KR101722328B1 - 캔디다 인판티콜라 균주를 이용한 디오익 산류의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

유전자 조작 하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라 균주를 이용하여 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익 산류(Dioic acids)를 생산하는 방법 및 이에 사용되는 캔디다 인판티콜라 미생물에 대한 것으로, 본 발명에 따르면 추가적인 유전자 조작 없이 탄소원으로부터 도데칸디오익 산을 생산할 수 있어, 화석연료의 사용으로 인한 국제 유가변동에 따른 비용 증가 및 환경 오염의 부담을 줄여 DDDA를 원료로 하는 다양한 산업 분야에 활용 될 수 있다.

Description

캔디다 인판티콜라 균주를 이용한 디오익 산류의 생산방법{METHODS FOR PRODUCING DIOIC ACIDS USING CANDIDA INFANTICOLA SP.}
본 발명은 캔디다 인판티콜라 균주를 이용하여 탄화수소 또는 지방산과 같은 탄소원으로부터 디오익 산류(Dioic acids)를 생산하는 방법 및 이에 이용되는 캔디다 인판티콜라 미생물에 대한 것이다.
디오익 산(Dioic acids)은 화학산업에 있어서 매우 중요한 화학물질로서 엔지니어링 수지, 자동차 부품, 스포츠 용품, 카펫 및 칫솔 등에 이용되는 석유유래 나일론뿐만 아니라, 다른 고분자 가소제, 접착제, 윤활유, 에폭시수지, 부식방지제, 코팅제, 가공 플라스틱, 향수 및 약제품 등 다양한 산업적 용도로 사용된다. 이들 디오익 산(Dioic acids) 가운데 연간 약 15,000,000,000 파운드의 도데칸디오익 산이 석유화학 원료로부터 합성되고 있으며, 이러한 석유화학 원료들은 주로 부족한 천연 원료로서 이들 원료의 사용은 전세계적으로 환경 파괴·변화와 밀접한 연관이 있으며, 이러한 석유화학 원료들은 가격변동에 민감하고 환경 오염에 대한 부담을 가중시킨다.
따라서, 재생가능하며 지속가능하고 환경에 대한 부담을 줄일 수 있는 디오익 산의 대체적인 생산방법이 요구되고 있다.
본 발명에서는 상기와 종래 기술의 같은 문제점을 해결하기 위해, 재생 가능한 원료로부터 생물학적 공정으로 디오익 산류를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
캔디다 인판티콜라 균주를 이용하여 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익 산류를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 디오익 산류를 생산하는 방법은,
(A) 초기 셀 매스 확보를 위한 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질을 첨가한 효모 추출물 글루코스 배지(yeast extract glucose medium; YG medium)에서 캔디다 인판티콜라 균주를 배양하는 단계;
(B) 상기 단계(A)에서 얻은 배양액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원을 첨가하여 오메가 옥시데이션(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계; 및
(C) 상기 단계(B)에서 얻은 반응물에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 단계
를 포함하는 것 일 수 있다.
상기 단계(A)의 배양은 30±5 ℃, 용존산소량 10% 이상의 조건에서 20 내지 50시간 동안 진행되는 것 일 수 있다.
또한, 상기 단계(B)의 반응은 0.5 내지 5%의 탄소원으로 10 내지 30시간 동안 진행될 수 있다.
또한, 상기 단계(C)의 배양은 0.1 내지 2 ml/L/h 의 기질 및 1 내지 3 g/L/h 의 글루코스로 50 내지 100 시간 동안 진행될 수 있다.
디오익 산류를 생산하는 방법에 있어서, 상기 디오익 산류는 에탄디오익산(ethanedioic acid), 프로판디오익 산(propanedioic acid), 부탄디오익 산(butanedioic acid), 펜탄디오익 산(pentanedioic acid), 헥산디오익 산(hexanedioic acid), 옥탄디오익 산(octanedioic acid), 노난디오익 산(nonanedioic acid), 데칸디오익 산(decanedioic acid), 언데칸디오익 산(undecanedioic acid), 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid) 및 헥사데칸디오익 산(hexadecanedioic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합일 수 있다.
디오익 산류를 생산하는 방법에 있어서, 상기 캔디다 인판티콜라 균주는 유전자 조작을 하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라 균주 일 수 있다.
디오익 산류를 생산하는 방법에 있어서, 상기 캔디다 인판티콜라 균주는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)인 것일 수 있다.
본 발명은 또한 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익산(dioic acids)류를 생산하는 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 균주를 제공한다.
상기 캔디다 인판티콜라 균주는 유전자 조작하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라 균주 일 수 있다.
본 발명은 또한 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)균주를 제공한다. 상기 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)는 탄화수소 및 지방산을 포함하는 탄소원을 이용하여 디오익산류를 생산할 수 있다.
본 발명은 또한 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주를 제공한다.
상기 균주는 탄화수소 또는 지방산을 유일한 탄소원으로 성장할 수 있는 것일 수 있다.
상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것일 수 있다.
상기 균주는 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 적어도 하나의 탄소원을 이용하여 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid; DDDA)을 생산하는 것일 수 있다.
본 발명은 유전자 조작 하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라 균주를 이용하여 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익 산류(Dioic acids)를 생산하는 방법 및 이에 사용되는 캔디다 인판티콜라 미생물에 대한 것으로,화석연료의 사용으로 인한 국제 유가변동에 따른 비용 증가 및 환경 오염의 부담을 줄여 DDDA를 원료로 하는 다양한 산업 분야에 활용 될 수 있다.
도 1은 경쟁유도 연속식 집적 배양장치를 간략하게 나타내는 도면이다.
도 2는 경쟁유도 연속식 집적 배양에서 미생물의 시간에 따른 OD값 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 경쟁유도 연속식 집적 배양에서 미생물의 시간에 따른 희석율(dilution rate) 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 분리균주의 18s rRNA 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 5는 분리균주(신규한 캔디다 인판티콜라 DS02)의 pH에 따른 성장률을 나타내는 그래프이다.
도 6은 캔디다 인판티콜라 DS02(KCTC 12820BP) 및 캔디다 트로피칼리스(ATCC 20336) 시간에 따른 도데칸 소모 속도 및 생산되는 균체량을 나타내는 그래프이다.
도 7은 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)에 의한 도데칸의 DDDA(dodecanedioic acid) 전환을 나타내는 그래프이다.
도 8은 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis; ATCC20336)에 의한 도데칸의 DDDA(dodecanedioic acid) 전환을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공기 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
'탄화수소'는 탄소와 수소로만 이루어져 있는 유기화합물을 지칭한다.
'지방산'은 사슬 모양의 포화 또는 불포화 모노카르복시산을 지칭한다.
'오메가-옥시데이션(ω-oxidation)'은 지방산의 메틸기말단이 산화되어 디카르복시산으로 되는 반응을 지칭한다.
이하에서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 디오익 산류를 생산하는 방법은 캔디다 인판티콜라 균주를 이용하여 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익산류를 생산 하는 것을 특징으로 한다.
상기 디오익 산류를 생산하는 방법은 (A)초기 셀 매스를 확보하기 위한 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질을 첨가한 효모 추출물 글루코스 배지(yeast extract glucose medium; YG medium)에서 캔디다 인판티콜라 균주를 배양하는 단계; (B) 상기 단계(A)의 배양액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원을 첨가하여 오메가-옥시데이션(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계(B); (C) 상기 단계(B)의 반응물에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 단계(A)의 배양은 30±5 ℃, 용존산소량 10% 이상의 조건에서 20 내지 50시간 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 30±3℃, 용존산소량 30±3%의 조건에서 24 내지 48시간 동안 진행될 수 있다. 또한 상기 기질은 라우릴산 메틸일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계(B)의 반응은 0.5 내지 5%의 탄소원으로 10 내지 30시간 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 3%의 탄소원으로 15 내지 25시간 동안 진행될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 약 1%의 도데칸으로 15 내지 25시간 동안 진행될 수 있다.
상기 단계(C)의 배양은 0.1 내지 2 ml/L/h 의 기질 및 1 내지 3 g/L/h 의 글루코스로 50 내지 100 시간 동안 진행될 수 있으며, 바람직하게는 0.5 내지 1 ml/L/h 의 기질 및 1.5 내지 2.5 g/L/h 의 글루코스로 80 내지 100시간 동안 진행될 수 있다. 상기 기질은 라우릴산 메틸일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 디오익 산류는 에탄디오익산(ethanedioic acid), 프로판디오익 산(propanedioic acid), 부탄디오익 산(butanedioic acid), 펜탄디오익 산(pentanedioic acid), 헥산디오익 산(hexanedioic acid), 옥탄디오익 산(octanedioic acid), 노난디오익 산(nonanedioic acid), 데칸디오익 산(decanedioic acid), 언데칸디오익 산(undecanedioic acid), 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid) 및 헥사데칸디오익 산(hexadecanedioic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는, 디오익 산류가 도데칸디오익 산 일 수 있다.
상기 캔디다 인판티콜라 균주는 유전자 조작을 하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라일 수 있다.
또한, 상기 캔디다 인판티콜라 균주는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)일 수도 있다.
상기 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)는 탄화수소 및 지방산으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합을 탄소원으로 이용하는 균주일 수 있다.
상기 탄소원은 탄소수 6 내지 30의 탄화수소 또는 지방산, 바람직하게는 탄소수 8 내지 20의 알케인 또는 지방산으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid), 이들의 유도체, 또는 이들의 조합일 수 있으며, 라우르산의 유도체는 C1-8 알킬라우레이트일 수 있다. 바람직하게는 메틸라우레이트(methyl laurate), 에틸라우레이트, 프로필라우레이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 캔디다 인판티콜라(Candida infanticola) 균주는 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익산(dioic acids)류를 생산하는 것을 특징으로 한다.
상기 캔디다 인판티콜라 균주는 유전자 조작하지 않은 야생형 캔디다 인판티콜라인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 균주는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP)균주를 제공한다.
상기 균주는 탄화수소 또는 지방산을 유일한 탄소원으로 성장할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것을 특징으로 할 수 있다.
균주는 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 적어도 하나의 탄소원을 이용하여 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid; DDDA)을 생산하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술 사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속하는 것도 자명한 것이다.
< 실시예 1> 캔디다 인판티콜라 DS02 ( candida infanticola DS02 )( KCTC 12820BP) 균주의 분리
고농도의 다양한 탄소원이 포함된 석유화학 공장의 폐수를 처리 하기 위해 오일세퍼레이터(CPI, Coagulated Plate Interceptor)에서 일차적으로 처리를 진행한 후 균등조, 폭기조, 침전조 등을 거쳐가며 폐수 처리를 진행하는 석유화학 공정의 폐수처리시설의 오일세퍼레이터(CPI), 폭기조, 침전조에서 시료를 채취하였다.
상기 시료는 오일세퍼레이터의 유입수, 오일세퍼레이터의 방류수, 균등조 방류수, 폭기조 유입수, 폭기조 방류수, 침전조 유입수 및 침전조 방류수에서 폐수 샘플을 1L 멸균 수질 샘플 팩에 채취하여 준비하고, 채취한 시료는 아이스박스에 넣어 실험실로 이송하였다. 상기 채취한 샘플의 일부를 하기 표 1에 나타낸 1차 배양 배지의 조성으로 만들어진 고체 배지(agar plate)에 1차 평판도말(spreading)하고, 30℃ 항온 배양기에서 1주일간 배양하였다. 배양 후, 도데칸(Dodecane; C12 알케인)이 포함된 배양액에서 생장성이 빠른 균주를 선별하기 위해, 고체 배지에 생성된 군락(colony)들을 채취하여, 하기 표 1에 나타낸 2차 배양 배지의 조성으로 만들어진 도데칸(Dodecane; C12 알케인)을 유일한 탄소원으로 포함하는 경쟁 유도 연속식 집적배양 배지에 접종하여 30℃, 1 v/v/m 통기량, 400 rpm 교반속도 및 pH 5.0 (controlled by 10N NaOH)의 조건의 경쟁 유도 연속식 집적배양장치(도 1)에서 배양 하였다. 상기 경쟁 유도 연속식 집적배양 시 초기 투입된 20g/L의 도데칸을 소진한 후, 추가로 40g/L의 도데칸이 포함된 하기 표 2의 추가 배지를 투입하여 희석률(dilution rate)을 0에서 0.4까지 상승 시켜, 최종적으로 생장성이 가장 우수한 균주 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)를 분리 하였다. 상기 실험에서 일부 미생물의 성장을 억제하기 위하여 항생제 카나마이신 25m g/L를 사용하였다. 상기 실험 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
배지 조성 1차 배양 배지
(고체 배지)		 경쟁 유도 연속식 집적배양 배지
2차 배양 배지 추가 배지
YNB
(Yeast nitrogen base without amino acid)		 6.7 g/L 20 g/L 20 g/L
도데칸(Dodecane) 10 g/L 20 g/L 40 g/L
계면활성제 Gum Arabic 0.5 % Tween 80 3 mL/L Tween 80 3 mL/L
< 실험예 1> 분리균주의 18s rRNA 유전학적 분석
상기 실시예 1에서 분리한 분리균주에 대해서 18s rRNA 염기서열분석법으로 분석하였다. Yeast gDNA prep kit(PureHelixTM, NANOHELIX)를 이용하여 상기 실시예 1의 분리균주의 genomic DNA를 추출하고, 상기 추출한 genomic DNA를 주형으로 하기 표 2의 18s ITS ¼ primer를 이용한 PCR 반응으로 증폭 시킨 후, TA 벡터 클로닝 시킨 후, DNA 시퀀싱 반응을 통하여 18s rRNA 염기서열을 얻었으며, 상기 염기서열은 서열번호 1 및 도 4에 나타내었다.
염기서열(5' → 3') 서열번호
정방향 프라이머 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G 서열번호 2
역방향 프라이머 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 서열번호 3
서열번호 1에 나타낸 상기 분리 균주의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 BLAST(Basic Local Alignment search tool)을 사용하여 균주의 상동성을 조사하였다. 상기 조사결과는 하기 표 3에 나타내었다.
하기 표 3에 나타낸 바와 같이 상기 분리균주는 캔디다 인판티콜라 CBS11940 와 높은 상동성을 가지는 근연종인 것을 확인 할 수 있었다.
분리 균주 서열의 길이 근연종 상동성
Candida infanticola DS02 441bp Candida infanticola strain CBS11940 (HQ695010) 99%
<실험예 2> 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820 BP)의 탄소원 자화능(資化能) 분석
상기 균주(캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP))의 탄소원 자화능을 알아보기 위하여 API 20c AUX (Biomerieux 社)를 사용하여 분석 하였다, API 20c AUX (Biomerieux 社)를 이용하여 분석한 실험 결과는 종래의 캔디다 인판티콜라 kurtzman 및 캔디다 인판티콜라 sp.와 비교분석 하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
탄소원 실시예 1
(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)		 비교예 1
(Candida infanticola kurtzman)		 비교예 2
(Candida infanticola sp.)
글루코오스(Glucose) + + +
글리세롤(Glycerol) - + +
2-케토-D-글루콘산
(2-keto-D-gluconate)		 - - -
L-아라비노오스(L-Arabinose) - - -
D-자일로스(D-Xylose) - - -
아도니톨(Adonitol) - - -
자일리톨(Xylitol) - - -
D-갈락토스(D-galactose) - + +
이노시톨(Inositol) - - -
D-솔비톨(D-Sorbitol) - + +
A-메틸-D-글루코시드
(A-Methyl-D-glucoside)		 - - -
N-아세틸-D-글루코사민
(N-Acetyl-D-glucosamine)		 - - -
D-세롤비오스(D-Cellobiose) - - -
D-젖당(D-Lactose) - - -
D-맥아당(D-Maltose) - - -
D-자당(D-Saccharose (Sucrose)) - - -
D-트레할로오스(D-Trehalose) - - -
D-멜레치토오스(D-Melezitose) - - -
D-라피노오스(D-Raffinose) - - -
상기 표 4에 나타낸 바와 같이 비교예 1(Candida infanticola kurtzman) 및 비교예 2(Candida infanticola sp.) 와 캔디다 인판티콜라 DS02(KCTC 12820BP)(실시예 1)을 비교해 보면, 기존에 알려진 캔디다 인판티콜라 균주인 비교예 1 및 비교예 2의 경우 글루코오스, 글리세롤, D-갈락토스 및 D-솔비톨의 탄소원에 대한 자화능을 가지는 반면, 캔디다 인판티콜라 DS02(KCTC 12820BP)는 탄소원으로 글루코스만 이용할 수 있었다. 상기와 실험 결과와 같이 본 발명의 신규한 캔디다 인판티콜라 DS02(KCTC 12820BP)는 기존의 균주들과 비교하여 탄소 자화능에서 큰 차이를 보이는 것을 확인 할 수 있었다.
<실험예 3> 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820 BP)의 최적 성장 pH
캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 최적 성장 pH를 알아보기 위하여, 상기 균주를 아미노산이 포함되지 않은 YNB(Yeast Nitrogen base (without amino acid)) 배지의 초기 pH를 4 내지 7로 다양하게 설정하고 배양하였다. 상기 실험 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 캔디다 인판티콜라 DS02(KCTK 12820BP)의 최적생장 pH는 pH 7인 것을 확인 할 수 있었다.
<실험예 4> 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820 BP)균주를 알케인(C12)을 유일한 탄소원으로 배양하였을 때의 알케인(C12) 기질 섭취 속도 비교
캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 알케인(C12) 기질 배양에서의 알케인(C12) 소모 속도 및 생산되는 균체량에 대하여 알아보기 위하여, 하기 표 5에 나타것과 같이 20 g/L의 도데칸을 유일한 탄소원으로 포함하는 효모 추출 배지에 실시예 1의 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP) 및 비교 표준 균주 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis; ATCC 20336)를 배양 하였다. 상기 실험 결과는 도 6에 나타내었다.
구 성 함 량(g/L)
Dodecane 20
MgSO4ㆍ7H2O 1
Yeast extract 20
(NH4)2SO4 8
KH2PO4(monobasic) 2
NaCl 0.1
CaCl2ㆍ2H2O 0.1
Trace element solution CaCl2 · 2H2O 13.2 g/L 1ml
FeSO4 · 7H2O 8.4 g/L
MnSO4 · 4H2O 2.4 g/L
ZnSO4 · 7H2O 2.4 g/L
CuSO4 · 5H2O 0.48 g/L
CoCl2 · 6H2O 0.48 g/L
Na2MoO4 · 2H2O 0.24 g/L
K2B4O7 · 4H2O 0.06 g/L
CaCl2 · 2H2O 13.2 g/L
Antifoam 0.5ml
도 6에 나타낸 바와 같이, 캔디다 인판티콜라 DS02의 도데칸 소모 속도는 일당 6.2 g/L로 비교 균주로 사용된 캔디다 트로피칼리스의 도데칸 소모 속도 일당 3.7 g/L 에 비해 1.6배 빠른 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 생산된 균체량 또한 17% 높은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2> 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820 BP)에 의한 도데칸(dodecane)의 DDDA(dodecanedioic acid) 전환
캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP) 및 상기 균주와 같은 속의 유전자 조작이 되지 않은 야생형 균주 캔디다 트로피칼리스(Candida trpoicalis; ATCC 20336), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis) 및 피키아 카리비카(Pichia caribbica)에 의한 도데칸의 DDDA(dodecanedioic acid) 전환을 위한 초기 세포량(cell mass)을 얻기 위하여 50g/L의 글루코스를 포함하는 라우릴산 메틸(methyl laurate)기질을 사용한 효모 추출(yeast extract) 배지에 실시예 1의 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)를 30℃, 1 v/v/m 통기량, 용존 산소량(dissolved oxygen:DO) 30%의 교반 속도(DO 값에 따라 100~900 rpm) 및 pH 5 로 24 내지 48시간 동안 배양한 후, 1% 도데칸을 이용하여 pH 7에서 12 내지 20시간 동안 오메가-옥시데이션(ω-oxidation) 유도를 진행한 후, 라우릴산 메틸 0.5 내지 1.0 ml/L/h 및 글루코스 2 g/L/h 로 넣어주며 96시간 배양하여 pH 7 내지 8에서 DDDA 전환을 진행하였다. 상기 실험 결과는 도 7, 도 8 및 하기 표 6에 나타내었다.
144 시간 배양결과 O.D. (max.) DDDA 농도 (g/L)
실시예 1
(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)		 157.4 14.0
비교예 3
(Candida tropicalis; ATCC 20336)		 133.1 0.62
비교예 4
(Candida parapsilosis)		 146.8 0
비교예 5
(Pichia caribbica)		 141.8 0
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1(Candida infanticola DS02; KCTC 12820BP)의 경우 144시간 배양결과 O.D (Optical density)값 및 DDDA 농도가 157 및 14.0 g/L으로 비교예 3(Candida tropicalis; ATCC 20336)의 O.D 값 133.1 및 DDDA 농도 0.62 g/L 보다 월등히 높게 나타났으며, 비교예 4 및 비교예 5에서는 DDDA 전환이 이루어지지 않고, 투입된 탄소원은 세포의 성장에만 사용된 것을 확인할 수 있었다.
<110> LOTTE CHEMICAL CORPORATION Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> METHODS FOR PRODUCING DIOIC ADIDS USING CANDIDA INFANTICOLA SP. <130> DPA-0673 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 434 <212> DNA <213> Candida infanticola DS02 <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ttgagattca tattacacct gtgaaacaac 60 taaattgctt ggccgaaagg ccaatgtaac aaaaactatt ttacctatta tatctgaaaa 120 acgaaatcaa aagtttcaac aacggatctc ttggttctcg catcgatgaa gaacgcagca 180 aagcgcgata gttagtgtga attgcagacg tgaatcattg agtttttgaa cgcacattgc 240 accttctggt attccgggaa gtatacttgt gcgagcgtca tttcatcttc ataaagcaat 300 ttatgtgttg gggctgtagc cagccttgaa aaagatgata gagtacatgt tagacacaat 360 gtgcttttct atatttttga cctcgtatca agcaagatta cccgctgaac ttaagcatat 420 caataagcgg agga 434 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s ITS quarter forward primer <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s ITS quarter reverse primer <400> 3 tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (15)

  1. 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주를 이용하여, 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익산(dioic acids)류를 생산하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 디오익산류를 생산하는 방법은
    (A) 초기 셀 매스를 확보하기 위한 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질을 첨가한 효모추출물 글루코스 배지(yeast extract glucose medium; YG medium)에서 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주를 배양하는 단계;
    (B) 상기 단계 (A)로부터 얻어진 배양액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원을 첨가하여 오메가-옥시데이션(ω-oxidation) 반응을 유도하는 단계; 및
    (C) 상기 단계 (B)로부터 얻어진 반응액에 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 기질 및 글루코스를 첨가하며 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 단계(A)의 배양은 30±5 ℃, 용존산소량 10% 이상의 조건에서 20 내지 50시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 단계(B)의 반응 0.5 내지 5%의 탄소원으로 10 내지 30시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 단계(C)의 배양은 0.1 내지 10 ml/L/h 의 기질 및 1 내지 3 g/L/h 의 글루코스로 50 내지 100 시간 동안 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 디오익산류는 에탄디오익산(ethanedioic acid), 프로판디오익산(propanedioic acid), 부탄디오익산(butanedioic acid), 펜탄디오익산(pentanedioic acid), 헥산디오익산(hexanedioic acid), 옥탄디오익산(octanedioic acid), 노난디오익산(nonanedioic acid), 데칸디오익산(decanedioic acid), 언데칸디오익산(undecanedioic acid), 도데칸디오익산(dodecanedioic acid) 및 헥사데칸디오익산(hexadecanedioic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 균주는 유전자 조작하지 않은 야생형 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 탄소원으로부터 디오익산(dioic acids)류를 생산하는 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 균주는 유전자 조작하지 않은 야생형 균주인 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 균주는 탄화수소 또는 지방산을 유일한 탄소원으로 성장할 수 있는 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 탄소원은 도데칸(dodecane), 메틸 라우레이트(Methyl laulate), 라우르산(lauric acid) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되거나 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주.
  12. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 균주는 탄화수소 또는 지방산을 포함하는 적어도 하나의 탄소원을 이용하여 도데칸디오익산(dodecanedioic acid: DDDA)을 생산하는 것을 특징으로 하는 캔디다 인판티콜라 DS02(Candida infanticola DS02)(KCTC 12820BP) 균주.
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