서는 피루베이트 탈탄산효소가(pyruvate decarboxylase, pdc)가 결여된 효모에 피루베이트 카르복실라제 또는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase)를 도입하여 숙신산을 생산하는 방법이 개시되어 있다.

통상 숙신산의 생물학적 생산 공정은 1) 중화제에 의한 숙신산염 발효, 2)산 첨가 및 숙신산화, 3) 숙신산 정제 및 부산물 회수, 재활용, 폐기 등 3단계로 요약할 수 있다. 그러나, 숙신산의 생물학적 제조기술은 고농도 생산의 한계와 분리, 정제 등의 기술적 한계로 인하여 여전히 상업화 수준에 이르지 못하고 있다.

이러한 근본 원인은 숙신산 생산 기술이 다량의 중화제를 사용하는 공정이기 때문이다. 미생물을 이용한 유기산 발효 생산은 유기산의 약산성으로 인해 중화제를 첨가한 중성 조건에서 이루어지며, 발효 생산공정에서 중화제의 사용으로 숙신산의 분리, 정제 공정 시 산화제가 필요하다. 이 경우 gypsum이 필수적으로 대량 생산되고 숙신산 회수에 있어 비용이 상승하고 복잡하고, 까다로운 공정을 필요로 한다.

이러한 단점을 극복하기 위해서는 획기적인 분리, 정제 기술이 개발되거나 또는 산성 조건에서 유기산을 생산할 수 있는 기술 개발이 필수적으로 요구된다.

현재까지 숙신산 연구개발은 중화제 의존적인 공정의 개선보다는, 목질계 바이오매스, 자일로스, 글리세롤, 사탕수수, 에탄올 등과 같은 저가 바이오매스 원료를 기질로 활용하는 기술을 개발하거나, 생산 수율 및 전환율 향상에 치우쳐 왔다. 또한, 대사 공학 기술을 이용하여 숙신산 생합성 효율 향상을 시도하고 있으며, 이산화탄소 고정 효율이 뛰어나고 저가 원료 이용성이 높은 숙신산 생산 성능이 뛰어난 숙신산 생산 균주의 탐색, 선별 시도 등이 있다.

그러나, 전통적인 균주 개발 방식은 기존의 숙신산 생산 기술이 갖는 원천적인 문제들과 기술적 한계를 극복하기 어렵기 때문에, 탄산염과 같은 중화제 비사용 또는 이산화탄소 고정이 필요없는 산성 발효 균주 개발과 같은 새로운 방안이 절실히 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 탄산염과 같은 중화제를 사용하지 않고, 분리 및 정제공정이 간편하며, 숙신산을 고농도 및 대량으로 생산하고자, ATP-시트레이트 리아제 유전자를 도입하여 숙신산의 생산이 가능한 효모 균주를 제공하며, 알코올 생합성 경로의 유전자 발현을 차단함으로써 숙신산 생산 효율을 향상시킬 수 있는 효모균주 및 이를 이용한 숙신산 생성 공정을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 달성하고자, 본 발명의 일 구현예는 외래(heterologous) ATP-시트레이트 리아제 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, ATP-시트레이트 리아제 효소를 발현하며 숙신산을 생산하는 재조합 효모균주에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일구현예는, 상기 ATP-시트레이트 리아제 효소를 발현하며 숙신산을 생산하는 재조합 효모균주는, 알코올 생합성 경로에 관여하는 효소가 불활성화 또는 결실, 숙신산 내성, 및 glyoxylate shunt 유전자 도입으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 특성을 추가로 포함하는 재조합 효모 균주일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일예는 숙신산 생산에 있어 부산물인 알코올 생산을 억제하여 숙신산 생성량을 더욱 높이고자, 상기 재조합 효모균주의 알코올 생합성 경로를 차단시킬 수 있다. 상기 알코올 생합성 경로를 차단하기 위해서, 알코올 생합성 경로에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자중 1종 이상의 유전자가 불활성화 또는 결실된 재조합 효모 균주를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는, 고농도 숙신산과 산성 조건에서 숙신산에 내성을 나타내어 고농도의 숙신산 생산을 가능하게 하는 효모 균주를 제공한다.

본 발명의 추가 구현예는 상기 재조합 효모 균주를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이며, 바람직하게는 상기 숙신산에 대한 내성이 갖는 효모를 이용하여 고농도로 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 명세서에서 사용되는 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다. 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 글리세롤 대사에 관련하는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을수록 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 3-히드록시프로피온산 합성 관련되는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다.

본 발명에서 서열의 동일성은 2개 이상의 아미노산 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열간의 관계로서 서열을 비교하여 결정될 수 있으며, 서열끼리 match되는 것으로 측정된다. 상기 동일성을 측정하는 방법은 알려진 프로그램을 사용할 수 있는데, 예들 들면 BLASTP, BLASTN 등을 들 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산 분자를 형성하는 능력을 언급하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 핵산 분자중 하나의 길이 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것을 의미한다.

본 발명의 "외인성 (exogenous)" 이란 핵산이나 단백질이 숙주 미생물로 도입되는 것을 의미한다. 예를 들어, 핵산이 숙주세포의 염색체에 도입되거나 플라즈미드와 같은 비염색체로서 숙주 세포로 도입되는 경우이다. 본 발명에서는 암호화하는 핵산이 발현가능한 형태로 숙주 세포에 도입되어 암호화하는 핵산이 발현될 수 있다.

상기 숙주 세포에 도입되는 핵산은 숙주 세포에 상동성(homologous)하거나 이종성(heterologous)일 수 있다. 본 발명의 "상동성" 핵산 또는 단백질은 같은 종(species), 바람직하게는 같은 균주(strain)의 숙주 세포에 의해 자연적으로 생산되는 핵산이나 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵산이나 단백질의 "이종성"이란 천연 미생물, 세포, 유전체, 플라즈미드 등에서는 존재하지 않는 핵산이나 단백질이거나, 자연에서 발견되는 것과 다른 세포에 존재하거나, 게놈이나 플라즈미드 상의 다른 위치에서 발견되는 핵산 또는 단백질을 의미한다. 본 발명의 핵산의 외인성(exogenous) 발현은 상동성 또는 이종성 암호화하는 핵산을 사용하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 "유전자" 또는 "(폴리)뉴클레오타이드"는 특정 단백질을 발현(암호화)시키는 핵산 단편(핵산 분자)을 지칭하며, 단일가닥 또는 이중가닥 형태일 수 있다. 또한 코딩 영역만을 지칭하거나 코딩 서열 앞에 있는 조절 서열(5' 비-코딩 서열) 및 코딩 서열 뒤에 있는 조절 서열(3' 비-코딩 서열)을 포함할 수 있으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 일 구현예는 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 야생형보다 상기 효소의 활성이 증가된 숙신산을 생산하는 재조합 효모균주에 관한 것이다. 상기 효모 균주는 ATP-시트레이트 리아제 유전자를 도입하여 숙신산의 생산이 향상된 효모 균주이다.

ATP-시트레이트 리아제(EC 2.3.3.8)는 시트레이트(citrate)를 옥살로아세테이트(oxaloacetate)와 acetyl-CoA(아세틸-CoA)로 대사하는 효소로서, 역방향 TCA 경로(reverse TCA cycle) 반응으로 알려져 있다. 상기 ATP-시트레이트 리아제 효소 반응으로 생성된 옥살로아세테이트를 환원 TCA 경로로 전환시켜 숙신산을 생산하도록 하기 때문에 호기조건에서 숙신산 생산 효율을 향상시킬 수 있는 경로로 활용할 수 있다. 상기 효소는 서브유닛 1(subunit 1)과 서브유닛 2(subunit 2)로 구성되어 있으며, 상기 효소에는 서브유닛 1과 2를 모두 포함한다.

ATP-시트레이트 리아제의 구체적인 예로는 상기 효소에는 서브유닛 1과 2를 모두 포함하여 AN2435.2(XP_660039.1), AN2436.2(XP_660040.1), ACL(EIT74888.1), ACL(XP_001268170.1), ACL(XP_750954.1), ACL(XP_001258191.1), ACL2(XP_001596162.1), ACL2(CCC07572.1), ACL2(ELA38193.1)등이 포함된다. 구체적인 예로서, ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 1은 AN2435.2(XP_660039.1)서열로서 서열번호 8의 아미노산서열을 포함하며, 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산서열을 포함할 수 있다. ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 2는 AN2436.2(XP_660040.1)서열로서, 서열번호 10의 아미노산서열을 포함하며, 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산서열을 포함할 수 있다.

ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 1은 서열번호 8의 아미노산 서열 또는 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 바람직하게는 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다. ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 2는 서열번호 10의 아미노산 서열 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 바람직하게는 적어도 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 효소일 수 있다.

상기 ATP-시트레이트 리아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 AN2435.2(EAA64141), acl2(EAA64141.1), AN2436.2(EAA64142), acl1(EAA64142.1), acl1(NCBI Gene ID: 2910381), acl1(NCBI Gene ID: 2874950), acl1(NCBI Gene ID: 2874699), acl2(NCBI Gene ID: 2910381), AclB-2(NCBI Gene ID: 917924), AclA-3(NCBI Gene ID: 471036), AclA-1(NCBI Gene ID: 471195), AclB-1(NCBI Gene ID: 477973), AclA-2(NCBI Gene ID: 475250)를 포함한다. 구체적인 예로서, ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 1의 유전자 서열은 AN2435.2(XP_660039.1)서열로서 서열번호 8의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. ATP-시트레이트 리아제의 서브유닛 2의 유전자 서열은 AN2436.2(XP_660040.1)서열로서, 서열번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 9의 아미노산서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 Aspergillus spp ., Saccharomyces spp ., Schizosaccharomyces spp ., Candida spp ., Yarrowia spp ., Fusarium spp ., Deinococcus spp ., Methanosaeta spp ., Microcera spp., Neonectria spp ., Arabidopsis spp ., Pencillium spp ., Trichoderma spp ., Neurospora spp ., Trichosporon spp ., Neosartorya spp ., Sclerotinia spp ., Sordari spp., Colletotrichum spp . 등으로부터 유래될 수 있다.

본 발명에 도입되는 상기 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 외인성 유전자일 수 있다. 본 발명의 숙주세포가 천연으로 상기 유전자를 포함하고 있는 경우에도 상기 효소의 발현양을 증가시키기 위하여 추가로 숙주세포 내로 도입할 수도 있다. 따라서 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 도입된 본 발명 균주는 야생형보다 상기 효소의 활성이 증가된다. 상기 ATP-시트레이트 리아제 유전자는 본 발명의 숙주세포에서 발현되기 위하여 프로모터에 작동 가능하도록 결합된다. 본 명세서에서 용어 "프로모터"는 코딩 서열의 전사 시작점에서 업스트림에 위치하여 유전자의 전사를 조절하는 DNA 서열을 의미하며, 항시성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 프로모터일 수 있다. 또한 상기 프로모터는 상기 ATP-시트레이트 리아제 유전자의 천연적 자체 프로모터이거나, 천연적이지 않을 수 있다. 바람직하게는 본 발명 숙주세포에 내재하는 것일 수 있다. 본 발명의 제조합 발현벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 "작동가능하도록 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다. 본 발명의 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 동일 또는 상이한 프로모터 하에서 조절될 수 있다. 또한, 상기 두 뉴클레오타이드 서열은 동일 또는 상이한 발현벡터에 포함될 수 있다.

본 발명의 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 종결인자 (terminator)를 포함할 수 있고, 진핵세포에서 기능을 하는 종결인자라면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 숙주세포에서 유래된 천연적인 종결인자일 수 있다.

본 발명에 따른 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 통상의 방법으로 상동 재조합 또는 비상동 재조합, 바람직하게는 상동 재조합 방식으로 숙주세포의 게놈 내에 삽입될 수 있거나, 유전자 발현이 가능한 발현 벡터 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다.

본 발명의 효모 균주는 C3 화?물을 C4 화합물로 전환할 수 있는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 추가로 형질전환될 수 있다. 상기 C3를 C4로 전환은 포스포에놀피루베이트(PEP)가 옥살로아세테이트, 피루베이트가 옥살로아세테이트 또는 말릭산으로 전환하는 것을 들 수 있다. 상기 전환 효소의 예로는 PEP 카르복시키나제(PEP carboxykinase, EC 4.1.1.49, EC 4.1.1.38), PEP 카르복실라제(PEPcarboxylase, EC 4.1.1.31), 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase, EC 6.4.1.1.) 또는 말릭 데히드로게나제(malic dehydrogenase, EC 1.1.1.38) 등을 들 수 있다. 상기 재조합 효모균주는 포스포에놀피루베이트(PEP) 카르복시키나제(PEP carboxykinase), 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(PEP carboxylase), 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase), 및 말릭 데히드로게나제(malic dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 추가로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 효소균주는 glyoxylate shunt 경로 관련 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하도록 추가로 형질전환될 수 있다. glyoxylate 경로는 그 경로를 통해 1분자의 숙신산이 생산되기 때문에 숙신산 생산 경로로 효율적이며, 경로에 관련 효소로 isocitrate lyase (EC 4.1.3.1) 및 malate synthase (EC.2.3.3.9) 중에서 하나 이상 선택될 수 있다

또한 본 발명의 재조합 효모균주는 알코올 생합성 경로의 유전자 발현을 차단함으로써 숙신산 생산 효율을 향상시킬 수 있는 효모 균주일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 효모 균주는 글루코스를 에탄올과 글리세롤로 대사하므로, 글루코스로부터의 숙신산 생산을 증대시키기 위하여 에탄올 생합성 경로를 차단하여 숙신산을 생산하는 효모 균주를 제조한다.

따라서, 상기 재조합 효모균주는 효모 균주의 알코올 생합성 경로를 차단하고, ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 숙신산을 생산하는 효모 균주일 수 있다. 상기 알코올 생합성 경로의 차단은 에탄올 생산 경로에 관여한 유전자들을 불활성화 또는 결실시키는 방법일 수 있다.

구체적인 일예에서, 효모 균주에서 에탄올 생합성 경로는 2단계로 이루어져 있으며, 첫 번째 단계는 pyruvate로부터 pyruvate decarboxylase(PDC 효소, EC 4.1.1.1)에 의해서 acetaldehyde를 생성하고, 최종 단계는 alcohol dehydrogenase(ADH 효소, EC1.1.1.1)들에 의해서 ethanol을 생산하는 것으로 알려져 있다. 숙신산 생산을 촉진시키기 위해 피루베이트 데카르복실라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 알코올 데히드로게나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 불활성화 또는 결실시킬 수 있다.

상기 피루베이트 데카르복실라제(PDC)는 PDC, PDCI, PDCII, PDC1, PDC2, PDC5, PDC6, KIPDC 등을 들 수 있다. 또한 알코올 데히드로게나제는 ADH1, ADHI, ADH2, ADHII, ADH3, ADHIII, ADH4, 및 ADHIV 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체예에서 피루베이트 데카르복실라제는 PDC1(AAA35267.1), 알코올 데히드로게나제는 ADH1(CAA42785.1.) 또는 AHD2(AAF91235.1.)일 수 있다. 상기 피루베이트 데카르복실라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 pdc1 (L09727.1)이며, 알코올 데히드로게나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 adh1 (X60224.2), adh2 유전자 (AF225206.1), adh3(AF261759.1), adh4(AF261760) 등일 수 있다.

상기 피루베이트 데카르복실라제의 바람직한 구체적인 예는 서열번호 2으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 상기 알코올 데히드로게나제는 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체예에서, 피루베이트 데카르복실라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 알코올 데히드로게나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열번호 3, 또는 서열번호 5로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기와 같이 본 발명은 부산물 제조에 관여하는 유전자를 불활성화시켜(inactivated) 기질의 비효율적인 사용을 방지하고 숙신산 생산으로 전환하게 함으로써 효율적으로 숙신산을 생산할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 효모의 알코올 생산 경로가 차단되도록 하기 위하여, 본 명세서의 용어 "불활성화된(inactivated)" 타겟 유전자의 기능이 차단되면 불활성화되었다고 표현하며, 예를 들어 안티센스 사슬에 의해 유발된 불활성화, 또는 유전자의 점 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 대체 돌연변이, 결실 돌연변이 등을 포함하는 돌연변이에 의해서 유발된 타겟 유전자의 불활성화를 포함한다.

상기 유전자의 불활성화는 타겟 유전자를 불활성화시킬 수 있는 공지의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 재조합 방법으로, 변이 유전자 또는 그 일부를 포함하는 DNA 단편을 숙주세포에 형질전환시키고 게놈 내 천연 유전자를 상동 재조합에 의하여 변이 유전자로 대체시킨 후 대체된 숙주 세포를 선별하여 타겟 유전자가 불활성화된 숙주 세포를 얻을 수 있다.

또는 K. marxianus 균주에서와 같이 숙주 세포 자체가 비상동성 재조합 활성이 높은 경우에는 상기와 같은 상동성 재조합으로는 타겟 유전자의 제거 효율이 낮은 경우가 있다. 이는 숙주 세포의 상대적으로 높은 비상동성 재조합 활성이 있기 때문이다. 일반적으로 세균과 달리 효모와 같은 진핵생물은 상동성 재조합 활성이 높은 것으로 알려져 왔으나, K. marxianus 균주와 같은 경우 세포 내 존재하는 Ku70/Ku80 단백질과 같은 비상동성 재조합에 관여하는 효소의 높은 활성으로 인해, 상동성이 낮음에도 원하지 않는 유전자와 재조합이 일어나는 것이다. 그러므로, 숙주세포가 K. marxianus와 같이 비상동성 재조합 활성이 높은 경우에는 타겟 유전자를 불활성화시키기 위하여 비상동성 재조합 활성을 회피할 수 있는 방법이 필요하다.

따라서, 본 발명에서는 비상동성 재조합 활성이 높은 숙주세포의 에탄올 생산 경로 유전자를 불활성화시키기 위하여 에탄올 생산 경로 유전자들의 전사체와 상보적인 전사체를 발현시킴으로써 상기 에탄올 생산 관련 효소의 번역(translation)을 차단하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 에탄올 생산 경로유전자들의 전사체에 대한 상보적인 전사체를 발현시키기 위해서, 상기 유전자들의 안티센스(anti-sense) 사슬의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열을 효모 균주에 도입하여 안티센스 사슬이 전사되도록 하는 방법으로 달성할 수 있다. 상기 안티센스 서열의 상보적 전사체(안티센스 뉴클레오타이드 서열)는 에탄올 생산 경로 유전자의 전장 유전자 또는 상보적 결합으로 전사체의 번역을 저해하는 길이의 단편일 수 있다.

본 발명의 추가 구현예는 상기 재조합 효모균주는 숙신산에 대한 내성을 갖는 효모일 수 있다. 구체적으로, 효모 균주는 숙신산에 대한 내성을 갖는 효모일 수 있다. 상기 효모균주는 숙신산이 100g/l 이상, 바람직하게는 120g/l 이상, 더욱 바람직하게는 140g/l 이상, 가장 바람직하게는 160g/l 농도로 포함된 배양조건에서 생장할 수 있다.

상기 효모 균주의 구체적인 예는 클루이베로미세스속 균주(Kluyveromyces spp.), 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces spp .), 시조사카로마이세스속 균주(Schizosaccharomyces spp .), 피키아속 균주(Pichia spp .), 파피아속 균주(Paffia spp .), 클루이베로미세스속 균주(Kluyveromyces spp .), 칸디다속 균주(Candida spp .), 탈라로미세스속 균주(Talaromyces spp .), 브레타노미세스속 균주(Brettanomyces spp .), 파키솔렌속 균주(Pachysolen spp .), 데바리오미세스속 균주(Debaryomyces spp .) 또는 이들의 산업적인 배수체(polyploid)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 효모균주는 클루이베로미세스속 균주(Kluyveromyces spp .)이며, 더욱 바람직하게는 클루이베로미세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus)일 수 있다. 상기 K. marxianus 균주는 내산성, 내열성, 광범위 기질 이용성, 글리세롤 합성, 호기 및 혐기 에탄올 발효, 높은 생장 수율, 빠른 생장 속도 등의 장점이 있다.

미생물을 이용한 유기산 발효 생산은 유기산의 약산성으로 인해 축적된 유기산과 세포내 pH의 산성화로 인하여 효소 활성이 저해됨은 물론 프로톤 구배에 의한 ATP 생산이 원활하지 못하게 되기 때문에 세포 생장이 저하되는 것이다. 따라서, 산업적 생산에서는 암모니아수, CaCO₃, Ca(OH)₂ 등의 중화제를 사용하여 발효공정의 조건을 중성으로 맞추어 수행한다. 중화제의 사용으로 인해, 유기산 발효 생산과 분리, 정제 공정에서 비용을 상승시키고, 공정을 복잡하게 한다. 즉, 발효 생산된 유기산과 동일한 농도(양)의 중화제가 필요하고, 다시 유기산을 분리, 정제하기 위해 산화제가 필요하게 되며, 이 과정에서 gypsum이 필수적으로 대량 생산된다.

따라서, 유기산의 발효 생산에 있어 낮은 pH나 유기산 산물에 내성을 갖는 미생물을 사용할 경우, 세포 활성 저하를 방지함은 물론 효율적인 발효 생산 및 분 리, 정제 공정 개발과 중화제 비용 절감이 가능하게 된다. 본 발명에 따른 효모 균주는 고농도의 숙신산에 대해 내성을 지녀, 고농도의 숙신산이 생산되는 환경에서도 세포 활성이 저하되지 않고 균주 생장이 가능하므로 숙신산을 상업적으로 생산시키를 것을 가능하게 한다.

본 발명에 있어서, 상기 숙신산을 생산하는 재조합 효모 균주는 알코올 생합성 경로를 차단하기 위한 안티센스 서열을 포함하는 벡터와 ATP-시트레이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 둘 이상의 벡터로 효모 세포에 도입하거나, 병합하여 하나의 벡터로 제조하여 효모 세포로 도입될 수 있다. 상기 알코올 생합성 경로에 관여하는 유전자가 2이상 사용되는 경우에 각각 별도의 벡터에 삽입되거나 하나의 벡터에 모두 삽입되어 효모 세포로 도입될 수 도 있다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기 천공법(electroporation), 리튬 아세테이트/DMSO 방법(Hill, J., et al., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19,5791) 등을 이용하여 실시한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 숙신산을 생산하는 재조합 효모 균주를 이용하여 숙신산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 효모 균주는 NaOH, KOH, NH₄OH, KHCO₃, K₂CO₃, NaHCO₃, Na₂CO₃, MgCO₃, CaCO₃, Ca(OH)₂ 등과 같은 염기(base), 중화제(neutralizer) 또는 탄산염(carbonate) 등이 포함되지 않은 최소배지(minimal media) 또는 복합배지(YPD media)를 이용하여 배양이 가능하다.

본 발명은 ATP-시트레이트 리아제 유전자를 도입하여 고농도 숙신산을 생산하는 균주를 개발함으로써 숙신산을 고농도 및 대량으로 생산할 수 있다. 또한 부산물인 에탄올 생합성 경로를 차단하여 추가적으로 숙신산의 생산 효율을 향상시킬 수 있다. 더욱이 산성 조건에서 숙신산을 생산하는 균주를 사용하여 중화제를 사용하지 않고부산물인 gypsum이 없는 (gypsum free) 숙신산 생산이 가능하므로 숙신산의 분리 및 정제공정이 간편하다.

도 1a 내지 1c는 실시예 2에 따라 제조된 K. marxianus 균주의 에탄올 핵심 유전자들에 대한 역주형 사슬 발현 벡터로서, 도 1a는 K. marxianus 균주의 pdc 유전자 역주형 사슬 발현 벡터 (pSVK_aPdc)이고, 도 1b는 K. marxianus 균주의 adh1 유전자 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK_aAdh1)이고, 도 1c는 K. marxianus 균주의 adh2 유전자 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK_aAdh2)이다.
도 2는 실시예 2에 따라 에탄올 핵심 유전자들에 대한 역주형 사슬을 발현하는 재조합 K. marxianus 균주의 숙신산 생산 결과를 나타낸다.
도 3는 실시예 2에 따라 에탄올 핵심 유전자들에 대한 역주형 사슬을 발현하는 내산성 재조합 K. marxianus 균주의 숙신산 생산 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4은 실시예 3에 따라 ATP-시트레이트 리아제 유전자들 AN2435.2와 AN2436.2 유전자들의 과발현 벡터 pSVK2-AnCiLy의 개열지도를 나타낸다.
도 5은 실시예 3에 따라 내산성 균주를 이용하여, 에탄올 핵심 유전자들에 대한 역주형 사슬 및 ATP-시트레이트 리아제 유전자를 발현하는 재조합 K. marxianus 균주의 숙신산 생산 결과를 나타낸다.

이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 이들에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 내산성 균주 선별

1.1 고체 배지에서의 고농도 숙신산 내산성 균주 선별

산성조건에서 숙신산 생산 균주를 개발하기 위해 고농도 숙신산에 대해 내산성을 갖는 균주를 선별하고자 하였다. 대상균주는 효모, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 그리고 고세균까지 포함하여 산성 미생물을 선정하였다.

숙신산이 각각 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160 g/l 로 포함된 YPD 고체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L, agar 15g/L)에 K. marxianus　KCCM11727 균주를 도말하여 30℃ 배양기에서 호기 조건과 혐기 조건 각각에서 3일간 배양하였으며, 숙신산 미첨가 배지와 고농도 숙신산이 첨가된 배지(pH 1 ~ 3)에서의 콜로니 형성 여부 및 생장 정도를 확인, 비교 하였다. 그 결과, K. marxianus　균주는 숙신산이 100 g/l 이상, 최대 160 g/l까지 포함된 고체 배지에서 생장이 가능함을 확인하였다. 숙신산이 포함된 고체 배지에서의 생장 여부를 하기 표 1에 나타냈다.

1-2. 액체 배지에서의 고농도 숙신산 내산성 균주 선별

산성조건의 액체배지에서 고농도 숙신산 내산성을 갖는 균주를 선별하고자 하였다. 대상 균주는 효모, 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 그리고 고세균까지 포함하여 산성 미생물을 선정하였다. 숙신산 20, 40, 60, 80, 100, 120 g/l 각각이 첨가된 YPD 액체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코오스 20g/L)에 선정된 균주들을 1%(vol/vol)씩 접종하여 30? 진탕배양기에서 호기 조건과 혐기 조건 각각에서 24시간 배양하였으며, 숙신산 미첨가 배지와 고농도 숙신산이 첨가된 배지(pH 1 ~ 3)에서의 생장 정도를 확인, 비교 하였다.

그 결과, 효모 K. marxianus　균주가 숙신산이 100 g/l 이상, 최대 160 g/l 까지 포함된 액체 배지에서 생장이 가능함을 확인하였다. 숙신산이 포함된 액체 배지에서의 생장 여부를 하기 표 2에 나타냈다.

상기 숙신산이 포함된 고체 배지와 액체 배지에서 생장결과에 따라, 숙신산이 160 g/l 존재하는 고체 배지 (pH 2 범위)에서 콜로니 형성 및 균체 생장이 가능한 동시에 숙신산이 160 g/l 존재하는 액체 배지 (pH 2 범위)에서도 생존과 생장이 가능할 뿐만 아니라 균체 생장이 활발한 균주 Kluyveromyces marxianus를 숙신산 내성 균주로 선별하였다.

< 실시예 2> 에탄올 생합성 경로 차단을 통한 숙신산 생산

2-1. pdc , adh1 , adh2 유전자에 대한 역주형 사슬 발현 벡터 제조

숙신산 생산을 증진시키기 위하여 안티센스 전사체 (antisense RNA) 방법을 이용하여 K. marxianus 균주 내 에탄올 생산 경로를 차단하였다. 즉, 에탄올 생합성 관련 유전자들의 역주형 사슬이 발현되도록 발현 벡터를 제작하고, K.marxianus에 도입하였다.

K. marxianus KCCM 11727 균주의 게놈은 다음과 같이 분리하였다. YPD 액체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L)에 균주를 1%(vol/vol)씩 접종하여 30℃ 진탕배양기에서 호기 조건에서 24시간 배양하여 균체를 회수한 다음, 게놈 분리, 정제 킷트(i-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit (INTRON Inc.))를 사용하여 제조사의 방법에 따라 게놈을 분리하였다.

상기 게놈에 대해 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 에탄올 생합성 핵심 유전자인 pdc(L09727.1: 서열번호 1), adh1(X60224.2: 서열번호 3) 및 adh2(AF225206.1: 서열번호 5) 유전자의 역주형 사슬을 PCR 증폭시켰다.

pdc 정방향 프라이머 (서열번호 11):

5'-AACCAAATTAATTAAATGTCTGAAATTACTCTAGGTCGTTA-3'

pdc 역방향 프라이머(서열번호 12):

5'- TGCTTCCATCAACGCCAAGCAAGAATAGTTAATTAAAGGATAA-3'

adh1 정방향 프라이머(서열번호 13):

5'- ATCATACTTAATTAAATGGCTATTCCAGAAACTCAAAAGGGT-3'

adh1 역방향 프라이머(서열번호 14):

5'- TAGAATTGTCGTTGACACTTCCAAATAATTAATTAAACCCTT-3'

adh2 정방향 프라이머(서열번호 15):

5'- ACAACCAACTTAATTAAATGTCTATTCCAACTACTCAAAAGGG-3'

adh2 역방향 프라이머(서열번호 16):

5'- GTAGATACGTTGTTGACACTTCCAAATAATTAATTAAACTAG-3'

상기 역주형 사슬 유전자들의 PCR 조건은 다음과 같다. PCR 증폭에 사용된 효소는 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (F-530L, Thermo Fisher Scientific Inc.)였으며, Phusion DNA Polymerase(0.02U/ul), Phusion HF Buffer(1x), dNTP(200mM), 그리고, 상기의 정방향 및 역방향 프라이머들(0.5 mM)과 K. marxianus KCCM 11727 게놈 유전체(약 20 ng)를 사용하였고, 다음과 같이 3단계를 거쳐 역주형 사슬 유전자들을 선택적으로 증폭하였다: 1단계에서 initial denaturation으로 98℃에서 30sec간 반응 한 다음, 2단계로 denaturation (98 ℃, 10sec), annealing (56℃, 30sec), extension(72℃, 30sec)의 3과정을 30싸이클 반복하였으며, 마지막 3단계로 final extension 반응을 72℃에서 7분간 진행하였다.

증폭된 각각의 역주형 사슬 유전자들을 제한효소 PacI으로 절단한 다음, 동일한 제한효소 PacI으로 절단된 pBS-SVK1 벡터에 클로닝하여 pBS-SVK1-aPdc, pBS- SVK1-aAdh1, 그리고 pBS-SVK1-aAdh2 벡터를 제작하였다. 그런 다음, NotI 제한 효소로 각 벡터를 절단하여 프로모터와 터미네이터를 포함하는 pdc, adh1, adh2 유전자에 대한 역주형 사슬 유전자들을 각각 회수한 다음, 동일한 제한 효소 NotI으로 절단된 K. marxianus 셔틀 벡터 pSVK 벡터에 각각 클로닝하였다 (도 1a 내지 도 1c).

도 1a 내지 도 1c는 K. marxianus 균주의 에탄올 핵심 유전자들에 대한 역주형 사슬 발현 벡터로서 도 1a는 pdc 유전자 역주형 사슬 발현 벡터 (pSVK_aPdc), 도 1b는 adh1 유전자 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK_aAdh1), 도 1c는 adh2 유전자 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK_aAdh2)의 개열지도를 나타낸다.

본 발명에서 사용한 pBS-SVK1 벡터는 K. marxianus 균주의 유전자 발현용 벡터로서, 공지된 방법(Ball et al ., 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (1999) 1(2): 347-353; Yamanishi et al ., 2011. Biosci. Biotechnol. Biochem, 75(11), 2234-2236, 2011)에 따라 제조하였다. 즉, K. marxianus 균주의 pcpl3 유전자(purinecytosine-like permease gene)의 프로모터(promoter)와 tps1 유전자(trehalose phosphate synthesis gene)의 터미네이터(terminator)가 pBluescript II 벡터(Stratagene)에 EcoRV 자리와 제한효소 HincII 자리 각각에 클로닝하였다 본 발명에서는 pBS-SVK1 벡터의 pcpl3 유전자 프로모터와 tps1 유전자 터미네이터 중간에 역주형 사슬 유전자들이 존재하도록 함으로써 역주형 사슬 유전자들을 과발현할 수 있도록 하였다.

또한, 본 발명에 사용한 pSVK 셔틀 벡터는 E. coli 균주와 K. marxianus 균주 모두에서 복제가 가능한 셔틀 벡터로서, K. marxianus 균주의 복제 원 점(replication origin)인 KMARS1+Centromere A 유전자(Kmori 1)를 공지된 방법으로 제조한 다음 (Ball et al ., 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (1999) 1(2):347-353) SspI으로 절단된 pBluescript II 벡터(Stratagene)에 클로닝하여 제작하였다.

2-2. K. marxianus 로의 형질전환

상기 도 3의 pdc, adh1 및 adh2 유전자 각각에 대한 역주형 사슬 발현 벡터를 실시예 1의 숙신산 내성 균주인 K. marxianus KCCM 11727 균주에 LiAc(lithium acetate)를 이용한 형질 전환 방법(Nonklang et al., 2008)에 따라 각각 형질 전환하여 도입하였다. 발현 벡터들이 도입된 형질 전환체들은 geneticin (100mg/ml, Sigma-Aldrich)과 숙신산 (100g/l)이 포함된 YPD 고체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L, agar 15g/L) 에서 30℃ 배양기에서 3일 동안 배양하여 생장하는 콜로니들을 1차적으로 선별한 다음, geneticin (100mg/ml, Sigma-Aldrich)이 포함된 YPD 액체 배지에 접종 및 배양하여 발현 벡터 및 역주형 사슬 유전자 유무 등을 확인하여 형질전환체로 최종 확인하였다.

2-3. 형질전환체의 숙신산 생성 확인

형질 전환체들의 숙신산 생성 확인은 기질인 포도당(2%)이 포함된 YNB(Yeast Nitrogen Base) 배지(Sigma-Aldrich)에서 실시하였으며, 플라스크(flask)에서 호기조건으로 배양하면서 숙신산 생산을 확인하였다. 형질 전환체들을 시험관(5ml)에서 12시간 배양 한 다음, 플라스크(250ml)에 1%(vol/vol) 부피를 접종하여 30?에서 150rpm으로 12시간 동안 배양 하였으며, 배양액(10ml)을 10분간 원심분리(12,000 rpm, 4?)하여 세포를 제거 한 후 얻어진 상등액으로부터 숙신산 생산 여부를 확인하였다. 포도당과 생산된 숙신산은 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 공지된 분석 방법에 따라 확인하였다(Eiteman and Chastain, 1997).

그 결과, pdc 유전자의 역주형 사슬 발현 K. marxianus 균주(Km004SA)로부터 숙신산 1.44 g/l, adh1 유전자의 역주형 사슬 발현 K. marxianus 균주 (Km005SB)로부터 0.83 g/l, 그리고 adh2 유전자의 역주형 사슬 발현 K. marxianus 균주 (Km006SE)로부터 1.38 g/l 숙신산을 생산하였다(도 2). 반면, 야생형 균주나 발현 벡터만 도입된 K. marxianus 균주 (Km002SB)에서는 숙신산이 거의 생성되지 않았다.

< 실시예 3> ATP - 시트레이트 리아제 유전자 도입을 통한 숙신산 생산

K. marxianus 균주에서 citrate를 이용해서 oxaloacetate 경로를 증폭함으로써 숙신산 생산을 촉진시키고자, 즉 호기적 조건에서 숙신산 생산을 촉진시키기 위해 외래 ATP-시트레이트 리아제 유전자들을 도입 및 과발현시켰다. Aspergillus nidulans KCCM 60342 균주로부터 ATP-시트레이트 리아제 유전자들(AN2435.2와 AN2436.2)을 PCR 증폭하여 K. marxianus 발현 벡터에 클로닝한 다음, 고농도 숙신산에 내산성을 갖는 K. marxianus 균주에 도입하여 숙신산 생산 여부를 확인하였다.

3-1. ATP - 시트레이트 리아제 유전자의 발현 벡터 제조

ATP-시트레이트 리아제 효소을 코딩하는 유전자을 발현 벡터에 클로닝하여, ATP-시트레이트 리아제 유전자들이 과발현되는 K. marxianus 균주를 제작하여 숙신산 생산 여부를 시험하였다.

Aspergillus nidulans KCCM 60342 균주의 게놈은 다음과 같이 분리하여 사용하였다. YPD 액체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L)에 균주를 1%(vol/vol)씩 접종하여 30℃ 진탕배양기에서 호기 조건에서 24시간 배양하여 균체를 회수한 다음, 게놈 분리, 정제 킷트(i-genomic BYF DNA Extraction Mini Kit (INTRON Inc.))를 사용하여 제조사의 방법에 따라 게놈을 분리하였다. 상기 게놈에 대하여 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 ATP-시트레이트 리아제 유전자들인 AN2435.2 유전자(acl1, ATP-시트레이트 리아제 subunit 1 gene)와 AN2436.2 유전자(acl2, ATP-시트레이트 리아제 subunit 2 gene) 각각을 다음과 같은 프라이머들을 이용하여 PCR 증폭시켰다.

정방향 프라이머 1 (AN2435.2 유전자 증폭)(서열번호 17)

5'-CACACACATTAATTAAATGTCCGCCAAGTCGATTTTCGAGG-3'

역방향 프라이머 2 (AN2435.2 유전자 증폭) (서열번호 18)

5'-GCCTTAATTAAGTTTACGCAGTACCAAACTCCTTGATA-3'

정방향 프라이머 3 (AN2436.2 유전자 증폭) (서열번호 19)

5'- AGAGTACCTTAATTAAATGCCTGCCGCTCCTCTTGTCAGCAC-3'

역방향 프라이머 4 (AN2436.2 유전자 증폭) (서열번호 20)

5'- TCAGAGGATTAATTAAAAATTATACGTTGACCTCAACACGAC-3'

상기 PCR의 조건은 다음과 같다. PCR 증폭에 사용된 효소는 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (F-530L, Thermo Fisher Scientific Inc.)였으며, Phusion DNA Polymerase(0.02U/ul), Phusion HF Buffer(1x), dNTP(200 mM), 그리고, 상기의 정방향 및 역방향 프라이머들(0.5 mM)과 A. nidulans KCCM 60342 게놈 유전체(약 20 ng)를 사용하였고, 다음과 같이 3단계를 거쳐 역주형 사슬 유전자들을 선택적으로 증폭하였다: 1단계에서 initial denaturation으로 98℃에서 30sec간 반응 한 다음, 2단계로 denaturation (98℃, 10sec), annealing (60℃, 30sec), extension(72℃, 1min)의 3과정을 30 싸이클 반복하였으며, 마지막 3단계로 final extension 반응을 72℃에서 7분간 진행하였다.

증폭된 AN2435.2 유전자를 제한효소 PacI으로 절단한 다음, 동일한 제한효소 PacI으로 절단된 pBS-SVK2 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음, 프로모터와 터미네이터를 포함하는 AN2435.2 유전자를 포함하도록 pBS-SVK2를 SacII와 NotI으로 절단하여 회수한 다음, 동일한 제한 효소 SacII와 NotI으로 절단된 K. marxianus 발현 벡터 pSVK2 벡터 클로닝하여 pSVK2-An2435.2를 제작하였다.

본 발명에서 사용한 pBS-SVK2 벡터는 K. marxianus 균주의 유전자 발현용 벡터로서, 공지된 방법(Ball et al ., 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (1999) 1(2): 347-353; Yamanishi et al ., 2011. Biosci. Biotechnol. Biochem, 75(11), 2234-2236, 2011)에 따라 제조하였다. 즉, K. marxianus 균주의 pcpl3 유전자(purinecytosine-like permease gene)의 프로모터(promoter)와 tps1 유전자(trehalose phosphate synthesis gene)의 터미네이터(terminator)가 pBluescript II 벡터(Stratagene)에 EcoRV 자리와 제한효소 HincII 자리 각각에 클로닝하였다 본 실시예에서는 pBS-SVK1 벡터의 pcpl3 유전자 프로모터와 tps1 유전자 터미네이터 중간에 역주형 사슬 유전자들이 존재하도록 함으로써 AN2435.2 유전자를 과발현할 수 있도록 하였다.

또한, 본 실시예에서 사용한 pSVK2 셔틀 벡터는 E. coli 균주와 K. marxianus 균주 모두에서 복제가 가능한 벡터로 제작, 보유한 셔틀 벡터이며, 공지된 방법(Ball et al ., 1999. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (1999) 1(2): 347-353)에 따라 K. marxianus 균주의 복제 원점(replication origin)으로 보고된 KMARS2 유전자(Kmori 2)를 pBluescript II 벡터(Stratagene)의 제한효소 SspI 자리에 클로닝하여 제작하였다.

다음으로, 증폭된 AN2436.2 유전자도 제한효소 PacI으로 절단하여, 동일한 제한효소 PacI으로 절단된 pBS-SVK3 벡터에 클로닝하였다. 그런 다음, 프로모터와 터미네이터를 포함하는 AN2436.2 유전자를 제한효소 NotI와 SpeI으로 절단하여 회수한 다음, 동일한 제한 효소 NotI과 SpeI으로 절단된 AN2435.2 유전자가 클로닝된 K. marxianus 발현 벡터 pSVK2-An2435.2 벡터에 클로닝하여 ATP-시트레이트 리아제 유전자들의 과발현 셔틀 벡터인 pSVK2-AnCiLy 벡터를 제작하였다(도 3). 도 3은 ATP-시트레이트 리아제 유전자들 AN2435.2와 AN2436.2 유전자들의 과발현 벡터(pSVK2-AnCiLy)의 개열지도이다 (도 3).

본 발명에서 사용한 pBS-SVK3 벡터는 K. marxianus 균주의 유전자 발현용으로 제작, 보유한 벡터로써, 공지된 방법(Ball et al., 1997, Yamanishi et al., 2011)에 따라, K. marxianus 균주의 tps1 유전자(trehalose phosphate synthesis gene)의 프로모터(promoter) 부위와 tps1 유전자(trehalose phosphate synthesis gene)의 터미네이터(terminator) 부위를 pBluescript II 벡터(Stratagene)의 제한효소 EcoRV 자리와 제한효소 HincII 자리 각각에 클로닝하여 제작된 벡터이다. 본 발명에서는 pBS-SVK3 벡터의 tps1 유전자 프로모터와 tps1 유전자 터미네이터 중간에 AN2436.2 유전자가 존재하도록 함으로써 AN2436.2 유전자가 과발현할 수 있도록 하였다.

3-2. 내산성 K. marxianus 로의 형질전환

상기 3-1의 ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터 pSVK2-AnCiLy를 실시예 1의 숙신산 내성 균주인 K. marxianus KCCM 11727 균주에 LiAc(lithium acetate)를 이용한 형질 전환 방법(Nonklang et al., 2008)에 따라 각각 형질 전환하여 도입하였다.

발현 벡터들이 도입된 형질 전환체들은 geneticin (100 mg/ml, Sigma-Aldrich)과 숙신산 (100 g/l)이 포함된 YPD 고체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L, agar 15g/L)에서 30? 배양기에서 3일 동안 배양하여 생장하는 콜로니들을 1차적으로 선별한 다음, geneticin (100 mg/ml, Sigma-Aldrich)이 포함된 YPD 액체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L)에 접종 및 배양하여 발현 벡터 및 ATP-시트레이트 리아제 유전자(AN2435.2와 AN2436.2) 유무 등을 확인하여 ATP-시트레이트 리아제 발현 형질 전환체인 K. marxianus KmES14.1 균주를 최종 확인하였다.

3-3. 내산성 및 에탄올 생합성 경로 차단된 K. marxianus 로의 형질전환

실시예2의 에탄올 핵심 유전자들의 역주형 사슬이 과발현되는 3개의 벡터 pSVK-aPdc, pSVK-aAdh1, pSVK-aAdh2 각각과 상기 3-1의 ATP-시트레이트 리아제 유전자들이 과발현되는 벡터 pSVK2-AnCiLy를 조합하여 K. marxianus 균주에 LiAc(lithium acetate)를 이용한 형질 전환 방법(Nonklang et al., 2008)에 따라 각각 형질 전환하여 도입하였다.

발현 벡터들이 도입된 형질 전환체들은 geneticin (100 mg/ml, Sigma-Aldrich)과 숙신산 (100 g/l)이 포함된 YPD 고체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L, agar 15g/L)에서 30? 배양기에서 3일 동안 배양하여 생장하는 콜로니들을 1차적으로 선별한 다음, geneticin (100 mg/ml, Sigma-Aldrich)이 포함된 YPD 액체 배지(박테리아성 펩톤 20g/L, yeast extract 10g/L, 글루코스 20g/L)에 접종 및 배양하여 발현 벡터 및 역주형 사슬 유전자 유무 등을 확인하였다.

그 결과, ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터(pSVK2-AnCiLy)와 pdc 유전자의 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK-aPdc)의 형질 전환체인 K. marxianus Km010SC.7 균주, ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터(pSVK2-AnCiLy)와 adh1 유전자의 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK-aAdh1)의 형질 전환체인 K. marxianus Km011SD.1 균주, 그리고 ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터(pSVK2-AnCiLy)와 adh2 유전자의 역주형 사슬 발현 벡터(pSVK-aAdh2)의 형질 전환체인 K. marxianus Km012S3.5 균주를 최종 확인하였다. 상기 결과를 하기 표 1에 정리하였다.

3-4. 형질전환체의 숙신산 생성 확인

상기 3-2 및 3-3에서 제조된 형질전환체의 숙신산 생성을 확인하고자, ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터가 형질 전환된 균주들의 숙신산 생성 확인은 기질인 포도당(2%)이 포함된 YNB(Yeast Nitrogen Base) 배지(Sigma-Aldrich)에서 실시하였으며, 플라스크(flask)에서 호기조건으로 배양하면서 숙신산 생산을 확인하였다. 형질 전환체들을 시험관(5ml)에서 12시간 배양 한 다음, 플라스크(250ml)에 1%(vol/vol) 부피를 접종하여 30?에서 150rpm으로 12시간 동안 배양 하였으며, 배양액(10ml)을 10분간 원심분리(12,000 rpm, 4?)하여 세포를 제거 한 후 얻어진 상등액으로부터 숙신산 생산 여부를 확인하였다. 포도당과 생산된 숙신산은 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 공지된 분석 방법에 따라 확인하였다(Eiteman and Chastain, 1997).

상기 실시예 3-2에서 얻어진, 숙신산 내성 균주에 ATP-시트레이트 리아제 유전자를 발현하는 K. marxianus 균주 (KmES14.1)로부터 숙신산 3.27 g/l를 확인하였다. 반면, 야생형 K. marxianus 균주와 K. marxianus Km003SC(pSVK2 벡터만 포함) 균주 그리고 K. marxianus Km013SA(pSVK 벡터와 pSVK2 벡터만 포함) 균주에서는 숙신산이 거의 생성되지 않았다.

상기 실시예 3-3에서 얻어진, ATP-시트레이트 리아제 발현 벡터를 에탄올 생합성 핵심 유전자들의 역주형 사슬 발현 균주에 도입한 형질전환체들의 경우, pdc 유전자 역주형 사슬과 ATP-시트레이트 리아제 유전자가 모두 발현되는 균주 K. marxianus 균주 (Km010SC.7)로부터 숙신산 6.24 g/l, adh1 유전자의 역주형 사슬과 ATP-시트레이트 리아제 발현 K. marxianus 균주 (Km011SD.1)로부터 숙신산 3.76 g/l, 그리고 adh2 유전자의 역주형 사슬 및 ATP-시트레이트 리아제 발현 균주 K. marxianus 균주 (Km012S3.5)로부터 숙신산 4.45 g/l을 생산하였다(도 5). 반면, 야생형 K. marxianus 균주와 K. marxianus Km002SB(pSVK 벡터만 포함) 균주에서는 숙신산이 거의 생성되지 않았다. 실험결과를 하기 표 3에 나타냈다.

균주명	숙신산 내성	ATP-citrate lyase	Adh	Pdc	숙신산 생성량(g/L)
야생형 K. marxianus 균주 (WT)	X	X	X	X	-
K. marxianus Km004SA	O	X	X	O	1.44
K. marxianus Km005SB	O	X	O-adh1	X	0.83
K. marxianus Km006SE	O	X	O-adh2	X	1.38
K. marxianus Km003SC (pSVK2 벡터만 포함)	O	X	X	X	-
K. marxianus Km002SB (pSVK 벡터만 포함)	O	X	X	X	-
K. marxianus Km013SA (pSVK와 pSVK2 벡터만 포함)	O	X	X	X	-
K. marxianus KmES14.1 (pSVK2-AnCiLy 벡터만 포함)	O	O	X	X	3.27
K. marxianus Km010SC.7	O	O	X	O	6.24
K. marxianus Km011SD.1	O	O	O-adh1	X	3.76
K. marxianus Km012S3.5	O	O	O-adh2	X	4.45

<110> SAMSUNG PETROCHEMICAL CO., LTD. <120> RECOMBINANT YEAST FOR PRODUCING SUCCINIC ACID AND PRODUCTION METHOD OF SUCCINIC ACID USING THE SAME <130> DPP20128840KR <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1695 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus <400> 1 atgtctgaaa ttactctagg tcgttacttg ttcgaaagat taaagcaagt cgaggtccaa 60 accatcttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccctat tggacaagat ctacgaagtc 120 ccaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcttacgc tgctgatggt 180 tacgccagat taaagggtat ggcctgtgtc atcaccacct tcggtgttgg tgaattgtct 240 gccttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgttg gtgttttgca cgttgttggt 300 gttccatcca tctcttccca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtcttcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacatcaaca gtgctccatc tgaaatcgac agatgtatca gaactaccta catctctcaa 480 agaccagttt acttgggttt gccagctaac ttggttgacc tgaaggttcc agcttctcta 540 ttggaaaccc caattgactt gagcttgaag ccaaacgacc cagaagctga aaacgaagtt 600 ctagaaaccg ttttggaatt gatcaaggac gccaagaacc cagttatctt ggccgatgct 660 tgttgttcca gacacaacgt taaggctgaa accaagaagt tgattgacat cactcaattc 720 ccagccttcg ttaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagattcggt 780 ggtgtctacg tcggtacctt gtcttctcca gaagttaagg aagctgttga atccgctgac 840 ttggttctat ctgtcggtgc tctattgtcc gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgactaca tcaaggtcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa gttcgtcttg caaaagttgt tgaccaaggt caaggatgct 1020 gctaagggtt acaagccagt tccagttcct cacgctccaa gagacaacaa gccagttgct 1080 gactctactc cattgaagca agaatgggtc tggactcaag tcggtaagtt cctacaagaa 1140 ggtgatgttg ttctaactga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aacccacttc 1200 ccaaatgaca cctacggtat ctcccaagtc ttgtggggtt ccattggttt caccggtggt 1260 gctactctag gtgctgcttt cgctgctgaa gaaatcgatc caaagaagag agttatcttg 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gtccaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggtttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aagattgatt 1440 cacggtgaaa ccgctcaata caactgtatc caatcttgga agcacttgga cctattgcca 1500 accttcggtg ccaaggacta cgaagccgtc agagtcgcca ccactggtga atggaacaag 1560 ttgaccactg acaagaagtt ccaagaaaac tctaagatca gattgatcga agtcatgttg 1620 ccagtcatgg atgctccatc caacttggtc aagcaagctc aattgactgc ttccatcaac 1680 gccaagcaag aatag 1695 <210> 2 <211> 564 <212> PRT <213> Kluyveromyces marxianus <400> 2 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Glu Val Gln Thr Ile Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Pro Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Leu 50 55 60 Lys Gly Met Ala Cys Val Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ser Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Asn Ser 130 135 140 Ala Pro Ser Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Ile Ser Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Lys Val 165 170 175 Pro Ala Ser Leu Leu Glu Thr Pro Ile Asp Leu Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Pro Glu Ala Glu Asn Glu Val Leu Glu Thr Val Leu Glu Leu Ile 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asn Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Ile Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Phe Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Ser Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Val Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp Tyr Ile Lys Val Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Lys 325 330 335 Val Lys Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Pro Val Pro His Ala 340 345 350 Pro Arg Asp Asn Lys Pro Val Ala Asp Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Val Trp Thr Gln Val Gly Lys Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Leu Thr Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr His Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asp Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Gly Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Arg Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Glu Thr Ala Gln Tyr Asn Cys Ile Gln Ser Trp Lys His Leu 485 490 495 Asp Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Ala Val Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asn Lys Leu Thr Thr Asp Lys Lys Phe Gln 515 520 525 Glu Asn Ser Lys Ile Arg Leu Ile Glu Val Met Leu Pro Val Met Asp 530 535 540 Ala Pro Ser Asn Leu Val Lys Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ser Ile Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln Glu <210> 3 <211> 1047 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus <400> 3 atggctattc cagaaactca aaagggtgtt atcttctacg aacacggtgg tgagttgcaa 60 tacaaggaca ttccagttcc aaagccaaag ccaaatgaac ttttgatcaa cgttaagtac 120 tctggtgtgt gtcacaccga tttgcacgca tggcaaggtg actggccatt ggacaccaag 180 ttgccattgg tcggtggtca cgaaggtgct ggtattgttg ttgccatggg tgagaacgtt 240 actgggtggg aaatcggtga ctatgctggt atcaagtggt tgaacggttc ctgtatgtct 300 tgtgaggagt gtgagttgtc gaacgaacca aactgtccaa aggccgactt gtctggttac 360 actcacgacg gttctttcca acaatacgct accgctgacg ctgtgcaggc tgccagaatt 420 ccaaagaacg tcgacttggc cgaggttgcc ccaatcttgt gtgccggtgt taccgtgtac 480 aaggctttga agtctgccca catcaaggct ggtgactggg tcgccatctc cggtgcatgt 540 ggtggtctag gttccttggc catccaatac gccaaggcta tgggttacag agtgctaggt 600 atcgatgctg gtgacgaaaa ggccaaattg ttcaaggaat tgggcggtga atacttcatc 660 gacttcacca agaccaagga catggtagca gaagtcattg aggccaccaa tggtgtggcc 720 cacgctgtca ttaacgtgtc tgtgtccgaa gccgccatct ctacctctgt cttgtacacc 780 agatcaaacg gtaccgtcgt cttggtcggt ttgccaagag acgcccaatg taagtctgat 840 gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatctcc attgttggtt cttacgttgg taacagagca 900 gacaccagag aagccctaga cttcttctcc agaggtttgg tcaaggctcc aattaagatt 960 ctcggcttgt ctgaattggc atccgtttac gacaagatgg tcaagggcca aatcgttggt 1020 agaattgtcg ttgacacttc caaataa 1047 <210> 4 <211> 348 <212> PRT <213> Kluyveromyces marxianus <400> 4 Met Ala Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu His Gly 1 5 10 15 Gly Glu Leu Gln Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Pro Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp Gln Gly Asp Trp Pro Leu Asp Thr Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Val Ala Met Gly Glu Asn Val 65 70 75 80 Thr Gly Trp Glu Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Ser Cys Glu Glu Cys Glu Leu Ser Asn Glu Pro Asn Cys 100 105 110 Pro Lys Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln 115 120 125 Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala Arg Ile Pro Lys Asn Val 130 135 140 Asp Leu Ala Glu Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Leu Lys Ser Ala His Ile Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Ala Cys Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Ile Gln Tyr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Ala Gly Asp Glu Lys Ala 195 200 205 Lys Leu Phe Lys Glu Leu Gly Gly Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Thr Lys 210 215 220 Thr Lys Asp Met Val Ala Glu Val Ile Glu Ala Thr Asn Gly Val Ala 225 230 235 240 His Ala Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Ser Thr Ser 245 250 255 Val Leu Tyr Thr Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro 260 265 270 Arg Asp Ala Gln Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser 275 280 285 Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu 290 295 300 Ala Leu Asp Phe Phe Ser Arg Gly Leu Val Lys Ala Pro Ile Lys Ile 305 310 315 320 Leu Gly Leu Ser Glu Leu Ala Ser Val Tyr Asp Lys Met Val Lys Gly 325 330 335 Gln Ile Val Gly Arg Ile Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 5 <211> 1047 <212> DNA <213> Kluyveromyces marxianus <400> 5 atgtctattc caactactca aaagggtgtt atcttctacg aaaacggtgg tcaattgtac 60 tacaaggaca tcccagtccc aaagccaaag tctaacgaac ttttgatcaa cgttaagtac 120 tccggtgtct gccacaccga tttgcacgcc tggaagggtg actggccatt ggacaccaag 180 ttgccattgg tcggtggtca cgaaggtgcc ggtgtcgtcg tcgccatggg tgacaatgtc 240 aagggctgga agatcggtga ccttgccggt atcaaatggt tgaacggttc ttgtatgaac 300 tgtgaagaat gtgaattgtc caacgaatcc aactgtccag acgctgactt gtccggttac 360 acccacgacg gttctttcca acaatacgct actgctgacg ctgtccaagc cgctcacatc 420 ccagctggta ccgacttggc tcaagtcgcc ccaatcttgt gtgccggtgt taccgtctac 480 aaggctttga agaccgctga aatgaaggct ggtgactggg tcgccatctc cggtgctgct 540 ggtggtctag gttccttggc cgtccaatac gccaaggcca tgggtttcag agtcctaggt 600 atcgatggtg gtgaaggtaa ggaagaattg ttcaagagct tgggtggtga agtcttcatt 660 gacttcacca agtctaagga cattgtcggt gaagtcatca aggctaccaa cggtggtgct 720 cacggtgtca tcaacgtctc cgtctccgaa aaggccatcg aatcctccat cgaatactgt 780 agatccaacg gtaccgtcgt tctagtcggt ttgccaaagg atgctaagtg taagtccgat 840 gtcttcaacc aagtcgtcaa gtccatccac atcgttggtt cttacgtcgg taacagagct 900 gacaccagag aagctcttga cttcttctgc agaggtctag tcaacgcccc aatcaaggtt 960 gtcggtttgt ccaccttgcc agaaatttac gaaaagatgg aacaaggtaa ggttctaggt 1020 agatacgttg ttgacacttc caaataa 1047 <210> 6 <211> 348 <212> PRT <213> Kluyveromyces marxianus <400> 6 Met Ser Ile Pro Thr Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Asn Gly 1 5 10 15 Gly Gln Leu Tyr Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ser Asn 20 25 30 Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu 35 40 45 His Ala Trp Lys Gly Asp Trp Pro Leu Asp Thr Lys Leu Pro Leu Val 50 55 60 Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Ala Met Gly Asp Asn Val 65 70 75 80 Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Leu Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Ser Cys Met Asn Cys Glu Glu Cys Glu Leu Ser Asn Glu Ser Asn Cys 100 105 110 Pro Asp Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln 115 120 125 Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Ala Gly Thr 130 135 140 Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr 145 150 155 160 Lys Ala Leu Lys Thr Ala Glu Met Lys Ala Gly Asp Trp Val Ala Ile 165 170 175 Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys 180 185 190 Ala Met Gly Phe Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu 195 200 205 Glu Leu Phe Lys Ser Leu Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys 210 215 220 Ser Lys Asp Ile Val Gly Glu Val Ile Lys Ala Thr Asn Gly Gly Ala 225 230 235 240 His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Lys Ala Ile Glu Ser Ser 245 250 255 Ile Glu Tyr Cys Arg Ser Asn Gly Thr Val Val Leu Val Gly Leu Pro 260 265 270 Lys Asp Ala Lys Cys Lys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser 275 280 285 Ile His Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu 290 295 300 Ala Leu Asp Phe Phe Cys Arg Gly Leu Val Asn Ala Pro Ile Lys Val 305 310 315 320 Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Gln Gly 325 330 335 Lys Val Leu Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys 340 345 <210> 7 <211> 1515 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP:Citrate lyase AN2435.2 <400> 7 atgtccgcca agtcgatttt cgaggccgat ggcaaggcca tcctcaacta ccacctcact 60 cgcgcccccg tcatcaagcc gactcctctc cccccttcca acactcacaa ccctcctccc 120 aagctcgcct ccctctactt ccccgacgac ctttccgtga aggacgttct cgaccaggcg 180 gaggttacat acccatggct gctgaccccc ggatccaagt tcgtggctaa gccagaccaa 240 ttgatcaagc gacgaggcaa gagcggtctg ctcgcgctga acaagacttg ggctgaagcc 300 agagaatgga tcgaggctcg tgctacgaag gaacaacagg ttgagaccgt tgttggtgtt 360 ctccgccatt tcctcgttga gcccttcgtt cctcaccccc aggagaccga gtactacatc 420 aacattcact ccgtgcgtga ggtaaggaac attcttccgc actttctgaa actacgttca 480 tagtctaact tttcttaggg tgactggatc ctcttcaccc acgagggtgg tgtcgatgtt 540 ggtgacgttg atgctaaagc agagaagctt ttgatccccg tcaaccttaa gaactacccc 600 tccaacgagg aaatcgcttc cgcacttctc agcaaagttc ccaagggcat tcacaacgtc 660 ttggttgact ttatttctcg tctctacgct gtctacgttg actgccagtt cacctacctt 720 gagatcaacc ctctcgttgt catccccaac gccgatgcta cttctgccga cgtccacttc 780 cttgacttgg ctgccaagct tgaccagact gctgagttcg agtgcggtac caagtgggct 840 gttgctcgta gcccggctaa ccttggcctg gccgctcttc ccacatccga caaggtcaac 900 attgatgccg gtcctcccat ggagttcccc gctcctttcg gacgtgaatt gagcaaggag 960 gagaagttca tctcagacat ggatgccaag actggtgcct ctcttaagct cactgtcctg 1020 aaccccaacg gccgtgtctg gactctcgtc gctggtggtg gtgcctccgt cgtctacgcg 1080 gacgccattg cttccgctgg tttcgttagc gagctcgcca actacggtga atactccggt 1140 gctcccactg agactcagac tttcaactac gcccgcacca ttctcgacct gatgctgcgc 1200 tctcccatcc accccgacgg caaggtcctc tttatcggtg gtggtattgc caacttcacc 1260 aacgtcgctt ccactttcaa gggtgtcatt cgcgcccttc gagaggttgc ccccgttctg 1320 aacgaacaca aggtccagat ctgggtgcgc cgtgccggtc ccaactacca ggagggtctc 1380 aagaacatca aggctgtcgg tgaagaactc ggcctcaaca tgcacgtata cgggcctgaa 1440 atgcacgtca gtggtatcgt gcctcttgcc ctccaaggca aacaaactga tatcaaggag 1500 tttggtactg cgtaa 1515 <210> 8 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP:Citrate lyase AN2435.2 <400> 8 Met Ser Ala Lys Ser Ile Phe Glu Ala Asp Gly Lys Ala Ile Leu Asn 1 5 10 15 Tyr His Leu Thr Arg Ala Pro Val Ile Lys Pro Thr Pro Leu Pro Pro 20 25 30 Ser Asn Thr His Asn Pro Pro Pro Lys Leu Ala Ser Leu Tyr Phe Pro 35 40 45 Asp Asp Leu Ser Val Lys Asp Val Leu Asp Gln Ala Glu Val Thr Tyr 50 55 60 Pro Trp Leu Leu Thr Pro Gly Ser Lys Phe Val Ala Lys Pro Asp Gln 65 70 75 80 Leu Ile Lys Arg Arg Gly Lys Ser Gly Leu Leu Ala Leu Asn Lys Thr 85 90 95 Trp Ala Glu Ala Arg Glu Trp Ile Glu Ala Arg Ala Thr Lys Glu Gln 100 105 110 Gln Val Glu Thr Val Val Gly Val Leu Arg His Phe Leu Val Glu Pro 115 120 125 Phe Val Pro His Pro Gln Glu Thr Glu Tyr Tyr Ile Asn Ile His Ser 130 135 140 Val Arg Glu Gly Asp Trp Ile Leu Phe Thr His Glu Gly Gly Val Asp 145 150 155 160 Val Gly Asp Val Asp Ala Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ile Pro Val Asn 165 170 175 Leu Lys Asn Tyr Pro Ser Asn Glu Glu Ile Ala Ser Ala Leu Leu Ser 180 185 190 Lys Val Pro Lys Gly Ile His Asn Val Leu Val Asp Phe Ile Ser Arg 195 200 205 Leu Tyr Ala Val Tyr Val Asp Cys Gln Phe Thr Tyr Leu Glu Ile Asn 210 215 220 Pro Leu Val Val Ile Pro Asn Ala Asp Ala Thr Ser Ala Asp Val His 225 230 235 240 Phe Leu Asp Leu Ala Ala Lys Leu Asp Gln Thr Ala Glu Phe Glu Cys 245 250 255 Gly Thr Lys Trp Ala Val Ala Arg Ser Pro Ala Asn Leu Gly Leu Ala 260 265 270 Ala Leu Pro Thr Ser Asp Lys Val Asn Ile Asp Ala Gly Pro Pro Met 275 280 285 Glu Phe Pro Ala Pro Phe Gly Arg Glu Leu Ser Lys Glu Glu Lys Phe 290 295 300 Ile Ser Asp Met Asp Ala Lys Thr Gly Ala Ser Leu Lys Leu Thr Val 305 310 315 320 Leu Asn Pro Asn Gly Arg Val Trp Thr Leu Val Ala Gly Gly Gly Ala 325 330 335 Ser Val Val Tyr Ala Asp Ala Ile Ala Ser Ala Gly Phe Val Ser Glu 340 345 350 Leu Ala Asn Tyr Gly Glu Tyr Ser Gly Ala Pro Thr Glu Thr Gln Thr 355 360 365 Phe Asn Tyr Ala Arg Thr Ile Leu Asp Leu Met Leu Arg Ser Pro Ile 370 375 380 His Pro Asp Gly Lys Val Leu Phe Ile Gly Gly Gly Ile Ala Asn Phe 385 390 395 400 Thr Asn Val Ala Ser Thr Phe Lys Gly Val Ile Arg Ala Leu Arg Glu 405 410 415 Val Ala Pro Val Leu Asn Glu His Lys Val Gln Ile Trp Val Arg Arg 420 425 430 Ala Gly Pro Asn Tyr Gln Glu Gly Leu Lys Asn Ile Lys Ala Val Gly 435 440 445 Glu Glu Leu Gly Leu Asn Met His Val Tyr Gly Pro Glu Met His Val 450 455 460 Ser Gly Ile Val Pro Leu Ala Leu Gln Gly Lys Gln Thr Asp Ile Lys 465 470 475 480 Glu Phe Gly Thr Ala 485 <210> 9 <211> 2194 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP:Citrate lyase AN2436.2 <400> 9 atgcctgccg ctcctcttgt cagcactgcc aacggcccta acgccaacga taacatcact 60 cgcttcgagc ctcccagccg agtgcgctct cccttcgccg atgccctctt ccacaacaag 120 acaagatgtt tcgtatagtg agtggaatgc gatcctgggt agtcaattgc ataaactgac 180 ggcaatcata gcggtatgca gccccgggct gtccagggta tgctggattt cgacttcatc 240 tgcaagcgtt ccactccttc cgttgccggt atcatctaca cattcggcgg tcaattcgtc 300 agcaagatgt aggttgcata tacaaggatc gatgctggtt catacagctg acaatatgtc 360 cgtaggtact ggggtaccag tgaaaccctc ctccctgttt accaggacac cgcaaaggcc 420 atggccaagc accccgacgt tgacaccgtt gtcaacttcg cctcttcccg ttccgtctac 480 agctctacta tggagctgat gcagtaccct cagatcaaat gcattgccat cattgcagag 540 ggtgttccag aaagggtatg tgagctgtgt gctgcacaat tgaagagacc tcggcgctaa 600 catgaaaaca gcgagctcgt gaaatccttg tcaccgctaa ggagaagggc atcaccatca 660 ttggacctgc tacagtcggt ggtatcaagc ctggcgcttt caaaattggt aacactggtg 720 gtatgatgga caacattgtc gcttccaagc tctaccgcaa gggatccgtt ggttatgtgt 780 ccaagtctgg tggaatgtcc aacgaattga acaacatcat ctcccaaact actgacggtg 840 tttacgaggg tgttgctatt ggaggtgacc gttaccccgg tactactttc atcgaccacc 900 tccttcgtta ccaagccgag cctgagtgca agatccttgt tctgctcggt gaggttggtg 960 gtgttgagga ataccgtgtc attgaggctg tcaagaacgg tgtgatcacc aaacccatcg 1020 tcgcctgggc catcggtact tgcgctagca tgttcaagac tgaggtccag tttggtcacg 1080 ctggtgcctc tgccaactcc gacctggaga ctgctgttgc taagaacaag gctatgagag 1140 aagccggtat ctacgtccct gacacattcg aggacatgcc cgccgtcctc aagaaggtct 1200 acgaggagca ggttcagaac ggtgttatca agcctcagcc tgagcctgtt ccccctaaga 1260 ttcccattga ctactcttgg gcccaggagc tcggtcttat tcgtaagcct gctgctttca 1320 tctccaccat ctccgacgac cgtggccagg agctcttata tgccggcatg cccatctctg 1380 atgtcttcaa ggaggacatt ggtatcggag gtgtcatgtc cttgctctgg ttccgccgcc 1440 gcctgcccag ctacgctacc aagttcttgg agatggttct catgctcaca gctgaccacg 1500 gtcccgctgt gtctggcgcc atgaacacta tcatcacaac tcgtgccggc aaggacctca 1560 tcagtgccct tgtctctggt cttctcacca ttggatcccg ctttggtggt gccctagatg 1620 gcgctgccga ggagttcacc aaggctttcg acaagggcat gagccctcgt gacttcgttg 1680 acaccatgag aaaggagaac aagctgagta cgttacctct gtcaatatat gggttttgaa 1740 gttctcatac tgacgcgacg ttttagttcc tggaattggc caccgtatca agtcccgcaa 1800 caaccccgat ctgcgtgttg agctggttaa ggaatacgtc aagaagcact tccccagcac 1860 caagcttctg gattacgcca ttgctgtcga gactgtcacc acatccaaga aggacaacct 1920 gattcttaac gtcgacggtt gcatcgctgt ttgcttcgtc gatctcatgc gcaactgcgg 1980 tgctttctcc gccgaggaat ccgaggacta catgaagatg ggtgtcctca acggtctttt 2040 cgttctaggc cgtagcatcg gtctgattgc ccactacctt gatcagaaga gactgcgcac 2100 tggtctttac cgccaccctt gggatgacat cacgtacctg ctccccgccc tgcaaaaggg 2160 tggctcggag ggtcgtgttg aggtcaacgt ataa 2194 <210> 10 <211> 655 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP:Citrate lyase AN2436.2 <400> 10 Met Pro Ala Ala Pro Leu Val Ser Thr Ala Asn Gly Pro Asn Ala Asn 1 5 10 15 Asp Asn Ile Thr Arg Phe Glu Pro Pro Ser Arg Val Arg Ser Pro Phe 20 25 30 Ala Asp Ala Leu Phe His Asn Lys Thr Arg Cys Phe Val Tyr Gly Met 35 40 45 Gln Pro Arg Ala Val Gln Gly Met Leu Asp Phe Asp Phe Ile Cys Lys 50 55 60 Arg Ser Thr Pro Ser Val Ala Gly Ile Ile Tyr Thr Phe Gly Gly Gln 65 70 75 80 Phe Val Ser Lys Met Tyr Trp Gly Thr Ser Glu Thr Leu Leu Pro Val 85 90 95 Tyr Gln Asp Thr Ala Lys Ala Met Ala Lys His Pro Asp Val Asp Thr 100 105 110 Val Val Asn Phe Ala Ser Ser Arg Ser Val Tyr Ser Ser Thr Met Glu 115 120 125 Leu Met Gln Tyr Pro Gln Ile Lys Cys Ile Ala Ile Ile Ala Glu Gly 130 135 140 Val Pro Glu Arg Arg Ala Arg Glu Ile Leu Val Thr Ala Lys Glu Lys 145 150 155 160 Gly Ile Thr Ile Ile Gly Pro Ala Thr Val Gly Gly Ile Lys Pro Gly 165 170 175 Ala Phe Lys Ile Gly Asn Thr Gly Gly Met Met Asp Asn Ile Val Ala 180 185 190 Ser Lys Leu Tyr Arg Lys Gly Ser Val Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gly 195 200 205 Gly Met Ser Asn Glu Leu Asn Asn Ile Ile Ser Gln Thr Thr Asp Gly 210 215 220 Val Tyr Glu Gly Val Ala Ile Gly Gly Asp Arg Tyr Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240 Phe Ile Asp His Leu Leu Arg Tyr Gln Ala Glu Pro Glu Cys Lys Ile 245 250 255 Leu Val Leu Leu Gly Glu Val Gly Gly Val Glu Glu Tyr Arg Val Ile 260 265 270 Glu Ala Val Lys Asn Gly Val Ile Thr Lys Pro Ile Val Ala Trp Ala 275 280 285 Ile Gly Thr Cys Ala Ser Met Phe Lys Thr Glu Val Gln Phe Gly His 290 295 300 Ala Gly Ala Ser Ala Asn Ser Asp Leu Glu Thr Ala Val Ala Lys Asn 305 310 315 320 Lys Ala Met Arg Glu Ala Gly Ile Tyr Val Pro Asp Thr Phe Glu Asp 325 330 335 Met Pro Ala Val Leu Lys Lys Val Tyr Glu Glu Gln Val Gln Asn Gly 340 345 350 Val Ile Lys Pro Gln Pro Glu Pro Val Pro Pro Lys Ile Pro Ile Asp 355 360 365 Tyr Ser Trp Ala Gln Glu Leu Gly Leu Ile Arg Lys Pro Ala Ala Phe 370 375 380 Ile Ser Thr Ile Ser Asp Asp Arg Gly Gln Glu Leu Leu Tyr Ala Gly 385 390 395 400 Met Pro Ile Ser Asp Val Phe Lys Glu Asp Ile Gly Ile Gly Gly Val 405 410 415 Met Ser Leu Leu Trp Phe Arg Arg Arg Leu Pro Ser Tyr Ala Thr Lys 420 425 430 Phe Leu Glu Met Val Leu Met Leu Thr Ala Asp His Gly Pro Ala Val 435 440 445 Ser Gly Ala Met Asn Thr Ile Ile Thr Thr Arg Ala Gly Lys Asp Leu 450 455 460 Ile Ser Ala Leu Val Ser Gly Leu Leu Thr Ile Gly Ser Arg Phe Gly 465 470 475 480 Gly Ala Leu Asp Gly Ala Ala Glu Glu Phe Thr Lys Ala Phe Asp Lys 485 490 495 Gly Met Ser Pro Arg Asp Phe Val Asp Thr Met Arg Lys Glu Asn Lys 500 505 510 Leu Ile Pro Gly Ile Gly His Arg Ile Lys Ser Arg Asn Asn Pro Asp 515 520 525 Leu Arg Val Glu Leu Val Lys Glu Tyr Val Lys Lys His Phe Pro Ser 530 535 540 Thr Lys Leu Leu Asp Tyr Ala Ile Ala Val Glu Thr Val Thr Thr Ser 545 550 555 560 Lys Lys Asp Asn Leu Ile Leu Asn Val Asp Gly Cys Ile Ala Val Cys 565 570 575 Phe Val Asp Leu Met Arg Asn Cys Gly Ala Phe Ser Ala Glu Glu Ser 580 585 590 Glu Asp Tyr Met Lys Met Gly Val Leu Asn Gly Leu Phe Val Leu Gly 595 600 605 Arg Ser Ile Gly Leu Ile Ala His Tyr Leu Asp Gln Lys Arg Leu Arg 610 615 620 Thr Gly Leu Tyr Arg His Pro Trp Asp Asp Ile Thr Tyr Leu Leu Pro 625 630 635 640 Ala Leu Gln Lys Gly Gly Ser Glu Gly Arg Val Glu Val Asn Val 645 650 655 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying pyruvate decarboxylase (pdc1) gene <400> 11 aaccaaatta attaaatgtc tgaaattact ctaggtcgtt a 41 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying pyruvate decarboxylase (pdc1) gene <400> 12 tgcttccatc aacgccaagc aagaatagtt aattaaagga taa 43 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying adh1 gene of alcohol dehydrogenase <400> 13 atcatactta attaaatggc tattccagaa actcaaaagg gt 42 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying adh1 gene of alcohol dehydrogenase <400> 14 tagaattgtc gttgacactt ccaaataatt aattaaaccc tt 42 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying adh2 gene of alcohol dehydrogenase <400> 15 acaaccaact taattaaatg tctattccaa ctactcaaaa ggg 43 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying adh2 gene of alcohol dehydrogenase <400> 16 gtagatacgt tgttgacact tccaaataat taattaaact ag 42 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying acl1 of ATP-citrate lyase subunit 1 gene <400> 17 cacacacatt aattaaatgt ccgccaagtc gattttcgag g 41 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying acl1 of ATP-citrate lyase subunit 1 gene <400> 18 gccttaatta agtttacgca gtaccaaact ccttgata 38 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying acl2 of ATP-citrate lyase subunit 2 gene <400> 19 agagtacctt aattaaatgc ctgccgctcc tcttgtcagc ac 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying acl2 of ATP-citrate lyase subunit 2 gene <400> 20 tcagaggatt aattaaaaat tatacgttga cctcaacacg ac 42

Claims

ATP-시트레이트 리아제(ATP-citrate lyase)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 도입되며, ATP-시트레이트 리아제를 발현하는 숙신산을 생산하며, pH 2 내지 4범위에서 내산성을 갖는 것인 재조합 효모균주.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 효모 균주는, 알코올 생합성 경로에 관여하는 효소 유전자의 불활성화 또는 결실, 숙신산 내성 유전자 도입, 및 상기 글리옥실레이트 션트 경로(glyoxylate shunt) 유전자 도입으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것이 재조합 효모균주.
제 2 항에 있어서, 상기 재조합 효모 균주가 숙신산이 100g/L 농도 이상으로 포함된 배양조건 및 pH 2 내지 4에서 생장하는 숙신산 내성을 갖는 것인, 재조합 효모균주.
제 3 항에 있어서, 상기 효모 균주가 숙신산이 160g/L 농도 이상으로 포함된 배양조건에서 생장하는 것인 재조합 효모균주.
제 1 항에 있어서, 상기 ATP-시트레이트 리아제(ATP-citrate lyase) 효소는 AN2435.2(XP_660039.1), AN2436.2(XP_660040.1), ACL(EIT74888.1), ACL(XP_001268170.1), ACL(XP_750954.1), ACL(XP_001258191.1), ACL2(XP_001596162.1), ACL2(CCC07572.1), 또는 ACL2(ELA38193.1)을 갖는 아미노산을 포함하는 것인 재조합 효모 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 ATP-시트레이트 리아제(ATP-citrate lyase) 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 AN2435.2(EAA64141), acl2(EAA64141.1), AN2436.2(EAA64142), acl1(EAA64142.1), acl1(NCBI Gene ID: 2910381), acl1(NCBI Gene ID: 2874950), acl1(NCBI Gene ID: 2874699), acl2(NCBI Gene ID: 2910381), AclB-2(NCBI Gene ID: 917924), AclA-3(NCBI Gene ID: 471036), AclA-1(NCBI Gene ID: 471195), AclB-1(NCBI Gene ID: 477973), 또는 AclA-2(NCBI Gene ID: 475250)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 효모균주.
제 1 항에 있어서, 상기 ATP-시트레이트 리아제는 서열번호 8의 아미노산 서열에 의해 암호화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서브유닛 1의 뉴클레오타이드 및 서열번호 10의 아미노산 서열에 의해 암호화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서브유닛 2의 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 재조합 효모균주.
제 1 항에 있어서, 상기 ATP-시트레이트 리아제 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서브유닛 1의 뉴클레오타이드 서열 및 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서브유닛 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 재조합 효모균주.
제 2 항에 있어서, 상기 알코올 생합성 경로에 관여하는 효소는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase) 및 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 재조합 효모 균주.
제 9 항에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라제는 PDC, PDCI, PDCII, PDC1, PDC2, PDC5, PDC6, 및 KIPDC로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 알코올 데히드로게나제는 ADH1, ADHI, ADH2, ADHII, ADH3, ADHIII, ADH4, 및 ADHIV로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인 재조합 효모 균주.
제 10 항에 있어서, 상기 피루베이트 데카르복실라제는 PDC1(AAA35267.1)을 갖는 아미노산서열을 포함하며, 상기 알코올 데히드로게나제는 ADH1(CAA42785.1.) 또는 AHD2(AAF91235.1.)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 재조합 효모균주.
제 11 항에 있어서, 상기 알코올 데히드로게나제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 adh1 (X60224.2), adh2 (AF225206.1), 또는 adh3(AF261759.1), adh4(AF261760) 을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 효모균주.
제 2 항에 있어서, 상기 글리옥실레이트 션트 경로의 유전자에 의해 코딩되는 효소는 이소시트레이트 리아제(isocitrate lyase) 및 말레이트 합성효소 (malate synthase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 재조합 효모 균주.
제 2 항에 있어서, 상기 효모 균주는 포스포에놀피루베이트(PEP) 카르복시키나제(PEP carboxykinase), 포스포에놀피루베이트 카르복실라제(PEP carboxylase), 피루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase), 및 말릭 데히드로게나제(malic dehydrogenase)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 유전자가 추가로 도입된 것인 재조합 효모 균주.
제 1 항에 있어서, 상기 효모 균주는 클루이베로미세스속 균주(Kluyveromyces spp .), 사카로마이세스속 균주(Saccharomyces spp .), 시조사카로마이세스속 균주(Schizosaccharomyces spp .), 피키아속 균주(Pichia spp .), 파피아속 균주(Paffia spp .), 칸디다속 균주(Candida spp .), 탈라로미세스속 균주(Talaromyces spp .), 브레타노미세스속 균주(Brettanomyces spp .), 파키솔렌속 균주(Pachysolen spp .), 데바리오미세스속 균주(Debaryomyces spp .) 또는 이들의 산업적인 배수체(polyploid)인 재조합 효모 균주.
제1항 내지 제15항중 어느 한항에 따른 숙신산 생산 재조합 효모균주를 호기적 조건에서 배양하는 단계 및 상기 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 단계를 포함하는 숙신산의 제조방법.
제16항에 있어서, 상기 배양은 포도당을 탄소원으로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.