CN108401434B - 新的婴儿假丝酵母菌株及其突变体菌株和转化体菌株以及使用该菌株生产二元酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用婴儿假丝酵母(Candida infanticola)菌株，从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的方法，以及用于该方法的婴儿假丝酵母(Candida infanticola)微生物。本发明降低了由于使用化石燃料引起的国际油价波动和环境污染负担所导致的成本增加，因此可以用于以DDDA为原料的各种工业领域中。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用婴儿假丝酵母(Candida infanticola)菌株从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸(dioic acids)的方法，以及为此所使用的婴儿假丝酵母(Candidainfanticola)微生物。
背景技术
二元酸(dioic acids)是在化学工业中非常重要的化学物质，用于各种工业应用，例如在工程树脂、汽车零配件、体育用品、地毯和牙刷中使用的石油衍生的尼龙，以及其它聚合增塑剂，粘合剂，润滑剂、环氧树脂，缓蚀剂，涂层剂，加工塑料，香水和药品。在这些二元酸(dioic acids)中，每年从石化原料合成约15,000,000,000磅十二烷二酸。这些石化原料主要是稀缺的天然原料，其应用与全球环境破坏和变化密切相关，而且这些石化原料对价格波动敏感并且增加了环境污染的负担。
因此，需要可再生、可持续且能够减轻环境负担的二元酸的替代生产方法。
发明内容
发明要解决的问题
为了解决上述那样现有技术中存在的问题，本发明的目的在于，提供一种生产二元酸的方法和婴儿假丝酵母(Candida infanticola)菌株。
解决问题的手段
为了实现上述目标，本发明提供了一种使用婴儿假丝酵母(Candidainfanticola)菌株，从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的方法。
所述生产二元酸的方法可以包括以下步骤：
(A)将婴儿假丝酵母菌株培养在酵母提取物葡萄糖培养基(YG Medium：yeastextract glucose medium)中以确保初始细胞质量，所述酵母提取物葡萄糖培养基补充有含烃类或脂肪酸的基质；
(B)将碳源或含烃类、脂肪酸或其衍生物的基质添加到在步骤(A)获得的培养溶液中，以诱导ω-氧化反应(ω-oxidation)；和
(C)在步骤(B)获得的反应溶液中添加含烃类或脂肪酸的基质和葡萄糖，并进行培养。
步骤(A)的培养可以在30±5℃，10％或更高的溶解氧的条件下进行20小时至50小时。
进一步地，步骤(B)的反应可以使用0.5％至5％的碳源进行10小时至30小时。
进一步地，步骤(C)的培养使用0.1ml/L/h至2ml/L/h的基质和1g/L/h至3g/L/h的葡萄糖进行50小时至100小时。
在所述生产二元酸的方法中，所述二元酸可以选自由乙二酸(ethanedioicacid)、丙二酸(propanedioic acid)、丁二酸(butanedioic acid)、戊二酸(pentanedioicacid)、己二酸(hexanedioic acid)、辛二酸(octanedioic acid)、壬二酸(nonanedioicacid)、癸二酸(decanedioic acid)、十一烷二酸(undecanedioic acid)、十二烷二酸(dodecanedioic acid)、十六烷二酸(hexadecanedioic acid)和它们的组合组成的组。
在所述生产二元酸的方法中，所述婴儿假丝酵母菌株可以是婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)，婴儿假丝酵母突变体菌株(Candidainfanticola LC-DA01；KCTC13099BP)，婴儿假丝酵母转化体菌株(Candida infanticola；KCTC13103BP,KCTC13104BP,KCTC13105BP,KCTC13106BP)或它们的组合。
进一步地，本发明提供了从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的婴儿假丝酵母(Candida infanticola)菌株。
发明的效果
本发明涉及一种使用婴儿假丝酵母(Candida infanticola)菌株从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的方法，并且涉及为此所使用的婴儿假丝酵母(Candidainfanticola)微生物。本发明降低了由于使用化石燃料引起的国际油价波动和环境污染负担所导致的成本增加，因此可以用于以DDDA为原料的各工业领域中。
附图说明
图1是简要表示诱导竞争连续式培养装置的图。
图2是示出在诱导竞争连续式培养中，微生物的OD值随时间变化的图。
图3是示出在诱导竞争连续式培养中，微生物的稀释率(dilution rate)随时间变化的图。
图4是示出分离菌株的18s rRNA碱基序列的图。
图5是示出分离菌株(婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP))在不同pH下的生长速率的图。
图6是示出婴儿假丝酵母野生型菌株(KCTC 12820BP)和热带假丝酵母(Candidatropicalis；ATCC 20336)随时间的十二烷消耗速率和所产生的细胞的量的图表。
图7是示出十二烷通过婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)进行十二烷二酸(DDDA：dodecanedioic acid)转化的图表。
图8是示出十二烷通过热带假丝酵母(Candida tropicalis；ATCC20336)进行十二烷二酸(DDDA：dodecanedioic acid)转化的图表。
图9是关于使用蒸汽制造固体培养基的示意图。
图10是示出按照单一碳源的存在或不存在，婴儿假丝酵母突变体菌株(Candidainfanticola LC-DA01：KCTC13099BP)的OD值的图表。
图11是示出突变体菌株使用脂肪酸转化二元酸的结果的图表。
图12是示出突变体菌株使用十二烷转化二元酸的结果的图表。
图13是示出突变体菌株使用癸烷转化二元酸的结果的图表。
图14是示出通过热处理(heat-shock)对菌株进行转化的结果的图。
图15是示出根据羟基脲浓度的细胞状态的相差显微镜照片。
图16是制造尿嘧啶营养缺陷型菌株的盒式模拟图和gDNA PCR的结果。
图17是用于制造CiPOX1基因缺陷型菌株的盒式模拟图和gDNA PCR的结果。
图18是用于制造CiPOX2基因缺陷型菌株的盒式模拟图和gDNA PCR的结果。
图19是用于制造CiPOX1和CiPOX2基因缺陷型菌株的盒式模拟图和gDNA PCR的结果。
图20是示出野生型菌株、CiPOX1基因缺陷型菌株和CiPOX1/CiPOX2基因缺陷型菌株在摇瓶中生产二元羧酸的能力的结果。
图21是示出CiPOX1/CiPOX2基因缺陷型菌株在5L发酵罐中生产二元羧酸的能力的结果。
具体实施方式
可以对本公开的实施方式进行形式和细节上的各种改变，因此不应该被解释为受限于本文所阐述的各方面。本公开的实施方式不限于本说明书中描述的各方面，因此应该理解的是，本公开的实施方式包括在本公开的实施方式的精神和范围内所包含的各种变型例或替代等同物。而且，在描述本发明时，如果认为对相关公知技术的具体描述反而误导本发明的宗旨或者使其不清楚的，则省略该详细描述。
在下文中，将对本发明进行详细描述。
本文中使用的术语“阻断”可以与术语“抑制”互换，并且可意味着阻断一些通路或反应。
进一步地，术语“烃”可以指仅由碳和氢组成的有机化合物。
进一步地，“脂肪酸”可以指链式饱和或不饱和的一元羧酸。
进一步地，术语“ω-氧化(ω-oxidation)”可以指其中将脂肪酸的末端甲基氧化成二元羧酸的反应，并且术语“β-氧化(β-oxidation)”可以指其中羧基的β-碳原子被氧化降解，同时释放乙酰辅酶A(CoA)的反应。通常，脂肪酸的氧化主要是脂肪酸从末端羧基被切割成两个碳的单元的β-氧化，并且ω-氧化被理解为是用于碳数为10至12的中链脂肪酸的补充通路。
根据本发明的生产二元酸的方法，可以使用婴儿假丝酵母(Candidainfanticola)菌株，从含有烃类或脂肪酸的基质生产二元酸。
所述生产二元酸的方法的特征在于包括以下步骤：(A)将婴儿假丝酵母菌株培养在酵母提取物葡萄糖培养基(YG培养基)中以确保初始细胞质量，所述酵母提取物葡萄糖培养基补充有含烃类或脂肪酸的基质；
(B)将碳源或含烃类、脂肪酸或其衍生物的基质添加到步骤(A)的培养溶液中，以诱导ω-氧化反应；和
(C)在步骤(B)的反应溶液中添加含烃类或脂肪酸的基质和葡萄糖，并进行培养。
步骤(A)的培养可以在30±5℃，10％或更高的溶解氧的条件下进行20小时至50小时，优选可以在30±3℃，30±3％的溶解氧的条件下进行24小时至48小时。进一步地，所述基质可以是月桂酸甲酯(methyl laurate)，但不限于此。
步骤(B)的反应可以使用基质或0.5％至5％的碳源进行10小时至30小时，优选可以使用基质或0.5％至3％的碳源进行15小时至25小时，更优选可以使用约1％的十二烷进行15小时至25小时。
步骤(C)的培养可以使用0.1ml/L/h至2ml/L/h的基质和1g/L/h至3g/L/h的葡萄糖进行50小时至100小时，优选可以使用0.5ml/L/h至1ml/L/h的基质和1.5g/L/h至2.5g/L/h的葡萄糖进行80小时至100小时。所述基质可以是月桂酸甲酯(methyl laurate)，但不限于此。
所述二元酸可以选自由乙二酸(ethanedioic acid)、丙二酸(propanedioicacid)、丁二酸(butanedioic acid)、戊二酸(pentanedioic acid)、己二酸(hexanedioicacid)、辛二酸(octanedioic acid)、壬二酸(nonanedioic acid)、癸二酸(decanedioicacid)、十一烷二酸(undecanedioic acid)、十二烷二酸(dodecanedioic acid)、十六烷二酸(hexadecanedioic acid)和它们的组合组成的组、优选所述二元酸可以包括十二烷二酸。
所述婴儿假丝酵母菌株可以选自野生型菌株、突变体菌株、转化体菌株和它们的组合。
具体地，所述野生型菌株可以是未经基因操作的婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)，所述突变体菌株可以是婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；KCTC13099BP)，所述转化体菌株可以是婴儿假丝酵母转化体菌株(Candida infanticola；KCTC13103BP,KCTC13104BP,KCTC13105BP,KCTC13106BP)。
根据一个实施方式，所述婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)可以是使用选自由烃类、脂肪酸及其组合组成的组中的碳源的菌株。
所述碳源可以选自碳数为6至30的烃类或脂肪酸，优选碳数为8至20的烷烃类或脂肪酸。例如，所述碳源可以是十二烷(dodecane)、月桂酸甲酯(methyl laulate)、月桂酸(lauric acid)、其衍生物或其组合，并且月桂酸的衍生物可以是月桂酸C1-8烷基酯。优选地，所述碳源可以选自由月桂酸甲酯(methyl laulate)、月桂酸乙酯、月桂酸丙酯及其组合组成的组。
另外，婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；KCTC13099BP)可以是使用选自烃类、脂肪酸及其组合中的基质的菌株。所述突变体菌株可通过对野生型菌株进行处理(例如甲磺酸乙酯(EMS：ethyl methanesulfonate)、紫外线(UV：ultraviolet)或其组合)的方法来制造，但不限于此。
另外，婴儿假丝酵母转化体菌株(Candida infanticola；KCTC13103BP，KCTC13104BP，KCTC13105BP，KCTC13106BP)可以使用选自烃类、脂肪酸及其组合中的基质。可以通过例如热处理和电穿孔等物理刺激，例如羟基脲处理等化学刺激等等诱导形态性质转化，来制造转化体菌株，并且可以例如通过使用聚乙二醇(PEG)、乙酸锂、二甲基亚砜(DMSO)等进行热处理(heatshock)来提高转化效率。一般来说，已知的是，根据细胞周期，调节真核生物例如酵母的同源重组和非同源重组。同源重组可能主要发生在使用染色单体进行DNA复制的S期和G2期，并且例如，为了增加同源重组的可能性，可以使用羟基脲(hydroxyurea)来调节细胞周期。具体而言，羟基脲(hydroxyurea)可以抑制核糖核苷酸还原酶并减少用于DNA合成的dNTP的量，从而将细胞周期阻滞在S期中。因此，可以增加转化时的同源重组的可能性。
根据一个实施方式，转化体菌株可包括使用URA3和POX基因进行缺失的菌株。可以通过例如对野生型婴儿假丝酵母菌株实施热处理(heatshock)、羟基脲(hydroxyurea)处理或其组合，并且可以由本领域技术人员适当地选择施用的顺序和次数，来诱导基因缺陷型菌株的转化。进一步地，根据一个实施方式，转化体菌株可以是单倍体的。例如，一般而言，与热带假丝酵母(Candida tropicalis)(其是主要用于二元羧酸工业生产的二倍体)相比，其多倍体是单倍的婴儿假丝酵母菌株在基因操作中可能是有利的。
下文中，本发明通过以下实施例进行更详细的解释。以下实施例旨在进一步阐明本发明。因此，本领域的普通技术人员将认识到，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文所描述的实施方式进行各种改变和修改。
实施例1：婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)的分离
从石油化工过程的废水处理设施的油分离器(CPI：Coagulated PlateInterceptor)、曝气池和沉淀池收集样品，其中石油化工过程的废水处理设施在油分离器(CPI)中进行第一次处理之后通过均质池(equalization tank)、曝气池、沉淀池等对废水进行加工，以处理来自石化厂的含高浓度的各种碳源的废水。
通过将来自油分离器的进水、油分离器的出水、均质池的出水、曝气池的进水、曝气池的出水、沉淀池的进水和沉淀池的出水的废水样品收集到1L无菌水样品容器中来制备样品，并且将收集的样品放入冰盒中，转移至实验室。首先将一部分收集的样品涂布(spread)在由下表1所示的原代培养基组合物制成的固体培养基(琼脂平板，ager plate)上，并在30℃恒温培养箱中培养1周。培养之后，为了在含有十二烷(Dodecane，C12烷烃)的培养液中选择生长速率高的菌株，而收集在固体培养基上生成的菌落(colony)，接种到含十二烷(Dodecane，C12烷烃)作为仅有碳源、由下述表1中所示的继代培养基组合物制成的诱导竞争连续式培养基中，然后在30℃、1v/v/m的气流量、400rpm的搅拌速度和pH5.0(由10NNaOH控制)的条件下培养在诱导竞争连续式培养装置(图1)中。在诱导竞争连续式培养期间消耗掉最初添加的20g/L的十二烷后，再另外添加下表2的含有40g/L十二烷的额外培养基，然后将稀释率(dilution rate)从0增加至0.4，由此作为具有最佳生长的菌株而最终分离出婴儿假丝酵母野生型菌株。该分离出的婴儿假丝酵母野生型菌株被命名为Candidainfanticola DS02，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC 12820BP，2015年5月29日)。在这个实验中，使用25mg/L的抗生素卡那霉素来抑制一些微生物的生长。上述实验的结果示于图2和图3中。
[表1]
测试例1：对分离菌株的18s rRNA的基因分析
通过对18s rRNA碱基序列的分析，分析了在实施例1中分离出的分离菌株。使用Yeast gDNA prep试剂盒(PureHelixTM，NANOHELIX)提取实施例1的分离菌株的基因组DNA(genomic DNA)，然后提取的基因组DNA作为模板，使用下表2所示的18s ITS1/4引物进行PCR扩增。在克隆TA载体后，通过DNA测序反应获得18s rRNA的碱基序列，并且碱基序列显示为图4中的SEQ ID NO.1。
[表2]
| 碱基序列(5'→3') | SEQ ID NO. | |
| 正向引物 | TCC GTA GGT GAA CCT GCG G | SEQ ID NO.2 |
| 反向引物 | TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC | SEQ ID NO.3 |
对于图4所示的分离菌株的碱基序列(SEQ ID NO.1)，使用NCBI(美国国立生物技术信息中心)的BLAST(基本局部比对搜索工具)检测了菌株的同源性。检测结果示于下表3中。
如下表3所示，可以证实分离菌株是与婴儿假丝酵母CBS11940具有高度同源性的近似种。
[表3]
| 分离菌株 | 序列长度 | 近似种 | 同源性 |
| 婴儿假丝酵母DS02 | 441bp | 婴儿假丝酵母菌株CBS11940(HQ695010) | 99％ |
测试例2：婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)的碳源同化能力分析
为了检查上述菌株(婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC12820BP))的碳源同化能力，使用API 20c AUX(Biomerieux公司)进行了分析。通过使用API20c AUX(Biomerieux公司)分析的实验结果与现有的婴儿假丝酵母库兹曼(Candidainfanticola kurtzman)和婴儿假丝酵母菌种(Candida infanticola sp.)进行比较，结果示于下表4中。
[表4]
如上表4所示，当对比例1(Candida infanticola kurtzman)和对比例2(Candidainfanticola sp.)与婴儿假丝酵母野生型菌株(KCTC 12820BP)(实施例1)进行比较时，可以证实，对比例1和对比例2的先前已知的婴儿假丝酵母菌株对碳源，即葡萄糖、甘油、D-半乳糖和D-山梨醇具有同化能力，而婴儿假丝酵母野生型菌株(KCTC 12820BP)仅可使用葡萄糖作为碳源。如上述实验结果所示，可以发现，与现有菌株相比，本发明的新的婴儿假丝酵母野生型菌株(KCTC 12820BP)在碳同化能力上示出很大差异。
测试例3：婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)的最适生长pH
为了检查婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)的最适生长pH，将无氨基酸的酵母氮源(YNB：yeast nitrogen base(without aminoacid))培养基的初始pH以不同方式设定为4至7，并将菌株培养于该培养基中。实验结果示于图5中。
如图5所示，可以证实婴儿假丝酵母野生型菌株(KCTK 12820BP)的最适生长pH为pH 7。
测试例4：当使用烷烃(C12)作为仅有碳源培养婴儿假丝酵母野生型菌株(Candidainfanticola DS02；KCTC 12820BP)时，烷烃(C12)基质吸收速率的对比
为了检查在婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC12820BP)的烷烃(C12)基质培养物中，烷烃(C12)的消耗速率和所产生的细胞的量，将实施例1的婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)和作为对比标准菌株的热带假丝酵母(Candida tropicalis；ATCC 20336)培养在含20g/L十二烷作为仅有碳源的酵母提取物培养基中，如下表5所示。实验结果示于图6中。
[表5]
如图6所示，可以证实，婴儿假丝酵母DS02的十二烷消耗速率为每天6.2g/L，这比用作对比菌株的热带假丝酵母的每天3.7g/L的十二烷消耗速率快1.6倍。另外，可以证实生产的细胞的量也提高了17％。
实施例2：十二烷(dodecane)通过婴儿假丝酵母野生型菌株(Candidainfanticola DS02；KCTC 12820BP)转化成DDDA(十二烷二酸)
为了获得婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC12820BP)，野生型菌株属于与该菌株相同物种且未经遗传操作的热带假丝酵母(ATCC20336)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)和卡利比克毕赤酵母(Pichiacaribbica)将十二烷转化成DDDA(十二烷二酸)的初始细胞质量，而将实施例1的婴儿假丝酵母野生型菌株(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)在含50g/L葡萄糖的酵母提取物(yeast extract)培养基中，并且使用月桂酸甲酯(methyl laurate)基质，在30℃、1v/v/m的气流量、30％的溶解氧(DO：dissolved oxygen)的搅拌速度(取决于DO值为100rpm至900rpm)和pH 5的条件下，培养24小时至48小时，然后使用1％十二烷在pH 7下诱导ω-氧化(ω-oxidation)12小时至20小时。然后，继续培养9小时，同时添加0.5ml/L/h至1.0ml/L/h的月桂酸甲酯和2g/L/h的葡萄糖，以在pH 7至pH 8进行DDDA转化。实验结果示于图7、图8和下表6中。
[表6]
如上表6所示，作为培养144小时的结果，可以证实实施例1(Candida infanticolaDS02；KCTC 12820BP)示出O.D(光密度)值为157且DDDA浓度为14.0g/L，这比对比例3(Candida tropicalis；ATCC 20336)的133.1的OD值和0.62g/L的DDDA浓度高得多，并且在对比例4和对比例5中，没有DDDA转化且添加的碳源仅用于细胞生长。
实施例3：野生型婴儿假丝酵母菌株的突变体的诱导和筛选
野生型婴儿假丝酵母(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)菌株可以使用十二烷作为单一碳源来生长，但其中β-氧化(β-oxidation)通路被阻断的突变体菌株使用十二烷作为单一碳源基本不能生长。“基本不能生长”意味着“不生长”或“少量生长”。因此，通过比较在含葡萄糖(glucose)或十二烷(dodecane)作为单一碳源的固体培养基中的菌株生长，来选择突变体菌株。
为了诱导突变以选择突变体菌株，使用了甲基磺酸乙酯(EMS：ethyl methanesulfonate)和UV。使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液，制备了OD(光密度600nm)为0.01～0.1的婴儿假丝酵母(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)菌株悬浮液，向其中添加2％EMS(甲基磺酸乙酯)诱变剂以调整到1ml。悬浮液在30℃、150rpm条件下反应120分钟，离心去除上清液，然后用20％硫代硫酸钠洗涤两次以除去EMS。然后，将菌株悬浮在1ml的PBS缓冲液中。将10μl悬浮液涂布在YPD固体培养基上，在30℃培养3天，以获得存活率10％以内的初级突变体菌株。
将经EMS诱变剂处理的菌株悬浮于PBS(磷酸盐缓冲盐水：phosphate bufferedsaline)中，OD为0.01至0.1。将10μl悬浮液涂布在YPD固体培养基上，用UV(紫外线254nm)辐照120秒，并在30℃培养3天，以获得存活率约10％以内的次级突变体菌株。诱变过程可以通过EMS处理后的UV辐照，UV辐照后的EMS处理，或单独的EMS或UV来进行，并且突变的次数可以由本领域技术人员进行适当选择。
为了选择其中β-氧化(β-oxidation)通过诱变被阻断的突变体菌株，比较了在含葡萄糖(glucose)或十二烷(dodecane)作为单一碳源的固体培养基上的菌株生长。所使用的固体培养基的组成如下：使用葡萄糖(glucose)作为单一碳源6.7g/L、葡萄糖10g/L)的固体培养基(YNB，无氨基酸酵母氮源)，和使用十二烷作为单一碳源6.7g/L、十二烷10g/L)的固体培养基(YNB，无氨基酸酵母氮源)。在含十二烷的固体培养基(其颜色为不透明的白色)的情况下，不易于鉴定生长的菌落。因此，使用十二烷蒸气制备了固体培养基，并有效比较了菌株生长。固体培养基示于图9中。
该程序如下进行：将灭菌的纸滤器放入固体培养基中，将固定量的十二烷施加在滤器上，使十二烷在固体培养过程中作为蒸气在固体培养基中扩散，并且菌株使用十二烷。将候选突变体菌株悬浮于PBS缓冲液中，以获得OD为0.01至0.1的菌株悬浮液，使用微量移液器将10μl悬浮液接种于上述两种固体培养基上，然后在30℃培养3天。通过选择在葡萄糖固体培养基上生长良好、但在十二烷固体培养基上不生长(因为β-氧化被阻断)的菌株进行初选。
经初选的突变体菌株在含十二烷作为单一碳源的液体培养基中生长，以二次选择β-氧化基因被阻断的菌株。在本实施例中，总共选择了6株菌株进行液体培养。液体培养如下进行：将所选择的每株菌株均接种在250ml摇瓶(锥形瓶，Erlnmeyer flask)中的含70ml十二烷作为单一碳源的培养溶液中，初级培养物OD为1，并在30℃、150rpm条件下培养6天。所使用的液体培养基的组成为使用十二烷作为单一碳源20g/L、十二烷20g/L)的培养基(YNB，无氨基酸酵母氮源)。各培养结果示于图10的曲线图中，其中示出对于不使用十二烷作为碳源的突变体菌株和使用十二烷的突变体菌株所测量的OD值。将不使用十二烷的菌株确定为其中β-氧化被阻断的菌株，以完成二次选择。将β-氧化被阻断的突变体菌株命名为婴儿假丝酵母LC-DA01(Candida infanticola LC-DA01)，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13099BP，2016年9月8日)。
如图10所示，主要可以证实突变体菌株(登记号：KCTC13099BP)的β-氧化通路被阻断了。
实施例4：使用脂肪酸基质的婴儿假丝酵母突变体菌株的二元酸转化培养
为了获得婴儿假丝酵母突变体菌株(登记号：KCTC13099BP)用于月桂酸甲酯的十二烷二酸(DDDA)转化的初始细胞质量，将婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticolaLC-DA01；登记号：KCTC13099BP)在含葡萄糖50g/L并补充月桂酸甲酯基质的酵母提取物培养基中，在30℃、30％的溶解氧(DO)的搅拌速度(取决于DO值为100rpm至900rpm，)且pH 5下，培养24小时至48小时。在培养12小时至24小时期间，在完全消耗了50g/L的葡萄糖后，以1g/L/h至4g/L/h添加葡萄糖直至培养结束。
获得初始细胞质量后，使用1％十二烷，在pH7诱导ω-氧化(ω-oxidation)12小时至20小时，并且继续培养96小时至144小时，同时以0.5ml/L/h至4.0ml/L/h的月桂酸甲酯并且以1g/L/h至4g/L/h的葡萄糖，以在pH7至pH8下进行DDDA转化。结果示于图11和表7中。
[表7]
可以证实，培养108小时后，β-氧化(β-oxidation)被阻断的婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；登记号：KCTC13099BP)示出OD(光密度，最大/最终)值为62.1/36.2，DDDA浓度为140.9g/L(转化产率为90％)且DDDA生产率为1.67g/L/h，该DDDA浓度是其中β-氧化未被阻断的野生型婴儿假丝酵母菌株(Candida infanticolaDS02；KCTC 12820BP)的10.6g/L DDDA浓度的13倍或更高。
实施例5：婴儿假丝酵母突变体菌株使用烃基质的二元酸转化的培养
为了获得婴儿假丝酵母突变体菌株(KCTC13099BP)用于十二烷和癸烷的二元酸转化的初始细胞质量，婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；登记号：KCTC13099BP)在含葡萄糖50g/L并且补充月桂酸甲酯(methyl laurate)基质的酵母提取(yeast extract)培养基中，在30℃、1v/v/m的气流量、30％的溶解氧(DO)搅拌速度(取决于DO值为100rpm至900rpm)且pH 5的条件下，培养24小时至48小时。在培养12小时至24小时期间，完全消耗了50g/L的葡萄糖后，以1g/L/h至4g/L/h添加葡萄糖直至培养结束。
获得初始细胞质量后，使用1％十二烷，在pH7诱导ω-氧化(ω-oxidation)12小时至20小时，并且继续培养96小时至144小时，同时以0.5ml/L/h至4.0ml/L/h加入十二烷(dodecane)和癸烷(decane)基质并且以1g/L/h至4g/L/h加入葡萄糖，以在pH 7至pH 8进行DDDA转化。十二烷基质的结果示于图12中，而癸烷基质的结果示于图13和表8中。
[表8]
可以证实，培养96小时后，β-氧化(β-oxidation)被阻断的婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；登记号：KCTC13099BP)的十二烷基质发酵结果示出OD(光密度，最大/最终)值为64.2/42.6，DDDA浓度为122.5g/L(转化产率为99％)且DDDA生产率为1.70g/L/h，因此，通过使用烃类作为基质，可以因β-氧化(β-oxidation)的阻断而提高二元酸的生产率。
进一步地，可以证实，培养96小时后，β-氧化(β-oxidation)被阻断的婴儿假丝酵母突变体菌株(Candida infanticola LC-DA01；登记号：KCTC13099BP)的癸烷基质发酵结果示出OD(光密度，最大/最终)值为66.9/40.0，癸二酸(sebacic acid)浓度为77.6g/L(转化产率为99％)且癸二酸生产率为0.75g/L/h，因此，通过使用烃类作为基质，可以因β-氧化(β-oxidation)的阻断而提高二元酸的生产率。
测试例5：转化方法的优化
为了获得转化体菌株，作为导入外源基因的转化方法，使用了主要用于酵母的使用聚乙二醇(PEG)和乙酸锂的热处理(heatshock)法。菌株在YPED固体培养基上，在30℃培养20小时至24小时。收集2×106个婴儿假丝酵母(Candida infanticola DS02；KCTC12820BP)细胞，并且悬浮于含有50％聚乙二醇和乙酸锂混合物的缓冲液中。该悬浮液在30℃反应45分钟并且在42℃反应15分钟，然后除去上清液。将细胞重悬于YPED培养基中，在30℃振荡培养6小时，涂布在含抗生素的YEPD培养基上，并且在30℃培养3天。为了提高转化效率，通过在热处理过程中加入二硫苏糖醇(DTT)和二甲基亚砜(DMSO)等化学物质，对最有效的方法进行了对比。结果证实，用DMSO处理的热处理(heatshock)法效率最高，结果示于图14中。
测试例6：使用羟基脲进行细胞周期调节
同源重组可主要发生在使用染色单体进行DNA复制的S期和G2期。因此，为了增加同源重组的可能性，而使用羟基脲调节细胞周期。用0.2M羟基脲处理在YEPD培养基中生长的107个细胞/20ml的婴儿假丝酵母(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)并反应2小时。结果证实，最频繁地观察到S期细胞。结果示于图15中。
实施例6：获得尿嘧啶营养缺陷型菌株
作为婴儿假丝酵母(Candida infanticola DS02；KCTC 12820BP)的细胞周期通过上述热处理和羟基脲处理被阻滞在S期的细胞的形态性质转化结果，获得其中在URA3基因的位置被外源基因取代的尿嘧啶营养缺陷型菌株(Candida infanticola DS02 Ura3-)，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13103BP，2016年9月8日)。
作为选择性培养基，使用了补充尿嘧啶和5-氟乳清酸(5'-FOA)的基本培养基，图16示出了用于制造尿嘧啶营养缺陷型菌株的模拟图和使用gDNA PCR确认序列的结果。
在合成尿嘧啶的过程中，5-氟乳清酸(5'-FOA：5-Fluoroorotic acid)转化为5-氟尿嘧啶(一种有害物质)，从而导致细胞凋亡。因此，URA3基因缺陷型菌株可在含尿嘧啶和5'-FOA的培养基上生长，但不能在没有尿嘧啶的培养基上生长。
实施例7：β-氧化基因的选择
为了除去酰基辅酶A(acyl-CoA)氧化酶(pox基因)，一种在β-氧化的第一步骤中将脂肪酰基辅酶A转化为2-反式-烯脂酰-辅酶A的酶，而对比了热带假丝酵母20336的POX4、POX5和POX2基因的氨基酸序列。作为结果，两个基因CINF_04670和CINF_13455的同源性最高，为40％或更高，将这些基因命名为CiPOX1和CiPOX2。氨基酸序列进行了对比并示于下表9中。进一步地，对于CINF_04670，核酸以SEQ ID NO.4示出且氨基酸序列以SEQ ID NO.5示出。进一步地，对于CINF_13455，核酸序列以SEQ ID NO.6示出且氨基酸序列以SEQ ID NO.7示出。
[表9]
SEQ ID NO.4(核酸)
TAGTGTCATGAAGCCTTTCTTCACCCGCAAGTTCAACGACGACCCTGATCTCAGTGCTCTTGAGGAAGAGGAGGCCGAGGAGAACGAGTAA
SEQ ID NO.5(氨基酸)
MTKSLSTNPANDVVIDGKKYNTFTEPPKAMAAERAKASFPVREMTYYLDGGEKVTEYNEAVWEQLERAPAFDNTDYYDVCGDHELLRARTLAKVGAIAEIVTDGRSERDIQKVLSFVSVIDPGAMTRIGVHFGLFLNGVRGSGTSEQFNYWVGEGAANLSNFFGCFCMTELGHGSNVAGVETTATFDRNTEEFVINTPTIAASKWWIGGAAHTATHGLVFARLIVDGKDYGVKNFVVPLRDRNTWNLMPGVSIGDIGKKMGRDGIDNGWVQFSNVRIPRLFMMMKYAKVSKDGKVTQPPLAQLAYGALISGRVSMVYDSYTWARRFLTIAIRYACCRRQFSSSPGGLETKLIDYTFHQRRLLPRLAYAYAMNAGSAELYKIYFAATDRLASTKPTDKEGLQSAIDDVKELFSVSAGLKAFSTWGTAQIIDECRQACGGLGYSGYNGFGQGYNDWVVQCTWEGDNNVLTLSAGRSLIQSGLAIRKGEHVGAAASYLKRELNAKLNGRSLEDLNVLIDGWEHVSAVGISQAVDRYVELEKEGVSQTEAFERLSQQRYDVTRVHTRMYLIKSFFENLKTASPALQPVLTDLALLFALWSIEIDASVFLRYGFLEPKDISTITVLVNKYTGKVREQAIPLTDAFNQSDFVINAPIGNYNGDVYNNYFAKTKAANPPINTHPPYYDSVMKPFFTRKFNDDPDLSALEEEEAEENE
SEQ ID NO.6(核酸)
CGCATTCTTCAAGCGCACTCCCTATGAGCAACCCAGGCTCGATGAGATTTAA
SEQ ID NO.7(氨基酸)
MKANNTASLLKDGKELNTFTRPASDMQAERDRTSFPVREMTHFFNNGKENTEFLEKLFERIQRDPAFNNKDFYDLDYKPLRQRTFEQIGRMWSYLDELGADSPLARRFLSPFGMINPSAQTRVSVHYGLFVSALRGQGTDKQYEFWKSQGCLSLNRFYGCFGMTELGHGSNVAELETTATFDRATDEFIIHTPNTAATKWWIGGAAHSSNHTVCFARLIVDGKDYGVRNFVVPLRDPESHNLLPGIAVGDIGKKMGRDGIDNGWIQFSNVRIPRTYMLMRYSQVTPEGKVIEPPLAQLTYGALINGRVAMAYDSWVWARRFLTIALRYAAVRRQFSSTEGREESKLLDYVLHQRRLIPLLAQAIGIEAAATELYRLFDEVTHHQASLDTSDRKAVSDMVDKTKELFSLSAGLKAFSTWATVDTIDECRQACGGLGYLSATGFGQGFDDWVVNCTWEGDNNVLCLSAGRSLIQSGCKVLDGKHVTGAADYLGRIKTLRGKSLASGDLRDPKVLVGAWESVAAQAVMDAAEAYKKLRARGVSDKAAFEELSIDRFNIARLHTRCFQIKALFRKIANANPSIQKVLTNVGLLFALWSIEKNGSPFLQYGFLTSDDMNKVIDLVTFYCGEVRDQVIGITDSFNISDFFLNSPIGNYDGNAYENLMDSVTERNVPGTPCPYQDAMNAFFKRTPYEQPRLDEI
实施例8：CiPOX1基因缺陷型菌株的选择
使用在CiPOX1基因的两端含500bp同源区的URA3弹出式载体，来制造CiPOX1基因缺失盒，然后将CiPOX1基因缺失盒通过转化导入经调节处于S期的尿嘧啶营养缺陷型菌株(登记号：KCTC13103BP)。URA3弹出式载体含有用于在无尿嘧啶培养基中存活的热带假丝酵母URA3(Ct.URA3)基因，和用于缺失(弹出)Ct.URA3基因的、位于Ct.URA3基因两端的来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的重复序列，并且可以通过Ct.URA3基因在表10的无尿嘧啶培养基上选择经转化的菌株。SEQ ID NO.8示出热带假丝酵母URA3(Ct.URA3)序列，而SEQ ID NO.9示出来源于枯草芽孢杆菌的重复序列。图17中示出载体和缺失盒的模拟图，和使用gDNA PCR证实序列的结果。该选择出的CiPOX1基因缺陷型菌株被命名为Candidainfanticola DS02 pox1-，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13104BP，2016年9月8日)。
[表10]
| 培养基组成 | g/L |
| 右旋糖 | 20 |
| 无氨基酸的YNB | 6.7 |
| 琼脂 | 20 |
SEQ ID NO.8
cgggacatggggggtagagaagaagggtttgattggatcatcatgacgcctggtgtggggttggatgataaaggcgatgcgttgggccagcagtataggactgttgatgaggtggttctgactggtaccgatgtgattattgtcgggagagggttgtttggaaaaggaagagaccctgaggtggagggaaagagatacagggatgctggatggaaggcatacttgaagagaactggtcagttagaataaatattgtaataaataggtctatatacatacactaagcttctaggacgtcattgtagtcttcgaagttgtctgctagtttagttctcatgatttcgaaaaccaataacgcaatggatgtagcagggatggtggttagtgcgttcctgacaaacccagagtacgccgcctcaaaccacgtcacattcgccctttgcttcatccgcatcacttgcttgaaggtatccacgtacgagttgtaatacaccttgaagaacggcttcgtctgacccttgagcttcgcctcgttgtaatgattatacacatccaacgcttccaacctcgataaatggatcttctgcacttttgaaatcgggtactggatcgcaagcaacgagaacgccgccgatgctccggcaagcaacacaaacgaggacttcaagatc
SEQ ID NO.9
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实施例9：CiPOX2基因缺陷型菌株的选择
使用在CiPOX2基因的两端含500bp同源区的URA3弹出式载体，来制造CiPOX2基因缺失盒，然后将CiPOX2基因缺失盒通过转化导入经调节处于S期的尿嘧啶营养缺陷型菌株(登记号：KCTC13103BP)。URA3弹出式载体含有用于在无尿嘧啶培养基中存活的热带假丝酵母URA3(Ct.URA3)基因，和用于缺失(弹出，pop-out)Ct.URA3基因的、位于Ct.URA3基因两端的来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的重复序列(repeated sequence)，并且可以在无尿嘧啶培养基上选择经转化的菌株。图18中示出载体和缺失盒的模拟图，和使用gDNAPCR证实序列的结果。该选择出的CiPOX2基因缺陷型菌株被命名为Candida infanticolaDS02 pox2-，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13105BP，2016年9月8日)。
实施例10：CiPOX1和CiPOX2基因缺陷型菌株的选择
使用在CiPOX2基因的两端含500bp同源区的URA3弹出式载体，来制造CiPOX2基因缺失盒，然后将CiPOX2基因缺失盒通过转化导入经调节处于S期的CiPOX1和CtURA3缺陷型菌株。通过从CiPOX1缺陷型菌株(登记号：KCTC13104BP)弹出Ct.URA3来制造CiPOX1和CtURA3缺陷型菌株。URA3弹出式载体含有用于在无尿嘧啶培养基中存活的热带假丝酵母URA3(Ct.URA3)基因，和用于缺失(弹出，pop-out)Ct.URA3基因的、位于Ct.URA3基因两端的来源于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的重复序列(repeated sequence)。可以通过Ct.URA3基因，在无尿嘧啶培养基上选择经转化的菌株。图19中示出载体和缺失盒的模拟图，和使用gDNA PCR证实序列的结果。该选择出的CiPOX1和CiPOX2基因缺陷型菌株命名为Candida infanticola DS02 pox1-,pox2-，并保藏于韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(登记号：KCTC13106BP，2016年9月8日)。
实施例11：用于二元酸转化的婴儿假丝酵母转化体菌株的摇瓶培养
为了检查本发明的转化体菌株的二元羧酸生产率，将各菌株(野生型菌株(登记号：KCTC 12820BP)，POX1基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13104BP)，CiPOX2基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13105BP)，CiPOX1/CiPOX2基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13106BP))进行摇瓶培养。在500ml带挡板的烧瓶中进行50ml液体培养。培养条件如下：使用YPED培养基，总培养时间为72小时，30℃，200rpm，pH为6至7.5。为了确保足够量的细胞生长，菌株使用葡萄糖作为碳源培养24小时，然后向其中加入十二烷1％和调节至pH7.5的磷酸钾(potassiumphosphate)。从加入十二烷开始，每6小时加入一次0.5％的葡萄糖。作为在72小时证实转化的十二烷二酸的浓度的结果，野生型菌株(登记号：KCTC 12820BP)的浓度为0g/L，POX1基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13104BP)的浓度为9.39g/L，POX1和POX2基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13106BP)的浓度为9.32g/L。证实了CiPOX1缺陷型菌株不使用十二烷作为碳源，并且十二烷以92％(摩尔/摩尔)或更高的量转化为十二烷二酸。结果示于图20中。
实施例12：用于二元酸转化的婴儿假丝酵母转化体菌株的5L发酵罐培养
为了检查本发明的转化体菌株的二元羧酸生产力，使用CiPOX1和CiPOX2基因缺陷型菌株(登记号：KCTC13106BP)进行5L规模的发酵罐培养。初级培养条件是培养体积为2L，pH为5至6，温度为30℃，气流量为1vvm，且搅拌速度为200rpm。使用10N NaOH来调节pH，并且随着培养溶液中溶解氧的减少，控制转速(rpm)以保持溶解氧为30％或更高。对于12小时后用于二元酸转化的次级培养，在初始培养基中消耗葡萄糖用于细胞生长的时间点，加入20ml十二烷烷作为ω-氧化诱导物质用于二元酸转化的次级培养，并且以4g/hr的速率加入用于提供还原能力的葡萄糖。将培养条件改变为pH 7.5，气流量为0.5vvm。在12小时次级培养后，以1.2ml/hr至1.5ml/hr的速率加入作为基质的月桂酸甲酯，培养合计48小时。证实了，在48小时以17.64g/L产生转化的十二烷二酸，并且转化产率为90％(摩尔/摩尔)或更高。结果示于图21中。
Claims (7)
1.一种使用婴儿假丝酵母（Candida infanticola）菌株，从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的方法；
其中，所述婴儿假丝酵母菌株是婴儿假丝酵母野生型菌株（Candida infanticolaDS02; KCTC 12820BP），婴儿假丝酵母突变体菌株（Candida infanticola LC-DA01;KCTC13099BP），婴儿假丝酵母转化体菌株（Candida infanticola; KCTC13103BP,KCTC13104BP, KCTC13105BP, KCTC13106BP）或它们的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤：
（A）将婴儿假丝酵母菌株培养在酵母提取物葡萄糖培养基（YG培养基）中以确保初始细胞质量，所述酵母提取物葡萄糖培养基补充有含烃类或脂肪酸的基质；
（B）将碳源或含烃类、脂肪酸、烃类衍生物或脂肪酸衍生物的基质添加到步骤（A）的培养溶液中，以诱导ω-氧化反应；和
（C）在步骤（B）的反应溶液中添加含烃类或脂肪酸的基质和葡萄糖，并进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤（A）的培养在30±5°C，10%或更高的溶解氧的条件下进行20小时至50小时。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤（B）的反应使用0.5%至5%的碳源进行10小时至30小时。
5.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤（C）的培养使用0.1 ml/L/h至10 ml/L/h的基质和1 g/L/h至3 g/L/h的葡萄糖进行50小时至100小时。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述二元酸选自由乙二酸，丙二酸，丁二酸，戊二酸，己二酸，辛二酸，壬二酸，癸二酸，十一烷二酸，十二烷二酸，十六烷二酸和它们的组合组成的组。
7.一种从含烃类或脂肪酸的基质生产二元酸的婴儿假丝酵母（Candida infanticola）菌株；
其中，所述婴儿假丝酵母菌株是婴儿假丝酵母野生型菌株（Candida infanticolaDS02; KCTC 12820BP），婴儿假丝酵母突变体菌株（Candida infanticola LC-DA01;KCTC13099BP），婴儿假丝酵母转化体菌株（Candida infanticola; KCTC13103BP,KCTC13104BP, KCTC13105BP, KCTC13106BP）或它们的组合。
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| New anamorphic yeast species: Candida infanticola sp.nov., Candida polysorbophila sp. nov., Candida transvaalensis sp. nov. and Trigonopsis californica sp. nov;Cletus P Kurtzman;《Antonie Van Leeuwenhoek》;20070321;第221页摘要 * |
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