CN113795503A - 细胞色素b2在酵母中过表达用于增加乙醇生产 - Google Patents
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Abstract
描述了涉及过表达细胞色素B2的经修饰的酵母的组合物和方法。与亲本细胞相比，所述酵母产生增加量的醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。
Description
技术领域
本申请要求2019年3月14日提交的美国临时专利申请号62/818448的优先权，所述专利申请的公开内容通过援引以其全文并入。
本发明的组合物和方法涉及过表达细胞色素B2的经修饰的酵母。所述酵母与其亲本细胞相比产生增加量的乙醇。这种酵母对于从淀粉底物大规模生产乙醇特别有用。
背景技术
第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇生产为约900亿升(Gombert,A.K.和van Maris.A.J.(2015)Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术现状]33:81-86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。
丁醇是一种重要的工业化学品和滴入式燃料(drop-in fuel)组分，其具有多种应用，包括用作可再生燃料添加剂、塑料工业中的原料化学品、以及食品和香料工业中的食品级提取剂。因此，对醇(如丁醇和异丁醇)以及有效且环境友好的生产方法有很高的需求。
鉴于世界范围的大量的醇生产，即使发酵生物效率的微小提高也可产生可用醇量的巨大增加。因此，对更有效地生产醇的生物存在需求。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及过表达细胞色素B2的经修饰的酵母。所述组合物和方法的各方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生增加量的CYB2P多肽，其中与在其他方面相同的亲本酵母细胞产生的乙醇的量相比，所述经修饰的细胞在发酵期间产生更多的乙醇。
2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括将核酸引入所述亲本细胞中，所述核酸能够指导CYB2P多肽以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括引入用于表达CYB2P多肽的表达盒。
4.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的表达水平相比，CYB2P多肽的表达的增加量为至少约500％。
5.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码所述CYB2P多肽的mRNA的增加量为至少约1,000％。
6.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码所述CYB2P多肽的mRNA的增加量为至少约5,000％。
7.在如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
8.在一些实施例中，如段落1-7中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含PKL途径。
9.在一些实施例中，如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
10.在一些实施例中，如段落1-9中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的备选途径。
11.在如段落1-10中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
12.在另一方面，提供了一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的醇生产的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使CYB2P多肽的产生增加的遗传改变。
13.在如段落12所述的方法的一些实施例中，具有所述引入的遗传改变的所述细胞是经修饰的细胞，所述经修饰的细胞是如段落1-3和7-11中任一项所述的细胞。
14.在如段落12或13所述的方法的一些实施例中，所述醇生产增加至少0.2％、至少0.5％、至少0.7％、或至少1.0％。
15.在如段落12-14中任一项所述的方法的一些实施例中，CYB2P多肽过表达至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少80倍、或甚至至少100倍。
根据包括任何附图/图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。
具体实施方式
I.定义
在详细地描述本发明的酵母和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。
如本文所使用的，术语“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N-末端到C-末端方向进行呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白”或“同源物”。这类蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物，或不同纲的生物(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的、或通过他们的功能确定的同源物。
如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)(遗传学计算机组公司(Genetics ComputerGroup)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。
例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。所述方法类似于Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[计算机在生物学中的应用]5:151-53)。有用的PILEUP参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)以及Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人,(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M′5、N′-4、以及两条链的比较作为默认值。
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。当生物含有多于一个相似基因时，术语“等位基因”通常是优选的，在这种情况下，每个不同的相似基因被称为不同的“等位基因”。
如本文所使用的，“组成型”表达是指基本上在所有典型生长条件下，由特定基因编码的多肽的产生，而不是“条件”表达，所述“条件”表达需要特定的底物的存在、温度等来诱导或激活表达。
如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
如本文所使用的，“过表达多肽”、“增加多肽的表达”和相似术语是指与不包括指定遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以高于正常水平的水平表达多肽。
如本文所使用的，“表达盒”是指包括启动子、和氨基酸编码区与终止子(即启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许在细胞中产生编码的多肽需要的其他核酸序列的DNA片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。
如本文所使用的，关于两个DNA片段的术语“融合的”和“融合”(例如启动子和多肽的编码区)是指致使两个DNA片段变成单个分子的物理键合。
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然”可互换地使用，并且是指在自然界中发现的基因、蛋白质或菌株，或者不是为了目前所述酵母的优点而有意修饰的基因、蛋白质或菌株。
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、可选择标记、信号转导子、受体、转运体、转录因子、翻译因子、辅因子等，并且可以被表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白质)的遗传的或化学的操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用CRISPR、RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。如本文所使用的，“基因的缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中去除。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。基因缺失也指编码序列的一部分、或与基因编码序列紧邻或不紧邻的启动子的一部分的缺失，其中工程化的细胞中不存在目的基因的功能活性。
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(例如酶活性、结合活性、表面活性特性、信号转导子、受体、转运体、转录因子、翻译因子、辅因子等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或减少此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以阻止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以阻止产生指定蛋白”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即，生物化学途径)泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间体的通量的任何遗传的或化学的操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一个或多个基因表达的其他调节元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
如本文所使用的，表述“发酵结束”是指就固定和可变成本而言，当连续发酵产生少量额外的醇的经济优势被连续发酵的成本超过时的发酵阶段。在更一般的意义上，“发酵结束”是指发酵将不再产生大量额外的醇，即不超过约1％的额外的醇，或无更多的用于进一步醇生产的底物剩余的点。
如本文所使用的，表达“碳通量”是指碳分子通过代谢途径的周转率。碳通量是由代谢途径中涉及的酶调节的，例如葡萄糖代谢途径和麦芽糖代谢途径。
如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过援引以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
℃ 摄氏度
AA α-淀粉酶
bp 碱基对
CYB2 细胞色素B2
DNA 脱氧核糖核酸
ds或DS 干固体
EC 酶学委员会
EtOH 乙醇
FG FERMAXTMGold
g或gm 克
g/L 克/升
GA 葡糖淀粉酶
H2O 水
HPLC 高效液相色谱
hr或h 小时
kg 千克
M 摩尔
mg 毫克
min 分钟
mL或ml 毫升
mM 毫摩尔
N 当量浓度
nm 纳米
PCR 聚合酶链式反应
ppm 百万分率
STL1 糖转运体样多肽
Δ 与缺失有关
μg 微克
μL和μl 微升
μM 微摩尔
II.具有增加的Cyb2p表达的经修饰的酵母细胞
在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，细胞色素B2(CYB2；L-乳酸脱氢酶)是线粒体膜间隙(mitochondrial intermembrane space)的组分。细胞色素B2将L-乳酸转化为丙酮酸，因为它将NAD+转化为NADH，同时伴随逆反应。CYB2是乳酸利用所必需的。其表达由乳酸诱导，并受葡萄糖和厌氧条件抑制。本发明的组合物和方法基于以下发现：以适当水平过表达CYB2可以增加酵母属中的乙醇生产。
在一些实施例中，在发酵期间，与在相同条件下生长的亲本细胞产生的CYB2P多肽的量相比，经修饰的细胞产生的CYB2P多肽的量的增加是至少200％、至少500％、至少1000％、至少2,500％、或甚至至少5,000％、或更多的增加。
在一些实施例中，在发酵期间，与在相同条件下生长的亲本细胞产生的CYB2P多肽的量相比，经修饰的细胞产生的CYB2P多肽的量增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、或甚至至少50倍、或更多。
在一些实施例中，在发酵期间，与控制CYB2P表达的天然启动子的强度相比，用于控制由经修饰的细胞产生的CYB2P多肽的表达的启动子的强度增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少70倍、至少100倍、或更多。
在一些实施例中，与在相同条件下生长的亲本细胞产生的乙醇的量相比，经修饰的细胞产生的乙醇的增加是至少0.2％、至少0.5％、至少0.75％、至少0.9％、至少1.0％、或更多的增加。
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现了Cyb2p表达增加，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括向酵母细胞中引入能够指导Cyb2p多肽过表达或表达增加的核酸。特定的方法包括但不限于(i)将用于产生所述多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地还有内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)修饰内源表达盒的启动子以增加表达，(iv)增加用于CYB2过表达的相同或不同盒的拷贝数，和/或(v)修饰宿主细胞的任何方面以增加所述多肽在宿主细胞中的半衰期。
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括目的基因，例如编码可选择标记、碳水化合物加工酶或其他多肽的基因。在一些实施例中，随后将引入的基因引入经修饰的细胞中。
在一些实施例中，被修饰的亲本细胞已经包括增加乙醇生产的工程化的目的途径(如PKL途径)，或增加醇生产的任何其他途径。
示例性酿酒酵母Cyb2p多肽的氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示：
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，在经修饰的酵母细胞中过表达的Cyb2p多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
氨基酸序列搜索在具有相似注释的示例性分子(即SEQ ID NO:1)的90％氨基酸序列同一性内鉴定了几种已知的Cyb2p分子。在本发明的组合物和方法的特定实施例中，在经修饰的酵母细胞中过表达的Cyb2p多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1和/或表1中提及的一个或多个Cyb2p氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或甚至至少99％同一性。
表1.来自公共数据库的细胞色素B2蛋白
III.具有与外源PKL途径的基因组合的增加的Cyb2p表达的经修饰的酵母细胞
Cyb2p的增加的表达可以与PKL途径中的基因表达组合以进一步增加乙醇生产。WO2015148272中先前已经描述了具有异源PKL途径的工程化的酵母细胞(Miasnikov等人)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)，任选地具有其他酶，以使通道碳通量远离甘油途径导向，并且朝向乙酰辅酶A的合成导向，所述乙酰辅酶A然后转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，此类经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。
IV.增加的Cyb2p生产与影响醇生产的其他突变的组合
在一些实施例中，除了表达增加量的Cyb2p多肽(任选地与引入的外源PKL途径组合)之外，本发明的经修饰的酵母细胞还包括影响乙醇生产的额外的修饰。
经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径和/或再利用甘油途径的减弱的突变，已知所述突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)和8,956,851(Argyros等人)。Methods to enhance the reuse glycerol pathway by over expression of glyceroldehydrogenase(GCY1)and dihydroxyacetone kinase(DAK1)to convert glycerol todihydroxyacetone phosphate[通过过表达甘油脱氢酶(GCY1)和二羟基丙酮激酶(DAK1)将甘油转化为磷酸二羟基丙酮以增强再利用甘油途径的方法](Zhang等人(2013)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物与生物技术杂志]40:1153-60)。
经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为Ac-CoA。这部分地降低了乙酸对酵母细胞生长的不希望的影响，并且可以进一步有助于醇产率的提高。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。
在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD+依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可进一步过表达糖转运体样(STL1)多肽以增加甘油的摄取(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol.Biol.Cell.[细胞分子生物学]16:2068-76；
等人(2015)Mol.Microbiol.[分子微生物学]97:541-59以及WO2015023989 A1)以增加乙醇生产并减少乙酸。
在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、和YMR226C的一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变和/或取代。
V.增加的Cyb2p表达与其他有益突变的组合
在一些实施例中，除表达增加的Cyb2p多肽之外，任选地与提供益处的其他遗传修饰组合，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括任何数量的编码目的蛋白的额外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入额外的目的基因，所述遗传操作导致Cyb2p多肽的生产增加。目的蛋白包括可选择标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
VI.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途
本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇生产和/或减少甘油生产的方法。此类方法不限于特定的发酵工艺。预期本发明的工程化的酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop-in)”替代品。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。
VII.适合修饰的酵母细胞
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购获得的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需的特征，如高乙醇生产、快速生长速率等。一些酵母已被基因工程化以产生异源酶，如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。
VIII.底物和产物
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述组合物和方法。
实例
实例1
材料与方法
液化物制备：
液化物(玉米醪浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds酸性真菌蛋白酶、0.33GAU/g ds变体里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶以及1.46SSCU/g ds白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶，用硫酸调节至pH 4.8来制备。
AnKom测定：
将300μL浓缩的酵母过夜培养物添加到填充有50g制备的液化物(参见上述)的多个ANKOM瓶中的每个，以达到0.3的最终OD。然后将所述瓶在150RPM振荡在32℃孵育55小时。
HPLC分析：
通过在14,000RPM离心12分钟在Eppendorf管中采集来自AnKom测定的培养物的样品。将上清液用0.2μM PTFE过滤器过滤，然后在以下条件下用于HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析：Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，运行温度为55℃，在0.01NH2SO4中的等度流速为0.6ml/min，以及进样体积为2.5μl。使用校准标准物用于定量乙酸、乙醇、甘油、葡萄糖和其他分子。除非另有说明，所有值以g/L报告。
RNA-Seq分析：
根据TRIzol法(生命技术公司(Life-Tech)，罗克维尔，马里兰州)从单个样品中制备RNA。然后使用Qiagen RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，日耳曼敦，马里兰州)清洁RNA。使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的大容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，威明顿市，特拉华州)从单个样品的总mRNA中生成cDNA。使用鸟枪法(shotgun method)对制备的每个样品的cDNA进行测序，然后相对于单个基因进行定量。结果报告为每千碱基千万转录物的读数(RPK10M)，并用于对样品中每个转录物的量进行定量。
实例2
酵母中CYB2的表达
如实例1中描述的进行RNA-Seq分析。如表2中总结的，在具有或不具有外源磷酸转酮酶(PKL)途径的情况下，过表达STL1的酵母以显著高于亲本酵母，即FERMAXTMGold(玛翠公司(Martrex Inc.)，明尼苏达州，美国；本文中缩写为“FG”)的水平表达CYB2。表达水平表示为每千碱基千万转录物的读数(RPK10M)。
表2.不同菌株中CYB2表达的RNA-Seq分析
结果表明，该基因可能是增加工程化的酵母中乙醇生产的靶标。
实例3
用于过表达CYB2的启动子选择
进行RNA-Seq分析以鉴定在发酵期间用于过表达CYB2的启动子。如实例1中描述的进行分析。与实例2中描述的结果一致，FG中的CYB2表达在发酵的前24小时内较低。相反，肌动蛋白(ACT1)基因在进入发酵6、15和24hr时高度表达。因此，选择ACT1启动子用于过表达酵母中的CYB2。
表3.发酵期间FG中的CYB2和ACT1的转录概况
实例4
Cyb2p表达盒的制备
合成了酿酒酵母的CYB2基因(YML054C基因座，SEQ ID:2)以生成CYB2s。ACT1启动子(YFL039C基因座；SEQ ID NO:3)和FBA1终止子(YKL060C基因座；SEQ ID NO:4)被有效地连接到编码序列以生成ACT1Pro::CYB2ss::Fba1Ter表达盒。在FERMAXTMGold(玛翠公司，明尼苏达州，美国；本文中缩写为“FG”)的II号染色体的位置350000处引入该表达盒，所述FERMAXTMGold是用于谷物乙醇工业的众所周知的发酵酵母。在两个亲本菌株中的CYB2s表达盒的期望插入通过PCR证实。
CYB2多肽的氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示：
CYB2编码区的DNA序列如下SEQ ID NO:2所示：
用于CYB2s过表达的ACT1启动子区如下SEQ ID NO:3所示：
用于CYB2s过表达的FBA1终止子区如下SEQ ID NO:4所示：
实例5
通过酵母过表达CYB2的醇生产
在含有50g液化物的Ankom测定中测试了在ACT1启动子控制下过表达CYB2s的一个PCR阳性菌株及其亲本菌株FG。在32℃进行发酵65小时。通过HPLC分析发酵结束的样品。重复实验几次，并且典型结果总结于表4中。数据是每个菌株的重复样品的平均值。
表4.FG和FG-CYB2菌株的HPLC结果
CYB2s的过表达导致FG酵母中约1.0％的乙醇生产增加，所述FG酵母被认为是用于燃料乙醇工业的稳健的、高乙醇生产酵母。这些结果说明CYB2过表达有益于增加乙醇。
Claims (15)
1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生增加量的CYB2P多肽，其中与在其他方面相同的亲本酵母细胞产生的乙醇的量相比，所述经修饰的细胞在发酵期间产生更多的乙醇。
2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括将核酸引入所述亲本细胞中，所述核酸能够指导CYB2P多肽以高于等同条件下生长的亲本细胞的水平表达。
3.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包括引入用于表达CYB2P多肽的表达盒。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的表达水平相比，所述CYB2P多肽的表达的增加量为至少约500％。
5.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码所述CYB2P多肽的mRNA的增加量为至少约1,000％。
6.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的细胞，其中与在等同条件下生长的亲本细胞中的水平相比，产生的编码所述CYB2P多肽的mRNA的增加量为至少约5,000％。
7.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
8.如权利要求1-7中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含PKL途径。
9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。
10.如权利要求1-9中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含用于制备乙醇的备选途径。
11.如权利要求1-10中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp.)。
12.一种用于增加生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的醇生产的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使CYB2P多肽的产生增加的遗传改变。
13.如权利要求12所述的方法，其中具有所述引入的遗传改变的所述细胞是经修饰的细胞，所述经修饰的细胞是如权利要求1-3和7-11中任一项所述的细胞。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述醇生产增加至少0.2％、至少0.5％、至少0.7％、或至少1.0％。
15.如权利要求12-14中任一项所述的方法，其中CYB2P多肽过表达至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少80倍、或甚至至少100倍。
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