CN118159649A

CN118159649A - 通过rsf2或tda9表达降低的酵母减少产生的乙酸

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Publication number: CN118159649A
Application number: CN202280072224.6A
Authority: CN
Inventors: C·贝门特; Z·陈; 范晓春; D·J·马库尔; M·齐; Y·J·王; Z·薛; Q·Q·朱
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2021-10-26
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2024-06-07

Abstract

描述了涉及具有破坏的RSF2或TDA9基因的经修饰的酵母的组合物和方法。与其他方面相同的亲本细胞相比，该酵母产生减少量的乙酸。这样的酵母对从淀粉底物中大规模生产乙醇是特别有用的，其中乙酸是不希望的终产物。

Description

通过RSF2或TDA9表达降低的酵母减少产生的乙酸

本申请要求于2021年10月26日提交的美国申请号63/271,862的权益，该临时申请通过引用以其全文特此并入。

技术领域

本发明的组合物和方法涉及具有破坏的RSF2或TDA9基因的经修饰的酵母。与亲本细胞相比，该酵母产生减少量的乙酸。这样的酵母对从淀粉底物中大规模生产乙醇是特别有用的，其中乙酸是不希望的副产物。

背景技术

第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年燃料乙醇生产量为约900亿升(Gombert,A.K.和van Maris.A.J.(2015)Curr.Opin.Biotechnol.[生物技术的当前观点]33:81-86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。由于生产量如此之大，即使产率的微小提升也会对整个行业产生巨大的经济影响。

在具有异源磷酸转酮酶(PKL)途径的工程化的酵母细胞中的乙醇生产高于在不具有PKL途径的亲本菌株中的乙醇生产(参见，例如Miasnikov等人，WO 2015148272)。PKL途径由磷酸转酮酶(PKL)和磷酸转乙酰酶(PTA)组成，以使碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶A的合成。两种支持酶，即乙醛脱氢酶(AADH)和乙酰辅酶A合酶(ACS)可以有助于使PKL途径更加有效。

不幸的是，这些工程化的菌株也比亲本酵母产生更多乙酸。乙酸是不希望的副产物，因为乙酸对酵母生长和发酵具有负面影响。此外，乙酸降低来自发酵和蒸馏的剩余水(称为逆流)的pH，其典型地再利用用于随后批次的底物的液化。结果是，乙醇生产者必需调节逆流(或液化物)的pH或增加用于液化的新鲜的水的量。

存在控制通过酵母(特别是倾向于产生增加量的乙酸的工程化的酵母)产生的乙酸的量的需要。

发明内容

本发明的组合物和方法涉及具有减少产生功能性RSF2或TDA9多肽的经修饰的酵母。这些组合物和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。

1.在一方面，提供了衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生减少量的RFS2和/或TDA9多肽，其中在相同发酵条件下与通过所述亲本细胞产生的乙酸的量相比，所述经修饰的细胞在发酵过程中产生减少量的乙酸。

2.在如段落1所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述遗传改变包括与所述亲本细胞中的水平相比能够指导RFS2和/或TDA9多肽的表达的核酸的破坏。

3.在一些实施例中，如段落1或2所述的经修饰的细胞进一步包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与所述亲本细胞中的量相比产生增加量的MIG3多肽。

4.在如段落1-3中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。

5.在如段落4所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。

6.在如段落1-5中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

7.在一些实施例中，如段落1-6中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

8.在一些实施例中，如段落1-7中任一项所述的经修饰的细胞进一步包含用于制备乙醇的替代途径。

9.在如段落1-8中任一项所述的经修饰的细胞的一些实施例中，所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp)。

10.在另一方面，提供了一种用于减少生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙酸产生的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使功能性RSF2和/或TAD9多肽的产生减少的遗传改变。

11.在一些实施例中，如段落10所述的方法进一步包括向所述亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使MIG3多肽的产生增加的遗传改变。

12.在如段落10或11所述的方法的一些实施例中，乙酸产生的减少是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或更多。

根据包括任何附图/图的说明书，本发明的经修饰的细胞和方法的这些和其他方面以及实施例将是清楚的。

具体实施方式

I.定义

在详细地描述本发明的酵母和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。

如本文所使用的，术语“醇”是指其中羟基官能团(-OH)与饱和碳原子键合的有机化合物。

如本文所使用的，术语“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)的生物。示例性酵母是来自酵母目(Saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的特定实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)。酵母包括用于生产燃料醇的生物以及用于生产可饮用醇的生物，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。

如本文所使用的，短语“工程化的酵母细胞”、“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”、或相似短语是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵母。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从N末端到C末端方向呈现。聚合物可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖了天然地修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关蛋白”或“同源物”。这样的蛋白质可以衍生自不同属和/或物种的生物，或不同纲的生物(例如，细菌和真菌)，或者是人工设计的蛋白质。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的、或通过他们的功能确定的同源物。

如本文所使用的，术语“同源蛋白”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不旨在表示同源物必定是进化上相关的。因此，该术语旨在涵盖从不同生物获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有相似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导一种或多种相似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种希望活性的酶。

序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85:2444；威斯康星遗传学软件包(WisconsinGenetics Software Package)(威斯康星州麦迪逊市的遗传学电脑集团(GeneticsComputer Group,Madison,WI))中的程序，诸如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux等人(1984)Nucleic Acids Res.[核酸研究]12:387-95)。

例如，PILEUP是确定序列同源性水平的有用程序。PILEUP使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建该比对的聚类关系的树。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化版(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]35:351-60)。该方法与Higgins和Sharp描述的方法((1989)CABIOS[生物科学中的计算机应用]5:151-53)相似。有用的PILEUP参数包括3.00的默认空位权重，0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是BLAST算法，由以下描述：Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10)和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90:5873-87)。一个特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol.[酶学方法]266:460-80)。参数“W”、“T”、以及“X”确定了该比对的灵敏度与速度。该BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M'5、N'-4、以及两条链的比较作为默认值。

如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的CLUSTAL W算法计算序列同一性百分比。参见Thompson等人(1994)Nucleic Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数是：

两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽的区别仅在于保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。

如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或RNA表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予指定表型。当生物含有多于一个相似基因时，术语“等位基因”通常是优选的，在这种情况下，每个不同的相似基因被称为不同的“等位基因”。

如本文所使用的，“组成型”表达是指在基本上所有典型生长条件下，由特定基因编码的多肽的产生，而不是“条件”表达，该“条件”表达需要特定的底物的存在、温度等来诱导或激活表达。

如本文所使用的，术语“表达多肽”和相似术语是指使用细胞的翻译机器(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。

如本文所使用的，“过表达多肽”、“增加多肽的表达”和相似术语是指与不包括指定遗传修饰的亲本或“野生型”细胞所观察到的相比，以高于正常水平的水平表达多肽。

如本文所使用的，“表达盒”是指包括启动子、和氨基酸编码区以及终止子(即，启动子::氨基酸编码区::终止子)以及允许该编码多肽在细胞中产生所需的其他核酸序列的DNA片段。表达盒可以是外源的(即，引入细胞中)或内源的(即，存在于细胞中)。

如本文所使用的，关于两个DNA片段的术语“融合的”和“融合”(如启动子和多肽的编码区)是指导致两个DNA片段变成单个分子的物理键合。

如本文所使用的，术语“野生型”和“天然”可互换地使用，并且是指在自然界中发现的基因、蛋白质或菌株，或者不是为了目前所述酵母的优势而有意修饰的基因、蛋白质或菌株。

如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、可选择标记等，并且能被表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。

如本文所使用的，“基因破坏”泛指基本上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物，例如蛋白质的任何遗传或化学操作，即突变。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括编码多肽的序列、启动子、增强子、或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用CRISPR、RNAi、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。如本文所使用的，“基因缺失”是指该基因从宿主细胞的基因组中去除。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。基因缺失也指编码序列的一部分、或与编码序列紧邻或不紧邻的启动子的一部分的缺失，其中工程化的细胞中不存在目的基因的功能活性。

如本文所使用的，术语“遗传操作”、“遗传改变”、“遗传工程化”以及相似术语可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。

如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性特性等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短、或以其他方式修饰以消除或降低此活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。

如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，这些破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。

如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以防止产生呈现出野生型蛋白的活性特征的功能性蛋白/多肽，则对这些酵母细胞已经进行了“修饰以防止产生指定蛋白”。这样的修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因的修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因的修饰、改变信号传导以开启细胞内基因转录或翻译、及其组合。

如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即，生物化学途径)泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间体的通量的任何遗传的或化学的操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。这样的方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有降低的催化活性或增加的Km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一个或多个基因表达的其他调节元件、针对减少的稳定性工程化这些酶或编码这些酶的mRNA、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰RNA等。

如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长以及生产过程。

如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长以及生产。

如本文所使用的，表述“发酵结束”是指就固定和可变成本而言，当连续发酵产生少量另外的醇的经济优势被连续发酵的成本超过时的发酵阶段。在更一般的意义上，“发酵结束”是指发酵不再产生大量另外的醇，即不超过约1％的另外的醇的点。

如本文所使用的，表达“碳通量”是指碳分子通过代谢途径的周转率。碳通量由代谢途径(如葡萄糖代谢途径和麦芽糖代谢途径)中涉及的酶调节。

如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“该/所述(the)”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：

除非另外说明，以下含义：

℃ 摄氏度

AA α-淀粉酶

AADH 乙醛脱氢酶

bp 碱基对

DNA 脱氧核糖核酸

ds或DS干固体

EC 酶学委员会

EtOH 乙醇

g或gm 克

g/L 克/升

GA 葡糖淀粉酶

H₂O 水

HPLC 高效液相色谱法

hr或h 小时

kg 千克

M 摩尔

mg 毫克

min 分钟

mL或ml毫升

mM 毫摩尔

N 当量浓度

nm 纳米

PCR 聚合酶链式反应

PKL 磷酸转酮酶

ppm 百万分率

PTA 磷酸转乙酰酶

Δ 与缺失有关

μg 微克

μL和μl微升

μM微摩尔

II.功能性RSF2或TDA9表达降低的经修饰的酵母细胞

RSF2(YJR127C)是锌指蛋白；涉及核基因和线粒体基因的转录控制，其中许多基因指定基于甘油的生长、呼吸和其他功能所需的产物。RSF2具有可能来源于全基因组复制的旁系同源物TDA9(YML081W)。TDA9自细胞核至细胞质重新定位以响应DNA复制应激。

申请人已经发现，功能性RSF2或TDA9多肽表达降低的酵母细胞比其他方面相同的亲本细胞产生更少的乙酸。所希望的是乙酸减少，因为乙酸不利地影响酵母生长和发酵并且另外地导致逆流，该逆流具有比希望的更低的pH，需要调节pH、或使用更新鲜的水以稀释逆流。

功能性RSF2和/或TDA9多肽的量的减少可以起因于编码这些存在于该亲本菌株中的多肽(即分别是YJR127C或YML081W)的基因破坏。因为YJR127C或YML081W基因的破坏是用于赋予经修饰的细胞减少的乙酸产生表型的主要遗传决定子，因此，在一些实施例中，经修饰的细胞仅需要包含破坏的YJR127C或YML081W基因，而所有其他基因可以保持完整。在其他实施例中，与衍生经修饰的细胞的亲本细胞相比，所述经修饰的细胞可以任选地包括另外的遗传改变。虽然这样的另外的遗传改变不是赋予所述表型所必需的，但它们可以赋予经修饰的细胞其他优点。

YJR127C或YML081W基因的破坏可以使用任何合适的方法进行，这些方案实质上降低功能性RSF2和/或TDA9多肽的表达。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失YJR127C或YML081W基因，包括完全或部分缺失例如编码RSF2或TDA9的序列、启动子、终止子、增强子或其他调节元件；以及完全或部分缺失包含YJR127C或YML081W基因任何部分的染色体的一部分。

破坏YJR127C或YML081W基因的特定的方法包括在YJR127C或YML081W基因的任何部分(例如，编码RSF2或TDA9的序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或插入。优选地，缺失、插入和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，化学诱变理论上仍可用于破坏YJR127C或YML081W基因。

在一些实施例中，通过经修饰的细胞产生的功能性RSF2或TDA9多肽的量的减少是与通过在相同条件下生长的其他方面相同的亲本细胞产生的功能性RSF2或TDA9多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。

在一些实施例中，通过经修饰的细胞产生的乙酸的减少是与通过在相同条件下生长的亲本细胞产生的乙酸的量相比，至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％或更多的减少。

III.RSF2或TDA9表达降低和MIG3过表达的经修饰的酵母细胞MIG3是Cys₂His₂锌指蛋白，其具有与另外两个转录因子MIG1和MIG2相似的序列。所有三个转录因子在其DNA结合域中共享大量的氨基酸同一性(>70％)。最近的一项研究表明，在一些菌株中，MIG3在分解代谢物阻遏中发挥作用，并且在暴露于乙醇时发挥另外的调节作用(Lewis,J.A.和Gasch,A.P.(2012)G3 2:1607-12)。

申请人已经发现，过表达MIG3多肽的酵母细胞与其他方面相同的亲本细胞相比产生减少量的乙酸(WO 2021108464)。所希望的是乙酸减少，因为乙酸不利地影响酵母生长和发酵并且另外地导致逆流，该逆流具有比希望的更低的pH，需要调节pH、或使用更新鲜的水以稀释逆流。

在此，申请人证明MIG3多肽过表达和RSF2或TAD9表达降低对酵母中的乙酸减少具有累加效应，包括具有外源PKL途径的那些。

在一些实施例中，通过经修饰的细胞产生的MIG3多肽的量的增加是与通过在相同条件下生长的亲本细胞产生的MIG3多肽的量相比，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％、至少1,000％、至少2,000％或更多的增加。

在一些实施例中，通过经修饰的细胞产生的乙酸的减少是与通过在相同条件下生长的亲本细胞产生的乙酸的量相比，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或更多的减少。

优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作实现MIG3表达增加，该遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。

过表达的特定的方法包括但不限于(i)将用于产生该多肽的外源表达盒引入宿主细胞中，任选地还有内源表达盒，(ii)用允许产生增加量的多肽的内源盒取代外源表达盒，(iii)修饰内源表达盒的启动子以增加表达，和/或(iv)修饰宿主细胞的任何方面以增加该多肽在宿主细胞中的半衰期。

IV.具有外源PKL途径的基因的经修饰的酵母细胞

RSF2或TDA9表达降低，任选地MIG3过表达，可以与PKL途径中的基因的表达组合，以降低与将外源PKL途径引入酵母相关的提高量的乙酸的产生。

先前已经描述了具有异源PKL途径的工程化的酵母细胞(WO 2015148272)。这些细胞表达异源磷酸转酮酶(PKL)、磷酸转乙酰酶(PTA)、和乙酰化乙酰基脱氢酶(AADH)(任选地以及其他酶)，以使碳通量远离甘油途径并且朝向乙酰辅酶A的合成，然后该乙酰辅酶A转化为乙醇。与在其他方面相同的亲本酵母细胞相比，这样的经修饰的细胞能够在发酵过程中增加乙醇生产。

V.具有影响醇生产的其他突变的经修饰的酵母细胞

在一些实施例中，除了表达减少量的RSF2或TDA9(任选地具有MIG过表达，以及进一步任选地具有异源PKL途径)之外，本发明的经修饰的酵母细胞包括另外的有益修饰。

经修饰的细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径和/或再利用甘油途径减弱的突变，已知这些突变可增加醇生产。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因GPD1、GPD2、GPP1和/或GPP2中的一个或多个来降低或消除内源性NAD依赖性甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)或磷酸甘油磷酸酶(GPP)活性。参见例如美国专利号9,175,270(Elke等人)、8,795,998(Pronk等人)以及8,956,851(Argyros等人)。Methods to enhance the reuse glycerol pathway by over expression of glyceroldehydrogenase(GCY1)and dihydroxyacetone kinase(DAK1)to convert glycerol todihydroxyacetone phosphate[通过过表达甘油脱氢酶(GCY1)和二羟基丙酮激酶(DAK1)将甘油转化为磷酸二羟基丙酮以增强再利用甘油途径的方法](Zhang等人(2013)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物学和生物技术杂志]40:1153-60)。

经修饰的酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶A合酶(也称为乙酰辅酶A连接酶)活性(EC 6.2.1.1)以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰-磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸并将其转化为乙酰辅酶A。这部分地降低了乙酸对酵母细胞生长的不希望的影响，并且可以进一步有助于醇产率的提升。增加乙酰辅酶A合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶A合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶A合酶基因的表达等来实现。

在一些实施例中，经修饰的细胞可进一步包括编码具有NAD⁺依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(Pronk等人)中描述了与甘油途径减弱组合的这样的基因的引入。在本发明的组合物和方法的一些实施例中，酵母特意缺乏编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一种或多种异源基因。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(STL1)多肽以增加甘油的摄入(参见，例如，Ferreira等人(2005)Mol.Biol.Cell.[细胞分子生物学]16:2068-76；等人(2015)Mol.Microbiol.[分子微生物学]97:541-59以及WO 2015023989A1)以增加乙醇生产和减少乙酸。

在一些实施例中，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括丁醇生物合成途径。在一些实施例中，丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，异丁醇生物合成途径包含编码如下多肽的多核苷酸，该多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3-二羟基异戊酸盐；(c)2,3-二羟基异戊酸盐至2-酮异戊酸盐；(d)2-酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸盐脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。

在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的经修饰的酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：PDC1、PDC5、PDC6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变、过表达和/或取代，这些内源多核苷酸编码FRA2、ALD6、ADH1、GPD2、BDH1、DLS1、DPB3、CPR1、MAL23C、MNN4、PAB1、TMN2、HAC1、PTC1、PTC2、OSM1、GIS1、CRZ1、HUG1、GDS1、CYB2P、SFC1、MVB12、LDB10、C5SD、GIC1、GIC2、YMR226C、PHO13、ADH5、MIG1、MIG2、MIG3、JID1、KGD2、ARG7、LEU4、MET2、DAL7和ISN1。

VI.具有其他有益突变的经修饰的酵母细胞

在一些实施例中，除表达减少量的RSF2或TDA9(任选地具有MIG过表达，进一步任选地具有异源PKL途径，以及仍进一步任选地与有益于醇生产的其他遗传修饰组合)之外，本发明的经修饰的酵母细胞进一步包括任何数目的编码目的蛋白的另外的目的基因。可以在遗传操作之前、期间或之后引入另外的目的基因，这些遗传操作导致活性MIG3多肽的产生增加。目的蛋白包括可选择标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自由以下组成的组的酶：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶(transladolase)、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化并以其他方式修饰。

VII.经修饰的酵母用于增加醇生产的用途

本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇产生和/或降低甘油产生的方法。这样的方法不限于特定的发酵工艺。预期本发明的工程化的酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“普适性(drop-in)”替代品。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。

VIII.适合修饰的酵母细胞

酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种(包括酿酒酵母)以及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、拉茜斯酵母属(Lachancea)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所希望的特征，如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已被基因工程化以产生异源酶，如葡糖淀粉酶或α-淀粉酶。

IX.底物和产物

从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与这样的底物和条件完全相容。

醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(-OH)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2-戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。

鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制组合物和方法。

实例

实例1

材料与方法

液化物制备：

液化物(玉米醪浆料)通过添加600ppm尿素、0.124SAPU/g ds酸性真菌蛋白酶、0.33GAU/g ds变体里氏木霉(Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶以及1.46SSCU/g ds白曲霉(Aspergillus kawachii)α-淀粉酶，用硫酸调节至pH 4.8来制备。

血清瓶测定：

向在24孔板中的2mL YPD接种酵母细胞，并且使培养物生长过夜以至25-30之间的OD。将2.5mL液化物转移至血清瓶(Chemglass公司，目录号：CG-4904-01)，并将酵母添加至每个小瓶中至最终OD为约0.4-0.6。安装小瓶的盖并用针(BD公司，目录号305111)刺穿以用于通风(以释放CO₂)，然后在200RPM振荡下在32℃孵育65小时。

AnKom测定：

将300μL浓缩的酵母过夜培养物添加至填充有50g制备的液化物(参见上文)的多个ANKOM瓶中的每个中，以达到0.3的最终OD。然后将这些瓶伴随150RPM振荡在32℃孵育65小时。

HPLC分析：

通过在14,000RPM下离心12分钟在Eppendorf管中采集来自血清瓶和AnKom测定的培养物的样品。将上清液用0.2μM PTFE过滤器过滤，并且然后用于以下条件下的HPLC(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1200系列)分析：Bio-Rad Aminex HPX-87H柱，运行温度为55℃。0.6ml/min等度流速，0.01N H₂SO₄，2.5μl注射体积。使用校准标准物用于定量乙酸、乙醇、甘油、葡萄糖和其他分子。所有值以g/L报告。

RNA-Seq分析：

根据TRIzol法(生命技术公司(Life-Tech)，罗克韦尔，马里兰州)从单个样品中制备RNA。然后用Qiagen RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，日耳曼敦，马里兰州)清洁RNA。使用应用生物系统公司(Applied Biosystems)的大容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，威明顿市，特拉华州)由单个样品的总mRNA生成cDNA。使用鸟枪法(shotgun method)对制备的每个样品的cDNA进行测序，然后相对于单个基因进行定量。结果报告为每千碱基千万转录物的读数(RPK10M)，并用于对样品中每个转录物的量进行定量。

实例2

生成用于过表达MIG3和破坏TDA9的菌株

酿酒酵母的MIG3基因(YER028C)经过密码子优化和合成为MIG3。在TAD9基因座上引入包括SUI3Pro::MIG3s::GPD1ter的过表达，使用CRISPR Cas-9技术(在这个情况下是敲除)对在菌株FERMAX^TM Gold(Martrex公司，查斯卡，明尼苏达州，美国；本文FG)和FG-PKL(WO2015148272)中的TDA9基因进行破坏。这个单个步骤方法用于同时表达MIG3和删除TAD9基因。

MIG3多肽的氨基酸序列如以下SEQ ID NO:1所示：

MNYLRDRFPPDNDQRPFRCEICSRGFHRLEHKKRHVRTHTGEKPHKCTVQGCPKSFSRSDELKRHLRTHTKGVQRRRIKSKGSRKTVVNTATAAPTTFNENTGVSLTGIGQSKVPPILISVAQNCDDVNIRNTGNNNGIVETQAPAILVPVINIPNDPHPIPSSLSTTSITSIASVYPSTSPFQYLKSGFPEDPASTPYVHSSGSSLALGELSSNSSIFSKSRRNLAAMSGPDSLSSSKNQSSASLLSQTSHPSKSFSRPPTDLSPLRRIMPSVNTGDMEISRTVSVSSSSSSLTSVTYDDTAAKDMGMGIFFDRPPVTQKACRSNHKYKVNAVSRGRQHERAQFHISGDDEDSNVHRQESRASNTSPNVSLPPIKSILRQIDNFNSAPSYFSK

MIG3-编码区的核酸序列如以下SEQ ID NO:2所示：

ATGAATTACCTGCGAGATAGATTTCCTCCGGATAATGACCAAAGACCCTTTAGATGTGAAATTTGTTCACGAGGTTTCCACAGACTTGAACATAAAAAAAGGCACGTAAGAACGCACACTGGCGAGAAGCCTCACAAATGTACCGTTCAGGGCTGTCCGAAAAGCTTCAGCCGAAGCGATGAACTAAAAAGACATTTGAGGACACATACTAAAGGCGTCCAAAGGCGCAGAATAAAATCCAAGGGCTCGCGAAAAACCGTTGTGAATACTGCTACCGCCGCCCCTACCACCTTCAATGAAAACACTGGTGTTTCGCTCACGGGGATAGGTCAATCTAAAGTGCCACCTATTCTTATCTCCGTTGCTCAGAATTGCGATGACGTGAATATACGAAATACTGGAAATAATAATGGCATTGTGGAGACACAGGCACCTGCAATTTTAGTGCCTGTGATAAATATTCCAAATGACCCTCATCCGATTCCAAGTAGCCTCTCCACTACTTCTATCACCTCCATTGCATCAGTATATCCCTCTACTTCTCCATTCCAGTACCTGAAAAGCGGGTTTCCTGAAGATCCTGCATCTACACCGTATGTACATTCGTCCGGAAGTTCTTTAGCCCTGGGTGAATTGTCTTCAAACTCCTCTATATTTTCGAAATCTAGGAGGAATTTGGCCGCCATGAGTGGTCCTGATTCTTTGAGTAGTTCTAAAAACCAATCCAGTGCTTCGCTTCTTTCTCAAACTTCACATCCATCAAAGAGCTTTTCAAGACCGCCAACAGACTTAAGTCCTCTGCGAAGAATCATGCCTTCTGTAAACACAGGAGACATGGAAATTTCAAGGACAGTATCCGTTTCGAGCAGTTCATCATCACTCACTTCTGTTACGTATGATGACACCGCGGCTAAAGACATGGGCATGGGAATATTTTTTGATAGGCCACCTGTAACACAGAAAGCTTGCAGGAGCAATCATAAGTACAAGGTTAATGCTGTTAGCAGAGGGAGACAACATGAAAGGGCACAATTTCATATATCTGGAGATGATGAGGACAGTAACGTTCACCGCCAAGAATCAAGAGCATCCAACACAAGTCCCAATGTATCATTGCCTCCGATAAAGAGCATTTTGCGACAAATTGATAATTTCAACAGTGCTCCTTCTTACTTCAGTAAATAA

SUI3(YPL237W)启动子(上文缩写为GPD1ter，上文)的核酸序列如以下SEQ ID NO:3所示：

CTTTTGTTAATGAGGTGAACAAAACAGGCAACACGGCTTTACATTGGGCGTCGTTGAATGGCAAATTAGACGTGGTCAAGCTACTGTGTGATGAATATGAGGCAGACCCCTTTATTAGAAACAAATTCGGCCACGATGCTATCTTTGAGGCCGAGAACAGCGGGAAGGAAGAAGTGGAAACATACTTTTTGAAGAAGTATGATGTCGAACCTGAAGATGATGAAGAAGACACACAAACTGAGGGCAAGAATTCGGTCCAAATCACAAAGGGTACAGAAATTGAACAAGTCACCAAGGAAGCCACCGAGGCTTTAAGAGAAGAAACCGAGAAACTGAATATAAATAAAGACTAAAGTAAAGAGCTTGTTTTCTTCGTGGAATAAAAGCCGTAATATCCATTGAGCATGATATTTTATTTCTTGGTACCGGAGAAGATAAAAGGATGGAACCAGCAGAAATGCATTAATAAATACAAAAAATTTAGAAAAGAGTTACAGTAATAATGTATATTTCTCTCACAAACTAAGTAACCGCTTCAAAAGCGTATATTTTGAATGCATTGAACTTTCCATTTCATTACCCGCAGAGCCGGAGTCCTCATCAACGACGGAGTGAAAAATTTTGTAATTGCGAGAAAAAGTGAAATTGATGGAAAAAAAGAAAAAGAAAGTAGAAGAAGACATTATAAGAGAGACTAGGAAACTTCTTGCACATCAACCGAAAAGCGCCTAGGCAACCAGTCATATAATAAGCACGCACGAG

GPD1(YDL022W)终止子(上文缩写为SUI3Pro)的核酸序列如以下SEQ ID NO:4所示：

ATTTATTGGAGAAAGATAACATATCATACTTTCCCCCACTTTTTTCGAGGCTCTTCTATATCATATTCATAAATTAGCATTATGTCATTTCTCATAACTACTTTATCACGTTAGAAATTACTTATTATTATTAAATTAATACAAAATTTAGTAACCAAATAAATATAAATAAATATGTATATTTGAATTTTAAAAAAAAAATCCTATAGAGCAAAAGGATTTTCCATTATAATATTAGCTGTACACCTCTTCCGCATTTTTTGAGGGTGGTTACAACACCACTCATTCAGAGGCTGTCGGCACAGTTGCTTCTAGCATCTGGCGTCCGTATGTATGGGTGTATTTTAAATAA

gRNA盒的核酸序列如以下SEQ ID NO:5(标下划线的序列是对TDA9具有特异性的gRNA序列)所示：

TCATGCGGCCGCCCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTTCTTTGAAAAGATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGGTGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCATTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCGGCAGCACTTGAGCTCGCGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTTTTTGTTTTTTATGTCTGAGCTCACGT

实例3

过表达MIG3并破坏RSF2的菌株的生成

与实例2中所述的流程相似，在RSF2基因座上引入由SUI3Pro::MIG3s::GPD1ter组成的MIG3表达盒，使用CRISPR Cas-9技术对MIG3进行表达以及同时对在菌株FG和FG-PKL中的RSF2进行破坏。MIG3多肽、MIG3-编码区、SUI3启动子和GPD1终止子的氨基酸序列如上文实例2中所示。gRNA盒的核酸序列如以下SEQ ID NO:6(标下划线的序列是对RSF2具有特异性的gRNA序列)所示：

TCATGCGGCCGCCCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAGCTTCTTTGAAAAGATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGGTGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCATTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGCATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCGCTCAATAGGCGGCTGGCATAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTGCTTTTTTTGTTTTTTATGTCTGAGCTCACGT

实例4

具有破坏的RSF2或TDA9的过表达MIG3的菌株的性能

表1总结了针对葡萄糖、甘油、乙酸和乙醇产生测试了过表达表达MIG3的FG菌株(FG-MIG3；WO 2021108464))的性能的Ankom结果，该FG菌株的RSF2或TDA9(分别是FG-RSF2Δ和FG-TAD9Δ)或两者(分别是FG-MIG3/RSF2Δ和FG-MIG3/TDA9Δ)被破坏，如实例1中所述。具有TAD9Δ或RSF2Δ且不具有MIG3过表达的FG菌株的乙酸降低了18％-20％。仅过表达MIG3的FG菌株的乙酸降低了约32％。具有MIG3/RSF2Δ基因型的菌株中的乙酸降低了约42％。

表1.具有或不具有TDA9或RSF2破坏的过表达MIG3的FG菌株的性能

实例5

具有破坏的RSF2或TDA9的过表达MIG3的PKL菌株的性能

表2总结了具有或不具有RSF2或TDA9破坏的过表达MIG3的FG-PKL菌株的性能的Ankom结果。菌株命名与实例4中所用的命名相似。FG-PKL-MIG3菌株以与WO 2021108464中所述的方式相似的方式进行构建。与亲本PKL菌株相比，具有MIG3/TAD9Δ的菌株使乙酸降低了约33％，并且具有MIG3/RSF2Δ的菌株使乙酸降低了约38％。在具有仅RSF2或TAD9破坏、或仅MIG3过表达的菌株中，乙酸仅降低了15％-20％。在具有MIG3过表达与RSF2或TDA9破坏结合的FG-PKL菌株中，乙醇滴度略微增加。

表2.具有或不具有TDA9或RSF2破坏的过表达MIG3的FG-PKL菌株的性能

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Claims

1.一种衍生自亲本酵母细胞的经修饰的酵母细胞，所述经修饰的细胞包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与所述亲本细胞相比产生减少量的RFS2和/或TDA9多肽，其中在相同发酵条件下与通过所述亲本细胞产生的乙酸的量相比，所述经修饰的细胞在发酵过程中产生减少量的乙酸。

2.如权利要求1所述的经修饰的细胞，其中所述遗传改变包含与所述亲本细胞中的水平相比能够指导RFS2和/或TDA9多肽的表达的核酸的破坏。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的细胞，其进一步包含遗传改变，所述遗传改变引起所述经修饰的细胞与亲本细胞中的量相比产生增加量的MIG3多肽。

4.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含磷酸转酮酶途径的一个或多个基因。

5.如权利要求4所述的经修饰的细胞，其中所述磷酸转酮酶途径的基因选自由以下组成的组：磷酸转酮酶、磷酸转乙酰酶、和乙酰化乙酰基脱氢酶。

6.如权利要求1-5中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。

7.如权利要求1-6中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含甘油途径和/或乙酰辅酶A途径中的改变。

8.如权利要求1-7中任一项所述的经修饰的细胞，其进一步包含用于制备乙醇的替代途径。

9.如权利要求1-8中任一项所述的经修饰的细胞，其中所述细胞属于酵母属物种(Saccharomyces spp)。

10.一种用于减少生长于碳水化合物底物上的酵母细胞的乙酸产生的方法，所述方法包括：向亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使功能性RSF2和/或TAD9多肽的产生减少的遗传改变。

11.如权利要求10所述的方法，其进一步包括向所述亲本酵母细胞中引入与所述亲本细胞中产生的量相比使MIG3多肽的产生增加的遗传改变。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中乙酸产生的减少是至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或更多。